JPH0768269B2 - Ｃ−反応性蛋白質の精製方法 - Google Patents
Ｃ−反応性蛋白質の精製方法Info
- Publication number
- JPH0768269B2 JPH0768269B2 JP61101173A JP10117386A JPH0768269B2 JP H0768269 B2 JPH0768269 B2 JP H0768269B2 JP 61101173 A JP61101173 A JP 61101173A JP 10117386 A JP10117386 A JP 10117386A JP H0768269 B2 JPH0768269 B2 JP H0768269B2
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- Japan
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- crp
- phosphorylcholine
- protein
- purifying
- reactive protein
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｃ−反応性蛋白質を高純度に精製する方法に
関するものである。
関するものである。
（産業上の利用分野） 一般に、Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ−reactive protein、以
下CRPという）は各種感染症や炎症性疾患の患者血中に
は正常人と比較して多量に含まれているため、臨床検査
の分野では、これら病気の診断によく測定される項目の
一つになっている。
下CRPという）は各種感染症や炎症性疾患の患者血中に
は正常人と比較して多量に含まれているため、臨床検査
の分野では、これら病気の診断によく測定される項目の
一つになっている。
また、各種の癌でも血中CRP量が増加することがわかっ
ており、癌の診断、特に手術後の予後のモニターリング
に測定されるようになってきている。
ており、癌の診断、特に手術後の予後のモニターリング
に測定されるようになってきている。
しかしながら、血中のCRPの含量は少なく、酵素のよう
にそれ自体の活性により分析できるものではないため
に、CRPと特異的に結合する抗体もしくは抗血清を用い
て毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、ラテック
ス凝集反応法等で測定されることが多い。
にそれ自体の活性により分析できるものではないため
に、CRPと特異的に結合する抗体もしくは抗血清を用い
て毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、ラテック
ス凝集反応法等で測定されることが多い。
これらCRP定量法で用いる抗体や抗血清は、特異性の高
いものが要求される。
いものが要求される。
そして、特異性の高い抗体、抗血清を作るためには、高
純度の抗原、即ち、高純度のCRPが必要となるのであ
る。
純度の抗原、即ち、高純度のCRPが必要となるのであ
る。
従来、CRPの単離方法としては、Woodらの方法（Wood,H.
W.,et al.（1954）J.Exp.Med.,10,71）やPepysらの方法
（Pepys,M.B.,（1977）Lancet,１,1029）が知られてい
るが、いずれの方法も夾雑蛋白質の混入を防ぐことが出
来ず、高純度のCRP標品を単離・精製することが困難で
ある。
W.,et al.（1954）J.Exp.Med.,10,71）やPepysらの方法
（Pepys,M.B.,（1977）Lancet,１,1029）が知られてい
るが、いずれの方法も夾雑蛋白質の混入を防ぐことが出
来ず、高純度のCRP標品を単離・精製することが困難で
ある。
その他の精製法として、CRPはカルシウム存在下でホス
ホリルコリン（Phosphorylcholine,以下、PCと略記する
こともある）と特異的に結合するという知見より、PCを
リガントとして固定化した高分子担体（以下、PC−固化
担体と略記することもある）のアフィニティークロマト
グラフィーによってCRPを単離する方法も提案されてい
る（Oliveira,E.B.et al.（1980）J.Immunol.,124,139
6）。これらのPC−固定化担体によるCRPの精製法には、
精製工程の簡略化と、夾雑蛋白質の混入を防止し、高純
度のCRPを得ることが出来るという利点がある。しか
し、従来のこれらのPC−固定化担体の製造法は、非常に
複雑で反応ステップも多いことから多大の労力が必要と
され、最終生成物の収量も低いという問題点がある。
ホリルコリン（Phosphorylcholine,以下、PCと略記する
こともある）と特異的に結合するという知見より、PCを
リガントとして固定化した高分子担体（以下、PC−固化
担体と略記することもある）のアフィニティークロマト
グラフィーによってCRPを単離する方法も提案されてい
る（Oliveira,E.B.et al.（1980）J.Immunol.,124,139
6）。これらのPC−固定化担体によるCRPの精製法には、
精製工程の簡略化と、夾雑蛋白質の混入を防止し、高純
度のCRPを得ることが出来るという利点がある。しか
し、従来のこれらのPC−固定化担体の製造法は、非常に
複雑で反応ステップも多いことから多大の労力が必要と
され、最終生成物の収量も低いという問題点がある。
本発明者らは、CRPの有効な精製方法を求めて鋭意研究
した結果、可溶性蛋白質をスペーサーとして結合させた
アフィニティー担体を使用することによって解決するこ
とができた。
した結果、可溶性蛋白質をスペーサーとして結合させた
アフィニティー担体を使用することによって解決するこ
とができた。
本発明は、ホスホリルコリン類をリガンドとし、可溶性
蛋白質（だたし、生体系結合活性蛋白質を除く）をスペ
ーサーとして結合させたアフィニティー担体を用いてＣ
−反応性蛋白質を吸着、溶離せしめることを特徴とする
Ｃ−反応性蛋白質の精製方法である。
蛋白質（だたし、生体系結合活性蛋白質を除く）をスペ
ーサーとして結合させたアフィニティー担体を用いてＣ
−反応性蛋白質を吸着、溶離せしめることを特徴とする
Ｃ−反応性蛋白質の精製方法である。
本発明の大きな特色は、アルブミンに代表される様な水
溶性蛋白質をスペーサーとして用いることによって、CR
P以外の夾雑蛋白質の非特異的吸着を防止することにな
り、精製されるCRPの純度がきわめて高くなることであ
る。
溶性蛋白質をスペーサーとして用いることによって、CR
P以外の夾雑蛋白質の非特異的吸着を防止することにな
り、精製されるCRPの純度がきわめて高くなることであ
る。
本発明のもう一つの特色は、一旦リガントであるホスホ
リルコリン類をスペーサーである水溶性蛋白質に多量に
結合させてからさらにこの結合物を担体に固定化するた
めに、多量のリガンドを導入でき、ひいては、アフィニ
ティー担体の親和力も強くなり、同時に、担体当りの精
製目的物質、即ちCRPの結合量が著しく増加することで
ある。
リルコリン類をスペーサーである水溶性蛋白質に多量に
結合させてからさらにこの結合物を担体に固定化するた
めに、多量のリガンドを導入でき、ひいては、アフィニ
ティー担体の親和力も強くなり、同時に、担体当りの精
製目的物質、即ちCRPの結合量が著しく増加することで
ある。
本発明においてスペーサーに用いる可溶性蛋白質は、血
清アルブミン、卵白アルブミン、カゼインなどの比較的
安価で高純度のものであつて多量に入手しえるものが適
している。しかし、γ−グロブリンや補体系の蛋白質
は、可溶性蛋白質ではあるけれども、スペーサー自体が
種々の成分との結合性をもつために適さない。
清アルブミン、卵白アルブミン、カゼインなどの比較的
安価で高純度のものであつて多量に入手しえるものが適
している。しかし、γ−グロブリンや補体系の蛋白質
は、可溶性蛋白質ではあるけれども、スペーサー自体が
種々の成分との結合性をもつために適さない。
本発明では、γ−グロブリンや補体系の蛋白質など、他
の成分との結合性をもった蛋白質を「生体系結合活性蛋
白質」として、本発明には使用できないものとしてい
る。
の成分との結合性をもった蛋白質を「生体系結合活性蛋
白質」として、本発明には使用できないものとしてい
る。
可溶性蛋白質には、多くのアミノ基、カルボキシル基、
少量のSH基があり、これらの基をリガンドとの結合に、
そして、アフィニティー担体との結合に使用することに
なる。
少量のSH基があり、これらの基をリガンドとの結合に、
そして、アフィニティー担体との結合に使用することに
なる。
リガンドであるホスホリルコリン類を可溶性蛋白質に結
合させる方法は種々あるが、アミノ基もしくはカルボキ
シル基のどちらか一方にだけ結合させる方法が好まし
い。また、ホスホリルコリンを結合させることに使われ
ない基を使って担体に結合するのが好ましい。
合させる方法は種々あるが、アミノ基もしくはカルボキ
シル基のどちらか一方にだけ結合させる方法が好まし
い。また、ホスホリルコリンを結合させることに使われ
ない基を使って担体に結合するのが好ましい。
ホスホリルコリンの誘導体でアルデヒド基を有するコリ
ンホスホリルグリコアルデヒドは、蛋白質のアミノ基
と、還元的アミノ化反応により反応し、炭素原子２個分
のスペーサーのついた形でホスホリルコリンが導入で
き、他のカルボキシル基やSH基には影響しないので良好
な結合方法である。
ンホスホリルグリコアルデヒドは、蛋白質のアミノ基
と、還元的アミノ化反応により反応し、炭素原子２個分
のスペーサーのついた形でホスホリルコリンが導入で
き、他のカルボキシル基やSH基には影響しないので良好
な結合方法である。
次の式（Ｉ）で表される。
コリンホスホリルグリコアルデヒドと可溶性蛋白質、例
えば市販の牛血清アルブミンとを緩衝液中で還元アミノ
化反応を行なえばよい。還元剤としては、ジメチルアミ
ンボラン、シアノ水素化ほう素ナトリウムなどがある
が、シアノ水素化ほう素ナトリウムが一般的である。反
応は37℃程度に加温し、10〜30時間の反応によって、可
溶性蛋白質のアミノ基に式（Ｉ）の化合物が結合する。
反応後は、水に対して透析し、未反応低分子化合物を除
去し、透析内液を凍結乾燥し、ホスホリルコリン誘導体
（PC−誘導体）を粉末で得ることができる。
えば市販の牛血清アルブミンとを緩衝液中で還元アミノ
化反応を行なえばよい。還元剤としては、ジメチルアミ
ンボラン、シアノ水素化ほう素ナトリウムなどがある
が、シアノ水素化ほう素ナトリウムが一般的である。反
応は37℃程度に加温し、10〜30時間の反応によって、可
溶性蛋白質のアミノ基に式（Ｉ）の化合物が結合する。
反応後は、水に対して透析し、未反応低分子化合物を除
去し、透析内液を凍結乾燥し、ホスホリルコリン誘導体
（PC−誘導体）を粉末で得ることができる。
ここに得られたホスホリルコリン誘導体を結合させるア
フィニティー担体としては、多糖体を骨格とするセルロ
ース、セファデックス、セファロース、合成樹脂を骨格
とするトリスアクリル、トーヨーパール、ガラスを骨格
とするもの、その他種々のものがあげられる。
フィニティー担体としては、多糖体を骨格とするセルロ
ース、セファデックス、セファロース、合成樹脂を骨格
とするトリスアクリル、トーヨーパール、ガラスを骨格
とするもの、その他種々のものがあげられる。
アフィニティー担体にホスホリルコリン誘導体を結合さ
せる方法としてはブロムシアン活性化法、エポキシ活性
化法、活性化チオール法など、アフィニティー担体に種
々の官能基を導入して行なわれることが多いが、これら
のいずれの方法を用いてもアフィニティー担体にホスホ
リルコリン誘導体を縮合させることができる。
せる方法としてはブロムシアン活性化法、エポキシ活性
化法、活性化チオール法など、アフィニティー担体に種
々の官能基を導入して行なわれることが多いが、これら
のいずれの方法を用いてもアフィニティー担体にホスホ
リルコリン誘導体を縮合させることができる。
ホスホリルコリン類をリガンドとし、可溶性蛋白質をス
ペーサーとして結合させたアフィニティー担体は、これ
をCaCl2を含むリン酸バッファーで平衡化して、ここにC
RP含有液、例えばCRP陽性ヒト血清を加えて、CRPを吸着
させ、非吸着の蛋白質を洗い流し、次いでEDTAを含むリ
ン酸バッファーを流下することによって吸着しているCR
Pを溶離させることができる。
ペーサーとして結合させたアフィニティー担体は、これ
をCaCl2を含むリン酸バッファーで平衡化して、ここにC
RP含有液、例えばCRP陽性ヒト血清を加えて、CRPを吸着
させ、非吸着の蛋白質を洗い流し、次いでEDTAを含むリ
ン酸バッファーを流下することによって吸着しているCR
Pを溶離させることができる。
ここに、きわめて純度の高いCRPを得ることができる。
次に本発明の製造例及び実施例を示す。
以下に示すのは、スペーサーにウシ血清アルブミンを用
い、そこにホスホリルコリンを結合させたホスホリルコ
リン−BSA結合物を用いてCRPを精製する方法である。
い、そこにホスホリルコリンを結合させたホスホリルコ
リン−BSA結合物を用いてCRPを精製する方法である。
製造例1. PC55 BSAの製造： 50mMのＬ−グリセロホスホリルコリン水溶液52mlにメタ
過ヨウ素酸ナトリウムを終濃度100mMとなるように溶解
し、室温で30分間放置することにより、コリンホスホリ
ルグリコアルデヒドとホルムアルデヒドの混合生成物を
得た。次に、この混合生成物を氷浴中で２時間冷却し、
加えた過ヨウ素酸と等モル量のエチレングリコールを加
え乾固した。得られた白色の粉末を0.1Mの酢酸10mlに溶
解し0.1M酢酸であらかじめ平衡化しておいたセファデッ
クスＧ−75（ファルマシア社製）カラムでゲルロカを行
なった。ネオカブロイン法で確認したコリンホスホリル
グリコアルデヒド溶出画分を集め濃縮した。分子内リン
酸残基を定量することによりコリンホスホリルグルコア
ルデヒドのＬ−グリセロホスホリルコリンよりの収率を
求めたところ80％であった。
過ヨウ素酸ナトリウムを終濃度100mMとなるように溶解
し、室温で30分間放置することにより、コリンホスホリ
ルグリコアルデヒドとホルムアルデヒドの混合生成物を
得た。次に、この混合生成物を氷浴中で２時間冷却し、
加えた過ヨウ素酸と等モル量のエチレングリコールを加
え乾固した。得られた白色の粉末を0.1Mの酢酸10mlに溶
解し0.1M酢酸であらかじめ平衡化しておいたセファデッ
クスＧ−75（ファルマシア社製）カラムでゲルロカを行
なった。ネオカブロイン法で確認したコリンホスホリル
グリコアルデヒド溶出画分を集め濃縮した。分子内リン
酸残基を定量することによりコリンホスホリルグルコア
ルデヒドのＬ−グリセロホスホリルコリンよりの収率を
求めたところ80％であった。
ここに得られたコリンホスホリルグリコアルデヒド108m
gを0.2Mリン酸バッファー（pH7.0）の溶液70mlに溶解
し、さらに牛血清アルブミン（BSA）を40mg加えた。次
にシアノ水素化ホウ素ナトリウム90.3mgを加え、37℃で
20時間インキュベートした。インキュベート後、反応液
を水に対して透析し、透析内液を凍結乾燥することによ
りホスホリルコリンとBSAの結合した誘導体を得た。BSA
1分子につき平均55分子のホスホリルコリンが結合した
誘導体であった。この誘導体をPC55 BSAとした。
gを0.2Mリン酸バッファー（pH7.0）の溶液70mlに溶解
し、さらに牛血清アルブミン（BSA）を40mg加えた。次
にシアノ水素化ホウ素ナトリウム90.3mgを加え、37℃で
20時間インキュベートした。インキュベート後、反応液
を水に対して透析し、透析内液を凍結乾燥することによ
りホスホリルコリンとBSAの結合した誘導体を得た。BSA
1分子につき平均55分子のホスホリルコリンが結合した
誘導体であった。この誘導体をPC55 BSAとした。
製造例2. アフィニティー担体の製造： 8mlのチオプロピルトーヨーパールHW−65を1mMのEDTAを
含む0.1Mリン酸バッファーでpH6.0に平衡化し、そこに
N,N−ジメチルフォルムアミド1mlに溶解したN,N′−Ｏ
−フェニレンジマレイミド67mgを加え、さらに10mlの上
記バッファーを加え30℃20分間インキュベートし、マレ
イミド化トーヨーパールHW−65とする。
含む0.1Mリン酸バッファーでpH6.0に平衡化し、そこに
N,N−ジメチルフォルムアミド1mlに溶解したN,N′−Ｏ
−フェニレンジマレイミド67mgを加え、さらに10mlの上
記バッファーを加え30℃20分間インキュベートし、マレ
イミド化トーヨーパールHW−65とする。
上記バッファーで洗浄後、製造例１で得たPC55 BSA 63.
24mgを含む上記バッファー34mlを加え４℃40時間インキ
ュベートする。得られたPC55 BSA−トーヨーパールHW−
65は、1mlのゲル当り5.3mgのPC55 BSAを結合している。
24mgを含む上記バッファー34mlを加え４℃40時間インキ
ュベートする。得られたPC55 BSA−トーヨーパールHW−
65は、1mlのゲル当り5.3mgのPC55 BSAを結合している。
実施例1. CRPの精製： 製造例２で得たPC55 BSA−トーヨーパールHW−65 1mlを
1mMのCaCl2を含むリン酸バッファー（PBS）（10mM、pH
7.2）で平衡化した後、1mMのCaCl2を含むCRP陽性ヒト血
清100mlを添加する。次いで50mlの1mM CaCl2を含むリン
酸バッファー（PBS）（10mM、pH7.2）を添加し、非吸着
の蛋白質を洗い流す。そこに30mlの1mM EDTAを含むリン
酸バッファー（PBS）（10mM、pH7.2）を添加し、吸着し
ているCRPを溶出する。その結果9.56mgのCRPを得た。
1mMのCaCl2を含むリン酸バッファー（PBS）（10mM、pH
7.2）で平衡化した後、1mMのCaCl2を含むCRP陽性ヒト血
清100mlを添加する。次いで50mlの1mM CaCl2を含むリン
酸バッファー（PBS）（10mM、pH7.2）を添加し、非吸着
の蛋白質を洗い流す。そこに30mlの1mM EDTAを含むリン
酸バッファー（PBS）（10mM、pH7.2）を添加し、吸着し
ているCRPを溶出する。その結果9.56mgのCRPを得た。
本実施例の溶出曲線は第１図に示される通りであり、純
度の高いCRPが得られるのが分る。
度の高いCRPが得られるのが分る。
第１図は実施例１におけるCRPの精製に際しての溶出曲
線を示す図である。
線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高河原 勇 兵庫県川西市大和東５−７−13 (56)参考文献 特開 昭59−169532（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】ホスホリルコリン類をリガンドとし、可溶
性蛋白質（ただし、生体系結合活性蛋白質を除く）をス
ペーサーとして結合させたアフィニティー担体を用いて
Ｃ−反応性蛋白質を吸着、溶離せしめることを特徴とす
るＣ−反応性蛋白質の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61101173A JPH0768269B2 (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | Ｃ−反応性蛋白質の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61101173A JPH0768269B2 (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | Ｃ−反応性蛋白質の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62258399A JPS62258399A (ja) | 1987-11-10 |
| JPH0768269B2 true JPH0768269B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=14293614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61101173A Expired - Lifetime JPH0768269B2 (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | Ｃ−反応性蛋白質の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0768269B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2971290B2 (ja) * | 1993-04-27 | 1999-11-02 | オリエンタル酵母工業株式会社 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ |
| WO2003036297A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-05-01 | Tridelta Development Limited | Non-immunological assays for the detection and determination of c-reactive protein |
| JP4535490B2 (ja) * | 2004-04-09 | 2010-09-01 | 株式会社資生堂 | 蛋白質吸着防止方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59169532A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-09-25 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｃ反応性蛋白の吸着材 |
-
1986
- 1986-05-02 JP JP61101173A patent/JPH0768269B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62258399A (ja) | 1987-11-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |