JPH07121876B2 - 静注用免疫グロブリンの製法 - Google Patents

静注用免疫グロブリンの製法

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JPH07121876B2
JPH07121876B2 JP61264125A JP26412586A JPH07121876B2 JP H07121876 B2 JPH07121876 B2 JP H07121876B2 JP 61264125 A JP61264125 A JP 61264125A JP 26412586 A JP26412586 A JP 26412586A JP H07121876 B2 JPH07121876 B2 JP H07121876B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、静脈注射に適する凍結乾燥した免疫グロブリ
ンの製法に係る。
さらに詳述すれば、本発明は、カップリング剤としてジ
カルボン酸ジスクシンイミジルエステルを使用して、ア
ミノ基によって官能化された親水性ゲル（アミノ基官能
化親水性ゲル）に不動化せしめたペプシンによって処理
することからなる静脈注射に適する免疫グロブリンの製
法に係る。
ヒト血漿の各種成分への分離は、1940年代の初頃、米国
においてCohnにより研究され、理論付けされている（E.
J.Cohnら「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・
ソサエティー（J.Am.Chem.Sec.）」62（1940）,p 3386
−93）。
CohnフラクションII（IgG濃縮物）は、1950年代の前半
から、先天性又は後天性無ガンマグロブリン血症の患者
の免疫治療に使用されている（D.Gitlin,C.A.Janeway
「Prog.Hemat.」Ｉ（1956）318−329）。
これら調製物の筋肉内注射は一般に良好に行なわれてお
り、報告されている一般的な副作用は大容量を注射した
後の不快感のみである。これに対して、静脈注射する場
合には、頻脈、呼吸困難、胸部圧迫感、痛み及びさらに
重大なアナフィラキシーショック様反応が引起される
（C.A.Janeway「ザ・ディベロップメント・オブ・クリ
ニカル・ユージーズ・オブ・イミュノグロブリンズ．ア
・レビュー・イン・イミュノグロブリンズ（The develo
pment of clinical uses of immunoglo−bulins,A Revi
w in immunoglobulins）」E.Merler編、ワシントン、Na
tional Academy of Sciences（1970））。アナフィラキ
シーは、Cohnエタノール分画法の間に形成されるIgG凝
集体によって引起されるものと思われる。事実、免疫グ
ロブリン凝集体は補体系を特異的に活性化させることが
確認されている（C.A.Janeway,同上）。
IgGの静脈内への注入は、特に迅速な抗体の上昇が望ま
れる際には、効果的な治療効果を発揮するものと考えら
れるため、静脈注射に適する免疫グロブリン調製品を提
供するよう各種の方法が開発されてきた。特に興味深い
方法は下記のものである。
−ペプシンによるIgGタンパク分解 （H.E.Schuitze,G.Schwick「Veber Neve Moglichkeiten
Intravenoser Gammaglobulin Applikation,Desch.Med.
Wschr.」87,1643（1962）） −プラスミンによるIgGタンパク分解 （J.T.Sgouris「Vox Sang.」13,71−84（1967））−β
−プロピオラクトンによるIgG分子の化学変性 （W.Stephan「Vox Sang.」28,422−437（1975））−ジ
スルフィッド結合の還元及びＳ−スルホン化によるIgG
分子の化学変性 （Y.Masuho,S.Tomibe,K.Matsuzawa,A.Ohtsu「Vox San
g.」32,175−181（1977））−還元−アミド化によるIgG
分子の化学変性（米国特許第4,118,379号） −ジチオトレイトールを使用する制御した条件下でのジ
スルフィッド結合の還元及びヨードアセトアミドでのア
ルキル化によるIgG分子の化学変性 （P.M.Fernandes,J.L.Lundbland「Vox Sang.」39,101−
112（1980）） −ポリエチレングリコールでの沈殿による凝集体の除去 （A.Polsh,C.Ruiz−Bravo「Vox Sang.」23,107−118（1
972）） −温和な条件下での血漿分画によるIgGの調製（イオン
交換樹脂用使用） （A.J.Johnson,V.E.Mac Donaldら「J.Lab.Clin.Med.」9
2,194−210（1978）;A.D.Friesen,J.M.Bowma,W.C.M.Bee
s「Vox Sang.」48,201−212（1985）） −pH4での微量ペプシンによるIgGの処理 （S.Barandun,P.Kistler「ヒトγ−グロブリンの静脈注
射」「Vox Sang.」７,157−174（1962）） −pH4.25を有する緩衝液によるIgGの処理 （B.Priofsky,「ジ・アメリカン・ジャーナル・オブ・
メディカル（The Am.J.of Med.）」76（3A）,53−60（1
984）） しかしながら、これらの方法のいずれも何らかの欠点を
有している。
ペプシン又はプラスミドによるタンパク分解に基く方法
では、原料タンパク質よりも小さい分子量を有する生成
物が生成される（このため、半減期が短縮されかつ限ら
れた生物学的作用を有することになる）。
β−プロピオラクトンによる処理又は分子間−Ｓ−Ｓ−
結合の還元、つづくアルキル下（又はＳ−スルホン化）
に基く方法では、元の分子に関して化学的に変化された
免疫グロブリン分子が最終生成物として生成される。
pH4での微量の可溶性ペプシンによる処理では、元の分
子と同じ分子量を有する微量の動物性酵素で汚染された
生成物が生成される。
ポリエチレングリコールを使用して得られた免疫グロブ
リン含有調製品について、かなり高い抗補体作用が検知
されている（J.Romerら「Vox Sang.」42,74−80（198
2））。
温和な条件下での血漿分画法では、原料が全血漿である
場合にのみ、実質的に抗補体作用がない無傷免疫グロブ
リンを生成する。かかる方法では、原料として、凍結又
は凍結乾燥された高ACAのCohnフラクションIIを使用す
ることができない。
さらに、25％エタノールによる沈殿法は、ウイルスによ
る汚染を制御するためには有効な方法である。
pH4.25の緩衝液による処理では、生理的なpH値とはかけ
離れたpHを有する生成物を生ずる。
最後に、特開昭56−15215号には、カップリング剤とし
てグルタルアルデヒドを使用して親水性ゲルに不動化せ
しめたペプシンを使用することによって免疫グロブリン
を調製する方法が開示されている。
しかしながら、この方法では、30％もタンパク分解され
る生成物が生成される。タンパク分解後、IgG分子は、
なお抗原分子を結合せしめうるが、補体系の活性化（中
でも溶菌作用に関与する）を果たし得ない。さらに、タ
ンパク分解IgGの半減期は、元の分子が28日であるのに
対して３日である。従って、タンパク分解分子が高率の
場合には、各種の欠点があることが明らかである。
発明者らは、静脈注射に適する凍結乾燥免疫グロブリン
を製造できると共に、上述の欠点を解消できる方法を見
出だし、本発明に至った。
従って、本発明の目的は、アミノ基で官能化された親水
性ゲルに不動化せしめたペプシンによる処理を介して、
静注用免疫グロブリンを製造する方法において、カップ
リング剤として、 一般式（Ｉ） （式中、Ｒは炭素数１ないし20の直鎖状または分枝状の
アルキレン基、 又は である）で表されるジカルボン酸ジスクシンイミジルエ
ステルを使用することを特徴とする静注用免疫グロブリ
ンの製法を提供することにある。
本発明の好適な具体例によれば、カップリング剤とし
て、一般式（Ｉ）のＲが炭素数１ないし10のアルキレン
基であるジカルボン酸ジスクシンイミジルエステルが使
用される。本発明の最も好適な具体例では、カップリン
グ剤として、一般式（Ｉ）のＲが炭素数２ないし６の直
鎖状アルキレン基であるジカルボン酸ジスクシンイミジ
ルエステルが使用される。アジピン酸ジスクシンイミジ
ル（Ｒ＝CH2 ４）は、本発明の目的に特に有効であ
る。
本発明の方法は、凍結乾燥後、下記特性を有するため、
静脈注射に特に適する免疫グロブリン調製品を与える免
疫グロブリンを生成する。
−抗補体作用（ACA）を実質的に有しないこと。
−化学的に変質されていないこと。
−タンパク分解されていないこと（すなわち、元の免疫
グロブリンと同じ分子量及び同じ半減期を有するこ
と）。
−処理終了後、不動化酵素が除去されると共に、酵素と
担体との間の結合力が強く、高イオン強度の物質又は塩
溶液の存在下でも酵素の遊離を生じないため、動物性の
酵素に全く汚染されないこと。
従って、本発明の他の目的は、本発明の方法により調製
された静脈注射用として適する凍結乾燥免疫グロブリン
調製品を提供することにある。
特に、凍結乾燥免疫グロブリンを調製する場合、本発明
の方法は下記の工程を介して行なわれる。
ａ） カップリング剤として一般式（Ｉ）で表されるジ
カルボン酸ジスクシンイミジルエステルを使用し、アミ
ノ基で適当に官能化された親水性ゲルにペプシンを不動
化せしめる工程、 ｂ） 得られた不動化ペプシンを免疫グロブリンとイン
キュベーションする工程、 ｃ） 免疫グロブリンを回収し、これらを凍結乾燥させ
る工程。
ペプシン不動化用担体としては、アミノ基を含有する
か、アミノ基の導入により官能化されうるものであり、
酵素自体によってはタンパク分解されず、インジュベー
ション工程で選択される反応条件下で安定かつ不活性で
あれば、有機性又は無機性を問わず各種の親水性ゲルが
使用できる。しかしながら、一般には、有機性担体の場
合、セルロース、デキストラン、アガロースの如きポリ
サッカライド誘導体及びポリアクリルアミド、これらの
アミノ化誘導体及び合成重合体ゲルを使用することが特
に好適である。たとえば、ポリサッカライドゲル製品
（たとえば、Sepharose、Sephadex（いずれもPharmacia
社の登録商標）、Bio−Gel（Bio Rad社の登録商標）、E
nzacryl等の商標名で市販されているもの）のいくつか
のものを使用できる。コスト及び入手容易性の点から、
Sepharose−4B、Cl−Sepharose−4B、AH−Sepharose−4
B（いずれも商標）として知られている市販のゲルが特
に好適である。
原料の親水性ゲルのアミノ基を含有していない場合に
は、アミノ基は、文献上公知の各種の方法により容易に
導入される（たとえば、J.Porath,R.Axen,S.Ernback
「ネーチャー（Nature）」215,1491（1967）;G.S.Bethe
ll,J.S.Ayers,W.S.Mancock,M.T.W.Hearn「ザ・ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）」Vol.124,n.8,p2577−2574（1979）参照）。特
に、縮合剤としてカルボニルジイミダゾールを使用する
後者の文献に記載の方法が有効である。
カップリング剤として一般式（Ｉ）で表されるジカルボ
ン酸ジスクシンイミジルエステルを使用するアミノ基官
能化親水性ゲルへのペプシンの不動化は、別々の２つの
工程で行なわれる。
さらに詳述すれば、まずアミノ基を含有する担体を、適
当に選択された一般式（Ｉ）のジカルボン酸ジスクシン
イミジルエステルとの反応を介して活性化し、ついで、
活性化された担体をペプシンと反応させる。
カップリング剤として一般式（Ｉ）の化合物を使用する
ことにより、酵素との反応を特に温和な条件下で実施で
きる。これは、共有結合による酵素不動化に要求される
反応条件が一般的にはかなり複雑で、特に温和でないこ
とから、極めて重要である。従って、ある場合には、共
有結合の結果、酵素の配座構造及び活性中心が変化し、
これにより、活性の低下／又は基質特異性の変化を招
く。
一般式（Ｉ）で表されるジカルボン酸ジスクシンイミジ
ルエステルの一部のものは既知の化合物であり、他のも
のは極めて容易な縮合法により調製される。
結合法の第１工程では、アミノ基官能化親水性ゲルを、
担体のアミノ基に関して大過剰モル量の一般式（Ｉ）の
化合物と反応させる。大過剰モル量としては、代表的に
は5/1ないし15/1、好ましくは8/1ないし12/1である。
この反応（室温において簡単に行なわれる）は、選択し
た担体と相溶性のある不活性は極性有機溶媒又は溶媒混
合物の存在下で実施される。この工程での使用に適する
有機溶媒は、たとえばジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、高級脂肪族エーテル、ジメチルホルムアミド等であ
り、特にジオキサンが好適である。
反応の終了時（一般に数時間で完了する）、活性化され
た担体を回収し、次工程に適する5.0ないし6.2の範囲の
pHを有する緩衝液で充分に洗浄する。活性化担体とペプ
シンとの反応は、事実、pH値5.0−6.2、好ましくは6.0
−6.2を有する緩衝液中で行なわれる。この目的には、
リン酸塩緩衝液、好ましくは0.1Mリン酸塩緩衝液が使用
される。反応は、一般に０℃ないし室温の範囲の温度で
行なわれる。好ましくは、細菌による汚染を回避するた
め、温度は10℃以下に維持される。活性化された担体へ
のペプシンの適切な架橋形成のため、ペプシンは膨潤ゲ
ル1ml当たり約30ないし70mgの量で使用される。
数時間後（一般に３ないし７時間、代表的には４ないし
５時間）、反応が完了したところで、不動化ペプシンを
濾過又はデカンテーションにより簡単に分離し、微量の
汚染物をも除去するため厳重に洗浄する。
必要に応じて、かかる不動化ペプシンを保存することも
できる。この場合、任意により少量の保存剤（たとえば
ホルムアミド溶液）を添加して、酸性緩衝液（pH4−4.
5）中で保存する。
一方、不動化されたペプシンを次のインキュベーション
工程に直接に使用することもできる。
このように、本発明は、カップリング剤として前記一般
式（Ｉ）のジカルボン酸ジスクシンイミジルエステルを
使用するアミノ基官能化親水性ゲルへのペプシンの不動
化法を提供するものでもある。
本発明による静脈溶凍結乾燥免疫グロブリンの製造に使
用される原料は、冷エタノールによる連続沈殿によっ
て、正常又は免疫されたドナーから集められた血漿から
得られる凍結又は凍結乾燥CohnフラクションIIである。
さらに詳述すれば、ペプシンのインキュベーションの前
に、免疫グロブリンを注射用蒸留水に溶解し、得られた
溶液のpH及びイオン強度を適当に調節して（たとえばpH
6.0ないし7.0及びイオン強度約0.005ないし約0.05）不
純物を沈殿させることによって完全な精製を行なう。つ
いで、不溶物をフィルタによる濾過又は同様の分離法に
よって除去し、得られた清浄溶液のpHをインキュベーシ
ョン工程の最適値（3.8ないし4.3、好ましくは約４）に
調節する。
このようにして得られた溶液を不動化酵素に添加する。
免疫グロブリンの不動化酵素によるインキュベーション
にあたり、バッチ法を利用することが便利であるが、不
動化ペプシンを収容するカラム内に免疫グロブリン溶液
を循環させることもできる。
この工程で使用される不動化ペプシンの量は、清浄溶液
中の免疫グロブリンの量に左右される。酵素活性600な
いし3,000U/g（免疫グロブリン）を提供する量で不動化
ペプシンを使用する場合に最適結果が得られる。
インキュベーションは温度34ないし40℃、好ましくは36
ないし38℃で実施され、完了には約16ないし24時間、一
般的には17ないし20時間を要する。
最適結果を保証するためには、タンパク質濃度を５％
（w/v）以下、好ましくは３％以下に維持することが必
要である。しかしながら、現在の薬品工業における要求
を満足させ、かつ極端な大容量の使用を回避するために
は、タンパク質濃度は１％（w/v）以上、好ましくは２
％以上に維持される。
インキュベーション終了後、代表的には遠心分離又は多
孔質膜を介する濾過によって不動化酵素を除去し、免疫
グロブリンを含有する溶液のタンパク質濃度及びpHを、
つづく凍結乾燥工程での要求に応じて調整する。
ついで、無菌の凍結乾燥生成物の調製にあたり薬学の分
野で従来から使用されている公知の方法に従って凍結乾
燥を行う。
このようにして得られた静脈注射に適する凍結乾燥免疫
グロブリン調製品は下記の特性を有する。
−単量体＞85％、二重体≦12、高分子＜５％、断片形生
成物≦５％の親生成物に匹敵する分子量分布を有する
（H.Sumelaらによって「ジャーナル・オブ・クロマトグ
ラフィー（J.Chromat.）」297，（1984）,p369−373に
記載された方法に従ってHPLCにより検定）； −ACAが常に20CH50/gより小、一般に15CH50/gより小で
ある（スイス赤十字社による提案され、M.M.Maierによ
って「Kabat及びMayerの実験免疫化学（Kabat and Maye
r's Experimental Immunochemistry）」第２刊（196
1）,Charles C.Thomas,スプリングフィールド、p133−2
40に記載された溶血法とほど同様にして検定）； −化学的変質がない； −汚染物が存在しない さらに、かかる調製品の特定は、37℃、１カ月後でも変
化しない（安定性試験）。下記の実施例は本発明をさら
に説明するものであるが、本発明はこれらの実施例に限
定されない。
実施例１ AH−Sepharose−4Bに不動化されたペプシン １）アジピン酸ジスクシンイミジルエステルの調製 N,N−ジシクロヘキシカルボジイミド（88ミリモル）の
ジオキサン（80ml）溶液を、滴加ロート及び攪拌機を具
備し、かつジオキサン（320ml）中にアジピン酸（5.8g,
40ミリモル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（9.2
g,80ミリモル）を含有する溶液を収容する三頸フラスコ
（1000ml）に滴加した。ついで、反応混合物を室温で18
−24時間攪拌した。
得られた懸濁液を、多孔性の磁製ブフナーフィルタ（G
3）を介して濾過し、得られた固体物を純粋なジオキサ
ン（50ml＋３×100ml）で４回抽出した。抽出液を濾液
と併わせ、ロータリーエバポレータによってジオキサン
を除去し、得られた粗製物質をイソプロピルアルコール
からの晶出により精製した。このようにして得られたア
ジピン酸ジスクシンイミジルエステルを減圧下（ウオー
ターポンプによる）約70℃に加熱して、微量のイソプロ
ピルアルコールをも除去した。得られた生成物につい
て、融点、及び他の物理−化学恒数によって同定した。
かかる特性データを下記に示す。なお、この化合物を無
水条件下−20℃で保存した。
m.p:168℃ 元素分析:C 49.41％,H 8.23％， Ｎ 4.70％ ν（cm-1）:1735,1785,810 収率:80％ ２）AH−Sepharose−4Bに不動化されたペプシンの調製 ゲル1ml当たりアミノ基約６・10-6ないし約10-5モルを
含有するAH−Sepharose−4B（30g）を膨潤させ、多孔性
の磁製ブフナーフィルタ上で0.5N NaCl（500ml）、つ
いで水（2000ml）で洗浄した。つづいて、順次、割合8
0:20,50:50,20:80を有する３種の水−ジオキサン混合物
（それぞれ１）で洗浄し、最後に純粋なジオキサン
（2500ml）で洗浄した。
このようにして洗浄したゲルを、攪拌機を具備しかつア
ジピン酸ジスクシンイミジルエステル（6.6g）のジオキ
サン（200−300ml）溶液を収容するフラスコに充填し
た。かかるジエステルは、担体アミノ基の約10倍の割合
で含有されている。
活性化反応は、攪拌しながら、室温で４時間続けた。
活性化反応終了後、反応混合物を濾過し、活性化ゲルを
取出し、ジオキサン（500ml）及びpH6.2リン酸塩緩衝液
（300ml）で洗浄した。
有機溶媒が使用されるいずれの操作において、ゲルが集
塊し易くなり、不都合を生ずるようになるため、ゲルの
不充分な処理を回避する必要がある。
ついで、活性化担体を、攪拌機を具備しかつペプシン
（6g）のpH6.2リン酸塩緩衝液（500−700ml）溶液を収
容するフラスコに充填し、反応混合物を４℃で４時間攪
拌した。
反応終了後、反応混合物を濾過し、担体結合酵素をpH6.
2リン酸塩緩衝液（300ml）で洗浄し、カラムを充填し、
まずHCl（1500ml）を添加してpH4に調節した6N尿素溶液
及びついでNaClの0.5N酢酸塩緩衝液（pH4）溶液（6000m
l）で洗浄した。かかる洗浄の後、ゲルを小形の目盛付
きカラム内で沈降せしめた。
このようにして調製したゲルを、１％ホルムアルデヒド
溶液を含有するNaClの0.5M酢酸塩緩衝液（pH4）溶液中
に保存した。
実施例２ カルボニル−ジイミダゾールによるCl−Sepharose−4B
へのアミノ基の導入 Cl−Sepharose−4B（10g）を、ブフナーフィルタ上で、
水（250ml）、順次、容量比80:20,50:50,20:80を有する
３種の水−ジオキサン混合物及び最後に純粋なジオキサ
ン（200ml）によって洗浄した。ついで、カルボニルジ
イミダゾール（0.400g）を含有するジオキサン（30ml）
中にゲルを懸濁化し、活性化反応を攪拌しながら室温に
おいて30分間行った。
活性化されたゲルを取出し、ジオキサン（100ml）及び
水（100ml）で洗浄し、pH10のアルカリ性水に懸濁化
し、攪拌しながら、４℃、24時間で1,6−ヘキサンジア
ミン（2.9g）と反応させた。
得られた官能化担体を、最後に、わずかに酸性の水溶液
（300ml）及び0.5N NaCl溶液で洗浄し、この最後の溶液
中に４℃で保存した。
実施例３ アミノ基官能化Cl−Sepharose−4Bに不動化されたペプ
シンの調製 アミノ基官能化Cl−Sepharose−4Bにペプシンを不動化
させる方法も、前述のAH−Sepharose−4Bにペプシンを
不動化させる場合と同様に行なわれる。
実施例４ AH−Sepharose−4B不動化ペプチンの使用による静脈用
凍結乾燥免疫グロブリン100ないし400バイアルの製造 １）免疫グロブリン（凍結乾燥又は凍結ペーストCohnフ
ラクションII）を注射用蒸留水にタンパク質濃度約50g/
Kgで溶解する。
２）0.2M HClを添加してpHを6.5±0.05に調整し、NaCl
を添加してイオン強度を0.01に調整する。
３）Celite 577（10g/Kg）又は同様の濾過助剤を添加
し、Millipore CWSCフィルタにより４℃で濾過すること
により溶液を浄化する。
４）注射用蒸留水を添加してタンパク質濃度を22g/Kgに
調整する。
５）0.2M HClを添加してpHを4.00±0.05に調整する。
６）攪拌手段を具備する無菌フラスコに、Durapore Mil
lipore等の如き膜を使用して濾過することにより溶液を
減菌する。
７）実施例１で得られたAH−Sepharose−4B不動化ペプ
シンを添加する。酵素活性（原料の抗補体作用及びタン
パク分解に対する抵抗性によって左右される）は1000な
いし3000U/タンパク質1gである。
８）ゆるやかに攪拌しながら37℃で18時間インキュベー
ションする。
９）多孔性の磁製フィルタ（G1−G2）により酵素を分
離、回収する。
10）溶液を20℃に冷却し、0.2M NaOHを添加してpHを6.5
±0.05に調整する。
11）前記３）の好く浄化する。
12）各バイアルに必要なタンパク質の量に応じて、PTHK
カセット（100,000nmwl）を組込んだPelliconシステム
を使用する限外濾過によってタンパク質を濃縮する。
13）前記３）の如く浄化する。
14）ほぼ等張溶液となるまでサッカロースを添加する。
15）前記６）の如く濾過により減菌する。
16）溶液を100mlバイアルに分配する（各バイアルにつ
きガンマロブリン3gを収容することが望まれる場合に
は、６％溶液を50mlずつ分配する）。
17）−21℃で凍結乾燥を始め、終了時30℃とする。
上述の工程を経て得られた免疫グロブリンは、以下の特
性を有する。
−単量体＞85％、二重体＜12％、断片形生成物＜１％及
び高分子（凝集体）検知不能の元の分子に類似する分子
量分布を有する； −化学的に変質されていない； −抗補体作用8.64CH50/gを有する； −汚染物を含有しない； −37℃で１ケ月後でも、上述の特性を維持する。
実施例５ アミノ基官能化Cl−Sepharose−4Bに不動化されたペプ
シンを使用する静注用凍結乾燥免疫グロブリン100ない
し400バイアルの製造 アミノ基官能化Cl−Sepharose−4Bに不動化せしめたペ
プシンを使用する静注用凍結乾燥免疫グロブリンの調製
も、前記実施例４に記載のAH−Sepharose−4Bを使用す
る場合と同様に実施される。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】静注用免疫グロブリンの製法において、 ａ）一般式（Ｉ） （式中、Ｒは炭素数１ないし20の直鎖状または分枝状の
    アルキレン基、 又は である）で表されるジカルボン酸ジスクシンイミジルエ
    ステルをカップリング剤として使用して、アミノ基で官
    能化された親水性ゲルにペプシンを不動化せしめ、 ｂ）得られた不動化ヘプシンを免疫グロブリンと共にイ
    ンキュベーションし、 ｃ）免疫グロブリンを回収し、凍結乾燥する、 ことを特徴とする、静注用免疫グロブリンの製法。
  2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、前記親水性ゲルが、アガロースゲル、デキストラン
    ゲル、セルロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、多孔
    シリカゲル、これらのアミノ化誘導体及び合成重合体ゲ
    ルの中から選ばれるものである、静注用免疫グロブリン
    の製法。
  3. 【請求項３】特許請求の範囲第２項記載の製法におい
    て、前記親水性ゲルのビーズ状のアガロースゲルであ
    る、静注用免疫グロブリンの製法。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、前記一般式（Ｉ）のジカルボン酸ジスクシンイミジ
    ルエステルをカップリング剤として使用するペプシンの
    不動化をpH5.0〜6.2の緩衝液中で行う、静注用免疫グロ
    ブリンの製法。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第４項記載の製法におい
    て、前記緩衝液がpH6.0〜6.2のリン酸塩緩衝液である、
    静注用免疫グロブリンの製法。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、前記一般式（Ｉ）のジカルボン酸ジスクシンイミジ
    ルエステルをカップリング剤として使用するペプシンの
    不動化を温度１〜10℃で行う、静注用免疫グロブリンの
    製法。
  7. 【請求項７】特許請求の範囲第６項記載の製法におい
    て、温度が２〜６℃である、静注用免疫グロブリンの製
    法。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、前記一般式（Ｉ）のＲが炭素数１〜10のアルキレン
    基である、静注用免疫グロブリンの製法。
  9. 【請求項９】特許請求の範囲第８項記載の製法におい
    て、Ｒが炭素数２〜６の直鎖状アルキレン基である、静
    注用免疫グロブリンの製法。
  10. 【請求項１０】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、ペプシンとのインキュベーションを温度34〜40℃、
    pH3.8〜4.3で行う、静注用免疫グロブリンの製法。
  11. 【請求項１１】特許請求の範囲第10項記載の製法におい
    て、pHが約４である、静注用免疫グロブリンの製法。
  12. 【請求項１２】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、前記ペプシンとインキュベーションを16〜22時間行
    う、静注用免疫グロブリンの製法。
  13. 【請求項１３】特許請求の範囲第１項記載の製法におい
    て、前記ペプシンとインキュベーションを、タンパク質
    濃度１〜５％（w/v）及び酵素活性600〜3000U/g（タン
    パク質）で行う、静注用免疫グロブリンの製法。
  14. 【請求項１４】特許請求の範囲第13項記載の製法におい
    て、タンパク質濃度が２〜３％（w/v）である、静注用
    免疫グロブリンの製法。
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