JPH01283268A - 新規二官能性化合物およびその製法 - Google Patents
新規二官能性化合物およびその製法Info
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- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
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- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、一般式I
〔式中、Aはアミン置換された芳香族基を表わし、Xは
1〜10個の炭素原子を有する炭化水素基を表わす〕の
化合物に関する。
1〜10個の炭素原子を有する炭化水素基を表わす〕の
化合物に関する。
タンパク質へ反応性基を導入するためには、例えばティ
ラセン(P、 Tijssen )著、バートン(R,
H,Burdon )、フォノ クニスンベルク(P、
H,Von Knippenberg)編のプラクテイ
ス・アンド・セオリー・オシ・エンデイム・イムノアッ
セイで(Practice and Theory o
f gnzyme工mmunoassays )、エル
ゼヴイーアーフエアラーク(Elsevier−Ver
lag )刊1985に記載されている一連の試薬が公
知である。このような試薬は、例えば2−イミノチオラ
ン(Juθ等、Biochemistr7 1 7
、 5399 〜5405 頁(1978))、N−
スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)−プロ
ピヘート(Carl−sson等、Biochem、
J、 173.723〜737(1978)Lアセチル
メルカプトコハク酸無水物(Klotz und He
1ney 、 Arch、 Biochem。
ラセン(P、 Tijssen )著、バートン(R,
H,Burdon )、フォノ クニスンベルク(P、
H,Von Knippenberg)編のプラクテイ
ス・アンド・セオリー・オシ・エンデイム・イムノアッ
セイで(Practice and Theory o
f gnzyme工mmunoassays )、エル
ゼヴイーアーフエアラーク(Elsevier−Ver
lag )刊1985に記載されている一連の試薬が公
知である。このような試薬は、例えば2−イミノチオラ
ン(Juθ等、Biochemistr7 1 7
、 5399 〜5405 頁(1978))、N−
スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)−プロ
ピヘート(Carl−sson等、Biochem、
J、 173.723〜737(1978)Lアセチル
メルカプトコハク酸無水物(Klotz und He
1ney 、 Arch、 Biochem。
Biophys、 96.605〜612頁(1962
))またはS−アセチルメルカプト酢酸−N−ヒドロキ
シスクシンイミVエステル(R,Julian 等、A
nal、 Biochem、 132.68〜73 (
1983))である。このような化合物はそれぞれ、タ
ンパク質の遊離アミノ基と反応するので、反応性基だけ
全遊離アミン基、例えばリジンのε−アミノ基またはN
末端アミノ基を有するタンパク質またはペプチドに導入
することができる。しかしながら、反応性アミノ基をわ
ずかだけ受は容′れるかまたは反応性アはノ基を全く受
は容れないタンパク質がある。
))またはS−アセチルメルカプト酢酸−N−ヒドロキ
シスクシンイミVエステル(R,Julian 等、A
nal、 Biochem、 132.68〜73 (
1983))である。このような化合物はそれぞれ、タ
ンパク質の遊離アミノ基と反応するので、反応性基だけ
全遊離アミン基、例えばリジンのε−アミノ基またはN
末端アミノ基を有するタンパク質またはペプチドに導入
することができる。しかしながら、反応性アミノ基をわ
ずかだけ受は容′れるかまたは反応性アはノ基を全く受
は容れないタンパク質がある。
SH−反応性基をタンパク質またはペプチドのチロシン
でカップリングすることができる試薬は、ダンカン(D
uncan )等によって、ジャーナル・オプ・イムノ
ロジカル・メソッズ(J。
でカップリングすることができる試薬は、ダンカン(D
uncan )等によって、ジャーナル・オプ・イムノ
ロジカル・メソッズ(J。
1:mmunol、 Methods )第80巻、1
37〜140頁(1985)に記載されている。しかし
ながら、これらの試薬は、高い過剰量で使用する心安が
あり、従って相当な規模で副反応が進行する可能性があ
る。
37〜140頁(1985)に記載されている。しかし
ながら、これらの試薬は、高い過剰量で使用する心安が
あり、従って相当な規模で副反応が進行する可能性があ
る。
従って本発明の課題は、チロシンにカップリングされる
ことができる基を有し、かつタンパク質またはペプチド
へ結合した際には副反応が小規模で進行する二官能性化
合物を提供することであった。
ことができる基を有し、かつタンパク質またはペプチド
へ結合した際には副反応が小規模で進行する二官能性化
合物を提供することであった。
この課題は、一般式I
〔式中、Aはアミン置換された芳香族基、およびXは1
〜10個の炭素原子を有する炭化水素基を表わす〕の化
合物によって解決される。
〜10個の炭素原子を有する炭化水素基を表わす〕の化
合物によって解決される。
Xは、有利に1〜6個の炭素原子を有する炭化水素基で
ちり、特に有利にはエチリデン基である。
ちり、特に有利にはエチリデン基である。
アミン置換された芳香族基Aは、例えば自体公知の方法
によリシア・戸ニウム塩に変換することができ、このシ
ア・戸ニウム塩は、再び容易にチロシンまたはチロシン
誘導体の芳香族環に結合し、その後還元によってチオピ
リジル基が脱離され、かつ8H−基が得られる。
によリシア・戸ニウム塩に変換することができ、このシ
ア・戸ニウム塩は、再び容易にチロシンまたはチロシン
誘導体の芳香族環に結合し、その後還元によってチオピ
リジル基が脱離され、かつ8H−基が得られる。
特に有利な本発明による化合物は、次の通りである:
N−(4−アミノベン・戸イル)”N’−(ピリジルジ
チオグロビオニル)−ヒドラジン、N−(4−アミノベ
ン・戸イル)−N’−(ピリジルジチオアセチル)−ヒ
ドラジン、 N−(4−アミノベンゾイル) −N/ −(ピリジル
ジチオブチリル)−ヒドラジン、 N−(2−アミノベンゾイル)−N’−(ビリジルジチ
オグロビオニル)−ヒドラジン、N−(2−アミノベン
ゾイル)−N’−(ピリジルジチオアセチル)−ヒドラ
ジン、 N−(2−アミノベンゾイル)−N’−(ピリジルジチ
オブチリル)−ヒドラジン。
チオグロビオニル)−ヒドラジン、N−(4−アミノベ
ン・戸イル)−N’−(ピリジルジチオアセチル)−ヒ
ドラジン、 N−(4−アミノベンゾイル) −N/ −(ピリジル
ジチオブチリル)−ヒドラジン、 N−(2−アミノベンゾイル)−N’−(ビリジルジチ
オグロビオニル)−ヒドラジン、N−(2−アミノベン
ゾイル)−N’−(ピリジルジチオアセチル)−ヒドラ
ジン、 N−(2−アミノベンゾイル)−N’−(ピリジルジチ
オブチリル)−ヒドラジン。
適当なのは、同様に、アミン置換された芳香族基Aが付
加的に一回寸たけ数回アルキル置換されている化合物で
ある。アミン置換は、−回または数回芳香族基Aで行な
わnでよい。
加的に一回寸たけ数回アルキル置換されている化合物で
ある。アミン置換は、−回または数回芳香族基Aで行な
わnでよい。
本発明の化合物によって、タンパク質またはペプチドと
のカップリング反応の際に、使用した試薬の約14の新
が取りこまれるので、従って反応には試薬の約6倍の過
剰量だけを使用すべきであることが、意想外にも判明し
た。
のカップリング反応の際に、使用した試薬の約14の新
が取りこまれるので、従って反応には試薬の約6倍の過
剰量だけを使用すべきであることが、意想外にも判明し
た。
本発明のもう一つの対象は一般式■の化合物の製法であ
り、この場合には、カルボン酸基のアルキル部分に1〜
10個の炭素原子を有するピリジルジチオアルキルカル
ボン酸−N−ヒドロキシスクシンイミダエステルを、芳
香族環でアミン置換された芳香族カルボン酸と反応させ
る。
り、この場合には、カルボン酸基のアルキル部分に1〜
10個の炭素原子を有するピリジルジチオアルキルカル
ボン酸−N−ヒドロキシスクシンイミダエステルを、芳
香族環でアミン置換された芳香族カルボン酸と反応させ
る。
ピリジルジチオアルキルカルボン酸−N−ヒドロキシス
クシンイミドエステルは、相応するピリジルジチオアル
キルカルボン酸から、N−ヒドロキシスクシンイミrか
よヒ縮合剤、例えばジシクロへキシルカルボジイミド、
ジイソグロビル力ルざジイミv寸たけモルホリノエチル
イソシアニドとの反応によって得られる。
クシンイミドエステルは、相応するピリジルジチオアル
キルカルボン酸から、N−ヒドロキシスクシンイミrか
よヒ縮合剤、例えばジシクロへキシルカルボジイミド、
ジイソグロビル力ルざジイミv寸たけモルホリノエチル
イソシアニドとの反応によって得られる。
ピリジルジチオアルキルカルボン酸のための出発物質は
、相応するメルカプトアルキルカルボン酸である。この
出発物質は2,2′−ピリジルジスルフィドとの反応に
よって、所望の化合物に変換される。
、相応するメルカプトアルキルカルボン酸である。この
出発物質は2,2′−ピリジルジスルフィドとの反応に
よって、所望の化合物に変換される。
有利には、ピリジルジチオプロピオン酸−N−ヒドロキ
シスクシンイミドニステルハ、芳香環の位背でアミン置
換された芳香族カルゼン酸のヒドラジドと反応される。
シスクシンイミドニステルハ、芳香環の位背でアミン置
換された芳香族カルゼン酸のヒドラジドと反応される。
有利な化合物N−(4−アミノ−ベン・戸イル)−N’
−(ヒlJジルジチオプロピオニル)−ヒドラジン全製
造するには、ビリジルジチオグロビオン酸−N−ヒνロ
キシスクシンイミドエステルをp−アミノ安息香酸ヒr
ラジドと反応させる。
−(ヒlJジルジチオプロピオニル)−ヒドラジン全製
造するには、ビリジルジチオグロビオン酸−N−ヒνロ
キシスクシンイミドエステルをp−アミノ安息香酸ヒr
ラジドと反応させる。
本発明の別の対象は、チロシンまたはチロシン誘導体、
殊((ペプチド捷たはタンパク質中で結合したチロシン
またはチロシン誘導体KSH−基を導入するために、一
般式■の化合物、有利にN−(4−アミノペン・戸イル
)−N’−(ピリジルジチオプロピオニル)−ヒドラジ
ンを使用することである。この場合本発明による化合物
・:は、基Aのアミン置換によりチロシンの芳香環に結
合され、還元によってチオぎリジル基は脱離され、この
場合にBH−基が生じる。
殊((ペプチド捷たはタンパク質中で結合したチロシン
またはチロシン誘導体KSH−基を導入するために、一
般式■の化合物、有利にN−(4−アミノペン・戸イル
)−N’−(ピリジルジチオプロピオニル)−ヒドラジ
ンを使用することである。この場合本発明による化合物
・:は、基Aのアミン置換によりチロシンの芳香環に結
合され、還元によってチオぎリジル基は脱離され、この
場合にBH−基が生じる。
本発明の有利な実施形において、基Aのアミノ基は、チ
ロシンまた7/iチロシン誘導体との反応前に、自体公
知の方法によりシア・戸化さnlその次にこのシア・ア
ル化合・物はチロシンまたはチロシン誘導体と反応され
、かつ還元剤の作用によってSH−基の遊離が惹起され
る。この場合、璧元剤は、チオール、例えばジチオトレ
イトールであるのか有利である。
ロシンまた7/iチロシン誘導体との反応前に、自体公
知の方法によりシア・戸化さnlその次にこのシア・ア
ル化合・物はチロシンまたはチロシン誘導体と反応され
、かつ還元剤の作用によってSH−基の遊離が惹起され
る。この場合、璧元剤は、チオール、例えばジチオトレ
イトールであるのか有利である。
適当ナチロシン誘導体の例は、チロキシンおよびトリョ
ードチロニンである。本発明によりBH基を導入するこ
とかで責るタンパク質の例は、R8AXIg()および
lHBsAg (B型肝炎−表面抗原)が、である。
ードチロニンである。本発明によりBH基を導入するこ
とかで責るタンパク質の例は、R8AXIg()および
lHBsAg (B型肝炎−表面抗原)が、である。
本発明によれば、sH−基をチロシン側鎖に導入するこ
とが可能になる。本発明による化合物のジアゾ化後の有
利な組人込みの際に、ジアゾ基が生じ、従って組み込&
率は、簡単なUV−測定によって測定することができる
。SH−基の遊離は、本発明によれば選択的に還元剤の
添加によって初めて行なわれ、かつ同様にUV測定によ
って続行することができる。
とが可能になる。本発明による化合物のジアゾ化後の有
利な組人込みの際に、ジアゾ基が生じ、従って組み込&
率は、簡単なUV−測定によって測定することができる
。SH−基の遊離は、本発明によれば選択的に還元剤の
添加によって初めて行なわれ、かつ同様にUV測定によ
って続行することができる。
また、本発明によれば、8H−反応性基、つ捷りビリジ
ルジチオ基、すなわちSH−基と反応可能な基の導入が
可能である。更に、還元過程は製造の際には不要である
。
ルジチオ基、すなわちSH−基と反応可能な基の導入が
可能である。更に、還元過程は製造の際には不要である
。
以下の例につき発明明金さらに詳述する。
例 1
X−(4−アミノペン・戸イル)−N/ −(ピリジル
ジチオプロピオニル)−ヒげラジンの合成p−アミノ安
息香酸ヒげラジば242叩をジオキサン/水(3M)2
OTnl中に入れる。これ(Cピリジルジチオプロピオ
ン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル500〜
を加える。
ジチオプロピオニル)−ヒげラジンの合成p−アミノ安
息香酸ヒげラジば242叩をジオキサン/水(3M)2
OTnl中に入れる。これ(Cピリジルジチオプロピオ
ン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル500〜
を加える。
室温で4時間攪拌し、次lC]l:空中で蒸発乾固させ
、メタノールから再結晶させる。結晶?吸引ろ過し、ク
コロホルムで洗浄し、かつ真空中CaCl2上で乾燥さ
せる。
、メタノールから再結晶させる。結晶?吸引ろ過し、ク
コロホルムで洗浄し、かつ真空中CaCl2上で乾燥さ
せる。
収量:500〜−理論値の89係
1H−NMR([D]a−DM80/CDr5CO2H
) :δ= 2.66 (t。
) :δ= 2.66 (t。
J = 6.6 Hz、2 H);3.09 (t、J
−6,6HzI 2H); 6.6 (d、 J −7
,2HzI 2 H); 7.22 (q、 J =4
.5 Hz、 1 H); 7.63 (dl J =
7.2 HzI 2 H);7.81 (m、2 H
a;8.47 ppm (d、 J −4−5Hz、
IH)。
−6,6HzI 2H); 6.6 (d、 J −7
,2HzI 2 H); 7.22 (q、 J =4
.5 Hz、 1 H); 7.63 (dl J =
7.2 HzI 2 H);7.81 (m、2 H
a;8.47 ppm (d、 J −4−5Hz、
IH)。
例 2
に−(4−アミノベンゾイル)−N’−(ピリジルジチ
オグロピオニル)−ヒドラジンのヒツジ−免疫グロブリ
ンとのカップリング a) 試薬溶液の製造 N−(4−アミノペン・戸イル)−N’−(ビリジルジ
チオグロピオニル)−ヒドラジン5雫(14,4μモル
)を、0℃で5 N HCl O,2M中に溶かす。こ
れにNaN0□水溶液10μt (220η/コ)を加
え、0℃で10分間攪拌し、2M尿素10μtを加え、
かつ再度0°Cで10分間攪拌する。反応溶液を氷冷水
で2μモル/dに希釈し、直ちに使用する。
オグロピオニル)−ヒドラジンのヒツジ−免疫グロブリ
ンとのカップリング a) 試薬溶液の製造 N−(4−アミノペン・戸イル)−N’−(ビリジルジ
チオグロピオニル)−ヒドラジン5雫(14,4μモル
)を、0℃で5 N HCl O,2M中に溶かす。こ
れにNaN0□水溶液10μt (220η/コ)を加
え、0℃で10分間攪拌し、2M尿素10μtを加え、
かつ再度0°Cで10分間攪拌する。反応溶液を氷冷水
で2μモル/dに希釈し、直ちに使用する。
b)ヒツジ−免疫グロブリンとのカップリング0.1M
ホウ酸塩緩衝液(pH9,2)中のヒツジ−免疫グロビ
リン500μtに0.8 Mホウ酸塩緩衝液500μ/
、(PI−19,2)を加える。0℃で次の物質を少な
くとも5回に分けて交互に加える: Q、14 MNa
OH50011tおよび前記の試薬溶液50μt0これ
によれば免疫グロブリン1モル当り試薬15モルが使用
されていることになる。
ホウ酸塩緩衝液(pH9,2)中のヒツジ−免疫グロビ
リン500μtに0.8 Mホウ酸塩緩衝液500μ/
、(PI−19,2)を加える。0℃で次の物質を少な
くとも5回に分けて交互に加える: Q、14 MNa
OH50011tおよび前記の試薬溶液50μt0これ
によれば免疫グロブリン1モル当り試薬15モルが使用
されていることになる。
0°Cで20分間、その後25°Cで2D分間インキュ
ベートし、かつセファデックス(5epha−dex
) G 25で脱塩する。
ベートし、かつセファデックス(5epha−dex
) G 25で脱塩する。
結合試薬の普Mの決定には、吸光度(OD)を420n
mで測定し、次式にあてはめる:タンパク質濃度の測定
後、組み込み率4.8=1が得られる。
mで測定し、次式にあてはめる:タンパク質濃度の測定
後、組み込み率4.8=1が得られる。
C)ジチオトレイトールを用いてのSH−基の遊離
タンパク質溶液を、2M酢酸でpH4,5に調節し、か
つジチオトレイトールを加え23mMにする。25°C
で20分間インキュベートする。
つジチオトレイトールを加え23mMにする。25°C
で20分間インキュベートする。
343 nmにおける吸光率測定(遊離されたチオピリ
ドンの吸光度)によって遊離されたSH−基を測定する
。8.08で割った吸光率の上昇(OD 343 )に
よシSH−基の濃度8モル/Mが得られる。負荷度SH
−基5/IgG1分子が得られる。
ドンの吸光度)によって遊離されたSH−基を測定する
。8.08で割った吸光率の上昇(OD 343 )に
よシSH−基の濃度8モル/Mが得られる。負荷度SH
−基5/IgG1分子が得られる。
同様に、HBsAg (B型肝炎表面−抗原)およびH
BeAg (B型肝炎e抗原)の際には、試薬のきる。
BeAg (B型肝炎e抗原)の際には、試薬のきる。
一般に、提供された試薬の3分の1が組み込まれる。
代理人 弁理士 矢 野 敏 雄
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) 〔式中、Aはアミン置換された芳香族基を表わし、Xは
1〜10個の炭素原子を有する炭化水素基を表わす〕の
化合物。 2、請求項1記載の化合物の製法において、カルボン酸
基のアルキル部分に1〜10個の炭素原子を有するピリ
ジルジチオカルボン酸−N−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを芳香環でアミン置換された芳香族カルボン酸
のヒドラジドと反応させることを特徴とする請求項1記
載の化合物の製法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3809986.1 | 1988-03-24 | ||
DE3809986A DE3809986A1 (de) | 1988-03-24 | 1988-03-24 | Verbindungen zur einfuehrung einer sh-gruppe in tyrosin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01283268A true JPH01283268A (ja) | 1989-11-14 |
JPH0552828B2 JPH0552828B2 (ja) | 1993-08-06 |
Family
ID=6350603
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1070743A Granted JPH01283268A (ja) | 1988-03-24 | 1989-03-24 | 新規二官能性化合物およびその製法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4925945A (ja) |
EP (1) | EP0339264B1 (ja) |
JP (1) | JPH01283268A (ja) |
AT (1) | ATE109468T1 (ja) |
DE (2) | DE3809986A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU4946297A (en) * | 1996-10-09 | 1998-05-05 | Akzo Nobel N.V. | A composition comprising an immobilised, acylated peptide |
KR100465353B1 (ko) * | 1999-04-22 | 2005-01-13 | 주식회사유한양행 | 하이드라진 유도체 및 그의 제조방법 |
WO2004037164A2 (en) * | 2002-06-21 | 2004-05-06 | University Of Utah Research Foundation | Crosslinked compounds and methods of making and using thereof |
US10865383B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-12-15 | Lineage Cell Therapeutics, Inc. | Methods and formulations for orthopedic cell therapy |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE430062B (sv) * | 1977-03-04 | 1983-10-17 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Kopplings- eller tioleringsreagens |
SE8302758L (sv) * | 1983-05-17 | 1984-11-18 | Pharmacia Ab | Sett for uppspjelkning av disulfidbindningar och derigenom erhallen forening |
US4723012A (en) * | 1985-03-25 | 1988-02-02 | Japan Tobacco Inc. | Desmosine derivatives having a disulfide bond and preparation of artificial antigen using the same |
US4797491A (en) * | 1986-03-17 | 1989-01-10 | Cetus Corporation | Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane |
-
1988
- 1988-03-24 DE DE3809986A patent/DE3809986A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-03-22 US US07/327,304 patent/US4925945A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-22 DE DE58908128T patent/DE58908128D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-22 EP EP89105157A patent/EP0339264B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-22 AT AT89105157T patent/ATE109468T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-24 JP JP1070743A patent/JPH01283268A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0552828B2 (ja) | 1993-08-06 |
DE58908128D1 (de) | 1994-09-08 |
ATE109468T1 (de) | 1994-08-15 |
EP0339264B1 (de) | 1994-08-03 |
DE3809986A1 (de) | 1989-10-05 |
US4925945A (en) | 1990-05-15 |
EP0339264A1 (de) | 1989-11-02 |
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