JPS61103838A - 免疫吸着体及びその製造法 - Google Patents
免疫吸着体及びその製造法Info
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- JPS61103838A JPS61103838A JP22593884A JP22593884A JPS61103838A JP S61103838 A JPS61103838 A JP S61103838A JP 22593884 A JP22593884 A JP 22593884A JP 22593884 A JP22593884 A JP 22593884A JP S61103838 A JPS61103838 A JP S61103838A
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫吸着体及びその製造法に関するものであ
る。
る。
更に詳細には、本発明は、抗原結合能のきわめて高い免
疫吸着体及びその製造法に関するものである。
疫吸着体及びその製造法に関するものである。
一般に、免疫吸着体は、免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーの担体、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の固相、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の固相、免疫センサー、
ラテックス凝集反応用のラテックス、免疫比濁法やレー
ザーネフエロメトリーの凝集体等に広く活用されており
、本発明はこのように広範囲の用途をもつ有用な免疫吸
着体を提供するものである。
ラフィーの担体、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の固相、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の固相、免疫センサー、
ラテックス凝集反応用のラテックス、免疫比濁法やレー
ザーネフエロメトリーの凝集体等に広く活用されており
、本発明はこのように広範囲の用途をもつ有用な免疫吸
着体を提供するものである。
また、免疫吸着体を用いる免疫アフィニティークロマト
グラフィーは、有用な生理活性物質の精製方法として、
活用されはじめており、インターフェロンの精製は、そ
の−例である。しかし、従来の免疫吸着体は、固定化方
法に問題があったために、せっかく固定化した抗体も抗
原との結合活性が著しく低下して、免疫吸着体の抗原に
対する結合溶量は小さなものであった。また、非特異的
吸着を引き起こす様な解離基、疎水性基が導入されるこ
とも多く、せっかく精製した抗原に若干不純物が混入す
ることが多かった。固定化に使われる高純度の抗体、も
しくはモノクローナル抗体は非常に高価でちゃ、かつ、
上記の様な問題点もあるために免疫アフィニティークロ
マトグラフィーの産業界への利用は十分に進んでいない
。しかし、違伝子操作、細肥培養等で作製した有用な生
理活性物質のｎＩ製など、高純度を必要とするものの精
製に免疫アフィニティークロマトグラフィーは期待され
ており、抗体の活性を失うことの少ない、抗原を結合す
る能力の大きな免疫吸着体は、多くの分野で待望されて
いるものである。
グラフィーは、有用な生理活性物質の精製方法として、
活用されはじめており、インターフェロンの精製は、そ
の−例である。しかし、従来の免疫吸着体は、固定化方
法に問題があったために、せっかく固定化した抗体も抗
原との結合活性が著しく低下して、免疫吸着体の抗原に
対する結合溶量は小さなものであった。また、非特異的
吸着を引き起こす様な解離基、疎水性基が導入されるこ
とも多く、せっかく精製した抗原に若干不純物が混入す
ることが多かった。固定化に使われる高純度の抗体、も
しくはモノクローナル抗体は非常に高価でちゃ、かつ、
上記の様な問題点もあるために免疫アフィニティークロ
マトグラフィーの産業界への利用は十分に進んでいない
。しかし、違伝子操作、細肥培養等で作製した有用な生
理活性物質のｎＩ製など、高純度を必要とするものの精
製に免疫アフィニティークロマトグラフィーは期待され
ており、抗体の活性を失うことの少ない、抗原を結合す
る能力の大きな免疫吸着体は、多くの分野で待望されて
いるものである。
また、酵素免疫測定よ（ＥＩＡ）やラジオイムノアッセ
イ法（ＲＩＡ）ラテックス凝集反応、免疫比濁法（ＴＩ
Ａ）などには、抗体を物理的に吸着させた免疫吸着体（
ポリスチＶンボール、ガラスポール、９６穴マイクロウ
エル 、ｆ ＋）スチレン製ラテックス、カオリン）が
使われることが多い。
イ法（ＲＩＡ）ラテックス凝集反応、免疫比濁法（ＴＩ
Ａ）などには、抗体を物理的に吸着させた免疫吸着体（
ポリスチＶンボール、ガラスポール、９６穴マイクロウ
エル 、ｆ ＋）スチレン製ラテックス、カオリン）が
使われることが多い。
しかしこれらは、物理的吸着であるために、抗体が担体
から剥離することが多く、免疫吸着体としての性質の時
間的な変化が生じるなどの欠点が多い。
から剥離することが多く、免疫吸着体としての性質の時
間的な変化が生じるなどの欠点が多い。
また、共有結合法によって固定化する方法もちるが、従
来の共有結合法では、非特異的な結合によって固定化さ
れており、固定化した抗体の抗原に対する結合活性が著
しく低下するなどの問題点があるために、物理的吸着法
よりもさらに欠点が多く、実用には適さなかった。
来の共有結合法では、非特異的な結合によって固定化さ
れており、固定化した抗体の抗原に対する結合活性が著
しく低下するなどの問題点があるために、物理的吸着法
よりもさらに欠点が多く、実用には適さなかった。
即ち、従来知られていた免疫吸着体の共有結合法による
作製方法は次の通りである。
作製方法は次の通りである。
１）ＣＮＢｒ活性化担体に、抗体の非解離アミノ基で結
合させる。
合させる。
２） カルボキシル基を持つ担体に、カルボジイミドを
使って、抗体のアミノ基をＲプチド結合で
。
使って、抗体のアミノ基をＲプチド結合で
。
結合させる。
３）アミノ基を持つ担体に、カルボジイミドを使って、
抗体のカルボキシル基をはプチド結合で結合させる。
抗体のカルボキシル基をはプチド結合で結合させる。
４）エポキシ活性化担体に、抗体のアミノ基もしくはＯ
Ｈ基を結合させる。
Ｈ基を結合させる。
５）プロティンＡもしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕ
ｓａｕｒａｌｌｇ の死菌体を固定化した担体にＩｇ
Ｇを吸着させ、その後、プロティンＡとＩｇＧとを架橋
試薬を用いて架橋する。
ｓａｕｒａｌｌｇ の死菌体を固定化した担体にＩｇ
Ｇを吸着させ、その後、プロティンＡとＩｇＧとを架橋
試薬を用いて架橋する。
１）〜４）の方法は、抗体分子上にあるアミノ基もしく
はカルボキシル基で担体と結合させようとするものであ
るが、抗体の表面には多くのアミノ基やカルボキシル基
が存在し、またこれらの基を持つアミノ酸残基は親水性
を示すことが多く、抗体分子の表面に多く存在する。そ
のために担体と非常の多くの位置で結合し、抗体分子の
構造に悪影響を与え、抗体の活性が著しく低下する。ま
た、抗体の抗原との結合部位付近には最も反応性の高い
αアミノ基が存在し、１）、２）、４）の方法で抗体を
固定化した場合には、抗原との結合部位で担体と結合す
ることが多く、抗体の活性も極端に低下する。５）の方
法は、プロティンＡとＩｇＧとを架橋する時に、１）〜
４）の方法と同様に著しく活性が低下する。またプロテ
ィンＡと結合しない抗体も多いために用途が限られる。
はカルボキシル基で担体と結合させようとするものであ
るが、抗体の表面には多くのアミノ基やカルボキシル基
が存在し、またこれらの基を持つアミノ酸残基は親水性
を示すことが多く、抗体分子の表面に多く存在する。そ
のために担体と非常の多くの位置で結合し、抗体分子の
構造に悪影響を与え、抗体の活性が著しく低下する。ま
た、抗体の抗原との結合部位付近には最も反応性の高い
αアミノ基が存在し、１）、２）、４）の方法で抗体を
固定化した場合には、抗原との結合部位で担体と結合す
ることが多く、抗体の活性も極端に低下する。５）の方
法は、プロティンＡとＩｇＧとを架橋する時に、１）〜
４）の方法と同様に著しく活性が低下する。またプロテ
ィンＡと結合しない抗体も多いために用途が限られる。
上記１）〜５）方法で抗体を固定化した時の抗体活性の
残存率は数ｃＩＪ〜１゜チ程度であるに過ぎないのであ
る。
残存率は数ｃＩＪ〜１゜チ程度であるに過ぎないのであ
る。
本発明者らは、このように活性の低い免疫吸着体の現状
を打破するために鋭意研究したところ、還元しても抗体
の活性の低下を引き起こさないヒンジ部分のＳ−Ｓ結合
を還元し、−８Ｈ基とし、このＳＨ基と担体とを架橋試
薬を用いて結合し、免疫吸着体を作製したとき、抗体の
活性をほとんど低下させないで固定しうろことを知った
のである。
を打破するために鋭意研究したところ、還元しても抗体
の活性の低下を引き起こさないヒンジ部分のＳ−Ｓ結合
を還元し、−８Ｈ基とし、このＳＨ基と担体とを架橋試
薬を用いて結合し、免疫吸着体を作製したとき、抗体の
活性をほとんど低下させないで固定しうろことを知った
のである。
本発明は、この知見により完成されたもので、抗体のヒ
ンジ部分にあるＳ−Ｓ結合を還元し、得られたＳＨ基を
有する抗体のＳＨ基と、結合基を有する担体の結合基と
を架橋してなる免疫吸着体に関するものである。
ンジ部分にあるＳ−Ｓ結合を還元し、得られたＳＨ基を
有する抗体のＳＨ基と、結合基を有する担体の結合基と
を架橋してなる免疫吸着体に関するものである。
着た１本発明は、抗体のヒンジ部分にあるｓ−８結合を
還元し、得られたＳＲ基を有する抗体のＳＩ基と、ＳＩ
基を有する担体のＳＩ基とを、１分子内にマレイミド基
を２ヶ以上有する化合物で架橋することを特徴とする免
疫吸着体の製造法であり、更には、本発明は、抗体のヒ
ンジ部分にあるＳ−８結合を還元し、得られたＳＩ（基
を有する抗体のＳＩ基と、アミノ基、イミノ基、ヒドラ
ジノ基、又は１〜３級アミンの１種もしくは２種以上の
結合基を有する担体の結合基とを、１分子内にマレイミ
ド基とスクシンイミドエステル基の両方を有する化合物
で架橋することを特徴とする免疫吸着体の製造法である
。
還元し、得られたＳＲ基を有する抗体のＳＩ基と、ＳＩ
基を有する担体のＳＩ基とを、１分子内にマレイミド基
を２ヶ以上有する化合物で架橋することを特徴とする免
疫吸着体の製造法であり、更には、本発明は、抗体のヒ
ンジ部分にあるＳ−８結合を還元し、得られたＳＩ（基
を有する抗体のＳＩ基と、アミノ基、イミノ基、ヒドラ
ジノ基、又は１〜３級アミンの１種もしくは２種以上の
結合基を有する担体の結合基とを、１分子内にマレイミ
ド基とスクシンイミドエステル基の両方を有する化合物
で架橋することを特徴とする免疫吸着体の製造法である
。
本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体のいづれでもよく、また、抗体の
部分分解物であるＦ（ａ ｂ’ ）１ 、Ｆ’ ａ ｂ
’、Ｆ（ａｂｃ勺、、Ｆａｂｃ’でもよい。好ましくは
Ｆａｂ’を用いる。抗体を採取する植物種は、哺乳温血
動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、
ハト、ガチョウ、アヒル、ウズラ）、８９７７２球とミ
エローマ細胞の融合株（例、マウスＢ細抱とマウスミエ
ローマ細胞、ラット６細胞とマウスミエローマ細胞、ヒ
トＢ細胞とヒトミニローマ細胞）などが挙げられるが生
物種に制限されない。
、モノクローナル抗体のいづれでもよく、また、抗体の
部分分解物であるＦ（ａ ｂ’ ）１ 、Ｆ’ ａ ｂ
’、Ｆ（ａｂｃ勺、、Ｆａｂｃ’でもよい。好ましくは
Ｆａｂ’を用いる。抗体を採取する植物種は、哺乳温血
動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、
ハト、ガチョウ、アヒル、ウズラ）、８９７７２球とミ
エローマ細胞の融合株（例、マウスＢ細抱とマウスミエ
ローマ細胞、ラット６細胞とマウスミエローマ細胞、ヒ
トＢ細胞とヒトミニローマ細胞）などが挙げられるが生
物種に制限されない。
得られた抗体はヒンジ部分のＳ−Ｓ結合のみを還元し、
ＳＩ基をもち、かつ、抗原に結合可能な抗体部分とする
。更に、好ましくは抗体をはプシン等によって酵素分解
し、Ｓ−Ｓ結合を還元して。
ＳＩ基をもち、かつ、抗原に結合可能な抗体部分とする
。更に、好ましくは抗体をはプシン等によって酵素分解
し、Ｓ−Ｓ結合を還元して。
Ｆａｂ’、Ｆａｂｃ’ とした抗体部分とするとよい
。
。
ヒンジ部分のＳ−８結合を還元するには、２−メルカプ
トエチルアミン等の還元剤を反応させれば、Ｆａｂ部分
のＳ−Ｓ結合は還元されることなく、ヒンジ部分のＳ−
Ｓ結合のみが還元され、抗体あるいはＦａｂ％ Ｆ’ａ
ｂｃ’はＳＩ基を有する構造となる。
トエチルアミン等の還元剤を反応させれば、Ｆａｂ部分
のＳ−Ｓ結合は還元されることなく、ヒンジ部分のＳ−
Ｓ結合のみが還元され、抗体あるいはＦａｂ％ Ｆ’ａ
ｂｃ’はＳＩ基を有する構造となる。
本発明における特色は、Ｆａｂ部分のＳ−Ｓ結合はその
ままとして、ヒンジ部分にあるＳ−８結合を還元し、ヒ
ンジ部分のみをＳＩ基として、これ ｆを架橋
の結合基として用い、抗原結合部位等は全
１′く架橋に関与させないで担体に固定する点にある。
ままとして、ヒンジ部分にあるＳ−８結合を還元し、ヒ
ンジ部分のみをＳＩ基として、これ ｆを架橋
の結合基として用い、抗原結合部位等は全
１′く架橋に関与させないで担体に固定する点にある。
本発明の免疫吸着体は強固に担体に結合されているが、
抗原結合部位は何らの損傷も受けていないので、抗原結
合能力は１００チ存有するというすぐれた免疫吸着体で
ある。
抗原結合部位は何らの損傷も受けていないので、抗原結
合能力は１００チ存有するというすぐれた免疫吸着体で
ある。
本発明において使用する担体としては多類体を骨格とし
たもの（例、アガロース”、 ５ｅｐｈａｒ−ｏｓｅ（
ファルマシアファインケミカルズ社製）、デキストラン
； ５ｅｐｈａｄｓｘ （’ ） ｙセルロース；ワ
ットマン社製））１合成樹脂を骨格としたもの（例。
たもの（例、アガロース”、 ５ｅｐｈａｒ−ｏｓｅ（
ファルマシアファインケミカルズ社製）、デキストラン
； ５ｅｐｈａｄｓｘ （’ ） ｙセルロース；ワ
ットマン社製））１合成樹脂を骨格としたもの（例。
ポリスチレン、ポリアクリルアミド；バイオゲルＰ（バ
イオラッド社製）、ポリビニルニド−ヨーバール（東洋
ソーダ社製））、ガラスもしくはシリカを骨格としたも
の、天然物（例、コロジオン。
イオラッド社製）、ポリビニルニド−ヨーバール（東洋
ソーダ社製））、ガラスもしくはシリカを骨格としたも
の、天然物（例、コロジオン。
カオリン、炭素、ベントナイト、毛糸、木材）さらＫは
微生物の陶体１種々の動物の赤血球等がちり、これらの
担体にＳＩ基もしくはアミノ基、イミノ基、ヒドラジノ
基、１〜３級のアミンを有するもの、あるいけ導入しう
るものなどがある。
微生物の陶体１種々の動物の赤血球等がちり、これらの
担体にＳＩ基もしくはアミノ基、イミノ基、ヒドラジノ
基、１〜３級のアミンを有するもの、あるいけ導入しう
るものなどがある。
担体に対するＳＩ基、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ
基、１〜３級アミンの導入は従来よく知られた各種方法
によって適宜行うことができる。
基、１〜３級アミンの導入は従来よく知られた各種方法
によって適宜行うことができる。
ＳＩ基を有する抗体の８）（基と、結合基を有する担体
の結合基との条横反応は、担体の結合基の反応に適した
架橋剤によって行なわれる。
の結合基との条横反応は、担体の結合基の反応に適した
架橋剤によって行なわれる。
担体の結合基がＳＩ基である場合は、１分子内にマレイ
ミド基を２ヶ以上有する化合物が用いられる。１分子内
にマレイミド基を２つ以上有する化合物としては、Ｎ
、 Ｎ’−（１、２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｂｉｓｍａ
ｌｅｉｍｉｄｅ、 Ｎ 、 Ｎ’−（１＊ ３− Ｐｈ
ｅｎｙｌｅｎｅ ）ｂｉａｍａｌｅｉｍｉｄｅ 、 Ｎ
＊Ｎ’−（１＋ ４− Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｌｂｉｓ
ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、 Ａｚｏｐｈｅｎｙｌｄｉｍａｌ
ｅｉｍｉｄｅ、 Ｎ 、 Ｎ’−Ｈｅｃａｍｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅ、 Ｂ１５（Ｎ −ｍ
ＩＬｌｅｉｍｉｄｏｍａｔｈｙｌ ） ｅｔｈｅｒ
などが挙げられる。
ミド基を２ヶ以上有する化合物が用いられる。１分子内
にマレイミド基を２つ以上有する化合物としては、Ｎ
、 Ｎ’−（１、２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｂｉｓｍａ
ｌｅｉｍｉｄｅ、 Ｎ 、 Ｎ’−（１＊ ３− Ｐｈ
ｅｎｙｌｅｎｅ ）ｂｉａｍａｌｅｉｍｉｄｅ 、 Ｎ
＊Ｎ’−（１＋ ４− Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｌｂｉｓ
ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、 Ａｚｏｐｈｅｎｙｌｄｉｍａｌ
ｅｉｍｉｄｅ、 Ｎ 、 Ｎ’−Ｈｅｃａｍｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅ、 Ｂ１５（Ｎ −ｍ
ＩＬｌｅｉｍｉｄｏｍａｔｈｙｌ ） ｅｔｈｅｒ
などが挙げられる。
また、担体の結合基がアミン基、イミノ基、ヒドラジノ
基又は１〜３級アミンである場合は、１分子内にマレイ
ミド基とスクシンイミドエステル基の両方を有する化合
物が用いられる。１分子内にマレイミド基とスクシニル
イミドエステル基の両方を有する化合物としては、 Ｎ
−８ｕｃｃＮ−８ｕｃｃｉｎｉ Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏａｃｅｔａｔｅ 、 Ｎ −Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｙｌ−４−（Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉｄｏ’） ｂｕｔｙ
ｒａｔｅ、 Ｎ −Ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−６−（Ｎ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ、Ｎ −
８ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −４−（Ｎ −ｍａｌｅｉ
ｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ −
１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、 Ｎ −８ｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ −ｍ −（Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ）
ｂｅｎｚｏａｔ＠。
基又は１〜３級アミンである場合は、１分子内にマレイ
ミド基とスクシンイミドエステル基の両方を有する化合
物が用いられる。１分子内にマレイミド基とスクシニル
イミドエステル基の両方を有する化合物としては、 Ｎ
−８ｕｃｃＮ−８ｕｃｃｉｎｉ Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏａｃｅｔａｔｅ 、 Ｎ −Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｙｌ−４−（Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉｄｏ’） ｂｕｔｙ
ｒａｔｅ、 Ｎ −Ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−６−（Ｎ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ、Ｎ −
８ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −４−（Ｎ −ｍａｌｅｉ
ｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ −
１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、 Ｎ −８ｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ −ｍ −（Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ）
ｂｅｎｚｏａｔ＠。
Ｎ −Ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ −ｐ −（Ｎ −ｍａｌ
ｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）−Ａ −ｂｕｔｙｒａｔｅ
、 Ｎ −ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −４
−（Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ） ｃｙ
ｃｌｏｈｅｘａｒ＞ｅ −１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
、 Ｎ −Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −ｍ −（Ｎ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ）ｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｎ −ｓ
ｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｐ −（Ｎ −ｍ
ａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ ） −４−ｂｕｔｙ
ｒａｔａなどが挙げられる。
ｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）−Ａ −ｂｕｔｙｒａｔｅ
、 Ｎ −ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −４
−（Ｎ −ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ） ｃｙ
ｃｌｏｈｅｘａｒ＞ｅ −１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
、 Ｎ −Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −ｍ −（Ｎ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ）ｂｅｎｚｏａｔｅ、Ｎ −ｓ
ｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｐ −（Ｎ −ｍ
ａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ ） −４−ｂｕｔｙ
ｒａｔａなどが挙げられる。
ＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と結合基を有する担体の結
合基との架橋反応は、上記架橋剤を適宜使用し、架橋さ
せることができる。まず、ＳＨ基を有する抗体と架橋剤
を反応させて、架橋剤の一方の反応基とＳＨ基を結′合
させ、次いでこれと結合基を有する担体と反応させ、架
橋剤の残った反応基と担体の結合基とを反応させて、架
橋するのが有利である。
合基との架橋反応は、上記架橋剤を適宜使用し、架橋さ
せることができる。まず、ＳＨ基を有する抗体と架橋剤
を反応させて、架橋剤の一方の反応基とＳＨ基を結′合
させ、次いでこれと結合基を有する担体と反応させ、架
橋剤の残った反応基と担体の結合基とを反応させて、架
橋するのが有利である。
この様にして作製された免疫吸着体は、抗体の抗原結合
活性をほぼ１００％保持している。従来知られている免
疫吸着体は、抗体の抗原との結合活性が数％〜１０チ程
度であるに過ぎない。
活性をほぼ１００％保持している。従来知られている免
疫吸着体は、抗体の抗原との結合活性が数％〜１０チ程
度であるに過ぎない。
本発明の免疫吸着体をアフィニティークロマトグラフィ
ーに応用した場合には、同量の抗体を使用しても従来の
ものの数十倍の精製効率を得ることができる。この精製
効率の高さが、従来抗体の価格が高価であったために産
業界への普及が進まなかった免疫吸着体を使用したアフ
ィニティークロマトグラフィーの利用を、今までコスト
との関係で利用できなかった物質の精製に広く利用する
ことを可能にすると考えられる。また、ポリスチレン、
ラテックス、ガラス等に物理的に吸着させる方法で行わ
れていたＲＩＡ’、ｇＩＡ、ラテックス凝集反応の固相
も、本発明の免疫吸着体を用いれば、担体からの抗体の
剥離、免疫吸着体の時間的な性質変化もなくなり、また
、従来からの共有結 。
ーに応用した場合には、同量の抗体を使用しても従来の
ものの数十倍の精製効率を得ることができる。この精製
効率の高さが、従来抗体の価格が高価であったために産
業界への普及が進まなかった免疫吸着体を使用したアフ
ィニティークロマトグラフィーの利用を、今までコスト
との関係で利用できなかった物質の精製に広く利用する
ことを可能にすると考えられる。また、ポリスチレン、
ラテックス、ガラス等に物理的に吸着させる方法で行わ
れていたＲＩＡ’、ｇＩＡ、ラテックス凝集反応の固相
も、本発明の免疫吸着体を用いれば、担体からの抗体の
剥離、免疫吸着体の時間的な性質変化もなくなり、また
、従来からの共有結 。
合法にみられる免疫吸着体の抗体の抗原結合活性の低下
、非特異的な吸着といった欠点も同時に解消さすること
かできるものである。
、非特異的な吸着といった欠点も同時に解消さすること
かできるものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
１７０〜の抗ヒトフェリチンＩｇＧ（ウサギ）をｐＨ４
，５の酢酸バッファー中で、６．８ ！９のにプシンを
作用させ、３７℃４０時間後、ｐＨ８，０のホウ酸バッ
ファーで平衡化したクルトロダルＡｃＡ３４カラムを使
ってケ゛ル濾過を行い、Ｆ（ａｂ’）Ｈのヒータを集め
、７３■の抗ヒトフェリチンＦ（ａｂ’）１を得た。こ
のうち６０■の抗ヒトフェリチンＦ（ａｂ’）２を、ｐ
ｔ−＋ ６．０のリン酸ナトリウムバッファー中で、１
０ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを作用させ、６７
℃９０分間反応させ、Ｆａｂ’とした後に、セファデッ
クスＧ−２５の２５−カラムでゲル濾過を行い、Ｆａ
ｂ’分画を集めた。とのＦａｂ’分画に６０マイクロモ
ルのＮ、Ｎ” （１、２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ）ｂｉ
ｓｍａｌｅｉｍｉｄｅ を加え、３０℃で゛２０分間反
応させた後１．１ｏｏｉのセファデックスＧ−２５カラ
ムを用いてゲル濾過を行い、マレイミド化されたＦａｂ
’を２８．３ｍｑ得た。
，５の酢酸バッファー中で、６．８ ！９のにプシンを
作用させ、３７℃４０時間後、ｐＨ８，０のホウ酸バッ
ファーで平衡化したクルトロダルＡｃＡ３４カラムを使
ってケ゛ル濾過を行い、Ｆ（ａｂ’）Ｈのヒータを集め
、７３■の抗ヒトフェリチンＦ（ａｂ’）１を得た。こ
のうち６０■の抗ヒトフェリチンＦ（ａｂ’）２を、ｐ
ｔ−＋ ６．０のリン酸ナトリウムバッファー中で、１
０ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを作用させ、６７
℃９０分間反応させ、Ｆａｂ’とした後に、セファデッ
クスＧ−２５の２５−カラムでゲル濾過を行い、Ｆａ
ｂ’分画を集めた。とのＦａｂ’分画に６０マイクロモ
ルのＮ、Ｎ” （１、２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ）ｂｉ
ｓｍａｌｅｉｍｉｄｅ を加え、３０℃で゛２０分間反
応させた後１．１ｏｏｉのセファデックスＧ−２５カラ
ムを用いてゲル濾過を行い、マレイミド化されたＦａｂ
’を２８．３ｍｑ得た。
別に罪体としてトーヨーパールＨｖ、ｒ−７５（東洋ソ
ーダ製：商品名）の９０−を純水でよく洗浄した後に、
９０−の１ 、４− ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｄｉｇｌｙ
ｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ を加え、さらに１８Ｏｆｆ
ＩＰのＮａＢＨ４を含む０．６ Ｍ ＮａＯＨ溶液の９
０−を加え、２５℃で８時間撮トウする。その後担体を
再度純水で洗浄し、２７０−の１．５ Ｍ Ｎａｇ ８
２０３を加え、２５℃で１６時間反応させる。反応後、
１ｔの純水で洗浄しヌツチェで引ききった後に２７０ｒ
ｎｔの２５ ｍＭジチオスライトールを加え、５０℃９
０分間反応させる。反応後１ ｍＭＥＤＴＡ を含む
リン酸バッファーｐＨ６，０で洗浄し、１ゴの担体に２
５μモルのＳＨ基を有するトーヨーパールＨｗ−７５を
９０ゴ得た。
ーダ製：商品名）の９０−を純水でよく洗浄した後に、
９０−の１ 、４− ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｄｉｇｌｙ
ｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ を加え、さらに１８Ｏｆｆ
ＩＰのＮａＢＨ４を含む０．６ Ｍ ＮａＯＨ溶液の９
０−を加え、２５℃で８時間撮トウする。その後担体を
再度純水で洗浄し、２７０−の１．５ Ｍ Ｎａｇ ８
２０３を加え、２５℃で１６時間反応させる。反応後、
１ｔの純水で洗浄しヌツチェで引ききった後に２７０ｒ
ｎｔの２５ ｍＭジチオスライトールを加え、５０℃９
０分間反応させる。反応後１ ｍＭＥＤＴＡ を含む
リン酸バッファーｐＨ６，０で洗浄し、１ゴの担体に２
５μモルのＳＨ基を有するトーヨーパールＨｗ−７５を
９０ゴ得た。
１５ゴのＳＨ基を有するトーヨーパールＩ（Ｗ−７５に
２８．５１ｎ９のマレイミド化Ｆａｂ’を加え、１ｍＭ
のＥＤＴＡ存在下、リン酸バッファーｐＨ６，０の条件
下４℃で４００時間反応た。反応後１５０ｍ／！のリン
酸バッファーｐｉ−１６，０で洗浄し、洗浄液に米るＡ
２ａ。ｎｍの吸収から固定化量を求めた。その結果、０
．９７〜のマレイミド化Ｆａｂ’が１−のトーヨーパ−
ルＨＷ−７５に結合しているのが分った。ここに抗フェ
リチン免疫吸着体が得られたのである。
２８．５１ｎ９のマレイミド化Ｆａｂ’を加え、１ｍＭ
のＥＤＴＡ存在下、リン酸バッファーｐＨ６，０の条件
下４℃で４００時間反応た。反応後１５０ｍ／！のリン
酸バッファーｐｉ−１６，０で洗浄し、洗浄液に米るＡ
２ａ。ｎｍの吸収から固定化量を求めた。その結果、０
．９７〜のマレイミド化Ｆａｂ’が１−のトーヨーパ−
ルＨＷ−７５に結合しているのが分った。ここに抗フェ
リチン免疫吸着体が得られたのである。
４°Ｃでろ−の抗フェリチン免疫吸着体に、ヒト胎盤抽
出液（フェリチン濃度４μｇ／ｄ）を９００ゴ流しその
後、ＰＢＳの１５０ｍ１で免疫吸着体を洗浄した。各５
ｍｅづつ分画し、それぞれのＡ□。、。
出液（フェリチン濃度４μｇ／ｄ）を９００ゴ流しその
後、ＰＢＳの１５０ｍ１で免疫吸着体を洗浄した。各５
ｍｅづつ分画し、それぞれのＡ□。、。
ｎｍ とフェリチン量を定量した。その溶出曲゛線は第
１図に示される。第１図において、ａはＡ２８゜ｎｍに
おける吸光度を示し、夾雑蛋白質の濃度を表し、ｂはフ
ェリチンの濃度を示している。
１図に示される。第１図において、ａはＡ２８゜ｎｍに
おける吸光度を示し、夾雑蛋白質の濃度を表し、ｂはフ
ェリチンの濃度を示している。
第１図からフェリチンが５２０７！の溶出流量の所から
もれはじめ、この結果から、３−の免疫吸着体に２．０
８〜の７エリチンが結合したことが分った。結合したＦ
ａｂ’の力価が、０．６７■フエリチン／１ηＦａｂ’
から、 固定化された抗フェリ≠ン抗体の活性残存率（チ）実施
例２゜ 抗Ｍ Ｄ Ｈマウスモノクローナル抗体の固定化常法に
より得た抗ＭＤ）（マウスモノクローナル抗体のＦ（ａ
ｂ′）、分画３．５５ｍ９を０．９−の１ｍＭＥＤＴＡ
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，０に溶
解する。さらに０．１ｒｎｔの０．１Ｍ２−メルカプト
エチルアミンを添加し、６０℃９０分間インキュベート
した後、２５ｍの５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −２５を用い
上記緩衝液に対して脱塩する。２．９５■のＦａｂ’を
得た。
もれはじめ、この結果から、３−の免疫吸着体に２．０
８〜の７エリチンが結合したことが分った。結合したＦ
ａｂ’の力価が、０．６７■フエリチン／１ηＦａｂ’
から、 固定化された抗フェリ≠ン抗体の活性残存率（チ）実施
例２゜ 抗Ｍ Ｄ Ｈマウスモノクローナル抗体の固定化常法に
より得た抗ＭＤ）（マウスモノクローナル抗体のＦ（ａ
ｂ′）、分画３．５５ｍ９を０．９−の１ｍＭＥＤＴＡ
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，０に溶
解する。さらに０．１ｒｎｔの０．１Ｍ２−メルカプト
エチルアミンを添加し、６０℃９０分間インキュベート
した後、２５ｍの５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −２５を用い
上記緩衝液に対して脱塩する。２．９５■のＦａｂ’を
得た。
常法により得だアミノド・−ヨーパールＨＷ７５５、５
？ （１６μｍｏｌ −ＮＨ２／ｍｌ ｇｅｌ ）に
０．５５１のＮ 、 Ｎ −ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｆｏｒ
ｍａｍｉｄｅに溶解した１５．７〜のＮ−（γ−ｍａ
ｌ ｅ １ｍ１ｄｏｂｕｔｙ−ｒｙｌｏｘｙ ）ｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｅを添加し、次いで、３．１５ｒｎｔの
０．１Ｍリリンナトリウム緩衝液ｐｉ−１７，０を添加
する。ろＯ℃６０分間インキュベートした後、１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む０．１ Ｍ ＩＪン酸ナナトリウム緩衝
液ｐＨ６０で充分に洗浄する。そこに２．９３〜の抗Ｍ
Ｄ）（マウス ！モノク・エチル抗体−・ｂ
・を添加し、゛４℃４０時間反応させる。９０．８％の
Ｆａｂ’が固定化され、０．９■Ｆａｂ’／ｄｇｅｌの
固定化Ｆａｂ’を得た。さらに過剰のマレイミド基を１
ｒｒＬＭ メルカプトエタノール、メ４６．０の１００
４でブロックし、ＰＢＳで充分に洗浄し免疫吸着体を得
た。１．５ ｍｌの免疫吸着体カラムに、１２５ ｕｎ
ｉｔ／−のＭＤＨと１４／ｄのＭＤ）Ｉを含むＰ、Ｂ
Ｓを４、〇−添加し、出て来る溶出液を１．９−づつ分
析した。結果を第２図に示す。
？ （１６μｍｏｌ −ＮＨ２／ｍｌ ｇｅｌ ）に
０．５５１のＮ 、 Ｎ −ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｆｏｒ
ｍａｍｉｄｅに溶解した１５．７〜のＮ−（γ−ｍａ
ｌ ｅ １ｍ１ｄｏｂｕｔｙ−ｒｙｌｏｘｙ ）ｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｅを添加し、次いで、３．１５ｒｎｔの
０．１Ｍリリンナトリウム緩衝液ｐｉ−１７，０を添加
する。ろＯ℃６０分間インキュベートした後、１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む０．１ Ｍ ＩＪン酸ナナトリウム緩衝
液ｐＨ６０で充分に洗浄する。そこに２．９３〜の抗Ｍ
Ｄ）（マウス ！モノク・エチル抗体−・ｂ
・を添加し、゛４℃４０時間反応させる。９０．８％の
Ｆａｂ’が固定化され、０．９■Ｆａｂ’／ｄｇｅｌの
固定化Ｆａｂ’を得た。さらに過剰のマレイミド基を１
ｒｒＬＭ メルカプトエタノール、メ４６．０の１００
４でブロックし、ＰＢＳで充分に洗浄し免疫吸着体を得
た。１．５ ｍｌの免疫吸着体カラムに、１２５ ｕｎ
ｉｔ／−のＭＤＨと１４／ｄのＭＤ）Ｉを含むＰ、Ｂ
Ｓを４、〇−添加し、出て来る溶出液を１．９−づつ分
析した。結果を第２図に示す。
この結果、１智のＦａｂ’に２５８５ ｕｎｉｔのＭＤ
Ｈが結合した。ＭＤＨの比活性を２５００ ｕｎｉｔ
／ＪＩＩ９ｐｒｏｔｅｉｎとすると、１りのＦａｂ’Ｋ
１ ｒＮｉのＭＤＨが結合した事になる。Ｍ Ｄ Ｈ
の分子量が約６００００であるから、Ｆａｂ’の固定化
後の活性残存率は８６チであった。
Ｈが結合した。ＭＤＨの比活性を２５００ ｕｎｉｔ
／ＪＩＩ９ｐｒｏｔｅｉｎとすると、１りのＦａｂ’Ｋ
１ ｒＮｉのＭＤＨが結合した事になる。Ｍ Ｄ Ｈ
の分子量が約６００００であるから、Ｆａｂ’の固定化
後の活性残存率は８６チであった。
第１図は実施例１におけるフェリチンの溶出曲線を示す
図である。 第２図は実施例２におけるＭＤＨの溶出曲線を示す図で
ある。 ａ・・・Ａ２ｇ。ｎｍにおける吸光度 ｂ・・・フェリチンの濃度 Ｃ・・・Ａ２１゜ｎｍにおける吸光度 ｄ・・・Ｍ Ｄ Ｈの単位 代理人 弁理士 戸 １）親 男 手続補正＃（方式） 昭和６０年３月２２日
図である。 第２図は実施例２におけるＭＤＨの溶出曲線を示す図で
ある。 ａ・・・Ａ２ｇ。ｎｍにおける吸光度 ｂ・・・フェリチンの濃度 Ｃ・・・Ａ２１゜ｎｍにおける吸光度 ｄ・・・Ｍ Ｄ Ｈの単位 代理人 弁理士 戸 １）親 男 手続補正＃（方式） 昭和６０年３月２２日
Claims (3)
- （１）抗体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合を還元し、得
られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、結合基を有する
担体の結合基とを架橋してなる免疫吸着体。 - （２）抗体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合を還元し、得
られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、ＳＨ基を有する
担体のＳＨ基とを、１分子内にマレイミド基を２ケ以上
有する化合物で架橋することを特徴とする免疫吸着体の
製造法。 - （３）抗体のヒンジ部分にあるＳ−Ｓ結合を還元し、得
られたＳＨ基を有する抗体のＳＨ基と、アミノ基、イミ
ノ基、ヒドラジノ基、又は１〜３級アミンの１種もしく
は２種以上の結合基を有する担体の結合基とを、１分子
内にマレイミド基とスクシンイミドエステル基の両方を
有する化合物で架橋することを特徴とする免疫吸着体の
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22593884A JPH0753759B2 (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 免疫吸着体及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22593884A JPH0753759B2 (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 免疫吸着体及びその製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7018825A Division JP2826965B2 (ja) | 1995-01-12 | 1995-01-12 | 免疫吸着体とその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61103838A true JPS61103838A (ja) | 1986-05-22 |
| JPH0753759B2 JPH0753759B2 (ja) | 1995-06-07 |
Family
ID=16837248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22593884A Expired - Fee Related JPH0753759B2 (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 免疫吸着体及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0753759B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62132172A (ja) * | 1985-12-04 | 1987-06-15 | Shionogi & Co Ltd | 固相化抗体およびその製造方法 |
-
1984
- 1984-10-29 JP JP22593884A patent/JPH0753759B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62132172A (ja) * | 1985-12-04 | 1987-06-15 | Shionogi & Co Ltd | 固相化抗体およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0753759B2 (ja) | 1995-06-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |