WO2015020159A1 - タンパク質及びその製造方法、並びにタンパク質活性評価方法 - Google Patents

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infrared absorption
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克生 鈴木
吉田　洋一
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宇部興産株式会社
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    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
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    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection

Definitions

  • the present invention relates to a protein, a production method thereof, and a protein activity evaluation method.
  • the present invention also relates to an immobilized lipase and a regenerated immobilized lipase, methods for producing them, and a lipase activity evaluation method.
  • the present invention further relates to an immobilized peroxidase, a method for producing the same, and a method for evaluating peroxidase activity.
  • the present invention further relates to an antibody, a production method thereof, and an antibody activity evaluation method.
  • Lipase see, for example, Patent Document 1
  • Lipase may not have sufficient catalytic activity depending on its preparation conditions, use in the reaction, etc., but the evaluation of the catalytic activity of the immobilized lipase actually involves transesterification and the like. And the activity is measured.
  • Non-Patent Document 1 discloses a structure analysis method for lipase immobilized on solid particles by circular dichroism (CD) method, diffuse reflection Fourier transform infrared spectroscopy (DRIFT) method, and tryptophan residue fluorescence method. Is described.
  • Non-Patent Document 2 describes the catalytic, enzymatic and physical stability of Novozym® 435 in terms of raw materials, the presence or absence of moisture, and contact with biodiesel in biodiesel production using enzymes. It has been described that the effect on the environment was analyzed.
  • Non-Patent Document 3 describes that the influence of pretreatment with an organic solvent on the initial activity and secondary structure of immobilized lipase derived from Pseudomonas cepacia is analyzed.
  • proteins are widely used as catalysts for industrial processes and as pharmaceuticals. Decreasing the activity of a protein leads to a decrease in the efficiency of the entire process, a decrease in therapeutic effect, etc., so it is extremely important to evaluate the activity and provide a protein with sufficient activity.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 describe the relationship between the higher-order structure of the lipase of the immobilized lipase and the catalytic activity.
  • Novozym registered trademark
  • 435 manufactured by Novozyme
  • Non-patent document 2 describes that although it is not quantitative data, lipase whose activity is reduced by use in the reaction has decreased ⁇ -helix and increased ⁇ -sheet.
  • Non-Patent Document 3 describes that the structure of ⁇ -helix and ⁇ -sheet is changed by treatment with an organic solvent. However, contrary to Non-Patent Document 2, the activity is increased with the structural change. It is described that it has improved.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 describes or suggests technical means for distinguishing reversible denaturation from irreversible denaturation.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a protein production method capable of obtaining a protein having sufficient activity and a protein obtained by the production method. Another object of the present invention is to provide a protein activity evaluation method that can evaluate the activity of a protein without actually measuring the activity.
  • the present inventors approximated an infrared absorption band of a specific wave number in the infrared absorption spectrum of a protein with a normal distribution, and an index value indicating the degree of spread of the infrared absorption band calculated based on the normal distribution, It was found to reflect the activity of the protein or the potential activity of the protein. That is, it has been found that a protein having sufficient activity can be obtained by selecting a protein based on the index value.
  • the present invention is based on this novel finding.
  • the present invention is, in the infrared absorption spectrum of the protein, (also referred to herein as "absorption band II".) 1500 ⁇ 1600 cm-infrared absorption band derived proteins appearing in the vicinity of -1 or 1600 ⁇ 1700 cm -1 A step of approximating a protein-derived infrared absorption band (also referred to herein as “absorption band I”) appearing in the vicinity to one or more normal distributions, and the infrared absorption band based on the normal distribution A step of calculating an index value indicating a degree of spread of the sample, a step of comparing the index value with a preset threshold value, and selecting a protein having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value as a non-defective product; It is related with the manufacturing method of the said protein provided with the test process containing these.
  • an active protein can be produced because it comprises the above-described inspection step. Moreover, since reversible denaturation and irreversible denaturation of protein activity can be distinguished, a protein capable of regenerating activity can be obtained.
  • the index value may be a half width of the normal distribution when the infrared absorption band is approximated by a single normal distribution. Since the half-value width correlates with the degree of spread of the infrared absorption band, it is possible to select an active protein or a protein that can regenerate the activity using the half-value width as an index value.
  • the index value is obtained by waveform-separating the infrared absorption band into a plurality of normal distributions, and summing the areas of one or more normal distributions near the peak top position of the infrared absorption band as the end of the infrared absorption band. It may be a value (also referred to as “absorption band area ratio” in this specification) divided by the sum of the areas of one or more normal distributions in the vicinity. Since the absorption band area ratio correlates with the degree of spread of the infrared absorption band, it is possible to select an active protein or a protein capable of regenerating activity using the absorption band area ratio as an index value.
  • the absorption band area ratio is obtained by separating the waveform of the infrared absorption band into two normal distributions each having a vertex near the peak top position of the infrared absorption band and having different half-value widths. It may be a value obtained by dividing the area of the normal distribution having the smaller half-value width among the two normal distributions by the area of the normal distribution having the larger half-value width.
  • the infrared absorption spectrum is preferably measured by an attenuated total reflection method. Thereby, protein selection by the said index value can be performed more accurately.
  • the present invention also provides a protein obtained by the above protein production method. Since the protein of the present invention is obtained by the above production method, it has activity or can regenerate sufficient activity.
  • the present invention relates to a method for producing an immobilized lipase in which a lipase is immobilized on a resin carrier, and an infrared absorption band derived from lipase that appears in the vicinity of 1500 to 1600 cm ⁇ 1 in the infrared absorption spectrum of the immobilized lipase (A step of approximating an absorption band II) or a lipase-derived infrared absorption band (absorption band I) appearing in the vicinity of 1600-1700 cm ⁇ 1 to one or more normal distributions, and the infrared absorption band based on the normal distribution A step of calculating an index value indicating a degree of spread of the light, and comparing the index value with a preset threshold value, and selecting an immobilized lipase having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value as a non-defective product And a manufacturing method comprising an inspection process including steps.
  • the method includes a step of comparing the calculated index value with a threshold and selecting an immobilized lipase having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold. Therefore, an immobilized lipase having catalytic activity or capable of regenerating the catalytic activity can be obtained.
  • the index value is a half width of the normal distribution when the absorption band I is approximated by a single normal distribution (also referred to as “index value 1” in the present specification).
  • an immobilized lipase having the index value of 70 cm ⁇ 1 or less may be selected as a non-defective product.
  • the index value is such that the absolute value of the difference between the absorption band I and the difference between the area of the absorption band I and the area of two normal distributions is minimized. 1 (peak position 1656 cm -1, the half width 47cm -1), a 2 (peak position 1656 cm -1, the half width 82cm -1) and waveform separation into two normal distribution, the area a 1 in the area of a 2
  • an immobilized lipase having an index value of 0.27 or more may be selected as a non-defective product, which is a divided value (also referred to as “index value 2” in the present specification).
  • the index value is such that the absolute value of the difference between the absorption band I, the difference between the area of the absorption band I and the area of the three normal distributions is minimized.
  • 1 three normal (peak position 1680 cm -1, the half width 50cm -1), a 2 (peak position 1656 cm -1, the half width 50 cm -1) and a 3 (peak position 1631cm -1, the half width 50 cm -1) This is a value obtained by separating the waveform into a distribution and dividing the area of A 2 by the sum of the areas of A 1 and A 3 (also referred to as “index value 3” in the present specification).
  • An immobilized lipase having a value of 0.9 or more may be selected as a good product.
  • the index value is such that the absolute value of the difference between the absorption band I, the area of the absorption band I, and the sum of the areas of the five normal distributions is minimized.
  • 1 peak position 1685 cm -1, the half width 30cm -1
  • a 2 peak position 1670 cm -1, the half width 30cm -1
  • a 3 peak position 1656 cm -1, the half width 30cm -1
  • a 4 peak position 1641cm -1, the half width 30 cm -1) and a 5 (peak position 1626cm -1, and waveform separation into five normal distribution half width 30 cm -1
  • the index value is such that the absolute value of the difference between the absorption band I, the area of the absorption band I, and the sum of the areas of the eight normal distributions is minimized.
  • 1 peak position 1692cm -1, the half width 19cm -1
  • a 2 peak position 1682 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 3 peak position 1670 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 4 peak position 1658 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 5 peak position 1648 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 6 peak position 1638 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 7 peak position 1629cm -1, the half width 19cm -1) and a 8 (peak position 1619cm -1, and waveform separation into eight normal distribution half width 19cm -1
  • the index value is such that the absolute value of the difference between the absorption band I, the area of the absorption band I, and the sum of the areas of the eight normal distributions is minimized.
  • 1 peak position 1692cm -1, the half width 19cm -1
  • a 2 peak position 1682 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 3 peak position 1670 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 4 peak position 1658 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 5 peak position 1648 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 6 peak position 1638 cm -1, the half width 19cm -1
  • a 7 peak position 1629cm -1, the half width 19cm -1) and a 8 (peak position 1619cm -1, and waveform separation into eight normal distribution half width 19cm -1
  • a 4 ⁇ Fine A A 2 the sum of the areas of 5, A 3 and divided by
  • the above-mentioned index value is also referred to as the half width of the normal distribution when the absorption band II is approximated by a single normal distribution (also referred to as “index value 7” in the present specification).
  • an immobilized lipase having an index value of 44 cm ⁇ 1 or less may be selected as a non-defective product.
  • the index value is such that the absolute value of the difference between the absorption band II and the difference between the area of the absorption band II and the sum of the areas of the three normal distributions is minimized.
  • 1 peak position 1570 cm -1, the half width 31cm -1
  • B 2 peak position 1545 cm -1, the half width 31cm -1) 3 single regular
  • B 3 peak position 1518cm -1, the half width 31cm -1)
  • This is a value obtained by separating the waveform into a distribution and dividing the area of B 2 by the sum of the areas of B 1 and B 3 (also referred to as “index value 8” in the present specification).
  • An immobilized lipase having a value of 1.2 or more may be selected as a good product.
  • the above immobilized lipase may have transesterification activity or ester hydrolysis activity.
  • the infrared absorption spectrum is preferably measured by an attenuated total reflection method. Thereby, selection of the immobilized lipase by the said index value can be performed more accurately.
  • the lipase may be a lipase derived from Burkholderia cepacia or Candida antarctica.
  • the present invention also provides an immobilized lipase obtained by the above-described method for producing an immobilized lipase. Since the immobilized lipase of the present invention is obtained by the above production method, it has catalytic activity or can regenerate sufficient catalytic activity.
  • the present invention relates to a method for producing an immobilized peroxidase in which peroxidase is immobilized on a silica carrier, and an infrared absorption band derived from peroxidase appearing in the vicinity of 1500-1600 cm ⁇ 1 in the infrared absorption spectrum of the immobilized peroxidase (A step of approximating an absorption band II) or a peroxidase-derived infrared absorption band (absorption band I) appearing in the vicinity of 1600-1700 cm ⁇ 1 to one or more normal distributions, and the infrared absorption band based on the normal distribution A step of calculating an index value indicating the degree of spread of the light, and comparing the index value with a preset threshold value, and selecting an immobilized peroxidase having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value as a non-defective product
  • a manufacturing method comprising an inspection process including steps
  • an immobilized peroxidase of the present invention there is a step of comparing the calculated index value with a threshold and selecting an immobilized peroxidase having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold. Therefore, an immobilized lipase having catalytic activity or capable of regenerating the catalytic activity can be obtained.
  • the index value is an index value of 7, and in the selecting step, an immobilized peroxidase having the index value of 75 cm ⁇ 1 or less may be selected as a good product.
  • the index value is the index value 8
  • the immobilized peroxidase having the index value of 0.45 or more may be selected as a good product.
  • the infrared absorption spectrum is preferably measured by an attenuated total reflection method. Thereby, the selection of the immobilized peroxidase based on the index value can be performed with higher accuracy.
  • the present invention also provides an immobilized peroxidase obtained by the method for producing an immobilized peroxidase. Since the immobilized peroxidase of the present invention is obtained by the above production method, it has a catalytic activity or can regenerate a sufficient catalytic activity.
  • the present invention in the infrared absorption spectrum of the antibody, 1500 ⁇ 1600 cm -1 for the antibody from appearing in the vicinity of the infrared absorption band (absorption band II) or 1600 ⁇ 1700 cm antibodies from appearing in the vicinity of -1 infrared absorption bands (absorption Band I) is approximated to one or a plurality of normal distributions, an index value indicating a degree of spread of the infrared absorption band based on the normal distribution, and the index value is preset. And a step of selecting, as a non-defective product, an antibody having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value.
  • the method for producing an antibody of the present invention there is a step of comparing the calculated index value with a threshold value and selecting an antibody whose degree of spread of the infrared absorption band is smaller than the threshold value. A titered antibody can be obtained.
  • the index value is index value 1
  • an antibody having the index value of 65 cm ⁇ 1 or less may be selected as a good product.
  • the index value is the index value 6, and in the selecting step, an antibody having the index value of 0.98 or more may be selected as a good product.
  • the index value is the index value 8
  • an antibody having the index value of 0.85 or more may be selected as a good product.
  • the infrared absorption spectrum is preferably measured by an attenuated total reflection method. As a result, it is possible to more accurately select antibodies based on the index values.
  • the present invention also provides an antibody obtained by the above antibody production method. Since the antibody of the present invention is obtained by the above production method, it has a sufficient titer.
  • the present invention is also a production method for producing a regenerated immobilized lipase in which a part or all of the lipase activity is regenerated from an immobilized lipase with reduced lipase activity, wherein the immobilized lipase is immobilized on a resin carrier.
  • the lipase-derived infrared absorption band (absorption band II) appearing in the vicinity of 1500 to 1600 cm ⁇ 1 or the vicinity of 1600 to 1700 cm ⁇ 1 The infrared absorption band (absorption band I) derived from lipase appearing in 1 is approximated to one or a plurality of normal distributions, and an index value indicating the degree of spread of the infrared absorption band is calculated based on the normal distribution. Step and comparing the index value with a preset threshold value, and the degree of spread of the infrared absorption band above the threshold value.
  • the method comprises a step of comparing the calculated index value with a threshold and selecting an immobilized lipase having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold. Therefore, among the immobilized lipases having reduced lipase activity, those having reversible denaturation can be selected. That is, an immobilized lipase that can regenerate sufficient catalytic activity can be obtained.
  • the index value is index value 1
  • the lipase activity may regenerate the immobilized lipase having the index value of 70 cm ⁇ 1 or less. You may select as something.
  • the index value is index value 2
  • the lipase activity regenerates the immobilized lipase having the index value of 0.27 or more. You may select as something.
  • the index value is index value 3, and in the selection step, there is a possibility that the lipase activity regenerates the immobilized lipase having the index value of 0.9 or more. You may select as something.
  • the index value is index value 4, and in the selection step, there is a possibility that the lipase activity regenerates the immobilized lipase having the index value of 0.35 or more. You may select as something.
  • the index value is an index value of 5
  • the lipase activity regenerates the immobilized lipase having the index value of 0.6 or more. You may select as something.
  • the index value is the index value 6, and in the selection step, the lipase activity may regenerate the immobilized lipase having the index value of 1.2 or more. You may select as something.
  • the index value is index value 7
  • the lipase activity regenerates the immobilized lipase having the index value of 44 cm ⁇ 1 or less. You may select as something.
  • the index value is index value 8
  • the lipase activity regenerates the immobilized lipase having the index value of 1.2 or more. You may select as something.
  • the production method of the regenerated immobilized lipase may include a regenerating step of treating the immobilized lipase selected in the selecting step with water or a water-containing organic solvent.
  • the immobilized lipase selected in the selection step can regenerate lipase activity through the regeneration step.
  • the above immobilized lipase may have transesterification activity or ester hydrolysis activity.
  • the infrared absorption spectrum is preferably measured by an attenuated total reflection method. Thereby, selection of the immobilized lipase by the said index value can be performed more accurately.
  • the lipase may be a lipase derived from Burkholderia cepacia or Candida antarctica.
  • the present invention also provides a regeneratively immobilized lipase obtained by the method for producing a regeneratively immobilized lipase. Since the regenerated and immobilized lipase of the present invention is obtained by the above production method, it has a sufficient catalytic activity or can regenerate a sufficient catalytic activity.
  • the present invention in the infrared absorption spectrum of a protein, 1500 ⁇ 1600 cm -1 infrared absorption bands derived proteins appearing in the vicinity (absorption band II) or 1600 ⁇ 1700 cm-derived protein appearing in the vicinity of -1 infrared absorption bands (absorption Band I) is approximated to one or a plurality of normal distributions, an index value indicating a degree of spread of the infrared absorption band based on the normal distribution, and the index value is preset. It can also be referred to as a protein activity evaluation method comprising an evaluation step including a step of evaluating a protein having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value as compared with the threshold value as an active protein.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the lipase activity of an immobilized lipase obtained by immobilizing a lipase on a resin carrier, the infrared from the lipase appearing in the vicinity of 1500-1600 cm ⁇ 1 in the infrared absorption spectrum of the immobilized lipase.
  • An absorption band (absorption band II) or a lipase-derived infrared absorption band (absorption band I) appearing in the vicinity of 1600-1700 cm ⁇ 1 is approximated to one or a plurality of normal distributions, and the red based on the normal distribution
  • the present invention further relates to a method for evaluating the peroxidase activity of an immobilized peroxidase obtained by immobilizing a peroxidase on a silica carrier, and the infrared spectrum derived from peroxidase that appears in the vicinity of 1500-1600 cm ⁇ 1 in the infrared absorption spectrum of the immobilized peroxidase.
  • An absorption band (absorption band II) or an infrared absorption band (absorption band I) derived from peroxidase appearing in the vicinity of 1600-1700 cm ⁇ 1 is approximated to one or a plurality of normal distributions, and the red color is based on the normal distribution.
  • a step of calculating an index value indicating the degree of spread of the outer absorption band, and comparing the index value with a preset threshold value, an immobilized peroxidase having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value, Immobilized peroxidase with peroxidase activity Comprising an evaluation step including the steps of assessing a, it can be said that peroxidase activity evaluation method.
  • the present invention further provides an antibody-derived infrared absorption band (absorption band II) appearing in the vicinity of 1500-1600 cm ⁇ 1 or an antibody-derived infrared absorption band appearing near 1600-1700 cm ⁇ 1 in the infrared absorption spectrum of the antibody.
  • (Absorption band I) is approximated to one or a plurality of normal distributions, an index value indicating the degree of spread of the infrared absorption band based on the normal distribution, and the index values are preset. It can also be referred to as an antibody activity evaluation method comprising an evaluation step including a step of evaluating an antibody having a degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value as an active antibody.
  • the present invention also relates to a method for producing a compound produced through a catalytic reaction with lipase using the immobilized lipase of the present invention or the regenerated immobilized lipase. Since the above-mentioned immobilized lipase or regenerated immobilized lipase has sufficient catalytic activity or can regenerate sufficient catalytic activity, the production efficiency of the compound is improved.
  • the above compound may be produced through a transesterification reaction or an ester hydrolysis reaction. Further, the compound may be a polycarbonate diol (meth) acrylate compound.
  • the present invention it is possible to provide a protein production method capable of obtaining a protein having sufficient activity and a protein obtained by the production method.
  • a protein activity evaluation method capable of evaluating protein activity without actually performing activity measurement.
  • an immobilized lipase having sufficient catalytic activity, and to obtain the immobilized lipase by the production method.
  • An immobilized lipase can be provided.
  • a method for producing a regenerative immobilized lipase that can distinguish reversible and irreversible denaturation of catalytic activity and can obtain a regenerated immobilized lipase having sufficient catalytic activity, and the production thereof.
  • a regenerated immobilized lipase obtained by the method can be provided.
  • lipase activity that can identify an immobilized lipase having lipase activity, or an immobilized lipase that may regenerate part or all of the lipase activity, without actually measuring the activity.
  • An evaluation method can be provided.
  • the immobilized lipase or the regenerated immobilized lipase of the present invention has a sufficient catalytic activity or can regenerate a sufficient catalytic activity, and thus is suitably used for the production of a compound produced through a catalytic reaction with a lipase. It is done.
  • a method for evaluating peroxidase activity that can identify immobilized peroxidase having peroxidase activity, or immobilized peroxidase that may be able to regenerate part or all of peroxidase activity, without actually measuring activity. Can provide.
  • an antibody production method capable of obtaining an antibody having a sufficient titer and an antibody obtained by the production method can be provided.
  • an antibody activity evaluation method capable of evaluating antibody titer without actually performing activity measurement.
  • the method for producing a protein according to this embodiment includes at least an inspection process.
  • the inspection step includes an infrared absorption band (absorption band II) derived from a protein appearing in the vicinity of 1500 to 1600 cm ⁇ 1 or an infrared absorption band derived from a protein appearing in the vicinity of 1600 to 1700 cm ⁇ 1 ( A step of approximating the absorption band I) to one or a plurality of normal distributions, a step of calculating an index value indicating the degree of spread of the infrared absorption band based on the normal distribution, and a threshold value for which the index value is set in advance And a step of selecting, as a non-defective product, a protein having a degree of spread of an infrared absorption band smaller than a threshold value.
  • the protein produced by the protein production method according to the present embodiment is not particularly limited, and may be any protein.
  • a protein that is active in the inspection process or a protein that can regenerate the activity can be selected. Therefore, the produced protein is a functional protein.
  • the functional protein means a protein having activity when it has not undergone denaturation or the like.
  • “activity” includes catalytic activity, binding activity with a receptor, etc., antibody titer, and the like.
  • active proteins include enzymes that are catalytically active proteins such as lipase, peroxidase, and protease, proteins that have binding activity with receptors such as interferons, erythropoietin, and insulin, and antibodies. be able to.
  • the protein to be produced may be a protein supported on a carrier.
  • carrier refers to a resin carrier (for example, an ion exchange resin) and an inorganic carrier (for example, a silica carrier) capable of holding proteins by adsorption, a bulking agent mixed with protein, Includes solvents and solutes in protein solutions.
  • the index value according to the present embodiment indicates the degree of spread of the absorption band I or the absorption band II.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram for explaining a method of calculating an index value (here, an absorption band area ratio). The index value calculation method will be described below with reference to FIG. The following calculation method is merely an example, and various modifications are possible.
  • the infrared absorption spectrum of the protein is measured.
  • an infrared absorption spectrum is also measured for the carrier itself.
  • the infrared absorption spectrum of the carrier itself may be measured in advance.
  • the infrared absorption spectrum measurement method is preferably a transmission method, a diffuse reflection method, or an attenuated total reflection method (ATR method).
  • the ATR method is more preferable from the viewpoint of measuring an absorption spectrum derived from a trace amount of protein with high sensitivity.
  • FIG. 1 (A) shows an infrared absorption spectrum in the case of using immobilized lipase (Novozym (registered trademark) 435 in which CalB is supported on Lewatit (registered trademark) VP OC 1600) as a protein supported on a carrier, and The infrared absorption spectrum of the resin carrier (Lewatit (registered trademark) VP OC 1600) itself is shown.
  • the difference spectrum between the two becomes an infrared absorption spectrum derived from protein (lipase).
  • an infrared absorption spectrum derived from the carrier is simulated. That is, the carrier-derived infrared absorption spectrum is approximated by a normal distribution so that it can be used as the background spectrum of the infrared absorption spectrum of the protein supported on the carrier measured individually. Specifically, in the infrared absorption spectrum of the protein carried on the carrier measured individually by changing the intensity, the infrared absorption spectrum derived from the carrier is fitted.
  • FIG. 1B shows an example of simulation of an infrared absorption spectrum derived from a carrier.
  • FIG. 1C shows an example of calculation of the difference spectrum.
  • the difference spectrum can be calculated using, for example, a Gaussian function and spreadsheet software (for example, Microsoft Excel; manufactured by Microsoft).
  • the absorption band I or II is approximated by one or more normal distributions.
  • Approximation of the difference spectrum with a single normal distribution can be performed by, for example, a nonlinear least square method.
  • the nonlinear least square method can be performed using, for example, a peak position, a half width, and an intensity as variables using a Solver function of spreadsheet software (for example, Microsoft Excel; manufactured by Microsoft Corporation).
  • the index value when approximated by a single normal distribution can be, for example, the half-value width (unit: cm ⁇ 1 ) of the normal distribution. In this case, as the index value (half-value width) decreases, the degree of spread of the infrared absorption band decreases.
  • the approximation of the difference spectrum with a plurality of normal distributions can be performed, for example, by separating waveforms into a plurality of normal distributions.
  • Waveform separation can be performed using, for example, a Gaussian function and spreadsheet software (for example, Microsoft Excel; manufactured by Microsoft).
  • Waveform separation can be performed by calculating so that the residual sum of squares of the sum of the areas of A 1 to An and the area of the absorption band of the difference spectrum is minimized by the non-linear least square method.
  • Band position of the wave number of the A 1 ⁇ A n may be specified at regular intervals, it may be specified at different intervals. It is also possible to specify the band positions of the same wave number in at least two of A 1 ⁇ A n.
  • n is not particularly limited, and may be set as appropriate according to the purpose.
  • n is preferably 2 to 20, and more preferably 2, 3, 5 or 8.
  • the infrared spectrum derived from a protein (lipase) appearing in the vicinity of 1600-1700 cm ⁇ 1 using the difference spectrum is represented by A 1 , A 2 , A 3 , A 4 , A 5 , A 6 , A 7.
  • a 8 (collectively referred to as A 1 to A 8 collectively) are separated into eight normal distributions.
  • a 1 to A 8 are eight normal distributions having peak positions adjacent to each other at intervals of about 10 cm ⁇ 1 and having a half width of about 19 cm ⁇ 1 .
  • waveform separation is performed so that the sum of the areas A 1 to A 8 (the sum of the waveform separation components) becomes as equal as possible to the area of the absorption band of the difference spectrum.
  • FIG. 1D shows an example of waveform separation.
  • a 1 to A 8 are wave number band positions of 1692 cm ⁇ 1 (A 1 ), 1682 cm ⁇ 1 (A 2 ), 1670 cm ⁇ 1 (A 3 ) as initial values of Gaussian functions used for fitting. ), 1658 cm ⁇ 1 (A 4 ), 1648 cm ⁇ 1 (A 5 ), 1638 cm ⁇ 1 (A 6 ), 1629 cm ⁇ 1 (A 7 ) and 1619 cm ⁇ 1 (A 8 ), and half of each The value range is 19 cm ⁇ 1 .
  • the index value when the infrared absorption band is separated into two normal distributions is, for example, an infrared absorption band, each having an apex near the peak top position of the infrared absorption band, and different half-value widths. Can be divided into two normal distributions having the half-width, and the area of the normal distribution with the smaller half-value width of the two normal distributions divided by the area of the normal distribution with the larger half-value width.
  • the band positions of the wave numbers of the two normal distributions may be the same. In this case, the greater the index value, the smaller the extent of the infrared absorption band.
  • the index value when approximated by a plurality of (three or more) normal distributions is, for example, the sum of the areas of one or a plurality of normal distributions near the peak top position of the infrared absorption band, and 1 near the end of the infrared absorption band. Or it can be set to a value (absorption band area ratio) divided by the sum of the areas of a plurality of normal distributions. In this case, the greater the index value, the smaller the extent of the infrared absorption band.
  • n is an integer of 3 or more
  • an index value as follows.
  • n is an even number
  • the sum of the areas of at least one or both of A n / 2 and A n / 2 + 1 is selected from the group consisting of A 1 to A n / 2-1 and A n / 2 + 2 to A n
  • the index value is a value obtained by dividing the sum of at least one area.
  • n is an odd number
  • the value divided by the sum of the two areas is taken as the index value.
  • the index value can be A 2 / (A 1 + A 3 ).
  • the index value may be A 3 / (A 1 + A 2 + A 3 + A 4 ), A 3 / (A 1 + A 4 ), or A 3 / (A 1 + A 3 + A 4 ) or A 3 / (A 1 + A 2 + A 4 ).
  • the index value calculated in (ii) above is, for example, at least selected from the group consisting of A (n + 1) / 2-1 to A (n-1) / 2 + 2 also one of the sum of the areas is a value obtained by dividing the sum of the a 1 ⁇ a (n + 1 ) / 2-2 , and a (n-1) / 2 + 3 ⁇ at least one area selected from the group consisting of a n Good.
  • the index value may be (A 4 + A 5 ) / (A 2 + A 3 + A 8 ), or (A 4 + A 5 ) / (A 1 + A 2 + A 3 + A 6 + A 7 + A). 8 ).
  • the index value calculated in (i) above is, for example, the sum of at least one area selected from the group consisting of A n / 2-1 to A n / 2 + 2.
  • a 1 ⁇ a n / 2-2 and a n / 2 + 3 ⁇ is selected from the group consisting of a n may be a value obtained by dividing the sum of at least one area.
  • the threshold for selecting whether or not a protein is a good product may be appropriately set according to the type of protein to be produced, the level of activity required for the protein to be produced, and the like. Since the index value calculated as described above has a correlation that can be linearly approximated with the activity of the protein or the potential activity of the protein, the threshold value is set according to the level of activity required for the protein to be produced. Can be set. In order to determine the threshold value, it is preferable to analyze the correlation between the index value and the activity in advance for the protein to be produced.
  • the threshold will be described.
  • the index value is (A 4 + A 5 ) / (A 2 + A 3 + A 8 )
  • the index value is 1.2 (threshold) or more.
  • An immobilized lipase can be evaluated as an immobilized lipase having lipase activity, or an immobilized lipase that may be able to regenerate part or all of the lipase activity.
  • the threshold value may be 1.3, 1.4, or 1.5.
  • the index value is usually about 5.0 at most.
  • the index value calculation method described above does not depend on the type of protein. That is, even if the protein is, for example, lipase, peroxidase, antibody or the like, the index value can be calculated in the same manner.
  • the protein production method according to the present embodiment may include a protein synthesis step in addition to the above-described inspection step.
  • a known technique can be used for protein synthesis. For example, proteins expressed by culturing or rearing yeast, filamentous fungi, animal cells, animals, etc. that are recombinant so that the DNA encoding the protein can be expressed, and expressed from cell disruptions, culture media, animal milk, etc. By recovering (purifying) the protein, the protein can be synthesized.
  • the protein obtained by the method for producing a protein according to the present embodiment has undergone the above-described inspection process, it has sufficient activity or can regenerate sufficient activity, and is suitable for industrial use, pharmaceutical use, etc. Can be used for
  • the protein activity evaluation method includes a step of approximating absorption band I or absorption band II to one or more normal distributions in an infrared absorption spectrum of a protein, and an infrared absorption band based on the normal distribution.
  • an evaluation process including:
  • index value and the threshold value in the protein activity evaluation method according to this embodiment are the same as those described in the method for producing an immobilized lipase.
  • the immobilized lipase means a lipase supported on a resin carrier by adsorption or the like.
  • the lipase may be an enzyme that catalyzes a hydrolysis reaction of an ester bond. Moreover, it is preferable that it is an enzyme which catalyzes ester synthesis reaction.
  • a cutinase derived from Cryptococcus sp a lipase derived from Burkholderia cepacia (for example, Amano PS (manufactured by Amano Enzyme)), Candida antarctica (Candida) lipase from Antarctica (for example, Novozym 435 (manufactured by Novozyme)), lipase from Rhizomucor Miehei (for example, Thermomyces lanuginosus Lance from the company, Thermomyces lanpense Lancese) ), A lipase derived from Mucor Miehei.
  • the above-mentioned lipase may be obtained from a gene recombinant culture obtained by obtaining a gene encoding lipase from the microorganism, transforming a suitable host such as yeast or filamentous fungus, and the like.
  • a suitable host such as yeast or filamentous fungus, and the like.
  • Recombinant DNA techniques used for recombinant expression of lipases are known in the art.
  • the lipase may be a mutant of the above microorganism-derived lipase.
  • it may be a lipase in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the above-mentioned lipase derived from microorganisms and have at least an ester bond hydrolysis activity.
  • the lipase has a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more with respect to the lipase derived from the microorganism, and has at least an ester bond hydrolysis activity. Good.
  • the resin carrier is preferably a porous porous resin carrier from the viewpoint that the adsorption amount of lipase can be increased by having a large surface area.
  • the resin carrier include ion exchange resins, hydrophobic adsorption resins, chelate resins, and organic polymers such as synthetic adsorption resins.
  • a hydrophobic adsorption resin is preferable from the viewpoint of particularly high enzyme adsorptive power.
  • a resin carrier widely used for immobilizing enzymes can be used.
  • resin carrier a resin carrier widely used for immobilizing enzymes.
  • Specific examples include polystyrene, polyacrylic acid ester, polypropylene, polyethylene, and polyamide. These may be copolymers or may be cross-linked.
  • polystyrene-copolymers poly- (meth) acrylic acid esters (for example, polymethyl methacrylate crosslinked with divinylbenzene) are preferable.
  • These resin carriers are macroporous and typically have a most frequent pore size of about 5 to 20 nm and a total surface area of 50 to 1000 m 2 / g (by nitrogen adsorption method).
  • hydrophobic adsorption resins may be used. Specifically, for example, Rewatit (Lewatit (registered trademark)) VP OC 1600 (manufactured by LANXESS, Germany), Amberlite (Amberlite (registered trademark)) XAD-7HP (manufactured by Organo, Japan), Diaion HP20 ( Mitsubishi Chemical, Japan).
  • the lipase can be immobilized on the resin carrier by, for example, a carrier binding method by covalent bond, ionic bond, physical adsorption or the like, a comprehensive method in which the lipase is immobilized on a resin lattice having a network structure.
  • a carrier binding method by covalent bond, ionic bond, physical adsorption or the like a comprehensive method in which the lipase is immobilized on a resin lattice having a network structure.
  • the carrier binding method by physical adsorption is preferable because it is simple.
  • Immobilization by physical adsorption can be performed, for example, by bringing an aqueous solution of lipase into contact with a resin carrier.
  • the immobilized lipase formed by adsorbing the lipase to the resin carrier may be separated from the aqueous phase, and then the separated immobilized lipase may be washed and further dried to an appropriate moisture content.
  • the temperature and pH at the time of immobilization by physical adsorption may be appropriately set according to the type of lipase to be immobilized.
  • Many lipases can be immobilized, for example, at room temperature and near neutral pH.
  • the contact time between the resin carrier and the lipase is usually chosen such that it is required for essentially complete adsorption. This is typically 1-2 hours to 24 hours.
  • the immobilized lipase When the immobilized lipase is used for continuous transesterification in a fixed bed column, the immobilized lipase is preferably spherical and has a uniform particle size.
  • the particle diameter is preferably 100 to 5000 ⁇ m, more preferably 300 to 1000 ⁇ m.
  • the method for producing an immobilized lipase includes a step of approximating the absorption band I or the absorption band II to one or more normal distributions in the infrared absorption spectrum of the immobilized lipase, and based on the normal distribution.
  • an inspection process including the steps of:
  • the immobilized lipase having an index value of 70 cm ⁇ 1 (threshold) or less is preferably selected as a good product. More preferably, the threshold value is 65 cm ⁇ 1 .
  • the index value is usually about 55 cm ⁇ 1 even if it is small.
  • the immobilized lipase having an index value of 0.27 (threshold) or more is preferably selected as a non-defective product.
  • the threshold is more preferably 0.49.
  • the index value is usually about 1.00 at most.
  • the immobilized lipase having an index value of 0.9 (threshold) or more is preferably selected as a non-defective product.
  • the threshold is more preferably 1.5.
  • the index value is usually about 1.9 at most.
  • the immobilized lipase having an index value of 0.35 (threshold) or more is preferably selected as a non-defective product.
  • the threshold is more preferably 0.40.
  • the index value is usually about 0.49 at most.
  • the index value is an index value 5
  • the threshold is more preferably 0.65.
  • the index value is usually about 0.70 at most.
  • the index value is an index value 6
  • the threshold is more preferably 1.3.
  • the index value is usually about 1.4 at most.
  • the immobilized lipase having an index value of 44 cm ⁇ 1 (threshold) or less is preferably selected as a good product. More preferably, the threshold is 40 cm ⁇ 1 .
  • the index value is usually about 35 cm ⁇ 1 even if it is small.
  • the immobilized lipase having an index value of 1.2 (threshold) or more is preferably selected as a non-defective product.
  • the threshold is more preferably 1.5.
  • the index value is usually about 1.7 at most.
  • the method for producing an immobilized lipase may include a step of obtaining an immobilized lipase in which a lipase is supported on a resin carrier according to a conventional method.
  • the immobilized lipases obtained by this step those having low catalytic activity due to irreversible or reversible denaturation may be included, but irreversible denaturation and reversible denaturation can be distinguished through the above-described inspection step. It becomes possible.
  • the catalyst activity is apparently low, but the catalyst activity can be regenerated by adjusting the water content, for example.
  • the method for producing a regeneratively immobilized lipase is a method for producing a regeneratively immobilized lipase in which a part or all of the lipase activity is regenerated from an immobilized lipase with reduced lipase activity.
  • the production method includes a step of approximating the absorption band I or the absorption band II to one or more normal distributions, and the infrared spectrum based on the normal distribution.
  • index value and the threshold value in the method for producing a regenerated immobilized lipase according to the present embodiment are the same as those described in the method for producing an immobilized lipase.
  • the immobilized lipase selected in the selection step can regenerate the catalytic activity by adjusting the water content.
  • the production method of the above-mentioned regenerated and immobilized lipase may include a regeneration step of treating the immobilized lipase selected in the selection step and having reduced lipase activity with water or a water-containing organic solvent.
  • the immobilized lipase can be adjusted to an appropriate moisture content, and the lipase activity is regenerated.
  • the reason why the lipase activity can be regenerated is that a substance having a degree of spreading of the infrared absorption band smaller than the threshold value is selected in the selection process.
  • the water ultrapure water, distilled water, ion exchange water, tap water, industrial water, or the like can be used. Among these, ion exchange water and distilled water are preferably used from the viewpoint of avoiding contamination with inorganic salts.
  • the water-containing organic solvent an organic solvent such as acetone, ethanol, acetonitrile, 1-butanol or the like containing the above water can be used.
  • the water content of the water-containing organic solvent varies depending on the type of the organic solvent. For example, when acetone is used as the organic solvent, it can be 1.0% or more.
  • the regeneration step can be performed, for example, by bringing the immobilized lipase selected in the selection step into contact with water or a water-containing organic solvent.
  • the contact can be performed, for example, within a temperature range of ⁇ 10 to 50 ° C. and within a range of 0.5 to 48 hours by appropriately setting the water content of the immobilized lipase as an index.
  • the moisture content of the immobilized lipase serving as an index varies depending on the type and amount of lipase, the type of resin carrier, etc. For example, when the immobilized lipase is 3.4 wt% Amano PS / Lewatit, the moisture content is 5% or more. In the case of Novozym (registered trademark) 435, the water content is 0.05% or more.
  • the method for evaluating the lipase activity of immobilized lipase includes a step of approximating absorption band I or absorption band II to one or a plurality of normal distributions in the infrared absorption spectrum of the immobilized lipase; A step of calculating an index value indicating a degree of spread of the infrared absorption band based on the reference value, comparing the index value with a preset threshold value, and fixing the degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value; Evaluating the immobilized lipase as an immobilized lipase having lipase activity, or evaluating it as an immobilized lipase capable of regenerating part or all of the lipase activity.
  • index value and the threshold value in the lipase activity evaluation method for immobilized lipase according to this embodiment are the same as those described in the method for producing immobilized lipase.
  • the method for producing a compound according to this embodiment is characterized by using an immobilized lipase obtained by the method for producing an immobilized lipase, or a regenerated immobilized lipase obtained by the method for producing the regenerated immobilized lipase.
  • the said compound is a compound manufactured through the catalytic reaction by lipase.
  • the compound is preferably produced through an ester exchange reaction or an ester hydrolysis reaction, and examples thereof include a fuel diesel fuel and a polycarbonate diol (meth) acrylate compound obtained by an ester exchange reaction of fats and alcohols. .
  • a fuel diesel fuel and a polycarbonate diol (meth) acrylate compound obtained by an ester exchange reaction of fats and alcohols.
  • polycarbonate diol (meth) acrylate compounds are more preferable.
  • the immobilized peroxidase refers to a material in which a peroxidase is supported on a silica carrier by adsorption or the like.
  • the peroxidase may be an enzyme that catalyzes a reaction in which peroxide (—O—O—) is cleaved oxidatively and decomposed into two hydroxyl groups.
  • peroxidase derived from horseradish peroxidase for example, HRP (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • cytochrome c peroxidase for example, cytochrome c peroxidase
  • glutathione peroxidase for example, horseradish-derived peroxidase is preferable.
  • the peroxidase described above may be obtained from a culture of a genetic recombinant obtained by obtaining a gene encoding peroxidase and transforming an appropriate host such as yeast or filamentous fungus. Recombinant DNA techniques used for recombinant expression of peroxidase are known in the art.
  • the peroxidase may be a mutant of the peroxidase.
  • the amino acid sequence of the peroxidase has a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and an activity of oxidatively cleaving the peroxide into two hydroxyl groups. It may be a peroxidase having
  • the silica support is preferably a porous porous silica support from the viewpoint that the adsorption amount of peroxidase can be increased by having a large surface area.
  • the silica carrier include mesoporous silica such as MCFs, FSM-16, MCM-41, MCM-48, SBA-15 and the like. Among these, MCFs is preferable from the viewpoint that the amount of adsorbed enzyme is particularly large.
  • the immobilization of peroxidase on the silica support can be performed, for example, by a carrier binding method such as covalent bond, ionic bond, physical adsorption, or the like.
  • a carrier binding method such as covalent bond, ionic bond, physical adsorption, or the like.
  • the carrier binding method by physical adsorption is preferable because it is simple.
  • Immobilization by physical adsorption can be performed, for example, by bringing an aqueous solution of peroxidase into contact with a silica carrier. Further, the method may include separating the immobilized peroxidase formed by adsorbing the peroxidase on the silica carrier from the aqueous phase, then washing the separated immobilized peroxidase, and further drying to an appropriate water content.
  • the temperature and pH at the time of immobilization by physical adsorption may be appropriately set according to the type of peroxidase to be immobilized. Many peroxidases can be immobilized, for example, at room temperature and near neutral pH.
  • the contact time between the silica support and the peroxidase is usually chosen such that it is required for essentially complete adsorption. This is typically 1-2 hours to 24 hours.
  • the method for producing an immobilized peroxidase includes a step of approximating an absorption band I or an absorption band II to one or a plurality of normal distributions in an infrared absorption spectrum of the immobilized peroxidase, and based on the normal distribution.
  • an inspection process including the steps of:
  • the immobilized peroxidase having an index value of 75 cm ⁇ 1 (threshold) or less is preferably selected as a good product. More preferably, the threshold value is 70 cm ⁇ 1 .
  • the index value is usually about 65 cm ⁇ 1 even if it is small.
  • the immobilized peroxidase having an index value of 0.45 (threshold) or more is preferably selected as a good product.
  • the threshold is more preferably 0.50.
  • the index value is usually about 0.70 at most.
  • the method for producing an immobilized peroxidase according to the present embodiment may include a step of obtaining an immobilized peroxidase in which a peroxidase is supported on a silica carrier according to a conventional method.
  • the immobilized peroxidases obtained by this step those having low catalytic activity due to irreversible or reversible denaturation may be included, but the irreversible denaturation and reversible denaturation can be distinguished through the above-described inspection step. It becomes possible.
  • the catalyst activity is apparently low, but the catalyst activity can be regenerated by adjusting the water content, for example.
  • the method for evaluating the peroxidase activity of the immobilized peroxidase includes a step of approximating the absorption band I or the absorption band II to one or a plurality of normal distributions in the infrared absorption spectrum of the immobilized peroxidase; A step of calculating an index value indicating a degree of spread of the infrared absorption band based on the reference value, comparing the index value with a preset threshold value, and fixing the degree of spread of the infrared absorption band smaller than the threshold value; And a step of evaluating the peroxidase as an immobilized peroxidase having peroxidase activity.
  • index value and the threshold value in the method for evaluating the peroxidase activity of the immobilized peroxidase according to the present embodiment are the same as those described in the method for producing the immobilized peroxidase.
  • the antibody may be IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE.
  • it may be an antibody fragment (for example, scFV, F (ab), F (ab ′) 2, etc.) that retains antigen-binding ability.
  • the antibody may also be a human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, mouse antibody, rabbit antibody, chicken antibody.
  • the method for producing an antibody includes a step of approximating an absorption band I or an absorption band II to one or more normal distributions in the infrared absorption spectrum of the antibody, and the infrared absorption based on the normal distribution.
  • a step of calculating an index value indicating a degree of spread of the band a step of comparing the index value with a preset threshold value, and selecting an antibody whose degree of spread of the infrared absorption band is smaller than the threshold value as a non-defective product
  • an inspection process including:
  • the index value when the index value is index value 1, it is preferable to select an antibody having an index value of 65 cm ⁇ 1 (threshold) or less as a non-defective product. More preferably, the threshold value is 60 cm ⁇ 1 . The index value is usually about 57 cm ⁇ 1 even if it is small.
  • the antibody having an index value of 0.98 (threshold) or higher is preferably selected as a non-defective product.
  • the threshold is more preferably 1.00.
  • the index value is usually about 1.09 at most.
  • the antibody having an index value of 0.85 (threshold) or more is preferably selected as a non-defective product.
  • the threshold is more preferably 0.90.
  • the index value is usually about 0.97 at most.
  • the method for producing an antibody according to this embodiment may include a step of obtaining an antibody according to a conventional method.
  • the step includes, for example, expressing an antibody by culturing or breeding yeast, filamentous fungus, animal cell, animal or the like that is capable of expressing DNA encoding the antibody, and from cell disrupted material, medium, animal milk, etc. It can be performed by recovering (purifying) the expressed antibody.
  • An antibody having a sufficient titer can be produced by passing through the above-described test step in the method for producing an antibody according to this embodiment.
  • the antibody activity evaluation method includes a step of approximating an absorption band I or absorption band II to one or more normal distributions in an infrared absorption spectrum of an antibody, and the infrared absorption based on the normal distribution.
  • the antibody activity here is, for example, antibody titer.
  • index values and threshold values in the antibody activity evaluation method according to the present embodiment are the same as those described in the antibody production method.
  • FT-IR spectrum of each immobilized lipase was measured using a Fourier transform infrared spectrophotometer (FTS7000e micro UMA600; manufactured by Agilent Technologies).
  • an absorption band derived from lipase appearing in the vicinity of 1660 cm ⁇ 1 was approximated by a single normal distribution by a non-linear least square method, and a half width was calculated as an index value.
  • the peak position, the half width, and the intensity are variables.
  • the wave number band position is set to one point of 1656 cm ⁇ 1 (A 1 and A 2 ), and the half widths are 47 cm ⁇ 1 (A 1 ) and 82 cm ⁇ 1 (A 2 ). did.
  • Each absorption band was separated by the non-linear least square method, and the area of each absorption band obtained was used to calculate the absorption band area ratio as index value 2 according to the following formula.
  • Absorption band area ratio (index value 2) A 1 / A 2
  • a 1 and A 2 are the areas of the respective absorption bands.
  • the wave number band position is set to three points of 1680 cm ⁇ 1 (A 1 ), 1656 cm ⁇ 1 (A 2 ), 1631 cm ⁇ 1 (A 3 ), and the respective half-value widths are set to 50 cm. It was set to -1 .
  • Each absorption band was separated by the non-linear least square method, and the area of each absorption band obtained was used to calculate the absorption band area ratio as index value 3 according to the following formula.
  • Absorption band area ratio (index value 3) A 2 / (A 1 + A 3 )
  • a 1 , A 2 and A 3 are the areas of the respective absorption bands.
  • wave number band positions are set to 1685 cm ⁇ 1 (A 1 ), 1670 cm ⁇ 1 (A 2 ), 1656 cm ⁇ 1 (A 3 ), 1641 cm ⁇ 1 (A 4 ), and 1626 cm ⁇ 1.
  • the five points of (A 5 ) were used, and the half-value width of each was 30 cm ⁇ 1 .
  • Each absorption band was separated by the non-linear least square method, and the area of each absorption band obtained was used to calculate the absorption band area ratio as index value 4 according to the following formula.
  • Absorption band area ratio (index value 4) A 3 / (A 1 + A 2 + A 4 + A 5 )
  • a 1 , A 2 , A 3 , A 4 and A 5 are the areas of the respective absorption bands.
  • index value 5 and index value 6 Absorption band area ratio when the waveform is separated into 8 normal distributions
  • the obtained FT-IR spectrum was subjected to waveform separation using a spreadsheet software (Microsoft Excel; manufactured by Microsoft), and the absorption band area ratio was determined.
  • baseline correction was performed so that the infrared absorption intensities of 1800 and 1575 cm ⁇ 1 would be zero.
  • an absorption band derived from the porous resin carrier appeared in the vicinity of 1720 cm -1, and separated using a Gaussian function, then, was waveform separation of the absorption bands from lipase appeared in the vicinity of 1660 cm -1.
  • wave number band positions are 1692 cm ⁇ 1 (A 1 ), 1682 cm ⁇ 1 (A 2 ), 1670 cm ⁇ 1 (A 3 ), 1658 cm ⁇ 1 (A 4 ), 1648 cm ⁇ 1.
  • Eight points of (A 5 ), 1638 cm ⁇ 1 (A 6 ), 1629 cm ⁇ 1 (A 7 ), and 1619 cm ⁇ 1 (A 8 ) were used, and the respective half widths were 19 cm ⁇ 1 .
  • Each absorption band was separated by the non-linear least square method, and the absorption band area ratio was calculated as index value 5 and index value 6 according to the following formula using the area of each absorption band obtained.
  • Absorption band area ratio (index value 5) (A 4 + A 5 ) / (A 1 + A 2 + A 3 + A 6 + A 7 + A 8 )
  • a 1 , A 2 , A 3 , A 4 , A 5 , A 6 , A 7 and A 8 are the areas of the respective absorption bands.
  • Absorption band area ratio (index value 6) (A 4 + A 5 ) / (A 2 + A 3 + A 8 )
  • a 2 , A 3 , A 4 , A 5 and A 8 are the areas of the respective absorption bands.
  • Index values 7 to 8 were calculated from the lipase-derived absorption band II appearing in the vicinity of 1500 to 1600 cm ⁇ 1 of the FT-IR spectrum by the following procedure.
  • an absorption band derived from lipase appearing in the vicinity of 1500 to 1570 cm ⁇ 1 was approximated by a single normal distribution by a nonlinear least square method, and a half width was calculated as an index value.
  • the peak position, the half width, and the intensity are variables.
  • the wave number band position is set to three points of 1570 cm ⁇ 1 (B 1 ), 1545 cm ⁇ 1 (B 2 ), and 1518 cm ⁇ 1 (B 3 ), and the respective half widths are set to 31 cm. It was set to -1 .
  • Each absorption band was separated by the non-linear least square method, and the absorption band area ratio was calculated as an index value 8 according to the following formula using the area of each obtained absorption band.
  • Absorption band area ratio (index value 8) B 2 / (B 1 + B 3 )
  • B 1 , B 2 and B 3 are the areas of the respective absorption bands.
  • FIGS. 2 to 8 show examples of approximating a lipase-derived infrared absorption band with a single normal distribution and examples of waveform separation.
  • FIG. 2 shows an example in which the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (Novozym 435) used as a catalyst in Test Example 17 and the absorption band I derived from lipase are approximated by a single normal distribution.
  • FIG. 3 shows an example in which the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (Novozym 435) used as a catalyst in Test Example 17 and the absorption band I derived from lipase are separated into two normal distributions.
  • FIG. 2 shows an example in which the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (Novozym 435) used as a catalyst in Test Example 17 and the absorption band I derived from lipase are separated into two normal distributions.
  • FIG. 4 shows an example in which the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (Novozym 435) used as a catalyst in Test Example 17 and the absorption band I derived from lipase are separated into three normal distributions.
  • FIG. 5 shows the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (3.4 wt% Amano PS / Lewatit) used as a catalyst in Test Example 3, and each band obtained by separating the lipase-derived absorption band I into eight normal distributions. It is the shown graph.
  • FIG. 5 shows the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (3.4 wt% Amano PS / Lewatit) used as a catalyst in Test Example 3, and each band obtained by separating the lipase-derived absorption band I into eight normal distributions. It is the shown graph.
  • FIG. 6 shows the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (3.4 wt% Amano PS / Lewatit) used as a catalyst in Test Example 11 and each band obtained by separating the lipase-derived absorption band I into eight normal distributions. It is the shown graph.
  • FIG. 7 is a graph showing the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (Novozym 435) used as a catalyst in Test Example 14 and each band obtained by separating the lipase-derived absorption band I into eight normal distributions.
  • FIG. 8 is a graph showing the FT-IR spectrum of the immobilized lipase (Novozym 435) used as a catalyst in Test Example 15 and each band obtained by separating the lipase-derived absorption band I into eight normal distributions.
  • immobilized lipase PS lipase immobilization amount 3.4 wt%.
  • immobilized lipase PS 3.4 wt% Amano PS / Lewatit.
  • the amount of lipase immobilized was determined by measuring the protein concentration in the supernatant after immobilization using the BCA method with the BSA standard, and the decrease in protein concentration before and after immobilization as the amount immobilized on the carrier. The amount of immobilized protein was calculated.
  • Test Example 4 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was carried out in the same manner as in Test Example 3 except that immobilized lipase PS having a water content of 1.0% was used as the catalyst.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 16.5 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 54.1 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.73. Met.
  • Test Example 5 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was performed in the same manner as in Test Example 3 except that the immobilized lipase PS was used that was immersed in methanol at 25 ° C. for 2 hours and then washed with purified water to adjust the water content to 71.0%. .
  • the specific activity of the transesterification reaction was 89.8 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 61.1 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distributions) is 1.46. Met.
  • Test Example 8 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was conducted in the same manner as in Test Example 3 except that the immobilized lipase PS was used that was immersed in acetonitrile at 25 ° C. for 2 hours and then washed with purified water to adjust the water content to 58.6%.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 127.4 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above method is 63.5 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.33. Met.
  • Test Example 12 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was carried out in the same manner as in Test Example 3, except that the immobilized lipase PS washed with toluene was used for 3 months in a fixed bed flow type transesterification reaction as a catalyst.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 13.6 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above method is 61.1 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distributions) is 1.28. Met.
  • Test Example 14 Synthesis of hexyl acrylate
  • the immobilized lipase PS was used that was immersed in an acetic acid aqueous solution (pH 2) at 25 ° C. for 2 hours and then washed with purified water to adjust the water content to 25.0%.
  • the reaction was performed.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 209.6 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 56.4 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.55. Met.
  • Test Example 15 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was performed.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 220.5 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 61.1 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.51.
  • Test Example 16 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was performed.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 56.1 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 65.8 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.21. Met.
  • Test Example 17 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was performed in the same manner as in Test Example 3 except that Novozym (registered trademark) 435 (manufactured by Novozymes) having a water content of 1.0% was used as the catalyst.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 346.4 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 57.6 cm ⁇ 1
  • the index value 2 (absorption band I, absorption band area ratio—two normal distributions) is 0.72.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-3 normal distribution) is 1.87, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-5 normal distribution) is 0.49.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.70, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.42.
  • the index value 7 (absorption band II, half width) was 37.6 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 1.75.
  • Novozym (registered trademark) 435 is an immobilized lipase in which lipase CalB is immobilized on a porous resin carrier.
  • Test Example 18 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was conducted in the same manner as in Test Example 3 except that Novozym (registered trademark) 435, which was immersed in methanol at 25 ° C. for 3 hours and adjusted to a moisture content of 1.0% by vacuum drying, was used. .
  • the specific activity of the transesterification reaction was 98.6 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above method is 70.5 cm ⁇ 1
  • the index value 2 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ normal distribution) is 0.26.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-3 normal distribution) is 0.88, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-5 normal distribution) is 0.31.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.58, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.06.
  • the index value 7 (absorption band II, half-value width) was 44.7 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 1.13.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-three normal distributions) is 2.10, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-five normal distributions) is 0.50.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.69, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.48. Met.
  • Test Example 20 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was conducted in the same manner as in Test Example 3 except that Novozym (registered trademark) 435 having a water content adjusted to 1.0% by vacuum drying was used after being immersed in acetone at 25 ° C. for 3 hours.
  • the specific activity of the transesterification reaction was 384.4 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 56.4 cm ⁇ 1
  • the index value 2 (absorption band I, absorption band area ratio—two normal distributions) is 1.05.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-three normal distributions) is 2.50, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-five normal distributions) is 0.53.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.73, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.58. Met.
  • Test Example 21 Synthesis of hexyl acrylate
  • the reaction was performed in the same manner as in Test Example 3 except that Novozym (registered trademark) 435, which was immersed in acetonitrile at 25 ° C. for 3 hours as a catalyst and the water content was adjusted to 1.0% by vacuum drying, was used. .
  • the specific activity of the transesterification reaction was 375.9 mmol ⁇ h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 56.4 cm ⁇ 1
  • the index value 2 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ normal distribution) is 0.88.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-three normal distributions) is 2.20, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-five normal distributions) is 0.48.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.74, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.55. Met.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-3 normal distributions) is 0.47, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-5 normal distributions) is 0.25.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.45, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.85.
  • the index value 7 (absorption band II, half width) was 47.0 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.58.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-three normal distributions) is 1.63, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-five normal distributions) is 0.45.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.66, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.39. Met.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-three normal distributions) is 1.97, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-five normal distributions) is 0.50.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 070, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.42. It was.
  • the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio-three normal distributions) is 1.38, and the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio-five normal distributions) is 0.37.
  • the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 0.63, and the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) is 1.31.
  • the index value 7 (absorption band II, half-value width) was 40.0 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 1.67.
  • FIG. 9 is a graph plotting the specific activity of the transesterification reaction of lipase against the index value 1 (absorption band I, half-value width) of Test Examples 17 to 25. Negative correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 10 is a graph in which the index value 7 (absorption band II, half-value width) is plotted against the index value 1 (absorption band I, half-value width) of Test Examples 17, 18, 22, and 25. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 11 is a graph plotting the specific activity of the transesterification reaction of lipase against the index value 1 (absorption band I, full width at half maximum) of Test Examples 3 to 16. Negative correlation that can be linearly approximated is observed.
  • the results of Test Example 4 and Test Example 12 (numbers corresponding to each test example in the figure are attached to the plot) will be described later.
  • FIG. 12 is a graph plotting the index value 2 (absorption band I, absorption band area ratio—two normal distributions) of Test Examples 17 to 25 and the specific activity of the lipase transesterification reaction. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 13 is a graph plotting the index value 3 (absorption band I, absorption band area ratio—three normal distributions) of Test Examples 17 to 25 and the specific activity of the transesterification reaction of lipase. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 14 is a graph plotting the index value 4 (absorption band I, absorption band area ratio—five normal distribution) of Test Examples 17 to 25 and the specific activity of the lipase transesterification reaction. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 15 is a graph in which the index value 5 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) of Test Examples 17 to 25 and the specific activity of the transesterification reaction of lipase are plotted. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 16 is a graph plotting the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distribution) of Test Examples 3 to 25 and the specific activity of the lipase transesterification reaction. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • the immobilized lipase having sufficient water content is an index value (half-width or absorption band area ratio) and catalytic activity ( There is a correlation that can be linearly approximated with the specific activity of the transesterification reaction. From this correlation, an immobilized lipase having a half width of not more than a predetermined value or an absorption band area ratio of not less than a predetermined value (for example, 1.2 or more in the case of an index value of 6) has catalytic activity or potential catalytic activity. It can be evaluated that it is sufficient.
  • the catalytic activity corresponding to the absorption band area ratio can be regenerated by eliminating the reversible modification by treatment with a water-containing organic solvent. That is, the immobilized lipase of Test Example 13 is obtained by treating the immobilized lipase of Test Example 12 with acetone having a water content of 5%. As is apparent from the results in Table 1, the catalyst activity was regenerated by this treatment, and entered into a 3.4 wt% Amano PS / Lewatit linear approximation curve (not shown), for example, as shown in FIG.
  • the immobilized lipases of Test Example 13 and Test Example 12 have almost the same index value (for example, the half width of index value 1 is 61.1 cm ⁇ 1 , and the absorption band area ratio of index value 6 is 1 respectively. .33 and 1.28.).
  • the immobilized lipases of Test Example 3 and Test Example 4 differ only in the moisture content (the immobilized lipase of Test Example 4 having a low moisture content is considered to have undergone reversible denaturation) and have equivalent index values. ing.
  • the immobilized lipase of Test Example 12 and Test Example 4 can regenerate the catalytic activity. Nevertheless, it is repelled as a defective product.
  • the immobilized lipases of Test Example 12 and Test Example 4 have a half-value width equal to or less than a predetermined value or an absorption band area ratio equal to or greater than a predetermined value. Can be selected as a lipase.
  • oxidase weight is the weight of peroxidase determined on the basis of BSA by the BCA method.
  • an aqueous ammonium fluoride solution (0.38 g / 40 g-H 2 O) was added and aged at 100 ° C. for 24 hours. Thereafter, the mixture was washed with 500 mL of purified water-ethanol mixture, filtered, and dried overnight in an oven at 100 ° C. The obtained white powder was heated to 500 ° C. over 5 hours in an air atmosphere and held at that temperature for 5 hours.
  • the resulting white powder (Siliceous Mesocellular Foams, MCFs) is referred to as “silica support” or “MCFs”.
  • the specific surface area and average pore diameter of the silica support determined by nitrogen adsorption / desorption measurement were 597 m 2 ⁇ g ⁇ 1 and 24.4 nm, respectively.
  • Test Example 29 Oxidation reaction of o-phenylenediamine
  • the reaction was performed in the same manner as in Test Example 28 except that an immobilized peroxidase was used which was immersed in methanol at 25 ° C. for 3 hours and then washed with purified water to adjust the water content to 22.7%.
  • the specific activity of the oxidation reaction was 1016.0 h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 7 (absorption band II, half-value width) obtained by the above method is 75.1 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) is 0.40. Met.
  • Test Example 30 O-phenylenediamine oxidation reaction
  • the reaction was carried out in the same manner as in Test Example 28, except that an immobilized peroxidase which was immersed in toluene at 110 ° C. for 3 hours and then washed with purified water to adjust the water content to 28.5% was used.
  • the specific activity of the oxidation reaction was 2841.5 h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 7 (absorption band II, half-value width) obtained by the above-described method is 71.1 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) is 0.62. Met.
  • Test Example 31 O-phenylenediamine oxidation reaction
  • an immobilized peroxidase was used that was immersed in an aqueous HCl solution (pH 3.5) at 60 ° C. for 3 hours and then washed with purified water to adjust the water content to 25.3%.
  • the reaction was performed.
  • the specific activity of the oxidation reaction was 2374.8 h ⁇ 1 ⁇ g ⁇ 1 .
  • the index value 7 (absorption band II, half-value width) obtained by the above-described method is 70.5 cm ⁇ 1
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) is 0.58. Met.
  • FIGS. 17 to 18 show an example in which an infrared absorption band derived from peroxidase is approximated by a single normal distribution and an example in which waveforms are separated.
  • 19 to 20 show graphs plotting each index value (half-width or absorption band area ratio) and specific activity of peroxidase oxidation reaction.
  • FIG. 17 shows an example in which the FT-IR spectrum of the immobilized peroxidase used as a catalyst in Test Example 28 and the absorption band II derived from peroxidase are approximated by a single normal distribution.
  • FIG. 18 shows an example in which the FT-IR spectrum of the immobilized peroxidase used as a catalyst in Test Example 28 and the absorption band II derived from peroxidase are separated into three normal distributions.
  • FIG. 19 is a graph plotting the specific activity of the oxidation reaction of peroxidase against the index value 7 (absorption band II, half width) of Test Examples 28 to 31. Negative correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 20 is a graph plotting the specific activity of the oxidation reaction of peroxidase against the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) of Test Examples 28 to 31. A positive correlation that can be linearly approximated is observed.
  • the immobilized peroxidase having sufficient water content is determined by the index value (half width or absorption band area ratio) and catalytic activity ( There is a correlation that can be linearly approximated with the specific activity of the oxidation reaction. From this correlation, it can be evaluated that the immobilized peroxidase having a half width of not more than a predetermined value or an absorption band area ratio of not less than a predetermined value has sufficient catalytic activity or potential catalytic activity.
  • PBS Phosphate Buffered Saline: 10 mM phosphate (pH 7.4), 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl
  • antigen chicken IgG
  • an antigen solution of 1000, 500, 250, 125, 63, 31, 16 ng / mL was prepared by 2-fold dilution with PBS.
  • 50 ⁇ L of each antigen solution was added to each well of a 96-well plate, allowed to stand for 5 minutes, and adsorbed to each well. Each well was washed twice with PBS to obtain a 96-well plate with adsorbed antigen.
  • the antibody to be titered was dissolved and diluted with 0.05% Tween 20-containing PBS to obtain a 1 ⁇ g / mL antibody solution (referred to as a primary antibody solution). 50 ⁇ L of the primary antibody solution was added to each well of the 96-well plate on which the antigen was adsorbed, and allowed to stand for 5 minutes to bind to the antigen. Each well was washed twice with PBS containing 0.05% Tween20.
  • Horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-rabbit antibody 50 ⁇ g was dissolved and diluted with PBS containing 0.05% Tween 20 to obtain a 1 ⁇ g / mL antibody solution (referred to as secondary antibody solution). 50 ⁇ L of the secondary antibody solution was added to each well of the 96-well plate to which the primary antibody was bound, and allowed to stand for 5 minutes to bind to the primary antibody. Each well was washed twice with PBS containing 0.05% Tween20.
  • Test Example 33 corresponds to a plot of “ ⁇ 20 ° C.”).
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 57.0 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.09.
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.97.
  • Test Example 34 Measurement of antibody titer Measurement was carried out in the same manner as in Test Example 33, except that 0.5 mL of the antibody solution was dispensed into a test tube, allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours, and then freeze-dried at ⁇ 20 ° C. The results of measuring the antibody titer are shown in Table 3 and FIG. 23 (in FIG. 23, Test Example 34 corresponds to a plot of “4 ° C.”).
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above method is 57.6 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.03.
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.92.
  • Test Example 35 Measurement of antibody titer Measurement was performed in the same manner as in Test Example 33, except that 0.5 mL of the antibody solution was dispensed into a test tube, allowed to stand at 25 ° C. for 24 hours, and then lyophilized at ⁇ 20 ° C. The results of measuring the antibody titer are shown in Table 3 and FIG. 23 (in FIG. 23, Test Example 35 corresponds to a plot of “25 ° C.”).
  • the index value 1 (absorption band I, half width) obtained by the above-described method is 57.7 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.00.
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.94.
  • Test Example 36 Measurement of antibody titer Measurement was carried out in the same manner as in Test Example 33, except that 0.5 mL of the antibody solution was dispensed into a test tube, allowed to stand at 50 ° C. for 24 hours, and then lyophilized at ⁇ 20 ° C. The results of measuring the antibody titer are shown in Table 3 and FIG. 23 (in FIG. 23, Test Example 36 corresponds to a plot of “50 ° C.”).
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above-described method is 58.4 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 1.02.
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.93.
  • Test Example 37 Measurement of antibody titer Measurement was carried out in the same manner as in Test Example 33, except that 0.5 mL of the antibody solution was dispensed into a test tube, allowed to stand at 75 ° C. for 24 hours, and then lyophilized at ⁇ 20 ° C.
  • the results of measuring the titer of the antibody are shown in Table 3 and FIG. 23 (in FIG. 23, Test Example 37 corresponds to a plot of “75 ° C.”).
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above method is 66.0 cm ⁇ 1
  • the index value 6 absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.80.
  • Test Example 38 Measurement of antibody titer Measurement was performed in the same manner as in Test Example 33, except that 0.5 mL of the antibody solution was dispensed into a test tube, allowed to stand at 90 ° C. for 24 hours, and then lyophilized at ⁇ 20 ° C. The results of measuring the antibody titer are shown in Table 3 and FIG. 23 (in FIG. 23, Test Example 38 corresponds to a plot of “90 ° C.”).
  • the index value 1 (absorption band I, half-value width) obtained by the above method is 70.6 cm ⁇ 1
  • the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio ⁇ eight normal distribution) is 0.92.
  • the index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) was 0.79.
  • FIGS. 21 to 22 show an example in which an infrared absorption band derived from an antibody is approximated by a single normal distribution and an example in which waveforms are separated.
  • 24 to 25 show graphs in which each index value (half-width or absorption band area ratio) and antibody titer are plotted.
  • FIG. 21 shows an example in which the FT-IR spectrum of the antibody freeze-dried in Test Example 33 and the antibody-derived absorption band I and absorption band II are approximated by a single normal distribution.
  • 22 shows an example of FT-IR spectrum of the antibody freeze-dried in Test Example 33, an example in which the absorption band I derived from the antibody is waveform-separated into eight normal distributions, and an example in which the absorption band II is waveform-separated into three normal distributions. Indicates.
  • FIG. 24 is a graph plotting antibody titers against index value 1 (absorption band I, half-value width) of Test Examples 33 to 42. Negative correlation that can be linearly approximated is observed.
  • FIG. 25 shows the index value 6 (absorption band I, absorption band area ratio—eight normal distributions) and index value 8 (absorption band II, absorption band area ratio—three normal distributions) of Test Examples 33 to 42.

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Abstract

　本発明は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、タンパク質の製造方法に関する。

Description

タンパク質及びその製造方法、並びにタンパク質活性評価方法
　本発明は、タンパク質及びその製造方法、並びにタンパク質活性評価方法に関する。本発明はまた、固定化リパーゼ及び再生固定化リパーゼ及びそれらの製造方法、並びにリパーゼ活性評価方法にも関する。本発明は更に、固定化ペルオキシダーゼ及びその製造方法、並びにペルオキシダーゼ活性評価方法にも関する。本発明は更にまた、抗体及びその製造方法、並びに抗体活性評価方法にも関する。
　従来、タンパク質の活性評価は、実際に触媒反応等を行いその活性を測定すること等によるものであった。
　例えば、脂肪酸等の各種カルボン酸と、モノアルコール及び多価アルコール等のアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応等の反応に工業的に幅広く使用されている固定化リパーゼは（例えば、特許文献１を参照）、その調製条件、反応への使用等により触媒活性が充分ではなくなることがあるが、固定化リパーゼの触媒活性の評価は、実際にエステル交換反応等を行い、その活性を測定すること等により行われている。
　一方、固定化リパーゼのリパーゼの高次構造を解析した例が知られている。例えば、非特許文献１には、円偏光二色性（ＣＤ）法、拡散反射フーリエ変換赤外分光（ＤＲＩＦＴ）法及びトリプトファン残基蛍光法による固体粒子上に固定化されたリパーゼの構造解析法が記載されている。非特許文献２には、酵素を用いたバイオディーゼル生産における、原料、水分の存在又は不在、及びバイオディーゼルとの接触が、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５の触媒的、酵素的及び物理的な安定性に及ぼす影響について解析したことが記載されている。非特許文献３には、固定化されたシュード・モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼの初期活性及び二次構造に対する、有機溶媒による予備処理の影響を解析したことが記載されている。
特開２０１１－２０７９７５号公報
ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ，１０巻，ｐ．１４９２－１４９９（２００９年） Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　Ｔｏｄａｙ，２１３巻，ｐ．７３－８０（２０１３年） Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５巻，ｐ．１１７６－１１８０（２０１０年）
　現在、タンパク質は工業的プロセスの触媒として、また医薬としても幅広く利用されている。タンパク質の活性が低下するとプロセス全体の効率の低下、治療効果の低下等につながるため、その活性を評価して充分な活性のあるタンパク質を提供することは極めて重要である。
　また、活性が充分ではないタンパク質には、例えばタンパク質の含水率を調整すること等により、活性を再生することができる場合（本明細書中、「可逆的変性」とも称する。）と、活性を再生することができない場合（本明細書中、「非可逆的変性」とも称する。）とがある。
　従来のタンパク質の活性の評価は、実際に触媒反応等を行いその活性を測定すること等によるものであった。このような評価方法では、タンパク質の活性が充分ではない場合に、可逆的変性と非可逆的変性のいずれに起因するか評価することは困難である。
　また、実際に触媒反応等を行うことなく、タンパク質の活性評価を行い得る方法の選択肢は未だ充分ではない。例えば、工業的に利用される固定化リパーゼの場合、非特許文献１～３には、固定化リパーゼのリパーゼの高次構造と触媒活性との関係について記載されている。しかしながら、非特許文献１には、多孔性樹脂担体にリパーゼＣａｌＢを固定化したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）では、当該多孔性樹脂担体由来の強い吸収が、リパーゼ由来の吸収と隣接するため、赤外吸収スペクトル測定では構造解析は行えないと記載されている。
　また、非特許文献２には、定量的データではないものの、反応への使用によって活性が低下したリパーゼでは、α－へリックスが減少したこと、及びβ－シートが増大したことが記載されている。非特許文献３には、有機溶媒で処理することで、α－ヘリックス、及びβ－シートが構造変化したことが記載されているが、非特許文献２とは逆に、構造変化に伴い活性が向上したことが記載されている。
　このように、リパーゼの構造変化と触媒活性との相関について逆の報告がなされているのが現状であり、赤外吸収スペクトル測定から触媒能評価を行い得るか否かは明らかではない。また、非特許文献１～３のいずれにも可逆的変性と非可逆的変性とを見分ける技術手段に関し、記載乃至示唆はされていない。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、充分な活性を有するタンパク質を得ることができるタンパク質の製造方法及び当該製造方法により得られたタンパク質を提供することを目的とする。本発明はまた、実際に活性測定を行う必要なく、タンパク質の活性を評価することのできるタンパク質活性評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおける特定の波数の赤外吸収バンドを正規分布で近似し、その正規分布に基づいて算出した赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値が、タンパク質の活性又はタンパク質の潜在的な活性を反映することを見出した。すなわち、当該指標値に基づいてタンパク質を選抜することにより、充分な活性があるタンパク質が得られることを見出した。本発明はこの新規な知見に基づくものである。
　すなわち、本発明は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（本明細書中、「吸収バンドＩＩ」ともいう。）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（本明細書中、「吸収バンドＩ」ともいう。）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、上記タンパク質の製造方法に関する。
　本発明のタンパク質の製造方法によれば、上記検査工程を備えているため、活性のあるタンパク質を製造することができる。また、タンパク質活性の可逆的変性と非可逆的変性とを見分けることができるため、活性を再生可能なタンパク質を得ることもできる。
　上記指標値は、上記赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であってもよい。半値幅は上記赤外吸収バンドの広がりの度合いと相関するため、半値幅を指標値として、活性のあるタンパク質、又は活性を再生可能なタンパク質を選抜することが可能である。
　上記指標値は、上記赤外吸収バンドを複数の正規分布に波形分離し、上記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、上記赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値（本明細書中、「吸収バンド面積比」ともいう。）であってもよい。吸収バンド面積比は上記赤外吸収バンドの広がりの度合いと相関するため、吸収バンド面積比を指標値として、活性のあるタンパク質、又は活性を再生可能なタンパク質を選抜することが可能である。
　吸収バンド面積比は、上記赤外吸収バンドを、いずれも上記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、上記２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値であってもよい。
　吸収バンド面積比は、上記赤外吸収バンドをＡ１～Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離し、上記ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１～Ａｎ／２－１及びＡｎ／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよく、上記ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１～Ａ（ｎ＋１）／２－１及びＡ（ｎ－１）／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよい。
　上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値によるタンパク質の選抜をより精度よく行うことができる。
　本発明はまた、上記タンパク質の製造方法により得られたタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、上記製造方法により得られたものであるため、活性を有する、又は充分な活性を再生可能である。
　本発明は、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼの製造方法であって、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、製造方法にも関する。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを選抜するステップを有しているため、触媒活性がある、又は触媒活性を再生可能な固定化リパーゼを得ることができる。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅（本明細書中、「指標値１」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が７０ｃｍ－１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、２つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅４７ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅８２ｃｍ－１）の２つの正規分布に波形分離し、Ａ１の面積をＡ２の面積で割った値（本明細書中、「指標値２」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．２７以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８０ｃｍ－１、半値幅５０ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅５０ｃｍ－１）及びＡ３（ピーク位置１６３１ｃｍ－１、半値幅５０ｃｍ－１）の３つの正規分布に波形分離し、Ａ２の面積をＡ１及びＡ３の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値３」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．９以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、５つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８５ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６４１ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）及びＡ５（ピーク位置１６２６ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）の５つの正規分布に波形分離し、Ａ３の面積をＡ１、Ａ２、Ａ４及びＡ５の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値４」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．３５以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ６、Ａ７及びＡ８の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値５」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．６以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩを、吸収バンドＩの面積と、８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ２、Ａ３及びＡ８の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値６」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩＩを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅（本明細書中、「指標値７」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が４４ｃｍ－１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が、吸収バンドＩＩを、吸収バンドＩＩの面積と、３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値（本明細書中、「指標値８」ともいう。）であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜してもよい。
　上記固定化リパーゼは、エステル交換活性又はエステル加水分解活性を有するものであってもよい。
　上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による固定化リパーゼの選抜をより精度よく行うことができる。
　上記リパーゼは、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼであってもよい。
　本発明はまた、上記固定化リパーゼの製造方法により得られた固定化リパーゼを提供する。本発明の固定化リパーゼは、上記製造方法により得られたものであるため、触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能である。
　本発明は、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼの製造方法であって、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、製造方法にも関する。
　本発明の固定化ペルオキシダーゼの製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを選抜するステップを有しているため、触媒活性がある、又は触媒活性を再生可能な固定化リパーゼを得ることができる。
　本発明の固定化ペルオキシダーゼの製造方法では、上記指標値が指標値７であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が７５ｃｍ－１以下となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜してもよい。
　本発明の固定化ペルオキシダーゼの製造方法では、上記指標値が指標値８であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．４５以上となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜してもよい。
　上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による固定化ペルオキシダーゼの選抜をより精度よく行うことができる。
　本発明はまた、上記固定化ペルオキシダーゼの製造方法により得られた固定化ペルオキシダーゼを提供する。本発明の固定化ペルオキシダーゼは、上記製造方法により得られたものであるため、触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能である。
　本発明は、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、抗体の製造方法にも関する。
　本発明の抗体の製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を選抜するステップを有しているため、充分な力価のある抗体を得ることができる。
　本発明の抗体の製造方法では、上記指標値が指標値１であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が６５ｃｍ－１以下となる抗体を良品として選抜してもよい。
　本発明の抗体の製造方法では、上記指標値が指標値６であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．９８以上となる抗体を良品として選抜してもよい。
　本発明の抗体の製造方法では、上記指標値が指標値８であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．８５以上となる抗体を良品として選抜してもよい。
　上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による抗体の選抜をより精度よく行うことができる。
　本発明はまた、上記抗体の製造方法により得られた抗体を提供する。本発明の抗体は、上記製造方法により得られたものであるため、充分な力価を有する。
　本発明はまた、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼから、リパーゼ活性の一部又は全部が再生された再生固定化リパーゼを製造する製造方法であって、固定化リパーゼは、樹脂担体にリパーゼが固定化されたものであり、上記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい上記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜するステップと、を含む選抜工程を備える、再生固定化リパーゼの製造方法にも関する。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法によれば、算出した指標値を閾値と比較して、閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを選抜するステップを有しているため、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの中でも可逆的変性であるものを選抜することができる。すなわち、充分な触媒活性を再生可能な固定化リパーゼを得ることができる。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値１であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が７０ｃｍ－１以下となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値２であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．２７以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値３であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．９以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値４であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．３５以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値５であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が０．６以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値６であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値７であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が４４ｃｍ－１以下となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　本発明の再生固定化リパーゼの製造方法では、上記指標値が指標値８であり、上記選抜するステップにおいて、上記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜してもよい。
　上記再生固定化リパーゼの製造方法は、上記選抜工程で選抜された固定化リパーゼを水又は含水有機溶媒にて処理する再生工程を備えていてもよい。上記選抜工程で選抜された固定化リパーゼは、上記再生工程を経ることによって、リパーゼ活性を再生できる。
　上記固定化リパーゼは、エステル交換活性又はエステル加水分解活性を有するものであってもよい。
　上記赤外吸収スペクトルは、減衰全反射法により測定されたものであることが好ましい。これにより、上記指標値による固定化リパーゼの選抜をより精度よく行うことができる。
　上記リパーゼは、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼであってもよい。
　本発明はまた、上記再生固定化リパーゼの製造方法により得られた再生固定化リパーゼを提供する。本発明の再生固定化リパーゼは、上記製造方法により得られたものであるため、充分な触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能である。
　本発明は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を活性のあるタンパク質と評価するステップと、を含む評価工程を備える、タンパク質活性評価方法ということもできる。
　本発明はまた、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法であって、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを、リパーゼ活性のある固定化リパーゼと評価する、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える、リパーゼ活性評価方法ということもできる。
　本発明は更に、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性評価方法であって、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを、ペルオキシダーゼ活性のある固定化ペルオキシダーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える、ペルオキシダーゼ活性評価方法ということもできる。
　本発明は更にまた、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を活性のある抗体と評価するステップと、を含む評価工程を備える、抗体活性評価方法ということもできる。
　本発明は、本発明の固定化リパーゼ、又は再生固定化リパーゼを用いた、リパーゼによる触媒反応を経て製造される化合物の製造方法にも関する。上記固定化リパーゼ、又は再生固定化リパーゼは、充分な触媒活性を有するか、又は充分な触媒活性を再生可能であるため、当該化合物の製造効率が向上する。
　上記化合物は、エステル交換反応又はエステル加水分解反応を経て製造されるものであってもよい。また、上記化合物は、ポリカーボネートジオール（メタ）アクリレート化合物であってもよい。
　本発明によれば、充分な活性を有するタンパク質を得ることができるタンパク質の製造方法及び当該製造方法により得られたタンパク質を提供できる。また、本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、タンパク質の活性を評価することのできるタンパク質活性評価方法を提供できる。
　本発明によれば、触媒活性の可逆的変性と非可逆的変性を見分けることができ、充分な触媒活性を有する固定化リパーゼを得ることができる固定化リパーゼの製造方法及び当該製造方法により得られた固定化リパーゼを提供できる。
　また、本発明によれば、触媒活性の可逆的変性と非可逆的変性を見分けることができ、充分な触媒活性を有する再生固定化リパーゼを得ることができる再生固定化リパーゼの製造方法及び当該製造方法により得られた再生固定化リパーゼを提供できる。
　さらに、本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、リパーゼ活性のある固定化リパーゼ、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼを見分けることのできるリパーゼ活性評価方法を提供できる。
　本発明の固定化リパーゼ、又は再生固定化リパーゼは、充分な触媒活性を有する、又は充分な触媒活性を再生可能であるため、リパーゼによる触媒反応を経て製造される化合物の製造用途に好適に用いられる。
　本発明によれば、触媒活性の可逆的変性と非可逆的変性を見分けることができ、充分な触媒活性を有する固定化ペルオキシダーゼを得ることができる固定化ペルオキシダーゼの製造方法及び当該製造方法により得られた固定化ペルオキシダーゼを提供できる。
　本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、ペルオキシダーゼ活性のある固定化ペルオキシダーゼ、又はペルオキシダーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化ペルオキシダーゼを見分けることのできるペルオキシダーゼ活性評価方法を提供できる。
　本発明によれば、充分な力価を有する抗体を得ることができる抗体の製造方法及び当該製造方法により得られた抗体を提供できる。
　本発明によれば、実際に活性測定を行う必要なく、抗体の力価を評価することのできる抗体活性評価方法を提供できる。
吸収バンド面積比の算出方法を説明するための説明図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を単一の正規分布で近似した例を示す図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を２つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を３つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 リパーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を８つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 指標値１（半値幅）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値１（半値幅）と指標値７（半値幅）との相関を示すグラフである。 指標値１（半値幅）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値２（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値３（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値４（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値５（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値６（吸収バンド面積比）とリパーゼのエステル交換反応の比活性との相関を示すグラフである。 ペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）を単一の正規分布で近似した例を示す図である。 ペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）を３つの正規分布に波形分離した例を示す図である。 指標値７（半値幅）とペルオキシダーゼの酸化反応の比活性との相関を示すグラフである。 指標値８（吸収バンド面積比）とペルオキシダーゼの酸化反応の比活性との相関を示すグラフである。 抗体由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ及び吸収バンドＩＩ）を単一の正規分布で近似した例を示す図である。 抗体由来の赤外吸収バンドを８つの正規分布に波形分離した例（吸収バンドＩ）及び３つの正規分布に波形分離した例（吸収バンドＩＩ）を示す図である。 各種処理を施した抗体の力価を測定した結果を示すグラフである。 指標値１（半値幅）と抗体の力価との相関を示すグラフである。 指標値６（吸収バンド面積比）及び指標値８（吸収バンド面積比）と抗体の力価との相関を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔タンパク質の製造方法〕
　本実施形態に係るタンパク質の製造方法は、少なくとも検査工程を備えるものである。当該検査工程は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩＩ）又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンド（吸収バンドＩ）を、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む。
　本実施形態に係るタンパク質の製造方法により製造されるタンパク質に、特に制限はなく、任意のタンパク質であってよい。一方、本実施形態に係るタンパク質の製造方法によれば、検査工程において活性のあるタンパク質、又は活性を再生可能なタンパク質を選抜することができるため、製造されるタンパク質としては、機能性タンパク質であることが好ましい。ここで、機能性タンパク質とは、変性等を受けていない場合に活性を有するタンパク質を意味する。また、本明細書において、「活性」とは、触媒活性、受容体等との結合活性、抗体の力価等を含む。
　活性のあるタンパク質として、例えば、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ等の触媒活性のあるタンパク質である酵素、インターフェロン、エリスロポエチン、インスリン等の医薬品としても用いられる受容体との結合活性のあるタンパク質、並びに抗体を挙げることができる。
　製造されるタンパク質は、担体に担持されたタンパク質であってもよい。なお、本明細書において「担体」とは、タンパク質を吸着等により保持することができる樹脂担体（例えば、イオン交換樹脂）及び無機担体（例えば、シリカ担体）、タンパク質と混合される増量剤、並びにタンパク質溶液における溶媒及び溶質等を含む。
　本実施形態に係る指標値は、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩの広がりの度合いを示す。図１は、指標値（ここでは、吸収バンド面積比）の算出方法を説明するための説明図である。以下、図１を参照しながら指標値の算出方法を説明する。なお、以下の算出方法はあくまで一例であり、種々の変形が可能である。
　まず、タンパク質の赤外吸収スペクトルを測定する。ここで、タンパク質が担体に担持されたタンパク質である場合は、担体自体についても赤外吸収スペクトルを測定する。担体自体の赤外吸収スペクトルは、予め測定しておいてもよい。赤外吸収スペクトルの測定法は、透過法、拡散反射法、減衰全反射法（ＡＴＲ法）が好ましく、微量タンパク質に由来する吸収スペクトルを高感度で測定するという観点から、ＡＴＲ法がより好ましい。
　図１（Ａ）は、担体に担持されたタンパク質として固定化リパーゼ（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）　ＶＰ　ＯＣ　１６００にＣａｌＢが担持されたＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５）を用いた場合の赤外吸収スペクトル、及び樹脂担体（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）ＶＰ　ＯＣ　１６００）自体の赤外吸収スペクトルを示す。両者の差スペクトルは、タンパク質（リパーゼ）由来の赤外吸収スペクトルとなる。ただし、個別に測定した赤外吸収スペクトルの差分算出には、吸収強度を規定する必要がある場合がある。
　次に、担体由来の赤外吸収スペクトルをシミュレートする。すなわち、担体由来の赤外吸収スペクトルを正規分布で近似し、個別に測定した担体に担持されたタンパク質の赤外吸収スペクトルのバックグラウンドスペクトルとして使用できるようにする。具体的には、強度を変化させることで個別に測定した担体に担持されたタンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、担体由来の赤外吸収スペクトルにフィットさせる。図１（Ｂ）は、担体由来の赤外吸収スペクトルのシミュレートの一例を示す。
　次に、担体に担持されたタンパク質の赤外吸収スペクトルと、担体由来の赤外吸収スペクトル（シミュレート）から、差スペクトルを算出し、担体に担持されたタンパク質中のタンパク質に由来する赤外吸収スペクトルを抽出する。図１（Ｃ）は、差スペクトルの算出の一例を示す。
　差スペクトルの算出は、例えば、ガウス関数を用い、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）にて行うことができる。
　次に、差スペクトルを用い、吸収バンドＩ又はＩＩを、１又は複数の正規分布で近似する。
　差スペクトルの単一の正規分布での近似は、例えば、非線形最小二乗法により行うことができる。非線形最小二乗法は、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）のＳｏｌｖｅｒ機能を利用して、例えば、ピーク位置、半値幅及び強度を変数として行うことができる。
　単一の正規分布で近似した場合の指標値は、例えば、該正規分布の半値幅（単位：ｃｍ－１）とすることができる。この場合、指標値（半値幅）が小さくなるほど、赤外吸収バンドの広がりの度合いは小さくなる。
　差スペクトルの複数の正規分布での近似は、例えば、複数の正規分布に波形分離することにより行うことができる。波形分離は、例えば、ガウス関数を用い、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）にて行うことができる。具体的には、例えば、Ａ１～Ａｎのｎ個の正規分布に波形分離する場合、Ｓｏｌｖｅｒ機能を利用し、Ａ１～Ａｎの波数のバンド位置及び半値幅の初期値を指定し、非線形最小二乗法によって、Ａ１～Ａｎの面積の総和と、差スペクトルの吸収バンドの面積との残差二乗和が最小になるように計算することで波形分離を行うことができる。Ａ１～Ａｎの波数のバンド位置は、等間隔で指定してもよいし、異なる間隔で指定してもよい。また、Ａ１～Ａｎのうち少なくとも２つに同一の波数のバンド位置を指定してもよい。
　波形分離する正規分布の個数（すなわち、ｎの値）は特に制限がなく、目的に応じて適宜設定してよい。タンパク質を良品として選抜する精度がより一層向上するため、ｎは２～２０であることが好ましく、２、３、５又は８であることがより好ましい。
　例えば図１では、差スペクトルを用い、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質（リパーゼ）由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８（まとめてＡ１～Ａ８とも記載する）の８つの正規分布に波形分離している。Ａ１～Ａ８は、ピーク位置が約１０ｃｍ－１間隔で隣り合う、半値幅が約１９ｃｍ－１の８つの正規分布である。また、Ａ１～Ａ８の面積の総和（波形分離成分の合計）が、差スペクトルの吸収バンドの面積となるべく等しくなるように波形分離する。図１（Ｄ）は、波形分離の一例を示す。
　なお、図１における、Ａ１～Ａ８は、フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６９２ｃｍ－１（Ａ１）、１６８２ｃｍ－１（Ａ２）、１６７０ｃｍ－１（Ａ３）、１６５８ｃｍ－１（Ａ４）、１６４８ｃｍ－１（Ａ５）、１６３８ｃｍ－１（Ａ６）、１６２９ｃｍ－１（Ａ７）及び１６１９ｃｍ－１（Ａ８）の８点とし、またそれぞれの半値幅を１９ｃｍ－１としたものである。
　赤外吸収バンドを２つの正規分布に波形分離した場合の指標値は、例えば、赤外吸収バンドを、いずれも赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値とすることができる。２つの正規分布の波数のバンド位置は、互いに同一であってもよい。この場合、指標値が大きくなるほど、赤外吸収バンドの広がりの度合いは小さくなる。
　複数（３以上）の正規分布で近似した場合の指標値は、例えば、赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値（吸収バンド面積比）とすることができる。この場合、指標値が大きくなるほど、赤外吸収バンドの広がりの度合いは小さくなる。
　赤外吸収バンドをＡ１～Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離した場合、例えば、以下のようにして指標値を算出することができる。
（ｉ）ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１～Ａｎ／２－１及びＡｎ／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値を指標値とする。
（ｉｉ）ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１～Ａ（ｎ＋１）／２－１及びＡ（ｎ－１）／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値を指標値とする。
　例えば、ｎが３の場合、指標値はＡ２／（Ａ１＋Ａ３）とすることができる。また、例えば、ｎが５の場合、指標値はＡ３／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ４）としてもよいし、Ａ３／（Ａ１＋Ａ４）としてもよいし、Ａ３／（Ａ１＋Ａ３＋Ａ４）としてもよいし、Ａ３／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ４）としてもよい。また、ｎが５以上の奇数の場合、上記（ｉｉ）で算出される指標値は、例えば、Ａ（ｎ＋１）／２－１～Ａ（ｎ－１）／２＋２からなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和をＡ１～Ａ（ｎ＋１）／２－２及びＡ（ｎ－１）／２＋３～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよい。
　例えば、ｎが８の場合、指標値は（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ２＋Ａ３＋Ａ８）としてもよいし、（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ６＋Ａ７＋Ａ８）としてもよい。また、ｎが６以上の偶数の場合、上記（ｉ）で算出される指標値は、例えば、Ａｎ／２－１～Ａｎ／２＋２からなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和をＡ１～Ａｎ／２－２及びＡｎ／２＋３～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であってもよい。
　タンパク質を良品であるか否かを選抜するための閾値は、製造するタンパク質の種類、製造するタンパク質に求められる活性のレベル等に応じて適宜設定してよい。上記のようにして算出した指標値は、タンパク質の活性、又はタンパク質の潜在的な活性と線形近似可能な相関関係を有しているため、製造するタンパク質に求められる活性のレベルに応じて閾値を設定することができる。また、閾値を決定するため、製造するタンパク質について、予め指標値と活性の相関を解析しておくことが好ましい。
　閾値の例を説明する。図１に例示した固定化リパーゼの場合、指標値が（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ２＋Ａ３＋Ａ８）のときは、指標値（吸収バンド面積比）が１．２（閾値）以上である固定化リパーゼは、リパーゼ活性のある固定化リパーゼと評価することができるか、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼと評価することができる。閾値は１．３としてもよく、１．４としてもよく、１．５としてもよい。当該指標値は、通常大きくても５．０程度である。
　以上説明した指標値の算出方法は、タンパク質の種類に依存しない。すなわち、タンパク質が、例えば、リパーゼ、ペルオキシダーゼ及び抗体等の場合であっても、同様にして指標値を算出することができる。
　本実施形態に係るタンパク質の製造方法は、上述した検査工程に加えて、タンパク質を合成する工程を備えていてもよい。タンパク質の合成は、公知の手法を用いることができる。例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に組み換えた酵母、糸状菌、動物細胞、動物等を培養又は飼育することによりタンパク質を発現させ、細胞破砕物、培地、動物の乳等から発現したタンパク質を回収（精製）することでタンパク質を合成することができる。
　本実施形態に係るタンパク質の製造方法により得られたタンパク質は、上述した検査工程を経ているため、充分な活性を有する、又は充分な活性を再生可能であり、工業的用途、医薬用途等に好適に使用できる。
〔タンパク質活性評価方法〕
　本実施形態に係るタンパク質活性評価方法は、タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、当該指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を活性のあるタンパク質と評価するステップと、を含む評価工程を備える。
　本実施形態に係るタンパク質活性評価方法における指標値及び閾値については、上記固定化リパーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
〔固定化リパーゼの製造方法〕
　本明細書において、固定化リパーゼとは、樹脂担体にリパーゼを吸着等により担持させたものをいう。
　リパーゼは、エステル結合の加水分解反応を触媒する酵素であればよい。また、エステル合成反応も触媒する酵素であることが好ましい。具体的には、例えば、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ）由来のクチナーゼ、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ（例えば、Ａｍａｎｏ　ＰＳ（アマノエンザイム社製））、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍ　４３５（ノボザイム社製））、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　Ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ（例えば、Ｌｉｐａｓｅ　ＴＬ（名糖産業社製））、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　Ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼが挙げられる。これらの中でも、バルクホルデリア・セパシア由来のリパーゼ、カンジダ・アンタークティカ由来のリパーゼが好ましい。
　上述したリパーゼは、上記微生物からリパーゼをコードする遺伝子を得て、酵母又は糸状菌等の適切な宿主を形質転換し、得られた遺伝子組換え体の培養物から得たものであってもよい。リパーゼの組換え発現のために使用される組換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。
　リパーゼは、上記微生物由来のリパーゼの変異体であってもよい。例えば、上記微生物由来のリパーゼのアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、かつ少なくともエステル結合の加水分解活性を有するリパーゼであってもよい。また、上記微生物由来のリパーゼに対しアミノ酸配列が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の配列同一性を示し、かつ少なくともエステル結合の加水分解活性を有するリパーゼであってもよい。
　樹脂担体は、大きな表面積を有することによりリパーゼの吸着量を高くできるという観点から、多孔質である多孔性樹脂担体であることが好ましい。樹脂担体としては、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられる。これらの中でも、特に酵素の吸着力が高いという観点から、疎水性吸着樹脂が好ましい。
　樹脂担体としては、酵素の固定化に汎用されている樹脂担体を用いることができる。具体的には、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド等を挙げることができる。これらは共重合体であってもよく、架橋されていてもよい。中でも、ポリスチレン－共重合体、ポリ－（メタ）アクリル酸エステル、（例えばジビニルベンゼンで架橋されたポリメチルメタアクリレート）であることが好ましい。これらの樹脂担体は、マクロポーラスであり、典型的には最頻度細孔径約５～２０ｎｍを有し、かつ全表面積５０～１０００ｍ２／ｇ（窒素吸着法による）を有する。
　疎水性吸着樹脂は、市販されているものを使用してもよい。具体的には、例えば、レワチット（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標））ＶＰ　ＯＣ　１６００（ランクセス社製、ドイツ）、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標））ＸＡＤ－７ＨＰ（オルガノ社製、日本）、ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学製、日本）が挙げられる。
　樹脂担体へのリパーゼの固定化は、例えば、共有結合、イオン結合、物理的吸着等による担体結合法、網目構造を有する樹脂の格子にリパーゼを固定化する包括法等により行うことができる。中でも物理的吸着による担体結合法が簡便であるため好ましい。
　物理的吸着による固定化は、例えば、リパーゼの水性溶液を樹脂担体に接触させることにより行うことができる。また、リパーゼが樹脂担体に吸着し形成された固定化リパーゼを水相から分離し、次いで分離した固定化リパーゼを洗浄し、更に適切な含水率まで乾燥することを含んでもよい。
　物理的吸着により固定化する際の温度及びｐＨは、固定化するリパーゼの種類等に応じて適宜設定すればよい。多くのリパーゼでは、例えば、室温及び中性に近いｐＨで固定化することができる。樹脂担体とリパーゼの接触時間は、通常本質的に完全な吸着に対して必要とされるような時間が選ばれる。これは典型的には１～２時間から２４時間である。
　固定化リパーゼを固定床カラム中での連続的エステル交換に用いる場合、固定化リパーゼは、球状でありかつ均一な粒子径であることが好ましい。当該粒子径は、１００～５０００μｍであることが好ましく、３００～１０００μｍであることがより好ましい。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法は、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値１とした場合、指標値が７０ｃｍ－１（閾値）以下となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、６５ｃｍ－１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても５５ｃｍ－１程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値２とした場合、指標値が０．２７（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．４９であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．００程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値３とした場合、指標値が０．９（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．５であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．９程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値４とした場合、指標値が０．３５（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．４０であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．４９程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値５とした場合、指標値が０．６（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．６５であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．７０程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値６とした場合、指標値が１．２（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．３であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．４程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値７とした場合、指標値が４４ｃｍ－１（閾値）以下となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、４０ｃｍ－１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても３５ｃｍ－１程度である。
　本実施形態に係る固定化リパーゼの製造方法において、指標値を、指標値８とした場合、指標値が１．２（閾値）以上となる固定化リパーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．５であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．７程度である。
　上記固定化リパーゼの製造方法は、常法に従ってリパーゼを樹脂担体に担持させた固定化リパーゼを得る工程を含んでいてもよい。当該工程により得られる固定化リパーゼの中には、不可逆的変性又は可逆的変性により触媒活性の低いものも含まれ得るが、上記検査工程を経ることによって、不可逆的変性と可逆的変性とを見分けることが可能となる。
　可逆的変性の場合、見かけ上触媒活性が低いものであるが、例えば、含水率を調整すること等により、触媒活性を再生することができる。
〔再生固定化リパーゼの製造方法〕
　本実施形態に係る再生固定化リパーゼの製造方法は、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼから、リパーゼ活性の一部又は全部が再生された再生固定化リパーゼを製造するものである。当該製造方法は、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい上記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜するステップと、を含む選抜工程を備えるものである。
　本実施形態に係る再生固定化リパーゼの製造方法における指標値及び閾値については、上記固定化リパーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
　選抜工程では、指標値を指標としているため、リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの中でも可逆的変性であるものを選抜することができる。したがって、選抜工程で選抜した固定化リパーゼは、含水率を調整すること等により、触媒活性を再生することができる。
　上記再生固定化リパーゼの製造方法は、選抜工程で選抜されたリパーゼ活性が減少した固定化リパーゼを水又は含水有機溶媒にて処理する再生工程を含んでいてもよい。再生工程を経ることにより、固定化リパーゼを適切な含水率に調整することができ、リパーゼ活性が再生する。なお、リパーゼ活性を再生できるのは、選抜工程で閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいものを選抜しているからである。
　水としては、超純水、蒸留水、イオン交換水、水道水、工業用水等を用いることができる。中でも、無機塩混入回避の観点から、イオン交換水、蒸留水を用いることが好ましい。含水有機溶媒としては、アセトン、エタノール、アセトニトリル、１－ブタノール等の有機溶媒に上述の水を含ませたものを用いることができる。含水有機溶媒の含水率は有機溶媒の種類により異なるが、例えば、有機溶媒としてアセトンを用いる場合、１．０％以上とすることができる。
　再生工程は、例えば、選抜工程で選抜された固定化リパーゼを水又は含水有機溶媒に接触させることにより行うことができる。当該接触は、例えば、温度－１０～５０℃の範囲内で、０．５～４８時間の範囲内で、固定化リパーゼの含水率を指標として適宜設定して行うことができる。指標となる固定化リパーゼの含水率は、リパーゼの種類及び固定化量、樹脂担体の種類等によって異なるが、例えば、固定化リパーゼが３．４ｗｔ％　Ａｍａｎｏ　ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔの場合、含水率５％以上であり、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５の場合、含水率０．０５％以上である。
〔固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法〕
　本実施形態に係る固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法は、固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化リパーゼを、リパーゼ活性のある固定化リパーゼと評価する、又はリパーゼ活性の一部若しくは全部を再生できる可能性のある固定化リパーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える。
　本実施形態に係る固定化リパーゼのリパーゼ活性評価方法における指標値及び閾値については、上記固定化リパーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
〔化合物の製造方法〕
　本実施形態に係る化合物の製造方法は、上記固定化リパーゼの製造方法により得られた固定化リパーゼ、又は上記再生固定化リパーゼの製造方法により得られた再生固定化リパーゼを用いることを特徴とする。当該化合物は、リパーゼによる触媒反応を経て製造される化合物である。
　上記化合物としては、エステル交換反応又はエステル加水分解反応を経て製造されるものであることが好ましく、例えば、油脂類とアルコールのエステル交換反応による燃料ディーゼル燃料、ポリカーボネートジオール（メタ）アクリレート化合物が挙げられる。これらの化合物の中でもポリカーボネートジオール（メタ）アクリレート化合物がより好ましい。
〔固定化ペルオキシダーゼの製造方法〕
　本明細書において、固定化ペルオキシダーゼとは、シリカ担体にペルオキシダーゼを吸着等により担持させたものをいう。
　ペルオキシダーゼは、ペルオキシド（－Ｏ－Ｏ－）を酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する反応を触媒する酵素であればよい。具体的には、例えば、西洋わさび（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）由来のペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ（和光純薬社製））、シトクロムｃペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、西洋わさび由来のペルオキシダーゼが好ましい。
　上述したペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼをコードする遺伝子を得て、酵母又は糸状菌等の適切な宿主を形質転換し、得られた遺伝子組換え体の培養物から得たものであってもよい。ペルオキシダーゼの組換え発現のために使用される組換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。
　ペルオキシダーゼは、上記ペルオキシダーゼの変異体であってもよい。例えば、上記ペルオキシダーゼのアミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、かつ少なくともペルオキシドを酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する活性を有するペルオキシダーゼであってもよい。また、上記ペルオキシダーゼに対しアミノ酸配列が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の配列同一性を示し、かつ少なくともペルオキシドを酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する活性を有するペルオキシダーゼであってもよい。
　シリカ担体は、大きな表面積を有することによりペルオキシダーゼの吸着量を高くできるという観点から、多孔質である多孔性シリカ担体であることが好ましい。シリカ担体としては、例えば、ＭＣＦｓ、ＦＳＭ－１６、ＭＣＭ－４１、ＭＣＭ－４８、ＳＢＡ－１５等のメソポーラスシリカが挙げられる。これらの中でも、特に酵素の吸着量が多いという観点から、ＭＣＦｓが好ましい。
　シリカ担体へのペルオキシダーゼの固定化は、例えば、共有結合、イオン結合、物理的吸着等による担体結合法等により行うことができる。中でも物理的吸着による担体結合法が簡便であるため好ましい。
　物理的吸着による固定化は、例えば、ペルオキシダーゼの水性溶液をシリカ担体に接触させることにより行うことができる。また、ペルオキシダーゼがシリカ担体に吸着し形成された固定化ペルオキシダーゼを水相から分離し、次いで分離した固定化ペルオキシダーゼを洗浄し、更に適切な含水率まで乾燥することを含んでもよい。
　物理的吸着により固定化する際の温度及びｐＨは、固定化するペルオキシダーゼの種類等に応じて適宜設定すればよい。多くのペルオキシダーゼでは、例えば、室温及び中性に近いｐＨで固定化することができる。シリカ担体とペルオキシダーゼの接触時間は、通常本質的に完全な吸着に対して必要とされるような時間が選ばれる。これは典型的には１～２時間から２４時間である。
　本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法は、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、当該正規分布に基づいて赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、指標値を予め設定された閾値と比較し、閾値よりも赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える。
　本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法において、指標値を、指標値７とした場合、指標値が７５ｃｍ－１（閾値）以下となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、７０ｃｍ－１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても６５ｃｍ－１程度である。
　本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法において、指標値を、指標値８とした場合、指標値が０．４５（閾値）以上となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．５０であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．７０程度である。
　本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼの製造方法は、常法に従ってペルオキシダーゼをシリカ担体に担持させた固定化ペルオキシダーゼを得る工程を含んでいてもよい。当該工程により得られる固定化ペルオキシダーゼの中には、不可逆的変性又は可逆的変性により触媒活性の低いものも含まれ得るが、上記検査工程を経ることによって、不可逆的変性と可逆的変性とを見分けることが可能となる。
　可逆的変性の場合、見かけ上触媒活性が低いものであるが、例えば、含水率を調整すること等により、触媒活性を再生することができる。
〔ペルオキシダーゼ活性評価方法〕
　本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性評価方法は、固定化ペルオキシダーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい固定化ペルオキシダーゼを、ペルオキシダーゼ活性のある固定化ペルオキシダーゼと評価するステップと、を含む評価工程を備える。
　本実施形態に係る固定化ペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性評価方法における指標値及び閾値については、上記固定化ペルオキシダーゼの製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
〔抗体の製造方法〕
　本明細書において、抗体とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよい。また、抗原結合能を保持した抗体のフラグメント（例えば、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２等）であってもよい。抗体はまた、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体であってもよい。
　本実施形態に係る抗体の製造方法は、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える。
　本実施形態に係る抗体の製造方法において、指標値を、指標値１とした場合、指標値が６５ｃｍ－１（閾値）以下となる抗体を良品として選抜することが好ましい。閾値は、６０ｃｍ－１であることがより好ましい。当該指標値は、通常小さくても５７ｃｍ－１程度である。
　本実施形態に係る抗体の製造方法において、指標値を、指標値６とした場合、指標値が０．９８（閾値）以上となる抗体を良品として選抜することが好ましい。閾値は、１．００であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても１．０９程度である。
　本実施形態に係る抗体の製造方法において、指標値を、指標値８とした場合、指標値が０．８５（閾値）以上となる抗体を良品として選抜することが好ましい。閾値は、０．９０であることがより好ましい。当該指標値は、通常大きくても０．９７程度である。
　本実施形態に係る抗体の製造方法は、常法に従って抗体を得る工程を含んでいてもよい。当該工程は、例えば、抗体をコードするＤＮＡを発現可能に組み換えた酵母、糸状菌、動物細胞、動物等を培養又は飼育することにより抗体を発現させ、細胞破砕物、培地、動物の乳等から発現した抗体を回収（精製）することにより行うことができる。本実施形態に係る抗体の製造方法で上記検査工程を経ることによって、充分な力価のある抗体を製造することが可能となる。
〔抗体活性評価方法〕
　本実施形態に係る抗体活性評価方法は、抗体の赤外吸収スペクトルにおいて、吸収バンドＩ又は吸収バンドＩＩを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、上記正規分布に基づいて上記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、上記指標値を予め設定された閾値と比較し、上記閾値よりも上記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい抗体を活性のある抗体と評価するステップと、を含む評価工程を備える。ここでいう抗体活性とは、例えば、抗体力価である。
　本実施形態に係る抗体活性評価方法における指標値及び閾値については、上記抗体の製造方法で説明したものと同様のものが例示できる。
　以下、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［１．固定化リパーゼの触媒活性評価］
＜ヘキシルアクリレートの定量方法＞
　ヘキシルアクリレートは、ガスクロマトグラフィー（内部標準法）により定量した。ガスクロマトグラフィーによる測定条件は以下のとおりである。
・ガスクロマトグラフ装置（ＧＣ２０１４，株式会社島津製作所製）
・分析カラム：ＤＢ－５（３０ｍ×０．５３ｍｍ　ＩＤ　１．０μｍ，株式会社島津製作所製）
・カラム温度：６０℃→２分間保持→１０℃／分→２００℃→２分間保持
・注入口温度：２００℃
・検出口温度（ＦＩＤ）：２５０℃
・キャリアーガス：ヘリウム
・線速度：２９．４ｃｍ／秒
・スプリット比：１：５０
・注入量：１．０μＬ
・保持時間
　ヘキシルアクリレート：９．３１分
　テトラエチレングリコールジメチルエーテル（内部標準物質）：１５．６分
＜エステル交換反応の比活性の算出方法＞
　上記の方法で定量した生成ヘキシルアクリレートの量を用いて、下記式に従い、各多孔性樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼのエステル交換反応の比活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
＜含水率測定方法＞
　水分計（ＭＯＣ６３ｕ，乾燥重量法，株式会社島津製作所製）を用いて、測定条件：標準乾燥自動停止モード（１２０℃：水分変化率０．０５％）にて、試料約１．０ｇを用いて、２反復測定後平均値を算出した。
＜ＦＴ－ＩＲスペクトルの測定方法＞
　各固定化リパーゼのＦＴ－ＩＲスペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴＳ７０００ｅ顕微ＵＭＡ６００；Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定した。
〔試験例１：指標値の算出〕
＜吸収バンドＩ＞
　ＦＴ－ＩＲスペクトルの１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の吸収バンドＩから以下の手順により指標値１～６を算出した。
（指標値１：単一の正規分布近似における半値幅）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて単一の正規分布で近似した。ＦＴ－ＩＲスペクトルを単一の正規分布で近似する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離した。その後、１６６０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドを、非線形最小二乗法によって単一の正規分布で近似し、指標値として半値幅を算出した。なお、非線形最小二乗法では、ピーク位置、半値幅及び強度を変数とした。
（指標値２：２つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ－ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６５６ｃｍ－１（Ａ１及びＡ２）の１点とし、また半値幅を４７ｃｍ－１（Ａ１）、８２ｃｍ－１（Ａ２）とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値２として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値２）＝Ａ１／Ａ２
　式中、Ａ１及びＡ２は、各吸収バンドの面積である。
（指標値３：３つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ－ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６８０ｃｍ－１（Ａ１）、１６５６ｃｍ－１（Ａ２）、１６３１ｃｍ－１（Ａ３）の３点とし、またそれぞれの半値幅を５０ｃｍ－１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値３として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値３）＝Ａ２／（Ａ１＋Ａ３）
　式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、各吸収バンドの面積である。
（指標値４：５つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ－ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６８５ｃｍ－１（Ａ１）、１６７０ｃｍ－１（Ａ２）、１６５６ｃｍ－１（Ａ３）、１６４１ｃｍ－１（Ａ４）及び１６２６ｃｍ－１（Ａ５）の５点とし、またそれぞれの半値幅を３０ｃｍ－１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値４として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値４）＝Ａ３／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ４＋Ａ５）
　式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、各吸収バンドの面積である。
（指標値５及び指標値６：８つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ－ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１７２０ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１６６０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１６９２ｃｍ－１（Ａ１）、１６８２ｃｍ－１（Ａ２）、１６７０ｃｍ－１（Ａ３）、１６５８ｃｍ－１（Ａ４）、１６４８ｃｍ－１（Ａ５）、１６３８ｃｍ－１（Ａ６）、１６２９ｃｍ－１（Ａ７）及び１６１９ｃｍ－１（Ａ８）の８点とし、またそれぞれの半値幅を１９ｃｍ－１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値５及び指標値６として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値５）＝（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ６＋Ａ７＋Ａ８）
　式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８は、各吸収バンドの面積である。
吸収バンド面積比（指標値６）＝（Ａ４＋Ａ５）／（Ａ２＋Ａ３＋Ａ８）
　式中、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５及びＡ８は、各吸収バンドの面積である。
＜吸収バンドＩＩ＞
　ＦＴ－ＩＲスペクトルの１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の吸収バンドＩＩから以下の手順により指標値７～８を算出した。
（指標値７：単一の正規分布近似における半値幅）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて単一の正規分布で近似した。ＦＴ－ＩＲスペクトルを単一の正規分布で近似する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１４００～１５００ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離した。その後、１５００～１５７０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドを、非線形最小二乗法によって単一の正規分布で近似し、指標値として半値幅を算出した。なお、非線形最小二乗法では、ピーク位置、半値幅及び強度を変数とした。
（指標値８：３つの正規分布に波形分離したときの吸収バンド面積比）
　各固定化リパーゼについて、得られたＦＴ－ＩＲスペクトルを表計算ソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて波形分離し、吸収バンド面積比を求めた。ＦＴ－ＩＲスペクトルを波形分離する際、まず、１８００及び１５７５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行った。次いで、１４００～１５００ｃｍ－１付近に出現する多孔性樹脂担体に由来する吸収バンドを、ガウス関数を用いて分離し、その後、１５００～１５７０ｃｍ－１付近に出現するリパーゼに由来する吸収バンドの波形分離を行った。フィッティングに用いるガウス関数の初期値として、波数のバンド位置を１５７０ｃｍ－１（Ｂ１）、１５４５ｃｍ－１（Ｂ２）、１５１８ｃｍ－１（Ｂ３）の３点とし、またそれぞれの半値幅を３１ｃｍ－１とした。非線形最小二乗法によって各吸収バンドを分離し、得られた各吸収バンドの面積を用いて、下記式に従い指標値８として吸収バンド面積比を算出した。
吸収バンド面積比（指標値８）＝Ｂ２／（Ｂ１＋Ｂ３）
　式中、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、各吸収バンドの面積である。
　図２～８にリパーゼ由来の赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似した例、及び波形分離した例を示した。図２は、試験例１７で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ　４３５）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを単一の正規分布で近似した例を示す。図３は、試験例１７で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ　４３５）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを２つの正規分布に波形分離した例を示す。図４は、試験例１７で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ　４３５）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを３つの正規分布に波形分離した例を示す。図５は、試験例３で触媒として使用した固定化リパーゼ（３．４ｗｔ％　Ａｍａｎｏ　ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。図６は、試験例１１で触媒として使用した固定化リパーゼ（３．４ｗｔ％　Ａｍａｎｏ　ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。図７は、試験例１４で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ　４３５）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。図８は、試験例１５で触媒として使用した固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ　４３５）のＦＴ－ＩＲスペクトルと、リパーゼ由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した各バンドを示したグラフである。
〔試験例２：固定化リパーゼＰＳ（３．４ｗｔ％　Ａｍａｎｏ　ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ）の調製〕
　リパーゼＰＳ「アマノ」ＳＤＨ（アマノエンザイム社製）１５０ｇに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．６Ｌと純水を加え溶解後、３Ｌに定容し、固定化液を調製した。そこに多孔性樹脂担体（ＬＥＷＡＴＩＴ　ＶＰＯＣ　１６００、ＬＡＮＸＥＳＳ社製）６００ｇを加え、６℃にて１２時間攪拌した。その後、デカンテーションにて担体を回収し、純水で洗浄後、減圧乾燥し、固定化リパーゼ（リパーゼ固定化量３．４ｗｔ％）３５２ｇを得た。この固定化リパーゼを「固定化リパーゼＰＳ」又は「３．４ｗｔ％　Ａｍａｎｏ　ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔ」と呼ぶ。
　なお、リパーゼ固定化量は、固定化後上清中のタンパク濃度をＢＣＡ法によりＢＳＡ基準にてタンパク濃度を測定し、固定化前後のタンパク濃度減少分を、担体への固定化量として、総固定化タンパク量を算出した。
〔試験例３：ヘキシルアクリレートの合成〕
　攪拌装置及び温度調節装置を備えた内容積２０ｍＬのガラス製試験管に、１－ヘキサノール０．２ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、アクリル酸メチル１．６ｇ（１８．６ｍｍｏｌ）、テトラエチレングリコールジメチルエーテル０．０４ｇ（０．２ｍｍｏｌ）、及び触媒として、含水率が７．１％の固定化リパーゼＰＳを加えて、撹拌しながら４０℃で反応させた。１時間後、反応液を取り出し、上述の方法によりエステル交換反応の比活性を算出した。エステル交換反応の比活性は２５９．３ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１だった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５４．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は、１．７５であった。
〔試験例４：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、含水率が１．０％の固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１６．５ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５４．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．７３であった。
〔試験例５：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のメタノールに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を７１．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は８９．８ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．４６であった。
〔試験例６：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のトルエンに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を５０．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２１６．１ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５４．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．６８であった。
〔試験例７：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のアセトンに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を５２．４％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１６９．７ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．４４であった。
〔試験例８：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のアセトニトリルに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を５８．６％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１２７．４ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６３．５ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．３３であった。
〔試験例９：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃の１－ブタノールに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を６５．５％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は７９．７ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６５．８ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．３８であった。
〔試験例１０：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のエタノールに２時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を６０．２％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は８７．０ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６５．８ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．２４であった。
〔試験例１１：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、大気中２３０℃で１時間保持し、その後精製水で洗浄して含水率を４０．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。生成物であるヘキシルアクリレートは観測されなかった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７０．５ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．９５であった。
〔試験例１２：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、固定床流通式エステル交換反応に３ヶ月使用し、トルエンで洗浄した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１３．６ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．２８であった。
〔試験例１３：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、実施例１２と同じ固定床流通式エステル交換反応に３ヶ月使用し、トルエンで洗浄した後、含水率５％のアセトンに６℃で一晩浸し、含水率を４６．１％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は８８．２ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．３３であった。
〔試験例１４：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃の酢酸水溶液（ｐＨ２）に２時間浸した後、精製水で洗浄して含水率を２５．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２０９．６ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．５５であった。
〔試験例１５：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃の塩酸水溶液（ｐＨ４）に１６時間浸した後、精製水で洗浄して含水率を１２．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２２０．５ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．５１であった。
〔試験例１６：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、７０℃の塩酸水溶液（ｐＨ４）に１６時間浸した後、精製水で洗浄して含水率を３３．０％に調整した固定化リパーゼＰＳを使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は５６．１ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６５．８ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．２１であった。
〔試験例１７：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、含水率が１．０％のＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３４６．４ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．６ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．７２であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．８７であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．４９であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．７０であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．４２であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は３７．６ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．７５であった。なお、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５は、多孔性樹脂担体にリパーゼＣａｌＢを固定化した固定化リパーゼである。
〔試験例１８：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のメタノールに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は９８．６ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７０．５ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．２６であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．８８であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．３１であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．５８であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．０６であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は４４．７ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．１３であった。
〔試験例１９：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のトルエンに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３９２．６ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．９２であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は２．１０であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．５０であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．６９であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．４８であった。
〔試験例２０：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のアセトンに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３８４．４ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は１．０５であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は２．５０であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．５３であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．７３であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．５８であった。
〔試験例２１：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃のアセトニトリルに３時間浸した後、真空乾燥により含水率を１．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３７５．９ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．４ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．８８であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は２．２０であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．４８であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．７４であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．５５であった。
〔試験例２２：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、大気中２３０℃で１時間保持し、含水率を０．１％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。生成物であるヘキシルアクリレートは観測されなかった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は８２．３ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．４７であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．２５であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．４５であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．８５であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は４７．０ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．５８であった。
〔試験例２３：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃の酢酸水溶液（ｐＨ＝２）に２時間浸した後、真空乾燥により含水率を９．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は２２４．２ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．８ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．５９であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．６３であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．４５であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．６６であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．３９であった。
〔試験例２４：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、２５℃の塩酸水溶液（ｐＨ＝４）に１６時間浸した後、真空乾燥により含水率を３．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は３５１．６ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．８ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．５５であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．９７であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．５０であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０７０であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．４２であった。
〔試験例２５：ヘキシルアクリレートの合成〕
　触媒として、７０℃の塩酸水溶液（ｐＨ＝４）に１６時間浸した後、真空乾燥により含水率を５．０％に調整したＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５を使用したこと以外は、試験例３と同様に反応を行った。エステル交換反応の比活性は１８７．８ｍｍｏｌ・ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６１．１ｃｍ－１であり、指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）は０．４９であり、指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．３８であり、指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）は０．３７であり、指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．６３であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．３１であり、指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は４０．０ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は１．６７であった。
　上記の試験例の結果を下記表１にまとめた。また、図９～１６に各指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）及びリパーゼのエステル交換反応の比活性等をプロットしたグラフを示した。
　図９は、試験例１７～２５の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対してリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。
　図１０は、試験例１７、１８、２２及び２５の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対して指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
　図１１は、試験例３～１６の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対してリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。なお、試験例４及び試験例１２の結果（図中、各試験例に対応する数字をプロットに付した。）については後述する。
　図１２は、試験例１７～２５の指標値２（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－２つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
　図１３は、試験例１７～２５の指標値３（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
　図１４は、試験例１７～２５の指標値４（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－５つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
　図１５は、試験例１７～２５の指標値５（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
　図１６は、試験例３～２５の指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）とリパーゼのエステル交換反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び図９～１６から明らかなように、充分な含水率の固定化リパーゼ（可逆的変性を受けていないと考えられる）は、指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）と触媒活性（エステル交換反応の比活性）とに線形近似可能な相関が認められる。この相関関係から、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値（例えば、指標値６の場合は１．２以上）以上の固定化リパーゼは、触媒活性又は潜在的な触媒活性が充分であると評価することができる。
　また、試験例１２及び試験例１３の対比から、含水有機溶媒を用いた処理により可逆的変性を解消することによって、吸収バンド面積比に対応した触媒活性を再生可能であることが理解できる。すなわち、試験例１３の固定化リパーゼは、試験例１２の固定化リパーゼを含水率５％のアセトンで処理したものである。表１の結果から明らかなように当該処理により触媒活性が再生され、例えば図１６に示したとおり、３．４ｗｔ％　Ａｍａｎｏ　ＰＳ／Ｌｅｗａｔｉｔの線形近似曲線（図示せず）上に入った。試験例１３及び試験例１２の固定化リパーゼは、ほぼ同等の指標値（例えば、指標値１の半値幅はいずれも６１．１ｃｍ－１であり、指標値６の吸収バンド面積比は、それぞれ１．３３及び１．２８である。）を有するものである。
　さらに、試験例３及び試験例４の対比からも可逆的変性を解消することによって、吸収バンド面積比に対応した触媒活性を再生可能であることが理解できる。試験例３及び試験例４の固定化リパーゼは、含水率のみが異なり（含水率の低い試験例４の固定化リパーゼは可逆的変性を受けていると考えられる）、同等の指標値を有している。
　実際に触媒反応を行い触媒活性を測定することにより固定化リパーゼの触媒活性を評価する従来の方法では、例えば、試験例１２及び試験例４の固定化リパーゼは、触媒活性の再生が可能であるにも関わらず、不良品としてはじかれてしまう。一方、本発明の方法によれば、試験例１２及び試験例４の固定化リパーゼは、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値以上あるため、触媒活性を再生可能な固定化リパーゼとして選抜することができる。
［２．固定化ペルオキシダーゼの触媒活性評価］
＜ｏ－フェニレンジアミンの酸化物の定量方法＞
　ｏ－フェニレンジアミンの酸化物は、紫外可視分光光度計でＵＶ－ｖｉｓスペクトルを測定することにより定量した。紫外可視分光光度計による測定条件は以下のとおりである。
・紫外可視分光光度計（ＵＶ２４５０、株式会社島津製作所製）
・ピーク波長：４２０ｎｍ
＜酸化反応の比活性の算出方法＞
　上記の方法で測定したｏ－フェニレンジアミンの酸化物に由来するＵＶ－ｖｉｓスペクトルのピーク強度（４２０ｎｍにおける吸収強度）を用いて、下記式に従い、固定化ペルオキシダーゼの酸化反応の比活性を算出した。なお、オキシダーゼ重量は、ＢＣＡ法によりＢＳＡ基準にて求めたペルオキシダーゼの重量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
＜含水率測定方法＞
　固定化リパーゼの場合と同様の方法で含水率を測定した。
〔試験例２６：指標値の算出〕
　１８００及び１５４５ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行ったこと以外は、試験例１と同様にして指標値を算出した。
〔試験例２７：固定化ペルオキシダーゼ（２．６ｗｔ％　ＨＲＰ／ＭＣＦｓ）の調製〕
　３３．２ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｐ－１２３に、２０％％ＨＣｌ水溶液及び精製水をそれぞれ４００ｇ及び２００ｇずつ加え、次いで、メシチレンを２３．５ｇ加えた。その後、４０℃に加熱したウォーターバスに浸し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｐ－１２３を十分に溶解させた。その後、テトラエトキシシランを７０．０ｇ加え、５分間撹拌した後、３０℃で２０時間静置させた。得られた白色スラリーに、フッ化アンモニウム水溶液（０．３８ｇ／４０ｇ－Ｈ２Ｏ）を加え、１００℃で２４時間熟成させた。その後、５００ｍＬの精製水－エタノール混合液で洗浄、濾過した後、１００℃のオーブンで一晩乾燥させた。得られた白色粉体を大気雰囲気下、５００℃まで５時間かけて昇温し、そのままの温度で５時間保持した。得られた白色粉末（Ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ　Ｍｅｓｏｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｆｏａｍｓ，ＭＣＦｓ）を、「シリカ担体」又は「ＭＣＦｓ」と呼ぶ。窒素吸脱着測定によって求めたシリカ担体の比表面積及び平均細孔径は、それぞれ５９７ｍ２・ｇ－１及び２４．４ｎｍだった。
　西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ，１００ｕｎｉｔｓ・ｍｇ－１、和光純薬製）８２ｍｇを、８．１ｇの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解させて固定化原液とした。固定化原液を７．０ｇ秤量し、そこに担体を０．３５ｇ添加した。得られたスラリーを７℃で２４時間攪拌した。ペルオキシダーゼ固定化量は、固定化原液のタンパク質濃度と、スラリーを遠心分離して得られた上澄み液中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ法により定量し、両者の差分から算出した。その結果、ペルオキシダーゼ固定化量は２．６ｗｔ％であった。この固定化ペルオキシダーゼを、「固定化ペルオキシダーゼ」又は「２．６ｗｔ％　ＨＲＰ／ＭＣＦｓ」と呼ぶ。
〔試験例２８：ｏ－フェニレンジアミンの酸化反応〕
　攪拌装置及び温度調節装置を備えた内容積２０ｍＬのガラス製試験管に、０．１Ｍ　ｏ－フェニレンジアミンのトルエン溶液２．５ｍＬ、１．１Ｍ　ｔ－ブチルヒドロペルオキシドのデカン溶液０．６ｍＬ、及び触媒として、含水率が３４．９％の固定化ペルオキシダーゼを加えて、攪拌しながら３５℃で反応させた。１時間後、反応液を取り出し、上述の方法により酸化反応の比活性を算出した。酸化反応の比活性は、３８９９．９ｈ－１・ｇ－１だった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は６５．７ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．７０であった。
〔試験例２９：ｏ－フェニレンジアミンの酸化反応〕
　触媒として、２５℃のメタノールに３時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を２２．７％に調整した固定化ペルオキシダーゼを使用したこと以外は、試験例２８と同様に反応を行った。酸化反応の比活性は１０１６．０ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は７５．１ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．４０であった。
〔試験例３０：ｏ－フェニレンジアミンの酸化反応〕
　触媒として、１１０℃のトルエンに３時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を２８．５％に調整した固定化ペルオキシダーゼを使用したこと以外は、試験例２８と同様に反応を行った。酸化反応の比活性は２８４１．５ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は７１．１ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．６２であった。
〔試験例３１：ｏ－フェニレンジアミンの酸化反応〕
　触媒として、６０℃のＨＣｌ水溶液（ｐＨ３．５）に３時間浸し、その後精製水で洗浄して含水率を２５．３％に調整した固定化ペルオキシダーゼを使用したこと以外は、試験例２８と同様に反応を行った。酸化反応の比活性は２３７４．８ｈ－１・ｇ－１であった。また、上述の方法により求めた指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）は７０．５ｃｍ－１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．５８であった。
　試験例２８～３１の結果を下記表２にまとめた。また、図１７～１８にペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似した例、及び波形分離した例を示した。図１９～２０に各指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）及びペルオキシダーゼの酸化反応の比活性をプロットしたグラフを示した。
　図１７は、試験例２８で触媒として使用した固定化ペルオキシダーゼのＦＴ－ＩＲスペクトルと、ペルオキシダーゼ由来の吸収バンドＩＩを単一の正規分布で近似した例を示す。図１８は、試験例２８で触媒として使用した固定化ペルオキシダーゼのＦＴ－ＩＲスペクトルと、ペルオキシダーゼ由来の吸収バンドＩＩを３つの正規分布に波形分離した例を示す。
　図１９は、試験例２８～３１の指標値７（吸収バンドＩＩ、半値幅）に対してペルオキシダーゼの酸化反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。
　図２０は、試験例２８～３１の指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）に対してペルオキシダーゼの酸化反応の比活性をプロットしたグラフである。線形近似可能な正の相関が認められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２及び図１９～２０から明らかなように、充分な含水率の固定化ペルオキシダーゼ（可逆的変性を受けていないと考えられる）は、指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）と触媒活性（酸化反応の比活性）とに線形近似可能な相関が認められる。この相関関係から、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値以上の固定化ペルオキシダーゼは、触媒活性又は潜在的な触媒活性が充分であると評価することができる。
［３．抗体の力価評価］
＜抗体の力価測定方法＞
　抗体（ＩｇＧ）の力価は、直接吸着法ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）により測定した。
　抗原（ニワトリＩｇＧ）５０μｇにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ：１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．４）、０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ）緩衝液を加え、１０００ｎｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。１０００ｎｇ／ｍＬの抗原溶液から、ＰＢＳにより２倍希釈により、１０００，５００，２５０，１２５，６３，３１，１６ｎｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。各抗原溶液５０μＬを９６穴プレートの各ウェルに加え、５分放置し、各ウェルに吸着させた。各ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、抗原が吸着した９６穴プレートを得た。
　力価測定対象となる抗体を０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで溶解希釈し、１μｇ／ｍＬの抗体溶液（１次抗体溶液という）とした。１次抗体溶液５０μＬを抗原が吸着した９６穴プレートの各ウェルに加え、５分間放置し、抗原に結合させた。各ウェルを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した。
　西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギ抗体５０μｇを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで溶解希釈し、１μｇ／ｍＬの抗体溶液（２次抗体溶液という）とした。２次抗体溶液５０μＬを１次抗体を結合させた９６穴プレートの各ウェルに加え、５分間放置し、１次抗体に結合させた。各ウェルを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄した。
　酵素基質溶液（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）５０μＬを２次抗体を結合させた９６穴プレートの各ウェルに加え、室温で５分間放置した後、マイクロプレートリーダー（テカン社製）で６５５ｎｍの吸光度を測定した。
〔試験例３２：指標値の算出〕
　１７２０及び１４９０ｃｍ－１の赤外吸収強度が０になるようにベースライン補正を行ったこと以外は、試験例１と同様にして指標値を算出した。
〔試験例３３：抗体力価の測定〕
　抗ニワトリＩｇＧウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　ｉｎｃ製）溶液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬにポリエチレングリコール（ＰＥＧ：平均分子量２０，０００）４５ｍｇを加え、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに溶解し、抗体溶液とした。抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取し、直ちに－２０℃で凍結乾燥させた。凍結乾燥後の抗体を力価測定、及び顕微ＡＴＲ法によるＦＴ－ＩＲスペクトル測定に用いた。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３３は、「－２０℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．０ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．０９であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９７であった。
〔試験例３４：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３４は、「４℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．６ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．０３であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９２であった。
〔試験例３５：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２５℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３５は、「２５℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．７ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．００であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９４であった。
〔試験例３６：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３６は、「５０℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．４ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．０２であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９３であった。
〔試験例３７：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、７５℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３７は、「７５℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６６．０ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．９６であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．８０であった。
〔試験例３８：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、９０℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３及び図２３に示す（図２３中、試験例３８は、「９０℃」のプロットに対応する）。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７０．６ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．９２であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．７９であった。
〔試験例３９：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、１０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．９ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は０．９８であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９５であった。
〔試験例４０：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５６．７ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．０１であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９７であった。
〔試験例４１：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．０ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．００であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９６であった。
〔試験例４２：抗体力価の測定〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例３３と同様に測定を行った。抗体の力価を測定した結果を表３に示す。また、上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．８ｃｍ－１であり、指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）は１．００であり、指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）は０．９３であった。
〔試験例４３：指標値の算出〕
　抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体（Ａｎｔｉ　Ｗｈｉｔｅ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、コスモバイオ株式会社製）溶液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬにポリエチレングリコール（ＰＥＧ：平均分子量２０，０００）４５ｍｇを加え、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに溶解し、抗体溶液とした。抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取し、直ちに－２０℃で凍結乾燥させた。凍結乾燥後の抗体を顕微ＡＴＲ法によるＦＴ－ＩＲスペクトル測定に用いた。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．１ｃｍ－１であった。
〔試験例４４：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５７．４ｃｍ－１であった。
〔試験例４５：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２５℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．６ｃｍ－１であった。
〔試験例４６：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６２．５ｃｍ－１であった。
〔試験例４７：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、７５℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は７２．５ｃｍ－１であった。
〔試験例４８：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、９０℃で２４時間静置してから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は９４．０ｃｍ－１であった。
〔試験例４９：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、１０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５８．４ｃｍ－１であった。
〔試験例５０：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、２０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５９．０ｃｍ－１であった。
〔試験例５１：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、４０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は５９．９ｃｍ－１であった。
〔試験例５２：指標値の算出〕
　抗体溶液０．５ｍＬを試験管に分取した後、５０％ｖ／ｖとなるようアセトンを加え、２５℃で２４時間静置し、１０分間窒素パージしてアセトンを揮散させてから－２０℃で凍結乾燥させたこと以外は試験例４３と同様に測定を行った。上述の方法により求めた指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）は６２．０ｃｍ－１であった。
　試験例３３～５２の結果を下記表３にまとめた。また、図２１～２２に抗体由来の赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似した例、及び波形分離した例を示した。図２４～２５に各指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）及び抗体力価をプロットしたグラフを示した。
　図２１は、試験例３３で凍結乾燥した抗体のＦＴ－ＩＲスペクトルと、抗体由来の吸収バンドＩ及び吸収バンドＩＩを単一の正規分布で近似した例を示す。図２２は、試験例３３で凍結乾燥した抗体のＦＴ－ＩＲスペクトルと、抗体由来の吸収バンドＩを８つの正規分布に波形分離した例、及び吸収バンドＩＩを３つの正規分布に波形分離した例を示す。
　図２４は、試験例３３～４２の指標値１（吸収バンドＩ、半値幅）に対して抗体の力価をプロットしたグラフである。線形近似可能な負の相関が認められる。
　図２５は、試験例３３～４２の指標値６（吸収バンドＩ、吸収バンド面積比－８つの正規分布）、及び指標値８（吸収バンドＩＩ、吸収バンド面積比－３つの正規分布）に対して抗体の力価をプロットしたグラフである。いずれの指標値においても線形近似可能な正の相関が認められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表３及び図２４～２５から明らかなように、指標値（半値幅又は吸収バンド面積比）と抗体力価とに線形近似可能な相関が認められる。この相関関係から、半値幅が所定値以下、又は吸収バンド面積比が所定値以上の抗体は、力価が充分であると評価することができる。

Claims (33)

  1. 　タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、
    　前記正規分布に基づいて前記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、
    　前記指標値を予め設定された閾値と比較し、前記閾値よりも前記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を良品として選抜するステップと、を含む検査工程を備える、タンパク質の製造方法。
  2. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドを複数の正規分布に波形分離し、前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、前記赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドを、いずれも前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、前記２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドをＡ１～Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離し、
    　前記ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１～Ａｎ／２－１及びＡｎ／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であり、
    　前記ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１～Ａ（ｎ＋１）／２－１及びＡ（ｎ－１）／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値である、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　前記タンパク質が、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼである、請求項１に記載の製造方法。
  7. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が７０ｃｍ－１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１及びＡ２の２つの正規分布に波形分離し、Ａ１の面積をＡ２の面積で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記２つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅４７ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅８２ｃｍ－１）の２つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．２７以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  9. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２及びＡ３の３つの正規分布に波形分離し、Ａ２の面積をＡ１及びＡ３の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８０ｃｍ－１、半値幅５０ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅５０ｃｍ－１）及びＡ３（ピーク位置１６３１ｃｍ－１、半値幅５０ｃｍ－１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．９以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  10. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５の５つの正規分布に波形分離し、Ａ３の面積をＡ１、Ａ２、Ａ４及びＡ５の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記５つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６８５ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６５６ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６４１ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）及びＡ５（ピーク位置１６２６ｃｍ－１、半値幅３０ｃｍ－１）の５つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．３５以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  11. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ６、Ａ７及びＡ８の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）の８つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．６以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  12. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ２、Ａ３及びＡ８の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）の８つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  13. 　前記指標値が、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が４４ｃｍ－１以下となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  14. 　前記指標値が、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記リパーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が１．２以上となる固定化リパーゼを良品として選抜する、請求項６に記載の製造方法。
  15. 　前記固定化リパーゼが、エステル交換活性又はエステル加水分解活性を有する、請求項６～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. 　前記リパーゼが、バルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）又はカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼである、請求項６～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. 　前記タンパク質が、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼである、請求項１に記載の製造方法。
  18. 　前記指標値が、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が７５ｃｍ－１以下となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜する、請求項１７に記載の製造方法。
  19. 　前記指標値が、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れるペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドを、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記ペルオキシダーゼ由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．４５以上となる固定化ペルオキシダーゼを良品として選抜する、請求項１７に記載の製造方法。
  20. 　前記タンパク質が、抗体である、請求項１に記載の製造方法。
  21. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンドを、単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅であり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が６５ｃｍ－１以下となる抗体を良品として選抜する、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　前記指標値が、１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンドを、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ８の８つの正規分布に波形分離し、Ａ４及びＡ５の面積の総和をＡ２、Ａ３及びＡ８の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記抗体由来の赤外吸収バンドの面積と、前記８つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ａ１（ピーク位置１６９２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ２（ピーク位置１６８２ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ３（ピーク位置１６７０ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ４（ピーク位置１６５８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ５（ピーク位置１６４８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ６（ピーク位置１６３８ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）、Ａ７（ピーク位置１６２９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）及びＡ８（ピーク位置１６１９ｃｍ－１、半値幅１９ｃｍ－１）の８つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．９８以上となる抗体を良品として選抜する、請求項２０に記載の製造方法。
  23. 　前記指標値が、１５００～１６００ｃｍ－１付近に現れる抗体由来の赤外吸収バンドを、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の３つの正規分布に波形分離し、Ｂ２の面積をＢ１及びＢ３の面積の総和で割った値であり、
    　前記波形分離は、前記抗体由来の赤外吸収バンドの面積と、前記３つの正規分布の面積の総和との差の絶対値が最小となるように、Ｂ１（ピーク位置１５７０ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）、Ｂ２（ピーク位置１５４５ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）及びＢ３（ピーク位置１５１８ｃｍ－１、半値幅３１ｃｍ－１）の３つの正規分布に波形分離するものであり、
    　前記選抜するステップにおいて、前記指標値が０．８５以上となる抗体を良品として選抜する、請求項２０に記載の製造方法。
  24. 　前記赤外吸収スペクトルが、減衰全反射法により測定されたものである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の製造方法。
  25. 　リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼから、リパーゼ活性の一部又は全部が再生された再生固定化リパーゼを製造する製造方法であって、
    　固定化リパーゼは、樹脂担体にリパーゼが固定化されたものであり、
    　前記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼの赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるリパーゼ由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、
    　前記正規分布に基づいて前記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、
    　前記指標値を予め設定された閾値と比較し、前記閾値よりも前記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さい前記リパーゼ活性が減少した固定化リパーゼをリパーゼ活性が再生する可能性のあるものとして選抜するステップと、を含む選抜工程を備える、再生固定化リパーゼの製造方法。
  26. 　タンパク質の赤外吸収スペクトルにおいて、１５００～１６００ｃｍ－１付近又は１６００～１７００ｃｍ－１付近に現れるタンパク質由来の赤外吸収バンドを、１又は複数の正規分布に近似するステップと、
    　前記正規分布に基づいて前記赤外吸収バンドの広がりの度合いを示す指標値を算出するステップと、
    　前記指標値を予め設定された閾値と比較し、前記閾値よりも前記赤外吸収バンドの広がりの度合いが小さいタンパク質を活性のあるタンパク質と評価するステップと、を含む評価工程を備える、タンパク質活性評価方法。
  27. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドを単一の正規分布で近似したときの当該正規分布の半値幅である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
  28. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドを複数の正規分布に波形分離し、前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近の１又は複数の正規分布の面積の総和を、前記赤外吸収バンドの端付近の１又は複数の正規分布の面積の総和で割った値である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
  29. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドを、いずれも前記赤外吸収バンドのピークトップ位置付近に頂点を有し、かつ、互いに異なる半値幅を有する２つの正規分布に波形分離し、前記２つの正規分布のうち半値幅が小さい方の正規分布の面積を、半値幅が大きい方の正規分布の面積で割った値である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
  30. 　前記指標値が、前記赤外吸収バンドをＡ１～Ａｎのｎ個（ｎは３以上の整数）の正規分布に波形分離し、
    　前記ｎが偶数のとき、Ａｎ／２及びＡｎ／２＋１の少なくとも一方又は両方の面積の総和をＡ１～Ａｎ／２－１及びＡｎ／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値であり、
    　前記ｎが奇数のとき、Ａ（ｎ＋１）／２の面積をＡ１～Ａ（ｎ＋１）／２－１及びＡ（ｎ－１）／２＋２～Ａｎからなる群より選択される少なくとも一つの面積の総和で割った値である、請求項２６に記載のタンパク質活性評価方法。
  31. 　前記タンパク質が、樹脂担体にリパーゼが固定化されてなる固定化リパーゼである、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のタンパク質活性評価方法。
  32. 　前記タンパク質が、シリカ担体にペルオキシダーゼが固定化されてなる固定化ペルオキシダーゼである、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のタンパク質活性評価方法。
  33. 　前記タンパク質が、抗体である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のタンパク質活性評価方法。
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