JP2826965B2 - 免疫吸着体とその製造法 - Google Patents
免疫吸着体とその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫吸着体及びその製
造法に関するものである。更に詳細には、本発明は、抗
原結合能のきわめて高い免疫吸着体及びその製造法に関
するものである。一般に、免疫吸着体は免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィーの担体、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）の固相、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の固相、
免疫センサー、ラテックス凝集反応用のラテックス、免
疫比濁法やレーザーネフェロメトリーの凝集体等に広く
活用されており、本発明はこのように広範囲の用途をも
つ有用な免疫吸着体を提供するものである。 【０００２】 【従来の技術及び課題】免疫吸着体を用いる免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーは、有用な生理活性物質の
精製方法として、活用されはじめており、インターフェ
ロンの精製は、その一例である。しかし、従来の免疫吸
着体は、固定化方法に問題があったために、せっかく固
定化した抗体も抗原との結合活性が著しく低下して、免
疫吸着体の抗原に対する結合容量は小さなものであっ
た。また、非特異的吸着を引き起こす様な解離基、疎水
性基が導入されることも多く、せっかく精製した抗原に
若干不純物が混入することが多かった。固定化に使われ
る高純度の抗体、もしくはモノクローナル抗体は非常に
高価であり、かつ、上記の様な問題点もあるために免疫
アフィニティークロマトグラフィーの産業界への利用は
十分に進んでいない。しかし、遺伝子操作、細胞培養等
で作製した有用な生理活性物質の精製など、高純度を必
要とするものの精製に免疫アフィニティークロマトグラ
フィーは期待されており、抗体の活性を失うことの少な
い、抗原を結合する能力の大きな免疫吸着体は、多くの
分野で待望されているものである。また、酵素免疫測定
法（ＥＩＡ）やラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、ラ
テックス凝集反応、免疫比濁法（ＴＩＡ）などには、抗
体を物理的に吸着させた免疫吸着体（ポリスチレンボー
ル、ガラスボール、９６穴マイクロウエル、ポリスチレ
ン製ラテックス、カオリン）が使われることが多い。し
かしこれらは、物理的吸着であるために、抗体が担体か
ら剥離することが多く、免疫吸着体としての性質の時間
的な変化が生じるなどの欠点が多い。また、共有結合法
によって固定化する方法もあるが、従来の共有結合法で
は、非特異的な結合によって固定化されており、固定化
した抗体の抗原に対する結合活性が著しく低下するなど
の問題点があるために、物理的吸着法よりもさらに欠点
が多く、実用には適さなかった。即ち、従来知られてい
た免疫吸着体の共有結合法による作製方法は次の通りで
ある。 １）ＣＮＢｒ活性化担体に、抗体の非解離アミノ基で結
合させる。 ２）カルボキシル基を持つ担体に、カルボジイミドを使
って、抗体のアミノ基をペプチド結合で結合させる。 ３）アミノ基を持つ担体に、カルボジイミドを使って、
担体のカルボキシル基をベプチド結合で結合させる。 ４）エポキシ活性化担体に、抗体のアミノ基もしくはＯ
Ｈ基を結合させる。 ５）プロティンＡもしくはStaphylococcus aureusの死
菌体を固定化した担体にＩｇＧを吸着させ、その後プロ
ティンＡとＩｇＧとを架橋試薬を用いて架橋する。 １）〜４）の方法は、抗体分子上にあるアミノ基もしく
はカルボキシル基で担体と結合させようとするものであ
るが、抗体の表面には多くのアミノ基やカルボキシル基
が存在し、またこれらの基を持つアミノ酸残基は親水性
を示すことが多く、抗体分子の表面に多く存在する。そ
のために担体と非常に多くの位置で結合し、抗体分子の
構造に悪影響を与え、抗体の活性が著しく低下する。ま
た、抗体の抗原との結合部位付近には最も反応性の高い
αアミノ基が存在し、１）、２）、４）の方法で抗体を
固定化した場合には、抗原との結合部位で担体と結合す
ることが多く、抗体の活性も極端に低下する。５）の方
法は、プロティンＡとＩｇＧとを架橋する時に、１）〜
４）の方法と同様に著しく活性が低下する。またプロテ
ィンＡと結合しない抗体も多いために用途が限られる。
上記１）〜５）方法で抗体を固定化した時の抗体活性の
残存率は数％〜１０％程度であるに過ぎないのである。 【０００３】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
に活性の低い免疫吸着体の現状を打破するために鋭意研
究したところ、還元しても抗体の活性の低下を引き起こ
さないヒンジ部分のＳ−Ｓ結合を還元し、−ＳＨ基と
し、このＳＨ基とＳＨ基を有する担体のＳＨ基とを、１
分子内にマレイミド基を２ケ以上有する化合物を用い
て、架橋して免疫吸着体を作製したとき、抗体の活性を
ほとんど低下させないで固定しうることを知ったのであ
る。 本発明は、この知見により完成されたもので、抗
体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合のみを選択的に還元
し、得られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ基を
有する担体のＳＨ基とを、１分子内にマレイミド基を２
ケ以上有する化合物を用いて、架橋してなる免疫吸着体
に関するものである。また、本発明は、抗体のヒンジ部
分にあるＳ−Ｓ結合のみを選択的に還元し、得られたＳ
Ｈ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ基を有する担体のＳ
Ｈ基とを、１分子内にマレイミド基を２ケ以上有する化
合物で架橋することを特徴とする免疫吸着体の製造法で
ある。 【０００４】本発明において用いられる抗体は、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体のいづれでもよく、
また、抗体の部分分解物であるＦ（ａｂ′）2、Ｆａ
ｂ′、Ｆ（ａｂｃ′）2、Ｆａｂｃ′でもよい。好まし
くはＦａｂ′を用いる。抗体を採取する生物種は、哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウ
ス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワ
トリ、ハト、ガチョウ、アヒル、ウズラ）、Ｂリンパ球
とミエローマ細胞の融合株（例、マウスＢ細胞とマウス
ミエローマ細胞、ラット６細胞とマウスミエローマ細
胞、ヒトＢ細胞とヒトミエローマ細胞）などが挙げられ
るが生物種に制限されない。得られた抗体はヒンジ部分
のＳ−Ｓ結合のみを還元し、ＳＨ基をもち、かつ、抗原
に結合可能な抗体部分とする。更に、好ましくは抗体を
ペプシン等によって酵素分解し、Ｓ−Ｓ結合を還元し
て、Ｆａｂ′、Ｆａｂｃ′とした抗体部分とするとよ
い。ヒンジ部分のＳ−Ｓ結合を還元するには、２−メル
カプトエチルアミン等の還元剤を反応させれば、Ｆａｂ
部分のＳ−Ｓ結合は還元されることなく、ヒンジ部分の
Ｓ−Ｓ結合のみが還元され、抗体あるいはＦａｂ、Ｆａ
ｂｃ′はＳＨ基を有する構造となる。 【０００５】本発明における特色は、Ｆａｂ部分のＳ−
Ｓ結合はそのままとして、ヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合
を還元し、ヒンジ部分のみをＳＨ基として、これを架橋
の結合基として用い、抗原結合部位等は全く架橋に関与
させないで担体に固定する点にある。本発明の免疫吸着
体は強固に担体に結合されているが、抗原結合部位は何
らの損傷も受けていないので、抗原結合能力は１００％
存有するというすぐれた免疫吸着体である。本発明にお
いて使用する担体としては多糖体を骨格としたもの
（例、アガロース；Sepharose）（ファルマシアファイ
ンケミカルズ社製)、デキストラン；Sephadex（〃)、セ
ルロース；ワットマン社製)）、合成樹脂を骨格とした
もの（例、ポリスチレン、ポリアクリルアミド； バイ
オゲルＰ（バイオラッド社製）、ポリビニル；トーヨー
パール (東洋ソーダ社製)）、ガラスもしくはシリカを
骨格としたもの、天然物(例、コロジオン、カオリン、
炭素、ベントナイト、毛糸、木材)さらには微生物の菌
体、種々の動物の赤血球等があり、これらの担体にはＳ
Ｈ基を有するもの、あるいは導入しうるものなどがあ
る。 【０００６】担体に対するＳＨ基の導入は従来よく知ら
れた各種方法によって適宜行うことができる。ＳＨ基を
有する抗体のＳＨ基と、結合基を有する担体の結合基と
の架橋反応は、担体のＳＨ基の反応に適した架橋剤によ
って行なわれる。 担体の結合基がＳＨ基である本発明
の場合は、１分子内にマレイミド基を２ケ以上有する化
合物が用いられる。１分子内にマレイミド基を２つ以上
有する化合物としては、Ｎ，Ｎ′−（１，２−フェニレ
ン）ビスマレイミド（Ｎ，Ｎ′−（１，２−Phenylen
e）bismaleimide）、Ｎ，Ｎ′−（１，３−フェニレ
ン）ビスマレイミド（Ｎ，Ｎ′−(１，３−Phenylene）
bismaleimide）、Ｎ，Ｎ′−（１，４−フェニレン）ビ
スマレイミド（Ｎ，Ｎ′−（１，４−Phenylene）bisma
leimide）、アゾフェニルジマレイミド（Azophenyldima
leimide）、Ｎ，Ｎ′−ヘキサメチレンビスマレイミド
（Ｎ，Ｎ′−Hexamethylenebismaleimide）、ビス（Ｎ
−マレイミドメチル）エーテル（Bis（Ｎ−maleimidome
thyl）ether）などが挙げられる。ＳＨ基を有する抗体
のＳＨ基とＳＨ基を有する担体のＳＨ基との架橋反応
は、上記架橋剤を適宜使用し、架橋させることができ
る。まず、ＳＨ基を有する抗体と架橋剤を反応させて、
架橋剤の一方の反応基とＳＨ基を結合させ、次いでこれ
とＳＨ基を有する担体と反応させ、架橋剤の残った反応
基と担体のＳＨ基とを反応させて、架橋するのが有利で
ある。 【０００７】この様にして作製された免疫吸着体は、抗
体の抗原結合活性をほぼ１００％保持している。従来知
られている免疫吸着体は、抗体の抗原との結合活性が数
％〜１０％程度であるに過ぎない。本発明の免疫吸着体
をアフィニティークロマトグラフィーに応用した場合に
は、同量の抗体を使用しても従来のものの数十倍の精製
効率を得ることができる。この精製効率の高さが、従来
抗体の価格が高価であったために産業界への普及が進ま
なかった免疫吸着体を使用したアフィニティークロマト
グラフィーの利用を、今までコストとの関係で利用でき
なかった物質の精製に広く利用することを可能にすると
考えられる。また、ポリスチレン、ラテックス、ガラス
等に物理的に吸着させる方法で行われていたＲＩＡ、Ｅ
ＩＡ、ラテックス凝集反応の固相も、本発明の免疫吸着
体を用いれば、担体からの抗体の剥離、免疫吸着体の時
間的な性質変化もなくなり、また、従来からの共有結合
法にみられる免疫吸着体の抗体の抗原結合活性の低下、
非特異的な吸着といった欠点も同時に解消させることが
できるものである。次に本発明の実施例を示す。 【０００８】 【実施例】 実施例 １ １７０ｍｇの抗ヒトフェリチンＩｇＧ（ウサギ）をｐＨ
４．５の酢酸バッファー中で、６．８ｍｇのペプシンを
作用させ、３７℃４０時間後、ｐＨ８．０のホウ酸バッ
ファーで平衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４カラムを使
ってゲル濾過を行い、Ｆ(ａｂ′）2のピークを集め、７
３ｍｇの抗ヒトフェリチンＦ(ａｂ′）2を得た。このう
ち３０ｍｇの抗ヒトフェリチンＦ(ａｂ′）2を、ｐＨ
６．０のリン酸ナトリウムバッファー中で、１０ｍＭの
２−メルカプトエチルアミンを作用させ、３７℃９０分
間反応させ、Ｆａｂ′とした後に、セファデックスＧ−
２５のうち２５ｍＬカラムでゲル濾過を行い、Ｆａｂ′
分画を集めた。このＦａｂ′分画に６０マイクロモルの
Ｎ，Ｎ′−（１，２−Phenylene)bismaleimideを加え、
３０℃で、２０分間反応させた後、１００ｍＬのセファ
デックスＧ−２５カラムを用いてゲル濾過を行い、マレ
イミド化されたＦａｂ′を２８．３ｍｇ得た。 【０００９】別に担体としてトーヨーパールＨＷ−７５
(東洋ソーダ製：商品名)の９０ｍＬを純水でよく洗浄し
た後に、９０ｍＬの１，４−butanediol diglycidyl et
herを加え、さらに１８０ｍｇのＮａＢＨ4を含む ０．
６Ｍ ＮａＯＨ溶液の９０ｍＬを加え、２５℃で８時間
振トウする。その後担体を再度純水で洗浄し、２７０ｍ
Ｌの１．３Ｍ Ｎａ2Ｓ2Ｏ3を加え、２５℃で１６時間
反応させる。反応後、１Ｌの純水で洗浄しヌツチエで引
ききった後に２７０ｍＬの２５ｍＭジチオスライトール
を加え、３０℃９０分間反応させる。反応後１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含むリン酸バッファーｐＨ６．０で洗浄し、１
ｍＬの担体に２３μモルのＳＨ基を有するトーヨーパー
ルＨＷ−７５を９０ｍＬ得た。１５ｍＬのＳＨ基を有す
るトーヨーパールＨＷ−７５に２８．３ｍｇのマレイミ
ド化Ｆａｂ′を加え、１ｍＭのＥＤＴＡ存在下、リン酸
バッファーｐＨ６．０の条件下４℃で４０時間反応し
た。反応後１５０ｍＬのリン酸バッファーｐＨ６．０で
洗浄し、洗浄液に来るＡ280ｎｍの吸収から固定化量を
求めた。その結果、０．９７ｍｇのマレイミド化Ｆａ
ｂ′が１ｍＬのトーヨーパールＨＷ−７５に結合してい
るのが分かった。ここに抗フェリチン免疫吸着体が得ら
れたのである。 【００１０】４℃で３ｍＬの抗フェリチン免疫吸着体
に、ヒト胎盤抽出液（フェリチン濃度４μｇ／ｍＬ）を
９００ｍＬ流しその後、ＰＢＳの１５０ｍＬで免疫吸着
体を洗浄した。各５ｍＬづつ分画し、それぞれのＡ280
ｎｍとフェリチン量を定量した。その溶出曲線は図１に
示される。図１において、ａはＡ280ｎｍにおける吸光
度を示し、夾雑蛋白質の濃度を表し、ｂはフェリチンの
濃度を示している。図１からフェリチンが５２０ｍＬの
溶出流量の所からもれはじめ、この結果から、３ｍＬの
免疫吸着体に２．０８ｍｇのフェリチンが結合したこと
が分った。結合したＦａｂ′の力価が、０．６７ｍｇフ
ェリチン／１ｍｇＦａｂ′から、
造法に関するものである。更に詳細には、本発明は、抗
原結合能のきわめて高い免疫吸着体及びその製造法に関
するものである。一般に、免疫吸着体は免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィーの担体、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）の固相、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の固相、
免疫センサー、ラテックス凝集反応用のラテックス、免
疫比濁法やレーザーネフェロメトリーの凝集体等に広く
活用されており、本発明はこのように広範囲の用途をも
つ有用な免疫吸着体を提供するものである。 【０００２】 【従来の技術及び課題】免疫吸着体を用いる免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーは、有用な生理活性物質の
精製方法として、活用されはじめており、インターフェ
ロンの精製は、その一例である。しかし、従来の免疫吸
着体は、固定化方法に問題があったために、せっかく固
定化した抗体も抗原との結合活性が著しく低下して、免
疫吸着体の抗原に対する結合容量は小さなものであっ
た。また、非特異的吸着を引き起こす様な解離基、疎水
性基が導入されることも多く、せっかく精製した抗原に
若干不純物が混入することが多かった。固定化に使われ
る高純度の抗体、もしくはモノクローナル抗体は非常に
高価であり、かつ、上記の様な問題点もあるために免疫
アフィニティークロマトグラフィーの産業界への利用は
十分に進んでいない。しかし、遺伝子操作、細胞培養等
で作製した有用な生理活性物質の精製など、高純度を必
要とするものの精製に免疫アフィニティークロマトグラ
フィーは期待されており、抗体の活性を失うことの少な
い、抗原を結合する能力の大きな免疫吸着体は、多くの
分野で待望されているものである。また、酵素免疫測定
法（ＥＩＡ）やラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、ラ
テックス凝集反応、免疫比濁法（ＴＩＡ）などには、抗
体を物理的に吸着させた免疫吸着体（ポリスチレンボー
ル、ガラスボール、９６穴マイクロウエル、ポリスチレ
ン製ラテックス、カオリン）が使われることが多い。し
かしこれらは、物理的吸着であるために、抗体が担体か
ら剥離することが多く、免疫吸着体としての性質の時間
的な変化が生じるなどの欠点が多い。また、共有結合法
によって固定化する方法もあるが、従来の共有結合法で
は、非特異的な結合によって固定化されており、固定化
した抗体の抗原に対する結合活性が著しく低下するなど
の問題点があるために、物理的吸着法よりもさらに欠点
が多く、実用には適さなかった。即ち、従来知られてい
た免疫吸着体の共有結合法による作製方法は次の通りで
ある。 １）ＣＮＢｒ活性化担体に、抗体の非解離アミノ基で結
合させる。 ２）カルボキシル基を持つ担体に、カルボジイミドを使
って、抗体のアミノ基をペプチド結合で結合させる。 ３）アミノ基を持つ担体に、カルボジイミドを使って、
担体のカルボキシル基をベプチド結合で結合させる。 ４）エポキシ活性化担体に、抗体のアミノ基もしくはＯ
Ｈ基を結合させる。 ５）プロティンＡもしくはStaphylococcus aureusの死
菌体を固定化した担体にＩｇＧを吸着させ、その後プロ
ティンＡとＩｇＧとを架橋試薬を用いて架橋する。 １）〜４）の方法は、抗体分子上にあるアミノ基もしく
はカルボキシル基で担体と結合させようとするものであ
るが、抗体の表面には多くのアミノ基やカルボキシル基
が存在し、またこれらの基を持つアミノ酸残基は親水性
を示すことが多く、抗体分子の表面に多く存在する。そ
のために担体と非常に多くの位置で結合し、抗体分子の
構造に悪影響を与え、抗体の活性が著しく低下する。ま
た、抗体の抗原との結合部位付近には最も反応性の高い
αアミノ基が存在し、１）、２）、４）の方法で抗体を
固定化した場合には、抗原との結合部位で担体と結合す
ることが多く、抗体の活性も極端に低下する。５）の方
法は、プロティンＡとＩｇＧとを架橋する時に、１）〜
４）の方法と同様に著しく活性が低下する。またプロテ
ィンＡと結合しない抗体も多いために用途が限られる。
上記１）〜５）方法で抗体を固定化した時の抗体活性の
残存率は数％〜１０％程度であるに過ぎないのである。 【０００３】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
に活性の低い免疫吸着体の現状を打破するために鋭意研
究したところ、還元しても抗体の活性の低下を引き起こ
さないヒンジ部分のＳ−Ｓ結合を還元し、−ＳＨ基と
し、このＳＨ基とＳＨ基を有する担体のＳＨ基とを、１
分子内にマレイミド基を２ケ以上有する化合物を用い
て、架橋して免疫吸着体を作製したとき、抗体の活性を
ほとんど低下させないで固定しうることを知ったのであ
る。 本発明は、この知見により完成されたもので、抗
体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合のみを選択的に還元
し、得られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ基を
有する担体のＳＨ基とを、１分子内にマレイミド基を２
ケ以上有する化合物を用いて、架橋してなる免疫吸着体
に関するものである。また、本発明は、抗体のヒンジ部
分にあるＳ−Ｓ結合のみを選択的に還元し、得られたＳ
Ｈ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ基を有する担体のＳ
Ｈ基とを、１分子内にマレイミド基を２ケ以上有する化
合物で架橋することを特徴とする免疫吸着体の製造法で
ある。 【０００４】本発明において用いられる抗体は、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体のいづれでもよく、
また、抗体の部分分解物であるＦ（ａｂ′）2、Ｆａ
ｂ′、Ｆ（ａｂｃ′）2、Ｆａｂｃ′でもよい。好まし
くはＦａｂ′を用いる。抗体を採取する生物種は、哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウ
ス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワ
トリ、ハト、ガチョウ、アヒル、ウズラ）、Ｂリンパ球
とミエローマ細胞の融合株（例、マウスＢ細胞とマウス
ミエローマ細胞、ラット６細胞とマウスミエローマ細
胞、ヒトＢ細胞とヒトミエローマ細胞）などが挙げられ
るが生物種に制限されない。得られた抗体はヒンジ部分
のＳ−Ｓ結合のみを還元し、ＳＨ基をもち、かつ、抗原
に結合可能な抗体部分とする。更に、好ましくは抗体を
ペプシン等によって酵素分解し、Ｓ−Ｓ結合を還元し
て、Ｆａｂ′、Ｆａｂｃ′とした抗体部分とするとよ
い。ヒンジ部分のＳ−Ｓ結合を還元するには、２−メル
カプトエチルアミン等の還元剤を反応させれば、Ｆａｂ
部分のＳ−Ｓ結合は還元されることなく、ヒンジ部分の
Ｓ−Ｓ結合のみが還元され、抗体あるいはＦａｂ、Ｆａ
ｂｃ′はＳＨ基を有する構造となる。 【０００５】本発明における特色は、Ｆａｂ部分のＳ−
Ｓ結合はそのままとして、ヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合
を還元し、ヒンジ部分のみをＳＨ基として、これを架橋
の結合基として用い、抗原結合部位等は全く架橋に関与
させないで担体に固定する点にある。本発明の免疫吸着
体は強固に担体に結合されているが、抗原結合部位は何
らの損傷も受けていないので、抗原結合能力は１００％
存有するというすぐれた免疫吸着体である。本発明にお
いて使用する担体としては多糖体を骨格としたもの
（例、アガロース；Sepharose）（ファルマシアファイ
ンケミカルズ社製)、デキストラン；Sephadex（〃)、セ
ルロース；ワットマン社製)）、合成樹脂を骨格とした
もの（例、ポリスチレン、ポリアクリルアミド； バイ
オゲルＰ（バイオラッド社製）、ポリビニル；トーヨー
パール (東洋ソーダ社製)）、ガラスもしくはシリカを
骨格としたもの、天然物(例、コロジオン、カオリン、
炭素、ベントナイト、毛糸、木材)さらには微生物の菌
体、種々の動物の赤血球等があり、これらの担体にはＳ
Ｈ基を有するもの、あるいは導入しうるものなどがあ
る。 【０００６】担体に対するＳＨ基の導入は従来よく知ら
れた各種方法によって適宜行うことができる。ＳＨ基を
有する抗体のＳＨ基と、結合基を有する担体の結合基と
の架橋反応は、担体のＳＨ基の反応に適した架橋剤によ
って行なわれる。 担体の結合基がＳＨ基である本発明
の場合は、１分子内にマレイミド基を２ケ以上有する化
合物が用いられる。１分子内にマレイミド基を２つ以上
有する化合物としては、Ｎ，Ｎ′−（１，２−フェニレ
ン）ビスマレイミド（Ｎ，Ｎ′−（１，２−Phenylen
e）bismaleimide）、Ｎ，Ｎ′−（１，３−フェニレ
ン）ビスマレイミド（Ｎ，Ｎ′−(１，３−Phenylene）
bismaleimide）、Ｎ，Ｎ′−（１，４−フェニレン）ビ
スマレイミド（Ｎ，Ｎ′−（１，４−Phenylene）bisma
leimide）、アゾフェニルジマレイミド（Azophenyldima
leimide）、Ｎ，Ｎ′−ヘキサメチレンビスマレイミド
（Ｎ，Ｎ′−Hexamethylenebismaleimide）、ビス（Ｎ
−マレイミドメチル）エーテル（Bis（Ｎ−maleimidome
thyl）ether）などが挙げられる。ＳＨ基を有する抗体
のＳＨ基とＳＨ基を有する担体のＳＨ基との架橋反応
は、上記架橋剤を適宜使用し、架橋させることができ
る。まず、ＳＨ基を有する抗体と架橋剤を反応させて、
架橋剤の一方の反応基とＳＨ基を結合させ、次いでこれ
とＳＨ基を有する担体と反応させ、架橋剤の残った反応
基と担体のＳＨ基とを反応させて、架橋するのが有利で
ある。 【０００７】この様にして作製された免疫吸着体は、抗
体の抗原結合活性をほぼ１００％保持している。従来知
られている免疫吸着体は、抗体の抗原との結合活性が数
％〜１０％程度であるに過ぎない。本発明の免疫吸着体
をアフィニティークロマトグラフィーに応用した場合に
は、同量の抗体を使用しても従来のものの数十倍の精製
効率を得ることができる。この精製効率の高さが、従来
抗体の価格が高価であったために産業界への普及が進ま
なかった免疫吸着体を使用したアフィニティークロマト
グラフィーの利用を、今までコストとの関係で利用でき
なかった物質の精製に広く利用することを可能にすると
考えられる。また、ポリスチレン、ラテックス、ガラス
等に物理的に吸着させる方法で行われていたＲＩＡ、Ｅ
ＩＡ、ラテックス凝集反応の固相も、本発明の免疫吸着
体を用いれば、担体からの抗体の剥離、免疫吸着体の時
間的な性質変化もなくなり、また、従来からの共有結合
法にみられる免疫吸着体の抗体の抗原結合活性の低下、
非特異的な吸着といった欠点も同時に解消させることが
できるものである。次に本発明の実施例を示す。 【０００８】 【実施例】 実施例 １ １７０ｍｇの抗ヒトフェリチンＩｇＧ（ウサギ）をｐＨ
４．５の酢酸バッファー中で、６．８ｍｇのペプシンを
作用させ、３７℃４０時間後、ｐＨ８．０のホウ酸バッ
ファーで平衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４カラムを使
ってゲル濾過を行い、Ｆ(ａｂ′）2のピークを集め、７
３ｍｇの抗ヒトフェリチンＦ(ａｂ′）2を得た。このう
ち３０ｍｇの抗ヒトフェリチンＦ(ａｂ′）2を、ｐＨ
６．０のリン酸ナトリウムバッファー中で、１０ｍＭの
２−メルカプトエチルアミンを作用させ、３７℃９０分
間反応させ、Ｆａｂ′とした後に、セファデックスＧ−
２５のうち２５ｍＬカラムでゲル濾過を行い、Ｆａｂ′
分画を集めた。このＦａｂ′分画に６０マイクロモルの
Ｎ，Ｎ′−（１，２−Phenylene)bismaleimideを加え、
３０℃で、２０分間反応させた後、１００ｍＬのセファ
デックスＧ−２５カラムを用いてゲル濾過を行い、マレ
イミド化されたＦａｂ′を２８．３ｍｇ得た。 【０００９】別に担体としてトーヨーパールＨＷ−７５
(東洋ソーダ製：商品名)の９０ｍＬを純水でよく洗浄し
た後に、９０ｍＬの１，４−butanediol diglycidyl et
herを加え、さらに１８０ｍｇのＮａＢＨ4を含む ０．
６Ｍ ＮａＯＨ溶液の９０ｍＬを加え、２５℃で８時間
振トウする。その後担体を再度純水で洗浄し、２７０ｍ
Ｌの１．３Ｍ Ｎａ2Ｓ2Ｏ3を加え、２５℃で１６時間
反応させる。反応後、１Ｌの純水で洗浄しヌツチエで引
ききった後に２７０ｍＬの２５ｍＭジチオスライトール
を加え、３０℃９０分間反応させる。反応後１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含むリン酸バッファーｐＨ６．０で洗浄し、１
ｍＬの担体に２３μモルのＳＨ基を有するトーヨーパー
ルＨＷ−７５を９０ｍＬ得た。１５ｍＬのＳＨ基を有す
るトーヨーパールＨＷ−７５に２８．３ｍｇのマレイミ
ド化Ｆａｂ′を加え、１ｍＭのＥＤＴＡ存在下、リン酸
バッファーｐＨ６．０の条件下４℃で４０時間反応し
た。反応後１５０ｍＬのリン酸バッファーｐＨ６．０で
洗浄し、洗浄液に来るＡ280ｎｍの吸収から固定化量を
求めた。その結果、０．９７ｍｇのマレイミド化Ｆａ
ｂ′が１ｍＬのトーヨーパールＨＷ−７５に結合してい
るのが分かった。ここに抗フェリチン免疫吸着体が得ら
れたのである。 【００１０】４℃で３ｍＬの抗フェリチン免疫吸着体
に、ヒト胎盤抽出液（フェリチン濃度４μｇ／ｍＬ）を
９００ｍＬ流しその後、ＰＢＳの１５０ｍＬで免疫吸着
体を洗浄した。各５ｍＬづつ分画し、それぞれのＡ280
ｎｍとフェリチン量を定量した。その溶出曲線は図１に
示される。図１において、ａはＡ280ｎｍにおける吸光
度を示し、夾雑蛋白質の濃度を表し、ｂはフェリチンの
濃度を示している。図１からフェリチンが５２０ｍＬの
溶出流量の所からもれはじめ、この結果から、３ｍＬの
免疫吸着体に２．０８ｍｇのフェリチンが結合したこと
が分った。結合したＦａｂ′の力価が、０．６７ｍｇフ
ェリチン／１ｍｇＦａｂ′から、
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は実施例１におけるフェリチンの溶出曲
線を示す図である。 ａ…Ａ280ｎｍにおける吸光度 ｂ…フェリチンの濃度
線を示す図である。 ａ…Ａ280ｎｍにおける吸光度 ｂ…フェリチンの濃度
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 藤井 克美
吹田市山田西３−21−２ 801
(56)参考文献 特開 昭55−133382（ＪＰ，Ａ)
「酵素免疫測定法（第２版）」医学書
院発行（昭和57年）第92−113頁
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C07K 17/02 - 17/12
G01N 33/544 - 33/548
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．抗体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合のみを選択的に
還元し、得られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ
基を有する合成樹脂担体のＳＨ基とを、１分子内にマレ
イミド基を２ケ以上有する化合物を用いて、架橋してな
る免疫吸着体。 ２．抗体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合のみを選択的に
還元し、得られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ
基を有する合成樹脂担体のＳＨ基とを、１分子内にマレ
イミド基を２ケ以上有する化合物で架橋することを特徴
とする免疫吸着体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7018825A JP2826965B2 (ja) | 1995-01-12 | 1995-01-12 | 免疫吸着体とその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7018825A JP2826965B2 (ja) | 1995-01-12 | 1995-01-12 | 免疫吸着体とその製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22593884A Division JPH0753759B2 (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 免疫吸着体及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07268000A JPH07268000A (ja) | 1995-10-17 |
| JP2826965B2 true JP2826965B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=11982346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7018825A Expired - Fee Related JP2826965B2 (ja) | 1995-01-12 | 1995-01-12 | 免疫吸着体とその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2826965B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6231263B2 (ja) | 2012-07-17 | 2017-11-15 | 株式会社島津製作所 | アフィニティ支持体及びそれを用いた物質の捕捉方法 |
| GB201603291D0 (en) * | 2016-02-25 | 2016-04-13 | Binding Site Group The Ltd | Antibodies |
| CN113049811A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55133382A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-17 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel polyfunctional compound |
-
1995
- 1995-01-12 JP JP7018825A patent/JP2826965B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 「酵素免疫測定法（第２版）」医学書院発行（昭和５７年）第９２−１１３頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07268000A (ja) | 1995-10-17 |
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