JPS6052745B2 - 新規な化合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は下記、一般式［１］ （ただし、式中Ｒは２−ベンゾチアゾリル；たは２−ピ
リジルー Ｎ−オキサイド基を示す［表わされる、新規
な化合物に関する。

また、本；の一般式〔Ｉ〕で表わされる新規な化合物下
、化合物〔Ｉ〕と称す）は、その分子中に反応性の異な
る２種の５−５交換反応性を示す官能基］で１５を有す
る新規な化合物である。

さらに本発明の化箔明 合物〔Ｉ〕は、その官能基に基
き、ハブチッ、抗（以 原、抗体、その他の受容体、酵
素などにおけるチ乏応 オール基を有する生理活性物質
やチオール基を導入された生理活性物質の架橋試薬、固
定化試薬として、またこれらの生理活性物質やチオール
基を有する担体などの反応性誘導体を得るに当つて有用
な化合物である。従来より多官能性基を有する化合物が
架橋試薬または固定化試薬として種々知られているが、
これらの化合物におけるその官能基は互いに等価の反応
性を示す同一または異なる官能基からなるものにすぎず
、従つてこの化合物を生理活性物質などに反応せしめれ
ば、得られる生成物において生理活性物質のダイマー状
結合物や生理活性物質の分子内結合物、さらには異なる
官能性によつて結合状態を異にする結合物などの多種の
副反応生成物を生じる欠点があつた。

本発明者らは、上記の欠点のない優れた化合物について
種々研究した結果、一般式〔〕（ただし、式中Ｒは前記
と同じ基を示す）で表わされるカルボン酸誘導体に、式
〔〕で表わされるアミン誘導体を反応せしめて得られる
化合物〔１〕が、その２−ベンゾチアゾリル基、２−ピ
リジンーＮ−オキサイド基に結合するＳ−Ｓ基がチオー
ル基を有する化合物に対して第一段のＳ−Ｓ交換反応を
行ない、次いでその２−ピリジル基に結合するＳ−Ｓ基
が第二段のＳ−Ｓ交換反応を行なう逐次反応を示すＳ−
Ｓ交換反応．性を有する化合物であることを見い出した
。

また化合物〔１〕が、２種のチオール基を有する化合物
を化合物〔１〕に段階的に反応せしめることにより、化
合物〔１〕の目的とする部位に定量的に、各々のチオー
ル基を有する化合物をその両端．に結合せしめ得ること
のできる良好な化合物で、種々の試薬として有用な化合
物であることを知つた。本発明は上記の知見に基いて完
成されたもので、種々の有用性を有する優れた新規な化
合物を−提供するものである。

まず、本発明は化合物〔１〕を得るに当つては、例えば
、一般式〔〕で表わされるカルボン酸誘導体の反応性誘
導体と、式〔〕で表わされるアミン誘導体とを、不活性
媒体中反応せしめればよく、その際は各々等モル程度を
用いて、その反応条件として通常−２０〜３０℃程度、
１紛〜５時間程度にて行なえばよく、さらにその不活性
媒体としては例えばジメチルホルムアミド、クロロホル
ム、ベンゼン、酢酸エチル、メチレンクロライド、テト
ラヒドロフランまたはそれらの混合媒体が使用されるも
ので、次いでその反応終了後その反応生成物たる化合物
〔１〕を通常の分離、採・取、精製手段を用いて得れば
よい。

また上記における一般式〔旧で表わされるカルボン酸誘
導体を得るに当つては、例えば２，２″ージチオビス（
ベンゾチアゾール）または２，２″ージチオビス（ピリ
ジンーＮ−オキサイド）と、３−メルカプトプロピオン
酸とを、各々等モル程度ないし、３−メルカプトプロピ
オン酸を多少過剰用いて、これを例えばベンゼン、クロ
ロホルム、四塩化炭素、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの溶媒に加えて、１０〜７０℃程度、１紛〜５
時間程度の反応条件にて行ない、次いで反応終了後冷却
、濃縮、減圧乾燥などの通常の採取手段を用いて反応生
成物たる一般式〔旧で表わされるカルボン酸誘導体を得
ればよく、さらにこの誘導体は、ジメチルホルムアミド
、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの
溶媒中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドやｐ−ニトロフェ
ノールとともにシンクロヘキシルカルボジイミドを用い
るか、直接塩化チオニールなどにて処理して、そのカル
ボキシル基のＮ−スクシンイミドエステルやｐ−ニトロ
フェニルエステルなどの活性エステル、酸クロライドと
しての一般式〔旧で表わされるカルボン酸誘導体の反応
性誘導体とすればよく、また一般式〔旧で表わされるカ
ルホン酸誘導体にシンクロヘキシルカルボジイミドなど
の縮合剤を加えて式〔〕で表わされるアミン誘導体との
縮合反応を行なわせしめてもよい。

さらに式〔〕で表わされるアミン誘導体としては、ザ・
ジャーナル・オブ・オルガニック・ケミ ス ト
リ 一 （ＴｌｌｅＪＯｕｍａｌＯｆＯｒｇａ
ｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）？１６３５（１９６俳６月
）にて記載の化合物であり、この記載に従えば、２−メ
ルカプトエチルアミンを過酸化水素を用いて酸化して２
ーアミノエチルーJメ[アミノエタンチオールスルホナー
トを得、これに２−メルカプトピリジンを反応せしめる
ことによつて得られるものであり、また２，２″ージチ
オビス（ピリジン）と２−メルカプトエチルアミンとを
用いて得てもよい。さらに上記の一般式〔〕で表わされ
るカルボン酸誘導体またはその反応性誘導体や、式〔〕
て表わされるアミン誘導体を得るに当つて、上記の記載
はその一例であつて、何んら目的とする化合物〔１〕を
得るために限定されるものでなく、また本発明の化合物
〔１〕を得るに当つて、上記例示以外の方法によつて得
られたものであつてもよい。このようにして得られた本
発明の化合物〔１〕のＳ−Ｓ交換反応性についてみれば
次の通りである。

まず本発明の化合物〔１〕として、下記式〔１ａ〕，〔
Ｉｂ〕で表わされる化合物を用いた。

また上記の式〔１ａ〕，〔Ｉｂ〕で表わされる化合物の
各々のＳ−Ｓ交換反応性を求めるために、これらの化合
物に対して、チオール基を有する化一合物としてグルタ
チオンをモル比で０．５倍から２倍の各量で用いた。ま
たその反応においては、第一表に示す通りの各濃度に調
整したもので、またその反応媒体としてリン酸緩衝液（
１ｍＭのＥＤＴＡ含有０．１Ｍ，．ＰＨ７．２）を用い
、２５℃、３紛間反応せしめたものである。そのＳ−Ｓ
交換反応の結果、生成した２−メルカプトベンゾチアゾ
ール、２−メルカプトピリジンーＮ−オキサイド、２−
メルカプトピリジンの各吸収極大波長である３１０ｎｍ
１３３３ｒ１ｍ１３４３ｒ１ｍにおける各吸光度を求め
た。

また吸光度の測定は、各反応液を、上記反応媒体を用い
て、５＠希釈して行なつたものである。

さらに、グルタチオンを等モル以上用いる場合は、あら
かじめグルタチオンを等モル加えて反応せしめ、その反
応生成物を確認した後、その残部のグルタチオンを必要
量加えて行なつた。なお、第一表におけるΔＡは、反応
開始後と反応開始前での各吸収極大波長における吸光度
の差を示す。

さらに、それらの各吸収極大波長におけるモル吸光係数
は、次の通りであつた。

２−メルカプトベンゾチアゾール １９３００（３１０ｒ１ｍ）、１６０（３４３ｎｎ１）
２−メルカプトピリジンーＮ−オキサイド３８３０（３
３３ｎｎ１）、３１９０（３４３ｒ１ｍ）２−メルカプ
トピリジン３１７０（３１０ｒ１ｍ）、７２７０（３３
３ｒ１ｍ）、８１３０（３４３ｎｎ１）その結果、各条
件における、そのΔＡおよび考察は、第一表に示す通り
であつた。

上記の第一表に示す通り、本発明の化合物〔１〕は、チ
オール基を有する化合物に対し、２段階の異なる反応性
を示すＳ−Ｓ交換反応基を有する新規な化合物であり、
かつそのＳ−Ｓ交換反応性も反応方向の一定したもので
、また定量的に反応し得るもので極めて良好なものであ
る。

従つてまた、本発明の化合物〔１〕は、例えば酵素免疫
測定法や酵素レセプターアツセイにおいて用いられる酵
素とハプテン、抗原、抗体またはレセプターとの結合体
を得るための架橋試薬、抗体産生に必要なハプテンと蛋
白質との結合体を得るための架橋試薬、固相体としての
担体とハプテン、抗原、抗体またはレセプターとの固定
化のための固定化試薬などの免疫測定などへの利用、酵
素と担体との結合体たる固定化酵素としての固定化試薬
、ハプテン、抗原、抗体またはレセプターと担体とのア
フイニテイークロマトグラフイー用としての固定化試薬
としての種々の試薬としての利用が挙られ、またこれら
の生理活性物質や担体にこの化合物〔１〕を反応せしめ
ることによつ，て、Ｓ−Ｓ交換反応性を有するそれらの
反応性誘導体を得ることもできる有用な化合物であり、
これらの有用な化合物を得るに当つては、一般に不活性
媒体、例えば水、リン酸緩衝液、ジメチルホルムアミド
、テトラヒドロフランまたはそれらのｌ混合媒体を用い
て、室温下、１紛ないし２４時間程度反応せしめて得ら
れるものである。なお、上記の生理活性物質や担体にお
いては、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどの酵素
のチオール基をあらかじめ有している化合物や市販のチ
オール基；を有する担体、例えばアクリルアミド系ポリ
チオール、ガラス系チオール基含有化合物などのチオー
ル基を有する化合物に限らす、生理活性物質や担体にお
いて、特に蛋白質やペプタイド分子中のＳ−Ｓ基を還元
して得られたものであつてもよく、また官能基にチオー
ル基を導入する手段、例えばＳ−アセチルメルカプトサ
クシニツク・アンハイドライドを用いてそれらのアミノ
基をもつて導入してもよく（アーカイブス・オブ・バィ
オケミストリー・アンド●バイオフィジックス，ＡＲＣ
ＨＩＶＥＳＯｆＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤＢｌＯ
ＰＨＹＳＩＣＳ，．？，６０５−６１２（１９６２））
、また２ーベンゾチアゾリル基または２−ピリジルーＮ
−オキサイド基を有するジスルフィド誘導体の反応性誘
導体を用いてそれらのアミノ基をもつて反応せしめ（特
願昭５３−８５９０吋）、このＳ−Ｓ基をジチオスライ
トールまたはアルカリ性、例えば約ＰＨ９．５以上の水
性媒体にて処理して開裂せしめてチオール基を導入せし
めたものであつてもよい。

次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発明
は何んらこれにより限定されるものてはない。実施例１ （１）２，２″ージチオビス（ベンゾチアゾール）４０
ｙをベンゼン１．５ｅに溶解し、これに３−メルカプト
プロピオン酸８．０ｙを滴下し、７０℃、３時間攪拌し
た。

その後反応液を室温まて冷却し、これを減圧濃縮し、さ
らに５゜Ｃ１一晩静置して析出した粗結晶を淵取し、こ
の粗結晶をベンゼンにて再結晶化して３−（２″−ベン
ゾチアゾリルージチオ）プロピオン酸の結晶１６．２５
ｙを得た（構造１６３〜１６４℃）。

次いで、この３−（２″−ベンゾチアゾリルージチオ）
プロピオン酸８．１３ｆをジメチルホルムアミド８０ｍ
１に溶解し、氷冷下、攪拌しながらＮ−ヒドロキシスク
シンイミド３．４５ｙおよびジシグクロヘキシルカルボ
ジイミド６．８ｆ１を加えて１時間氷冷下攪拌し、さら
に２時間室温下攪拌した。

その後生成したシンクロヘキシル尿素を枦別した枦液を
１＠量の水に加えてその析出物を戸取し、これを減圧下
にて乾燥し、この乾燥物９．９４ｙをベンゼンを用いて
再結晶を繰り返して３−（２″−ベンゾチアゾリルージ
チオ）プロピオン酸●Ｎ−スクシンイミドエステル７．
１８ｆを得た（構造式：Ｍ．ｐ．ｌ２２〜１２３そＣＸ
ｍａｘ２７Ｏｎｍ（ジメチルホルムアミドリリン酸緩衝
液＋（イ）．１Ｍ，ＰＨ７．５）＝１：９）、Ｒｆ値：
０．５３（ベンゼンニ酢酸エチルニ３：１によるシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィー））
１（（２）２−メルカプトエチルアミ
ン●塩酸塩１０．０ｙを水４０ｍ１に溶解し、氷冷下攪
拌しながら３０％過酸化水素水４．５ｍ１を滴下し、３
紛間攪拌し、さらに３０％過酸化水素水９．０ｍ１を滴
下した後室温下２＠間静置した。

次いで室温にて反応液を減１．″圧濃縮し、シロツプ状
物を得、これに無水エタノールを添加して結晶化を行な
い、粗結晶１０．７ｑを得た。さらにこれを氷酢酸を用
いて再結晶を行ない白色針状晶の２−アミノエチル２″
−アミノエタンチオールスルホナート・２塩酸塩２（９
．７７ｙを得た（構造式：Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２一Ｓ
Ｏ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２●２ＨＣ１、Ｍ．ｐ
．ｌ６５〜１６６゜Ｃ（分解））。次いで、この２−ア
ミノエチル２″−アミノエタンチオールスルホナート・
２塩酸塩７．７１ｙ２ｊを、濃塩酸３ｍ１を含む水溶液
１２ｍ１に溶解し、これに、２−メルカプトピリジン３
．３３ｙを溶解した工タール溶液１２ｍ１を室温下攪拌
しながら滴下した。

２Ｃ＠間攪拌した後反応液より減圧下エタノールを留去
せしめ、これにクロロホルムを加３′えて未反応物を抽
出除去し、さらにこの溶液に氷冷下、冷却した水酸化カ
リウム８．４ク含有水溶液を加え、クロロホルムを加え
て抽出し、さらに２回抽出し、これらの抽出液は直ちに
濃塩☆Ｎ−〔２−（２″−ピリジルージチオ）エチル〕
−３−（２″ベンゾチアゾリルージチオ）プ４Ｃロピオ
ンアミド入ＮｌａＸ２８２ｎｎｌ、Ｅ（％＝２３５（ジ
メチノレホノレムアミドニ０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ
７．５）＝１９）Ｙ酸を用いて転溶せしめ、その塩酸層
を回収し、併合し、これを濃縮してシロツプ状物を得た
。

次いでこれに無水エタノールを加えて析出した粗結晶４
．９１ｆを得、さらにこれを無水エタノールより再結晶
化して、２−ピリジルJメ[アミノエチルジスルフィド・
２塩酸塩３．６８ｙを得た（構造式：））まず、２−ピ
リジルJメ[アミノエチルジスルフィド・２塩酸塩２．０
ｇを水２０ｍ１に溶解し、これを１Ｎ水酸化カリウム水
溶液にてＰＨｌＯに調整した後酢酸エチルを加えて抽出
し、この酢酸エチル層を回収し、これを水洗した後芒硝
を加えて脱水した。

次いで、この酢酸エチル層を−１５℃に冷却下、酢酸エ
チルに溶解した３−（２″−ベンゾチアゾリルージチオ
）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル２．２７
ｙ溶液を攪拌滴下し、９０分間反応せしめてその析出物
を枦取し、これを乾燥した。さらにこれをクロロホルム
に溶解し、氷冷下５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄
し、水洗し、さらに芒硝で乾燥した後そのクロロホルム
層を濃縮した。この濃縮液にヘキサンを加えて、下記構
造を有する目的物２．０７ｇを得た。Ｒｆ値：０．４１
（クロロホルムニ酢酸エチルニ１：１によるシリカゲル
薄層クロマトグラフィー）０．１２（ベンゼンニ酢酸エ
チルニ３：１によるシリカゲル薄層クロマトグラフィー
）また、本目的物は、次の反応よりも、その反応性およ
び有用性が明らかである。

後述の通り行つて得られた抗インスリン抗体一Ｆａｂ″
２．０ｍ９含有０．８５％（イ）．１５Ｍ）ＮａＣｌ・
１ｍＭＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（０．０１
Ｍ．．ｐＨ７．２）２．０ｍ１に、５０ｒｎｃｇ／Ｍｌ
Ｎ−〔２−（２′ーピリジルージチオ）エチル〕−３−
（７ーベンゾチアゾリルージチオ）プロピオンアミドの
１０％ジメチルホルムアミド含有ＰＢＳ（イ）．０１Ｍ
．．ＰＨ７．２）溶液３６ＳＰｅを加えて２５℃、３紛
間反応せしめた。

次いで、この反応液を分取して、波長 ３１０ｒ１ｍ３４３ｒ１ｍにて吸収値を求めた結果、該
反応液中のＮ−〔２−（２′−ピリジルージチオ）エチ
ル〕−３−（２″ベンゾチアゾリルージチオ）プロピオ
ンアミドのうち、９６％の２−メルカプトベンゾチアゾ
ールおよび３％の２−メルカプトピリジンが検出された
。

さらに、別に分取したこの反応液に、２−メルカプトエ
タノールを加えた結果、２−メルカプトベンゾチアゾー
ルの吸収の増加はみられなかつたが、２−メルカプトプ
リジンの吸収は増加し、その９３％が生成した。

その結果、抗インスリン抗体−Ｆａｂ″の約９６％が、
その２−ベンゾチアゾリル基に結合するＳ−Ｓ基とＳ−
Ｓ交換反応をしたものと認められる。

また、その反応液０．５ｍｔを分取し、０．１Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液てＰＨ８．５に調節した後、ＰＢＳ（
イ）．０１Ｍ，ＰＨ８．５）に溶解した４．３７ｍ９含
有β−ガラクトシダーゼ溶液を加え、２５℃、１時間反
応せしめた。

反応後これを、セフアデツクスＧ−５０（商品名：フア
ルマシア、ファインケミカル社製）を充填したカラム（
径１．５×８４ｃｍ）を用いてゲルｐ過（展開溶媒：Ｐ
ＢＳ（０．０１Ｍ，ＰＨ７．２）を行ない、５．０ｍ１
分画を行なつて、その１１〜１鉢目のフラクシヨンを回
収し、併合した。この得られた溶出液は、未反応のβ−
ガラクトシダーゼを４．６％含有し、また未反応の抗イ
ンスリン抗体−Ｆａｂ″は検出されなかつた。

また、このことよりも、この溶出液において、抗インス
リン抗体−Ｆａｂ″はβ−ガラクトシダーゼに対して１
対１の結合比をもつてなる、２−ベンゾチアゾリル基に
結合したＳ−Ｓ基に抗インスリン抗体−Ｆａｂ″のＳＨ
基との交換反応、２−ピリジル基に結合したＳ−Ｓ基に
β−ガラクトシダーゼのＳＨ基との交換反応によつて得
られた結合体と認められた。なお上記の抗インスリン抗
体−Ｆａｂ″の調製は次の通りの方法に従つたものであ
る。

インスリン抗体含有１ｇＧ５０ＷＬ９を、０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ＰＨ４．５）２ｍ１に溶解し、これにペプシン
（シグマ社製）１１ｎ９を加えて３ｒＣ、１６時間反応
せしめた。

次いで、この反応液をセフアデツクスＧ−１５０（商品
名）のカラム（径１．５×５０ｃｍ１展開溶媒０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ））にてゲル淵過して、その
Ｆ（Ａｂ″）２の活性分画を得、さらにこれをコロジオ
ンバツグにて濃縮後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．Ｏ
）に対して４℃、１晩透析を行なつた。透析内液にメル
カプトエタノールアミンを１０ｍＭ濃度に添加し、３Ｔ
Ｃ１９０分間反応させ、この反応液を、セフアデツクス
Ｇ一２５（商品名）のカラム（径１．５×５０ｃ！ｎ１
展開溶媒：０．１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．Ｏ））にてゲ
ルろ過を行ない、そのＦａｂ゛分画１５ｍｇを得た。得
られた抗インスリン抗体−Ｆａｂｌモル当りのＳＨ基は
約０．９５モルであつた（文献：′ＮｌｅＪＯｕｍａｌ
ＯｆＩｍｍｕｎＯｌＯｇｙ，Ｕ？６）１５５４（１９７
６）参照）。実施例２２，７ージチオビス（ピリジンー
Ｎ−オキサイド）５．０５ｙを、クロロホルム２００ｍ
１に溶解し、これに３−メルカプトプロピオン酸２．５
５ｙを滴下し、４０℃、１時間攪拌し、その後反応液を
室温まで冷却して析出物をｐ取し、さらにこの析出物を
クロロホルムにて再結晶化して、３−（２″−ピリジル
ーＮ−オキサイドージチオ）プロピオン酸３．７２ｆ！
を得た（Ｒｆ値：０．６３（ｎブタノールニ酢酸：水＝
４：１：１によるシリカゲル薄層クロマトグラフィー）
また実施例１と同様にして得られた２−ピリジルーJメ
[アミノエチルジスルフィド・２塩酸塩２．０ｆを水２
０ｒ１Ｌｔに溶解し、氷冷下１Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液にてＰＨを１０に調整した後クロロホルムにて抽出し
、そのクロロホルム層を回収し、水洗した後芒硝を加え
て乾燥し、さらにこれを減圧濃縮した。

さらに、上記の３−（２″−ピリジルーＮ−オキサイド
ージチオ）プロピオン酸１．１９ｙを、テトラヒドロフ
ラン５０ｍ１に溶解し、この溶液に、氷冷下攪拌しなが
ら、シンクロヘキシルカルボジイミド１．０６ｆ含有テ
トラヒドロフラン溶液２ｍｔを滴下した。

２紛後、この溶液と、上記の濃縮液とを氷冷下攪拌しな
がら合し、１時間攪拌した後室温下、３時間攪拌し続け
た。

反応後生成したシンクロヘキシル尿素を枦去し、その戸
液に水を加え、さらにクロロホルムを加えて、そのクロ
ロホルム抽出液を回収した。

さらにこのクロロホルム層を、５％塩酸、５％炭酸水素
ナトリウム水溶液、水の順にて洗浄した後、芒硝を加え
て乾燥し、クロロホルムを留去して、下記構造を有する
目的物１．４６ｇ（純度９１％）を得た。Ｎ−〔２−（
２″−ピリジルージチオ）エチル〕−３−（２″−ピリ
ジルーＮ−オキサイドージチオ）プロピオンアミドＲｆ
値：０．５５（ｎ−ブタノールリピリジンニ酢酸：水＝
１０：３：０．１：１１の上層液によるシリカゲル薄層
クロマトグラフィー）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］（ただし、
   式中Ｒは２−ベンゾチアゾリル基または２−ピリジル−
   Ｎ−オキサイド基を示す）で表わされる新規な化合物。