JPS6112630A - 免疫毒素およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は新規な細胞毒性包合体、その製造方法および
細胞毒性作用のある組成物に関する。

〔従来の技術とその問題点〕

米国特許第４．３４０，５３５号には、制癌剤の製造法
が記載°されでいるが、それはリシンのＡ鎖とタンパク
とが共有結合により結合されて得られる包合体あるいは
免疫毒素と呼ばれている。

そのタンパクは、例えば抗体すなわち免疫グロブリンま
たは免疫グロブリン断片であり、それらは標的となる癌
細胞のような細胞の表面にある特定の抗原を特異的に認
識することができる。

これらの包合体の主要な特徴は、それらが標的細胞に対
して特尋的な細胞毒性を発揮するということである。ハ
シテンまたは様々な抗原または癌細胞関連抗原に対する
抗体を使用することによって標的細胞に対する顕著な特
異性と大きな細胞毒性を有する包合体を製造することは
すでにおこなわれている。これは上記の特許において明
らかである。これらの特性をもった包合体としては人工
的に結合させた分子がありた。

それは、リシンのＡ鎖がジスルフィド型の共有結合によ
り抗体すなわち免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの
断片と結合しており、それらは標的となる癌細胞のよう
な細胞の表面にある特定の抗原を特異的に認識すること
ができる。

上記の特許に記載されている包合体の特徴は、次の三つ
の性質が同時に備わっているということである。

（１）　　リシンのＡ鎖と抗体との間の共有結合がジス
ルフィド結合である。

（２）　　ジスルフィド結合を形成しているイオウ原子
の１つは常にリシンのＡ鎖の２５７番目にあるシスティ
ン残基のイオウ原子である。

（３）リシンのＡ鎖と抗体とを結びつける結合手は抗体
ベゾチド鎖のＮＨ２末端に固定されている。

ところが、この種の抗癌剤の特徴である特異的細胞毒性
を有する包合体を得るために、必ずしも上記の条件が同
時に満たされる必要がないことが今や明らかとなった。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明は免疫毒素の部類に属する生成物に関する。そ
れは、一方がリシンのＡ鎖それ自体または適当に修飾し
たもの（以後Ａと称す）他方が抗体または抗体の断片そ
れ自体または適当に修飾したもの（以後Ｐと称す）を共
有結合させて得られる。後者は標的細胞が担っている抗
原を特異的に認識し得る。２つのタンノ９りはジスルフ
ィド結合またはチオエーテル結合により′結合されてい
る。

一つの観点に立つと、この発明は抗体Ｐとリシンのサブ
ユニットＡを結合させて形成される免疫毒素に関する。

それは次の一般式で示される。

Ｐ’−Ｗ−Ａ’　　　　　　Ｉ 上式中、Ｐ′は抗体または抗体の断片であるタン・ψり
のラジカルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを
示す。すなわちタンパクの様々な基の少なくとも１つが
除かれたり、他の官能基が任意に保護されている。Ａ′
はリシンのＡｉであるタンパクのラジカルそれ自体また
は適宜化学的に修飾したものを示す。すなわちタンパク
の様々な基の少なくとも１つが除かれたり、他の官能基
が任意に保護されている。Ｗは、チオエーテル基または
ジスルフィド基を含む２価の共有結合構造を示す。この
場合ジスルフィド基においては、両イオウ原子はＰおよ
びＡのシスティンのそれか、または両イオウ原子はＰお
よびＡ若しくはそのいずれかに属する原子団に結合して
いる。この後者の場合、両イオウ原子はＰおよびＡ若し
くはそのいずれかに属する前記原子団に結合している官
能基を有する分子が介在して前記原子団と結合している
。但し、Ｗがジスルフィド基を含む場合、前記ジスルフ
ィド基のイオウ原子の１つがＡのシスティンのウチの１
つに属するものであるときは、他方のイオウはアミノ基
以外のタンパクＰの基に結合した官能官を有する介在分
子によりタンノ４りＰに結合している。

２つのタンパク間のチオエーテル結合は、次の型である
。

上式中のｚ、ＹおよびＥは以下に定義する。

この発明は特には次の一般式の免疫毒素に関。

する。

Ｐ’−Ｗ’−Ａ”　ｎ 上式中のＰ′およびＡ′は上記のとおりである。Ｗ′は
次の群から選ばれる共有結合構造を示す。

（ｃ）　　−（ＮＨ−Ｙ’−ｇ’）　−８−８−Ｅ−Ｙ
−Ｚ−または （ｄ）　　−Ｚ”−Ｙ−Ｅ−８−８−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ
’）　−上式中、２および２′はタンノ４りＡおよびＰ
に属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸基に
由来する酸素原子、ＡおよびＰのグルタミン酸およびア
スパラギン酸またはそのいずれかの末端ないし遊離カル
ボキシル基の１つに由６来のカルメニル基、Ｐの糖鎖を
過ヨウ素酸で酸化したあと得られるジアルデヒド構造に
由来の基、および１つのリシン残基のε位のアミンの１
つ若しくはＡおよびＰの末端アミンの１つに由来の−Ｎ
Ｈ−基から選ばれる。ｚＩは上記の２および２′と同じ
であるが、−ＮＨ−ではあり得ない。Ｙおよびｆはタン
ノ母りＰおよびＡのｚ、ｚ’およ・びｚＩ基のいずれか
１つと共有結合し得る官能基を示す。ＥおよびＥ′は不
活性な介在分子を示す。そして、ｎはＯまたは１である
。

この発明の免疫毒素は上記の一般式■および■により簡
略された型で示されるが、２価の共有結合構造−Ｗ−ま
たは−Ｖ−は、少なくとも１つの２分子および少なくと
も１つのへ分子に結合している。タンパクＰおよびＡと
の結合数は、結合過程に関与する前記タン・ダクに属す
る原子団の数に応じて異なる。

例えば、免疫毒素がジスルフィド基を有する２価の共有
結合構造を介して天然リシンのＡ鎖と抗体Ｐ（例えば、
Ｔｌ０Ｉ抗体）との結合によシ形成されるならば（この
場合、ジスルフィド基のイオウの一方はリシンＡ鎖の２
５７番目のシスティンに属するものでおり、もう一方は
オキソプロピル基によって抗体Ｐのチロシン残基のフェ
ノ−化基の酸素に結合している）、その一般式は次のよ
うになる。

Ｐ’（０−Ｃｏ−ＣＨ２−ＣＩ（２−８−８−Ａつ。

上式中、ｔは結合に関与する抗体（例えば、ＴｉＯ２抗
体）中のチロシン残基の数を示す。

この結果得られる免疫毒素は、一般式■に相当する化合
物であって一般式■において以下の定義を有するもので
ある。すなわちＰ′は上記のとおりであるが、特にはチ
ロシン残基めフェノール基が除かれたＴｌ０Ｉ抗体の原
子団を指す。Ａも上記のとおシであるが、特には２５７
番目のシスイン残基のチオール基が除かれたリシンのＡ
鎖の原子団を指す。セしてＷ′は基（ｃ）すなわち−Ｚ
”−Ｙ−Ｅ−８−８−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’）ｎ−である
。この式中、ｚ〃は結合に関与するフェノール性水酸基
の酸素を示し、Ｙは−ＣＯ−１Ｅは不活性介在分子−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−であり、ｎはＯである。

％に好ましくは、リシンのＡ鎖および抗体単分子Ｐに含
まれる１つ以上の構造により形成される免疫毒素が挙げ
られる。それは次の一般式％式％ 上式中　ｐ／　、　ｗＪおよびＡ′ホ上記のとおりであ
り、ｍは結合に関与するタンノ臂りＰに属する原子団の
数を示す。ｍの数は０．３ないし１２であるが、０．５
から１０が好ましい。［ｍの数が０．３ないし１２であ
るが、’０．５から１０が好ましい」という表現は、結
合が抗体分子の集団内で均一に生じないため、ｍの値が
統計的な値であるという意味である。したがってｍの数
は整数でなくともよい。特にｍの値は使用される抗体に
依存し、さらに詳しくはその分子量に依存する。抗体断
片ＦａｂまたはＦａｂ’が出発抗体Ｐとして使われると
なると、ｍの値は０．３から約２の間となり得る。Ｆ　
（ａ　ｂ　’）２が用いられると、ｍは０．３から約２
の間になり得る。またＩｇＧ型の抗体では、ｍの値は０
．５ないし６となる。最後に、ＩｇＭ抗体の場合、ｍの
値は１ないし１２の数を取り得る。しかし抗体Ｐの置換
の程度は、ｍの値が０．５以上、１０以下となるような
ものにすることが好ましい。

また、すでに説明したように構造■および■は簡略化し
た型で記された統計的一般式である。

同様に、以下の一般式ＩＶ、Ｖおよび■も統計的１　。

一般式で、ある（ｎｆＪＺＪ、であるときは）。という
のも結合性反応体は、タンノ４りＰ、およびＰ２の群か
ら調製されるからである。そのＰ、およびＰ２は、これ
ら自体が抗体ＰまたはリシンのＡ鎖のいずれであろうと
、抗体Ｐに関して上記で考慮した特徴と全く同一の特徴
を有する。　。

もう一方の観点に立つと、この発明は上記構造式■を有
する免疫毒素の製造法に関する。この方法において、直
接または介在基を介して結合した少なくとも１つの遊離
チオール基を有するタンノ々りＰ、（場合に応じて修飾
されているりシ／のＡ鎖または抗体または抗体の断片）
を、タンノククＰ、の遊離チオールと結合してチオール
エーテルまたはジスルフィド結合を形成し得る原子団を
有する、タンノ９りＰ、とは異なるタン・やりＰ　２　
（リシンのＡ鎖または抗体または抗体の断片）と、室温
にて水溶液中で反応させる。但し、ジスルフィド結合が
形成される場合にタンパクＰ、かリシンのＡ鎖であると
きは、ジスルフィド結合はアミノ基以外の前記夕゛ンパ
クＰ２の基との間に形成される。

更に、この発明は好ましくは構造式■を有する免疫毒素
の製造法に関する。ここでは、Ｐ′、。

Ｗ′およびＡ′は上記のとおりである。この方法におい
ては、次の一般式 ％式％ で示されるタン／４′りを次の一般式のタンパクと室温
にて水溶液中で反応させる。

ｐ２’−ｚ’−Ｙ’−Ｅ’−Ｇ　　　　　　　　Ｖ上式
中、Ｐ、′およびＰ２′はＰ、およびＰ２の原子団であ
って前記タンパクに属する基に結合している、または抗
体若しくは抗体断片の糖鎖を過ヨウ素酸との反応により
開裂して得られるタン・ｆりＰｌまたはＰ２の１つの原
子団である。またＺ。

Ｚ’、Ｙ、Ｙ’、ＥおよびＥ′は上記のとおりであり、
Ｇは次の基を示す。

またはＧは−５−Ｓ−Ｘ基（Ｘは活性基）である。

Ｇが−５−Ｓ−Ｘ基であり、Ｐ、′がリシンのＡ鎖であ
る場合、ｎは１であるがＯであることもある。

しかしこの場合２′は−ＮＨ−以外である。

従って、ＰおよびＡ双方は、次の基のいづれかを有する
・。

（１）結合に関与する１個以上のチオール基、および （２）上記チオール基と反応してジスルフィドまたはチ
オエーテル結合を形成し得る１つ以上の官能基。この発
明では、前記チオール基および官能基は天然のタンパク
ＰまたはＡのものであるか、または人工的に修飾された
ものである。

以下に上記のタンパクまたはその原子団を表わすために
使われる記号の意味および様々な記号を表わすのに使わ
れる表現の意味するところを記載して、内容を明確にし
ておく。記号Ｐは、いかなる抗体または抗体の断片すな
わちいかなる免疫グミグリ／または免疫グミグリ／の断
片、またはいかなる分子であってその官能基の−ずれか
１つを人工的に修飾して得られるものをも示す。官能基
としてはそれらタン・やりに付込ている糖鎖構造を含む
。但し、修飾されたタンパクは、細胞とりわけ癌細胞の
表面に存在する特定抗原をなを特異的に認識し得るもの
でなければならない。

記号Ａはタンパクであるが、植物毒素のＡ鎖と称される
サブエニットである。それは天然のリシンから直接得る
こともできるし、とのタンノ臂りに付いているいかなる
官能基を人工的に修飾してＡ鎖から由来するいかなる分
子をも示す。

但し、照１１州ノ抱系においてｄ１明できるように、こ
レラのタン・やりは真核細胞においてリゲノームのタン
ノＰり合成を阻害するという性質金なお有するものであ
る。

記号Ｐ′は、上記タンパクＰそれ自体またはそれを適宜
化学的に修飾したものから得られるラジカルを示す。化
学修飾タンノ４りには、それからそれ自体の基の１つ以
上が除かれたもの、またそれに他の官能基が任意に保護
されているものが含まれる。

記号Ａ′は、上記タンｉ４りＡそれ自体またはそれを適
宜化学的に修飾したものから得られるラジカルを示す。

化学修飾タン／４’りにはそれからそれ自体の基の１つ
以上が除かれたもの、またそれに他の官能基が任意に保
護されているものが含まれる。

記号Ｐ、は、上記のタンノ４りＡおよびＰの１つを示す
。それは、直接かまたは介在分子を経て上記タンパクに
結合している遊離チオール基金有する。

記号Ｐ２は、Ｐｌとは異なり、上記のタンパクＡおよび
Ｐの１つを示す。それは、上記遊離チオール基と結合し
得る１つ以上の官能基を有する。

記号Ｐ、′は、タン・ｅりＰｌに属する原子団、特にＳ
Ｈ基（システィンの）、ＮＨ２基（タンパクの末端また
はリシンのε位）、ＯＨ基（チロシンの）またはＣ０Ｏ
Ｈ基（アスパラギン酸およびグルタミン酸の）に結合し
た、Ｐｌのラジカルを示す。またばｐ　、Ｊは、Ｐｌが
抗体または抗体断片である場合、過ヨウ素酸との反応に
より糖鎖を開裂することによって得られるタンパクＰ１
のラジカルを示す。

記号Ｐ２′は、特徴的な官能基ＮＨ２（タンパクの末端
またはリシンのε位）、ＯＨ（チロシン）またはＣ０Ｏ
Ｈ（アスパラギン酸およびグルタミン酸）に結合してい
る、タンパクＰ２のラジカルを示す。

例を挙げると、Ｐ、’−８Ｈは、システィンのＳＨ基が
そのままで他の官能基が場合に応じて保護されているタ
ンパクｐ、　（抗体または抗体断片Ｐまたはリシンの直
鎖・）を示す。

同様に、ｐ１’−ｃｏ−は、末端カル♂キシ基、または
そのグルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル
基がＳＨ基を人工的に導入する基と結合されたタンパク
Ｐ１を示す。

更にＰ２’−ＮＨ−は、末端アミノ基またはリシンのア
ミノ基がタンパクＰｌのチオール基と結合し得る基に付
いているタンノ４りＰ２（抗体または抗体断片Ｐまたは
リシンの直鎖）を示す。

Ｅおよび＝／に関して用いられている「不活性介在分子
」という用語は、この発明の方法に用いられる反応体比
対して不活性な２価の有機原子団を示す。例えば、炭素
数１から１５の直鎖または分枝アルキレン基が挙げられ
る。これらは１つ以上の二重結合を有してもよいし、酸
素原子が介在してもよい。またはメチル基°、遊離若し
くはエステル化されたカルボキシル基、ジアルキル基ま
たはカルバメート基のような１つ以上の不活性官能基に
よって置換されていてもよい。同じ用語は炭素数６から
１５の了り−レン基も示す。これはアルキレン基につ艷
て上に述べたような１つ以上の不活性官能基で置換され
ていてもよい。

ＹおよびＹ′に関して用いられている［共有結合し得る
官能基」という用語は、タンパクＰ。

およびＰ２に属する基と反応して共有結合を形成し得る
原子団（基）を指す。例えば、−ＣＯ−基およヒ−（Ｃ
＝ＮＨ）−基は、タンノやりの遊離アミ゛ン、チオール
およびフェノール性水酸基と反応し得る官能基とに適し
ている。同様に−ＮＨ−基は、Ｐ、またはＰ２が抗体ま
たは抗体断片のとき、過ヨウ素酸で酸化した後タンノリ
哩、またはＰ２の糖鎖構造の２２つの炭素原子と結合し
得る官能基として適している。

「タン・々りに属する原子団」という用語は、ここでは
ｚ　、　ｚ’および２＃に関して用いられているが、タ
ンパクＰ、およびＰ２を形成しているアミノ酸の特徴的
な原子団に由来する原子団のことを指す。例えばチロシ
ンおよびセリンの水酸基由来の酸素原子、アス・臂うギ
ン酸、およびグルタミン酸の末端カルボキシル基すなわ
ち遊離カルボキシル基由来のカルぎニル基、タン１４り
の末端アミノ基またはリシンのアミノ基由来の−ＮＨ−
基、まだはシスティンのチオール基由来のイオウ原子が
挙げられる。同じ用語は、Ｐ、また、はＰ２が抗体また
は抗体断片の場合、過ヨウ素酸処理によりタンパクＰ１
またはＰ２の糖鎖の１つを酸化したのち得られるジアル
デヒド構造由来の基をも指す。

「活性ラジカル」という言葉は、ここではＸに関して使
われているが、−５−Ｓ−架橋に結合し指す。活性基と
しては、ピリジン−２−イルおよびピリジン−４−イル
が適しており、それらは１つ以上のハロゲノまたはアル
キル、カル−キシルまたはアルコキシカルビニル基で置
換ｉれているか置換されていない基である。またフェニ
ル基もコ肉しており、それは、置換されていなくともよ
いが好ましくは、１つ以上の７１０グンまたはニトロ、
アルコキシ、カルボキシ若しくはアルコキシカル−ニル
基で置換される。更にメトキシカルブニルのようなアル
コキシカルゲニル基も適している。

「アルキル」および「アルコキシ」という語は炭素数５
以下のものを言う。

「アルキレン」という語は、炭素数１０までの直鎖また
は券枝の轟和脂肪属基を指すが、それらはアルコキシカ
ル−ニル基のような１つ以上の不活性官能基によって置
換され得る。

純粋なリシンのＡ＠の製造は、この発明の生成物を得る
ために必要であるが、米国特許第４．３４０，５３５に
記載されている。ヒト癌細胞を標的としたモノクローナ
ル抗体の製造法は科学文献に広く記載されており、今や
これらの多くは市販品として手に入る。

抗体（または抗体断片）とリシンの直鎖との化学的結合
はこの発明の方法により実施でき、この方法は次の特徴
を有する。

（１）　　包合体の２つの成分すなわち抗体とリシンの
Ａ鎖の各生物学的活性を保持する。

（２）　　この方法で充分な再現性が得られ、また高い
収率が保証される・ （３）　　得られる包合体中のリシン直鎖と抗体の比の
値を調節することを可能にする。

（４）安定で水溶性の生成物が調製できる。

これらの特徴を有する工程の中で２つのタンパクを結合
させるために１つ以上のチオール基が関与するものが好
ましい。事実、これらのチオール基は、ジスルフィド結
合またはチオエーテル結合を形成させるために特に適し
ている。

これらの双方は上記の一般的条件を充す。

一般に、タンパク間の結合を成功させ、特に無秩序な架
橋を生じさせないために、結合させる一方のタンパクに
だけにひとつまたはひとつ以上のチオール基を導入する
ことが重要である。

他方のタンパクは、ｐｉ−１５ないし９の水性溶媒中で
３０ｔを越えない温度にてチオール基と反応して安定な
共有結合を形成し得る１つ以上の基を備えているだけで
ある。出発物質として使用するタンノ４りＰ、およびＲ
２の特徴は以下で詳細に記載する。介在分子Ｅは好まし
い分子ＲからＲ８と置換させることができる。これは実
施例に述べる。

■、タンパクＰ。

とのタン／ＩＰりは、どんな場合も結合に関与する１つ
か１つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況
はタンパクＰ、の性質′に応じて異なる。

（４）　天然の状態でタンノぞりＰ、は、タンノ（りＲ
２との結合に関与する１つ以上のチオール基を有してい
る。このことは特に次のような場合に言える。すなわち
、タン・臂りＰ、が、ペゾシンの存在下で抗体を限定分
解し、続いて高分子間のジスルフィド結合を還元して通
常得られるようなＦ（ａｂ）’として知られる抗体断片
である場合である。この・ことは、タンノ母りＰ、がリ
シンのＡ鎖またはＡ鎖の誘導体である場合にもあてはま
る。

この場合、天然リシンの１７１番目のシスティン残基お
よび２５７番目のシスティン残基に付いている少なくと
も１つのチオール基が未結合であって化学結合を生じや
すい。これらすべての場合において、天然のチオ板ル基
を有するタンパクＰ、はとのような状態で結合工程に使
用される。

（Ｂ）　　天然の状態でタンパクＰ１は、タン／４’り
Ｒ２との結合に関与するチオール基を有していない。

このことは特に次のような場合に言える。すなわち、タ
ンパクＰｌが天然の免疫グロブリンであって、抗体全体
か抗体の断片時に通常Ｆ（ａｂ）’またはＦ（ａｂ）と
呼ばれる断片の１つである場合。

天然の状態でタンパクＰ、が結合に関与する１つのチオ
ール基を持たない場合のいま１つの例は、このタンパク
Ｐ１が、２つのシスティン残基それぞれがアルキル化に
より保護されているか、または化学修飾を受けないリシ
ンのＡ鎖である場合である。全ての場合において、結合
を可能にする１つ以上のチオール基をそのような分子に
導入することが妥当といえる。

３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。

（１）　　を初の型の反応は、Ｓ−アセチル保護基７’
）コハク酸無水物との反応である。この酸無水物は、タ
ンパクのアミノ基のアセチル化を可能にする。その後当
該チオール基をヒドロキシアミンと反応させることによ
ってアセチル保護基を除くことができる。この方法はす
でにアーチープズ・オプ・バイオケミストリー・アンド
・バイオフィジクス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｅｈｅｍｌｇｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙａｉｃｓ＋）
、１１９．４ｌ−４９（１９６７）に記載されている。

このように保護基が導入されたチオール基を続いて活性
型ジスルフィド基と反応させるｓ合、ヒドロキシアミン
によって前もって保護基をはずさなくて済む可能性があ
る。事実、この発明の物質を形成する反応体を使ってジ
スルフィげ結合を形成する反応は、遊離チオール基を使
った場合と同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。

文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。

（２）　　第２の型の反応は゛タンパクをカルボキシル
基を介して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的
なジアミノ分子と反応させることである。

Ｈ２Ｎ−Ｒ１−８−８−Ｒ１−ＮＨ２ 上式中、Ｒ１は炭素数２から５の脂肪族原子団である。

この反応では、カルデジイミド特に１−エチル−３ツメ
チルアミノゾロピル−３−カルメジイミドのような水溶
性の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
［Ｒ，＝−（Ｃｌ（２）２−）と反応させ、用いた化学
量論量に応じて次に示す誘導体の１つか双方の混合物を
形成させることが好ましい。

Ｐ　′−〇〇−ＮＨ−Ｒ−１３−８−Ｒ４−ＮＨ２（Ｉ
ａ）Ｐ、’−Ｃｏ−ＮＨ−Ｒ，−８−８−Ｒ１−ＮＨ−
Ｃｏ−Ｐ、（Ｉｂ）この型の反応生成物は次の２つの工
程のいずれかに供される。

（、）　　式１ａまたはＩｂにおいて、タン・（りＰｌ
がリシンのＡ鎖ま、たはその誘導体の１種ならば、得ら
れた反応溶液は分別せずに２−メルカゾトエタノールの
ような還元剤との反応に供せられる。それによって次式
の１種類のタンパク誘導体が得られる。

ｐ　’−ＣＯＮＨ−Ｒ１−８Ｈ こうして得られた生成物は続いて透析かグル濾過により
精製される。

（ｂ）　　式１ａおよびＩｂにおいて、ラジカルＰ、′
が抗体またはその断片の１種から成る、タンパクＰのラ
ジカルならば、得られた反応溶液はそのままカップリン
グに用いられ、その場合チオール／ジスルフィド交換法
が用いられる。この交換法は、例えばギリランド（Ｇｉ
ｌｌｉｌａｎｄ）　トコリエール（Ｃｏｌｌｉｅｒ）に
よりてキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｓｇｓ
ｒｃｈ）　＋　４（Ｌ　３５６４（１９８０）に記載さ
れている。

（３）第３の反応は、導入しようとするチオールを有す
るラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことである
。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在゛しているも
のである。続いてタンノ４りは、糖鎖単位にアルデヒド
基を生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰の
エチレングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と
過剰の反応体を透析により除いた後、得られた放生物を
次の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。

Ｈ２Ｎ−Ｒ１−８−８−Ｒ，−ＮＨ２ 上２上Ｒ１は炭素数２ないし５の脂肪族量である。

得られた付加生成物は、続いて金属水素化物（特には、
水素化ホウ素ナトリウム）との反応により第２または第
３アミンに還元される。この反応はシスタミン（：Ｒ１
＝−（ＣＨ２）２−）を用いて実施することが好ましく
、用いた化学量論量に応じて次式の誘導体の１方かその
両方の混合物が形成される。

Ｈ 得られた反応液を、ＩｍまたはＩｂの構造式で表わされ
る生成物であってＰ、′が抗体または抗体断片であるも
のに関して上記したとおりの処理を行なってもよい。

チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するための上に述べた後二者の
反応において、タンノタクＰ、は遊離ＳＨ基または遊離
アミノ基を持たないことが好ましい。Ａ鎖とその誘導体
の場合には、Ｎ−エチルマレイミドまたはヨード酢酸の
ようなチオール基に対する通常の試薬との反応により天
然のチオール基をアルキル化し、およびミイーンズ（Ｍ
ＥＡＮＳ　）およびフィーニー（ＦＥＥＮＥＹ）によっ
てバイオケミストリー（Ｂｌｏｃｈｅｍｉ　ｇｔｒｙ）
７．２１９２（１９６８）に記載された還元的メチル化
法に従がって天然のＮＨ２基をメチル化することによシ
常に遊離のチオール基を持たなくさせ得る。

このようにして天然リシンのＡ鎖に１モル当り６個まで
のメチル基を導入することができる。

このようにして修飾されたタンパクには、生物学的な特
性（特には、真核細胞のりぎソームにおけるタンパク合
成を阻害する能力）が備わっている。抗体または抗体断
片さらに第１群のすべての物質の場合には、前記したよ
うにそれらは天然の遊離ＳＨ基を持たないので、還元的
メチル化を例えばミーンズおよびフィーニーの方法によ
り実施するほうがよい。このようにして通常抗体１モル
当り数十のメチル基を導入するととができる。その場合
抗体の細胞表面上の抗原を認識する能力を変化させない
。

■　タンパクりＲ２ あらゆる場合、このタンパクは、タンパクＰ。

のチオール基と反応してジスルフィドまたはチオエーテ
ル結合を形成し得る１つ以上の官能基を有するタン／Ｉ
Ｐりである。これらの官能基は、常にタンパクＰ２に人
工的に導入されるが、それがジスルフィド結合によりカ
ップリングされるのかチオエーテル結合によりカップリ
ングされるのかに応じて異なっている。具体的には以下
に記載する。

（１）　　ジスルフィド結合 この場合、包合体の調製は以下の式で表わされる。

Ｐ、’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−８Ｈ＋Ｐ２’−Ｚ’−Ｙ’
−Ｅ’−８−８−Ｘ　　→Ｐ、　’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）、
−８−８−Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’−Ｐ２’＋　Ｘ−８Ｈ。

活性イオウ原子により置換されるタン・９りＲ２は、タ
ンパクＰ２または適切に保護されたタンノ４りＲ２から
それ自体活性イオウ原子を有する試薬による置換により
得られる。これは次の式で示される。

Ｐ２＋　Ｌ−Ｙ’−Ｒ−８−８−Ｘ−４Ｆ２’−Ｚ’−
Ｙ’−Ｒ’−８−８−Ｘ　　　′上式中、Ｒ２は置換さ
れるべきタンパクを示し、Ｌ−Ｙ’は試薬をタンパクに
共有結合させる基を示す。官能基Ｌ−Ｙ’は、置換され
るべきタンパクの構成アミノ酸の側鎖に付いているいず
れか１つの基と共有結合し得る基であ為。これらの基の
中で、特に次のものが選び出せる。

（ＩＬ）　　ベゾチド鎖の末端アミノ基またはタンノぐ
りに含まれるリシン残基のアミノ基。この場合、Ｌ−Ｙ
’は特に次のように表わせる。

Ｏカルゲジイミド、特に１−エチル−３−ジメチルアミ
ノゾロビル−３−力ルデジイミドの如き水溶性誘導体の
よりなカッシリング剤の存在下でタンパクのアミノ基と
結合し得るカルゲキシル基。

Ｏアミノ基と直接反応して、それをアシル化し得るカル
ゲン酸塩化物。

Ｏオルト−まだは／４’ラーニトロフェニルまたハーシ
ニ・トロフェニルエステル、ｔ７’ｃ−ハＮ−ｔニトロ
キシコハク酸イミドエステルのようないわゆる「活性型
」エステル。これはアミノ基と直接反応して、それをア
シル化し得る。

・コハク酸無水物のようなジカルゲン酸の内部無水物。

これはアミン基と自然に反応して、アミド結合を形成さ
せる。または Ｑイミドエステル基 上式中、Ｒ２はアルキル基で、次式のようにタンノぐり
Ｒ２のアミノ基と反応する。

上式中、Ｒ３は−Ｒ−８−８Ｘ基を示す、。

（ｂ）　　タンパクに含まれるチロシン残基のフエノー
ル基。この場合、Ｌ−Ｙ’は特にイミダゾール−１−イ
ルカルボニル基を示すことがある。そレバ次の式に従っ
てタンノ母りのフェノール基ト反応する。

上式中、Ｌがイミダゾール−１−イルで、Ｙ′がＣＯ°
基で、Ｒ４が−Ｒ−’５−ｓ−ｘ基である。−８−トＸ
は遊離チオール基と反応し得る活性型ジスルフィドを示
す。特に、このジスルフィドにおいて、Ｘは１つ以上の
アルキル、ハロダンまたはカルボキシ基で置換されてい
ることのあるピリジン−２−イルまたはピリジン−４−
イル基を指すことがある。Ｘもまた１つ以上のフェニル
基またはカルボキシ基で好ましくは置換されているフェ
ノール基を指すことがある。またはＸはメトキシ力ルゲ
ニル基のよう、なアルコキシカル？エル基を指すことも
ある。

Ｒ基は、置換基Ｙ′およびＳ−５−Ｘを同時に結合し得
る介在分子（前式中のＥのような）ｆ、示す。

それは、後の反応において、使用される反応物質と合成
される生成物を訪客するような基を含まないようなもの
でなければならない。特に、Ｒ基は−（ＣＨ２）−でも
あシ得（ｎは１ないしｉｏ）、また次の基でもあり得る
。

上式中、Ｒ６は水素または炭素数１ないし８のアルキル
基を指し、Ｒ５は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。

−ＮＨ−Ｃ−ＯＲ。

上式中、Ｒ７は炭素数１から５の直鎖または分枝アルキ
ル基、特に第３グチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ’−Ｒ−
８−８−Ｘとタンａ４りＰ２との反応は均質な液相、最
も一般的には水または緩衝液中で進行する。反応体の溶
解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反応溶液に
加えることができる。

その最終回度を゛、第３グタノ〜ルのようなＭ３アルコ
ールの場合には容量比で２０％までにすることができ、
ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフランの場合
には容量比で１０チまでにすることができる。

反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはグル濾過によって除宏することができる
。この方法により、タンパク１モルあたり工ないし１５
の置換基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンノ４りＰ、とのカップリングは、
Ｐ１１６から８の溶液中にて３０℃を越えない温度で、
１時間から２４時間かけておこなう。低分子量の生成物
を除くために適宜、得られた水溶液を透析する。ついで
包合体を既知の方法の変法により精製できる。

＜２）　　チオエーテル結合 この場合、包合体をＰ、’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）−８Ｈと前
もって１つ以上の７レイミド基を導入しておいたタン、
ノｆりＰ２とを反応させることにより調製する。

１例として、反応を次の式で示す。

上式中、Ｒ８は炭素数１ないし１５の脂肪族または芳香
族介在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に
対して不活性である。２は、結合に関与するタン・２り
Ｒ２の官能基の種類に従って変化し得る基を示す。すな
わち、２は、酸素（チロシン残基（チロシル基）のフェ
ノール基のエステルの場合）、ＮＨ（タンノククのアミ
ノ基と活性型カルブキシル基のカップリングの場合）ま
たはＮＨ−ＣＨ２（タンノぐ′りのアミノ基とクロロメ
チルケトンの場合）である。

マレイミドで置換されたタンノ４りＲ２は、それ自体マ
レイミド基を有する試薬によってタンノヤクの適当な基
を置換することによって、タンパクＲ２自体からまたは
７商当に保護されたタンパクＲ２から得られる。これら
に適した基のうち、特に次のものが選ばれる。

ａ）　　ｄプチド鎖の末端アミン基またはタンパクに含
まれるリシン残基（リシル基）の側鎖アミノ基。この場
合、マレイミド基を有する試薬は次のようなものがある
。

ア）次の一般式の試薬 上式中、Ｌ−Ｃｏ−は次のとうりである。

０　カルブキシル基。その場合、カルゲジイミドのよう
なカップリング剤および特には１−エチル−３−ツメチ
ルアミノプロピル−３−カルデジイミドのような水溶性
誘導体の存在下でカルブキシル基を活性化したのち、反
応が進行する。

０　またはオルト−若しくはｉ４ラーニトロフェニルマ
タはジニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドエステル。

これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、％にヘルペティカ・ケミ力・ア
クタ（Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ）
＝５」、５３１−５４１．（１９７５）に記載されてい
る。同じようなりラスの他の薬剤は市販品として手に入
る。

イ）次の一般式の試薬 す これは次の反応式に従ってタンｔ４　ｐ　Ｐ　２のアミ
ノ基と反応し得る。

ｂ）タンパクに含まれるチロクン残基のフェノール基。

この場合、マレイミＦ（１基を有する試薬は次の一般式
で示される。

これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。

マレイミドを有する試薬とタンパクＰ２との反応は均質
な液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する。

反応体の溶解性を高めるには、水圧可溶性の有機溶媒を
反応溶液に加えることができる。その最終濃度を、第３
ブタノールのような第３アルコールの場合には容量比で
２０憾までにすることができ、ジメチルホルムアミドま
たはテトラヒドロフランの場合には容量比で１０係まで
にすることができる。反応は室温にて数分から数時間か
けておこなう。そのような化合物を使うと、タンパクＰ
１とのカッブリ・ングは、ＰＨ６ないし８の水溶液中に
て３０’を越えない温度で１時間ないし２４時間かけて
、２つのタンパクを混合することによっておこなわれる
。得られた溶液を低分子量の生成物を除くため適宜透析
し、続いて包合体を既知の様々な方法により精製できる
。

この発明の化合物のうち、特に適したものとして、式Ｈ
の化合物が挙げられる。その場合、Ｗ′は一前記の原子
団（ａ）　、　（ｂ）　、　（ｅ）および（ｄ）の中の
１つを示し、その中でＥおりびＥ′は＋Ｃ）（２）、−
基（ｐは２ないし７の整数）および０Ｈ−ＣＨ２ＣＯＯ
ｆ（基を示す。

また、別の観点に立つと、この発明は次の一般式を有す
る新規な生成物に関する。

Ｐ２’　−０−Ｃｏ−Ｅ−Ｇ　　　　　　Ｖｌ上式中、
Ｐ２′は次の（、）　、　（ｂ）から選ばれるタンパク
のラジカルを示す。

（、）　　抗体または抗体断片、免疫グロブリンまたは
免疫グロブリン断片、または官能基のどれが１つを人工
的に修飾させることによりこれらの分子から由来する分
子。

（ｂ）　　ＩＪフランＡ鎖または官能基のどれか１つを
人工的忙修飾させることによりこれらの分子から由来す
る分子。前記タンノやりの一部から除かれたチロシンの
フェノール性水酸基の１つ以上は上記ラジカルから除去
されている。

０　酸素原子は、タン・ヤクのラジカルＰ２′から欠失
するフェノール性水酸基に属するもの。

ｏ　ＥおよびＧは前記に定義したとおり。

式■で表わされる化合物が特に好ましい。この場合、そ
の式中のＥは−（ＣＨ２）、−基（ｐは２な農 いし７の整数）または−ＣＨ−ＣＨ２ＣＯＯＨ基を示す
。

またＧは−５−Ｓ−Ｘ構造の基（Ｘは、１つ以上のハロ
ダンまたはアルキル基、カルがキシル基若しくはアルコ
キシカルブニル基で置換されているか置換されていない
ピリジン−２−イルおよびビリ・シン−４−イル基；１
つ以上のハロダンまたはニトロ基、アルコキシル基、゛
カルぎキシル基若しくはアルコキシカルがニル基で置換
されているか置換されていないフェニル基；またはアル
コキシカルブニル基から選ばれる活性基）である。

式■の生成物は次式の生成物とそのまた下に示す■式の
化合物とを反応させて得られる。

Ｐ２″−ＯＨ 上式中、Ｒ２″は上述したとおりであり、水酸基はＰ２
″のチロシンから欠失するフェノール性水酸基を示す。

上式中、ＥおよびＧは上記に記したとおりである。反応
は、１０ないし４０℃の温度でジオキサンまたはテトラ
ヒドロフランの如きエーテル溶媒のような水に可溶性の
有機溶媒を任意に含む水溶性溶媒中にて行なう。

次に示す実施例により、この発明がよりはっきりと分か
るであろう。しかしこの発明の範囲はこれに限定されな
い。すべての実施例において、記載される包合体の調製
法は、米国特許第４．３４０，５３５号に記載されてい
る方法により得られた。ような天然型のリシンのＡ鎖を
用いたものである。

これら実施例では次のような抗体が使用される。

０　ヒトＴリン／４’球や多種ヒトＴリンパ系白血病細
胞上に存在する抗原Ｔ６５に対するモノクローナル抗体
Ｔ１０１゜この抗体は、ジャーナｙ、オシ・イムノロノ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）＋
１２５（２）＊７２５−７２７（１９８０）に記載され
ている。これは、ノ・イゾリテク社（ＨＹＢＲＩＴＥＣ
ＨＩｎｃ、）　（米国、カリフォルニア州。

サンディエゴ）から入手できる。

Ｏマウスリン・子球上の’ｒｂｙ　１．２抗原に対する
モノクローナル抗体ＡＴ１５Ｂ、この抗体は、ツヤ−ナ
ル、オプーイムノロゾー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍ
ｕｎｏｌｏｇ３’　）、１２２．２４９１−２４９８（
１９８１）に記載されているものであり、ハイシリドー
マ（ｔ（ｙｂｒ、、ｉｄｏｍａ　）、１（１）、１３−
１７（１９８１）に記載のハイプリドーマから得られる
。

０　抗−ＤＮＰモノクローナル抗体。

〔実施例〕

実施例Ｉ Ｐｌは、カルボキシルを介して導入されたＳＨ基を有す
るリシンのＡ鎖。

Ｐ２はアミンを介して導入された活性型ジスルフィド基
のあるＴｉＯ２抗体。

１）　　Ｎ−エチルマレイミドによる天然チオール基の
保護 り’／７Ａ鎖の濃度８１ｎ９／ｒＩＬｌの水溶液１５ｄ
（Ａ鎖４．１マイクロモル）を終濃度１嗟となるように
２−メルカプトエタノール□の水溶液で処理した。その
水溶液を１時間静置し、続いて−７の１２５　ｍＭ　Ｉ
Ｊン酸緩衝液に対して連続的（３００ｍＡ　７時の速さ
で４０時間）Ｋ透析した。エルマンの方法〔メンド・イ
ン・エレザイモロノー（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇＦ　）　、２５　、４５７（１９７２））を
用いるとリシン直鎖１モル当りＳＨは０１ｇ当量であっ
た。このＳＨ基をメソッド・イン・エンザイモロジー、
１１，５４１（１９６７）に記載の方法によりＮ−エチ
ルマレイミドで保護した。この際、前段階で得られたリ
シンＡ＠を、Ａ鎖１モル当り２０当量のＮ−エチルマレ
イミドの存在下で３０℃にて２時間インキュベートした
。過剰の試薬をｐＨ７の１２５　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液
に対して連続的（５００ＩｎＩ！／時の速さで２０時間
）に透析して除いた。この結果、リシン直鎖濃度７ｒｎ
９／ｍｌの溶液１３ｒｎｌを得た。これには、エルマン
の試薬で測定し得るチオール基はもはや存在しなかった
。このようにして得られた生成物を以後Ａ鎖（ＮＥＭ　
）と呼ぶ。

２）カルブキシル基の修飾 シスタミン塩酸塩１．９５ミリモルおよび１−エチル−
３−ゾメチルアミノグロビルー３−カルがジイミドのＩ
Ｍ水溶液３９０Ｍを、Ａ鎖（ＮＥＭ　）　４０　η（１
，３３ミクロモル）を溶かした１、　２５　ｍＭ　リン
酸緩衝液に加えた。溶液の−をＩＮ塩酸で５．４に調節
した。反応を２０℃にて２時間進行させ、続いて酢酸ヂ
トリウムの１Ｍ水溶液７５０μｌを添加して停止させた
。そして反応溶液をＰＨ７の１２５　ｍＭＩＪン酸緩衝
液で連続的（３００ｒｎ／／時で２０１）に透析して精
製した。

続いてタンパクに付いているシスタミンのジスルフィド
結合を、２−メルカプトエタノールで還元した（最終濃
度３憾、３０℃にで１時間）。

続＜ＰＨ７の１２５ｍＭリン酸緩衝液に対しての透析は
上記のとおり続けた。遠心後、修飾されたＡ鎖（ＮＥＭ
　）　（濃度１．７５呼／ＩＬｌ）の溶液を得た。

この生成物をエルマンの方法で測定したところタンｔＪ
？クエ分子当りのＳＨ基は０．７であった。濃度勾配＆
　ＩＪアクリルアミド電気泳動により調べたところ、こ
の修飾されたＡ鎖（ＮｇＭ　）は、単一バンドとして現
われ、分子量は約３０，００°Ｏであった。

（Ｂ）　　修飾抗体の調製 ３−（ピＩＪジンー２−イルジスルファニル）ゾロピオ
ン酸１１ηを含む水溶液を前もりて第３シタノールに溶
かし、それと１−エチル−３−ジメチルアミノゾロビル
−３−カル？シイミド６．５■を゛、ＴｉＯ２抗体濃度
１０ダ／プの溶液２５Ｍ（抗体１．６８　ミＩＪモル）
に加えた。この混合物を３０℃にて１５分間攪拌し、続
ｐて−７，０のリン酸緩衝液に対して連続的（５００ｄ
／時で４０時間）に透析した。透析後、タン・母り溶液
を遠心し、ｌＩｎ１当り１０゜３ｒｖの修飾抗体を含む
溶液２４．５１１１１を得た。２−メルカプトエタノー
ルとの交換反応により放出されるピリジン−２−チオン
を３４３　ｎｍで分光分析したところ、得られた抗体は
１分子当り１．７個の活性型ジスルフィド基を有するこ
とが分かった。

（ｑ　免疫毒素の調製 上記で得た修飾Ａ鎖（ＮＥＭ　）の溶液７．５ｄ（０，
４４ミクロモル）を上記で得た活性型抗体の溶液１．７
５ｍ（０，１２ミクロモル）に加え。

その混合物を３０℃にて５時間インヤニベートし念。そ
の溶液を遠心し、そしてセファデックスＧ１００をつめ
たカラムでダル濾過して精製した（溶出液の光学的濃度
は２８０　ｎｍで測定した）。抗体とＡ鎖両方を含む両
分を集めたところ、濃度０．５１　ｍｅ／ｍｌの免疫毒
素溶液３１ｒｒＬｌ！（１５，８７＃＆）を得た。こ（
Ｄ溶液は、ＩＷＬｌ当り抗体と力、シリングした修飾Ａ
鎖（ＮＦ！Ｍ　）　０．１２５〜含んでいた。従って、
この調製液のカップリングの程度は、抗体１分子当り１
，６Ａ鎖（ＮＥＭ）であった０ この結果、式■の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、　ＳＲ基がＮ−エチルマレイミドで保護された
リシンのＡ鎖のラジカル。

Ｐ′は、Ｔ１０１抗体のラジカル。および、Ｗ′は次式
で示される原子団。

−２“イーＥ−８−８−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’）ｎ−上式
中、 ・２“は−ＣＯ− ・　Ｙ＆ま−ＮＨ− ・Ｅ２は−ＣＴ（２ＣＨ２− ・Ｅ′は−ＣＨ２ＣＨ２− ・Ｙ′は−Ｃ〇− ・２′は−ＮＨ− ・ｎは１゜ ■）免疫毒素活性試験 ６０Ｓリデソームサブユニツトを分解することによりて
、真核細胞のタン・母り合成を阻害することが、リシン
直鎖の基本的な生物学的特性である。従って、無細胞系
（テスト−１）または有細胞系（テスト−２）でタンパ
ク合成の阻害を調べる試験を行なった。

１）無細胞系（テスト−１） この生体外の実験法においては、適当に改良したラット
肝の細胞レベル以下の画分であって人工メツセンジャー
ＲＮＡ　’（ポリウリジル酸）の存在下で１４０−フェ
ニルアラニンを取込むことができるものを用いた。細胞
レベル以下の画分の調製のため、および１４ｃｍ７エニ
ルアラニンの取込みの測定のために使用した方法は、・
々イオケミ力・バイオロジカル ’Ｂｔｏｐｈｙｓｉｃａ−Ａｃｔａ　）　ｙ　３１２　
ｔ　６０８−６１５（１９７３）に記載された方法を応
用したものである。それには、ミクロゾーム画分と細胞
質画分の両方を用いた。Ａ鎖を含む試料を、ｐＨ７，６
の５０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（０，２４の２−メル
カプトエタノールおよびｘ５ｒｔｖ／ｍｌのクシ血清ア
ルブミンを含む）中に導入した。得られた計数を計算（
阻害剤を含まない対照溶液を比較として）し、リンン直
鎖を含む各反応溶液に対してタンパクへの１４Ｃ−ノ、
＝ルアラ＝しの取込みの阻害率を求めた。これらの値か
ら、この実験条件下で１４ｃｍフェニルアラニンの取込
みを５０係阻害するリシン直鎖の濃度（ＩＣ５ｏ）を求
めることができた。

２）有細胞系（テスト−２） この試験では、培養癌細胞中への１４Ｃ−ロイシンの取
込みを測って、その物質の効果を調べた。使用した細胞
は、免疫毒素を調製するために選ばれた抗体の特異性に
依存した。この実施例では、通常Ｔ６５抗原を有するＣ
ＥＭヒ）　リンパ芽球様の細胞を使用した。この細胞を
、測定すべき物質の製剤の存在下でインキュベートした
。そして、インキュベーションを終えてから、その細胞
が１４０−ロイシンをどの程度取込むかを調べた。この
測定に使用した手法は、ジャーナル・オシ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
）　、　２４９α］）ｔ３５５７−３５６２（１９７４
）に記載の方法を応用したものである。

すなわちトレーサーとして１４Ｃ−ロイシンを用い、タ
ンパク合成の程度を測定した。取込まれた放射線活性は
、ここではグル濾過で単離した完全な細胞に関して測定
した。この方法に基づくと、投与量−作用曲線（横軸に
被験物質の濃度を取り、縦軸に被験物質存在下で対照細
胞の１４０−ロイシンの取込に対する・セーセントで表
わした１４Ｃ−ロイシンの取込みを取る）を作製するこ
とができる。このようにして、各被験物質に対シて、１
４Ｃ−ロイシンの取込みを５０パーセント阻害する濃度
すなわち「５０チ阻害濃度」（工Ｃ３ｏ）を求めること
が七きる。完全側°胞の１４０−ロイシンの取込みを測
定すれば、従来のタンパク合成の測定法によって得られ
る結果と一致する■Ｃ５ｏを決定できることも調べた。

３）結果 ａ、テスト−１（無細胞系） 修飾Ａ鎖の阻害活性を測定した。工Ｃ５ｏは２．１８Ｘ
ＩＦ１０モル／ｌとなった。この実験で対照Ａ鎖のＩＣ
３゜は１．０３Ｘ１０　　　モル／ｌであった。従って
、修飾してもＡ鎖の活性はあまり減少しない。

ｂ、テスト−２（有細胞系） そのｉｔで抗原Ｔ６５を有するＯＥＭ細胞について、こ
の試験を行なった。包合体の細胞毒性は著しかった（■
Ｃ５ｏは約１０−９ｒｎｏ、Ｌ／ｌ　）。Ａ鎖の値（同
一操作条件で■Ｃ５ｏは５ｘｌｏ　　）より５０倍高か
った。１０ｍＭ塩化アンモニウムの存在下では包合体の
細胞毒性効果は更に増大（Ｉ　Ｃｓｏ　＝２　ＸＩ　Ｏ
ｍｏ！−／　ｌ　）　シた。このようにこの細胞毒性効
果は、Ａ鎖のそれよりも２５，０００倍高い。

実施例２ Ｐｌは、カル〆キシを介して導入されたＳＨ基を有する
リシン人類。

Ｐ２は、アミンを介、して導入されたマレイミド基を有
するＴｉＯ２抗体。

実施例１に同じ。

１−エチル−３−ゾメリルアミノノロビルー３−カルデ
ジイミド８．８■とマレイミドカブロン酸１１■を含む
溶液を、前もって２５℃にて１５分間インキュベートし
、濃度１０ｍ９／ｍｌのＴｌＯ２抗体溶液１０ゴ（０，
ロアマイクロモル〕に加えた。その混合物を３０℃にて
３時間攪拌し、４℃にて４０時間ｐＨ７の１２５ｍＭリ
ン酸緩衝液に対して連続的（５００ゴ／時）透析した。

この結果、１ゴ当り５．２８１１１ｉ＋の修飾抗体を含
む溶液１８．５　ｍｌを得た。１４Ｃ−シテインにより
マレイミド基を測定したところ、得られた抗体は１分子
当り２．８個の活性基を有することが分ったＯ 修飾されたリシンＡ銀溶液７．５７７１７（０，４４マ
イクロモル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液３ｍ
Ａ’（ｏ、ｔｔマイクロモル）に加えた。続いて、その
混合物を３０℃にて１時間静置した。

残りのマレイミド基を５．８マイクロモルの７ステイン
を添加して保護した。３０℃にて１時間インキュベート
した。この反応溶液を、実施例１に記載した方法通りセ
ファデックスＧ１００を詰めたカラム上でｒル濾過して
精製した。この結果、濃度０．３５■／ｍｌの免疫毒素
溶液３９ａ／（１３，７η）を得た。この溶液は、１ｒ
Ｌｌ当り抗体とカップリングした修飾Ａ鎖（ＮＩＪ　）
　０．１０■を含んでいた。従って、この調製物のカッ
プリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（ＮＥＭ　）２
、１であった。

この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、ＳＨｉがＮ−エチルマレイミドで保護されたリ
シン人類のラジカル。

Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団。

上式中、 ・２′は−ＣＯ− ・Ｙ′は−ＮＨ− ・Ｅ′は−ＣＨ２ＣＨ２− ・Ｅは−（ＣＨ２）６− ・Ｙ（ま−Ｃ０− １ｚは−ＮＨ− ・ｎは１゜ ■）　活性試験 ａ、テスト−１（無細胞系）：実施例１に同じ。

ｂ、テスト−２（有細胞系）：実施例１．と同じ条件で
は、活性剤（１０ｍＭ塩化アンモニウム）存在下のＩＣ
５Ｇは２．ＸＩ　Ｏ−モル／ｌでありた。

このことは、この包合体の細胞毒活性がＡ鎖のそれ（同
じ実験でＩＣ５ｏは５Ｘ１０−８）より２，５００倍高
いことを示している。

実施例３ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＨ基を有するリシ
ン人類。

Ｐ２は、アミンを介して導入された活性ジスルフィド基
を有するＴｌ　０１抗体。

１）　　Ｎ−エチルマレイミド保護：実施例１に同じ。

２）アミンの修飾 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）　１　ｄ当りＳ−ア
セチルメルカゾトコハク酸（ＳＡＭＳＡ　）　７４〜を
含むＤＭＦ溶液５０ｍ１を、ｐｌ−１７の１２５ｍＭリ
ン酸緩衝液にＡ鎖（ＮＥＭ　）を溶かした溶液２．５ｄ
（０，７５マイクロモル）忙加えた。２時間インキュベ
ートし、続いて過剰の試薬を除去するた　　。

、めにｐＨ７の１２５ｒｎＭリン酸緩衝液に対して透析
して精製した。この結果、濃度７．７５■／ゴの溶液２
．６−を得た。ヒドロキシアミンとの反応により遊離し
たＳＨ基を分光測定法で解析したところ、得られた修飾
Ａ鎖（ＮＥＭ　）は１分子当り１．４個のＳｌ（基を有
していることが分った。

（Ｂ）　　修飾抗体の調製 実施例１に同じ。

（Ｃ）、免疫毒素の調製 修飾されたリシンＡ銀溶液１．２に／（０，８１マイク
ロモル）を、ヒドロキシアミン塩酸塩の１Ｍ溶液３５０
μｌ存在下にて、上記で得られた活性型抗体の溶液２．
３１７’（０，１６０マイクロモル）に加えた。続いて
、その混合物を３０℃にて５時間インク、？）した。こ
の反応溶液を、実施例１に記載した方法通りセファデツ
クスＧ１００を詰めたカラム上でグル濾過して精製した
。この結果、濃度０．７１　ｍ９／＠ｌの免疫毒素溶液
２４プ（１７η）を得た。この溶液は、１　ｍｌ当り抗
体とカップリングした修飾Ａ鎖（ＮＥＭ　）　０．１３
０ダを含んでいた。従って、この調製物の平均のカップ
リングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（ＮＥＭ　）　１
．１であった。

この結果、前記Ｈ式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、ＳＨ基がＮ−エールマレイミドで保護されたリ
シン人類のラジカル。

Ｐ′は、ＴｌＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団 −（ＮＨ−Ｙ’−Ｅ’）　−８−８−Ｅ−Ｙ−Ｚ−上式
中、 ・Ｙ′は−ＣＯ− ・Ｅ′は−ＣＨ− ＣＨ２Ｃ０ＯＨ ・Ｅは−ＣＨ２−ＣＨ２− パＹは一〇〇− ・２（ま−ＮＨ− ・ｎは１゜ （ロ）活性試験 ２、テスト−１（無細胞系） 修飾されたＡ鎖の阻害活性を測定した。ＩＣ５Ｇは１．
９５ＸＩＯモル／ｌでありた。この実験で、対照（Ｄ　
Ａ鎖）Ｉ　Ｃハ１．５Ｘ１０−１０モル／ｌであった。

この結果から、修飾したからといってＡ鎖の活性が著し
く減少するわけではなかった。

ｂ・　テスト−２〔有細胞系〕　　。

実施例１と同じ条件では、活性剤（ＩＱｍＭ塩化アンモ
ニウム〕存在下のＩ　Ｃ５，は１゜６Ｘ１０−”モル／
ＩＩであった。このことは、この包合体の細胞毒活性が
Ａ鎖のそれ（同じ実験でＩＣ５Ｇは２．２Ｘ１０　　）
より４，０００倍高いことを示している。モネンシン（
５０ｎＭ　）存在下では、この免疫毒素のＩＣ５ｏは１
０−”であった。

実施例４ Ｐ、は、アミンを介して導入されたＳＨ基を有するリン
ン人類。

Ｐ２は、アミンを介して導入されたマレイミド基を有す
るＴｉＯ２抗体。

実施例３に同じ。

（Ｂ）　　修飾抗体の調製 実施例２に同じ二 （Ｃ）　　免疫毒素の調製 修飾されたリシンＡ銀溶液１．２ｍ／（０，３’１マイ
クロモル）を、ヒドロキシアミン塩酸塩の１Ｍ溶液３５
０μｌ存在下にて、上記で得られた活性型抗体の溶液３
．５ｍ７　（０，１２マイクロモル）九加えた。続いて
、その混合物を３０℃にて１時間インクベートした。残
りのマレイミド基を６．９マイクロモルの７ステインを
添加して保護した。３０℃にて１時間インキュ々−トし
た。

この反応溶液を、実施例１に記載した方法通りセフ了デ
ックスＧ１００を詰めたカラム上でｒル濾過して精製し
た。この結果、濃度０．５１４旬の免疫毒素溶液３０属
（１５，２ｍｇ）を得た。この溶液は、１ｄ当り抗体と
カップリングした修飾Ａ鎖（ＮＥＭ　）　０．０８　＋
＋９を含んでいた。従って、この調製物の平均のカップ
リングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（Ｎ１１１Ｍ　）
　１であった。

この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、　Ｓｌ（基がＮ−エチルマレイミドで保護され
たリシン人類のラジカル。

Ｐ′は、Ｔｌ０Ｉ抗体のラジカル。および。

Ｗ′は、次の式で示される原子団。

、　　　０ 上式中、 ・２′は−ＮＨ− ・Ｙ′は一〇〇− ・Ｅ′は−ＣＩ（− ＣＨ２Ｃ００）Ｉ ・Ｅは−（ＣＨ２）６− ・Ｙは一〇〇− ・２は−Ｎｌ（− ・ｎは１゜ （２）活性試験 ａ、テスト−１（無細胞系） 実施例３に同じ。

ｂ、テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件では、活性剤（５０ｎＭモネンシン
）存在下の工Ｃ５ｏは３．３Ｘ１０−１２モル／ｌであ
った。このことは、この包合体の細胞毒活性がＡ鎖のそ
れより５，０００倍高ψことを示している。

実施例５ Ｐｌは、アミンを介して導入された８Ｈ基を有する抗Ｄ
ＮＰ杭体。

Ｐ２は、アミンを介して導入されたマレイミド基を有す
るリシンのＡ鎖。

に）　カップリング試薬の調製 カップリング試薬の調製は、￥レイミドカシロン酸を２
−フェニル−１−アミノエチルクロロメチルケトンで濃
縮して実施し友。

マ、レイミドカグロン酸（１当量）を、メチルクロロフ
ォルメイト（１，１当量）とＮ−エチルモ／ｌ／７オリ
ン（１，１当量〕存在下にてテトラヒト９０フラン（Ｔ
ＨＦ　）　Ｋ溶解した。この混合物を−３０℃にて５時
間冷却した。冷ＴＨＦに溶かした２−フェニル−１−ア
ミンエチルクロロメチルケトンおこびＮ−エチルモルフ
ォリン（１，１当ｔ）を徐々に加えた。４℃にて１時間
静置して反応を進行させ、更に室温にて３時間反応を進
行させた。続いて、尽忠溶液を濾過し、その濾液を真空
中で蒸発乾固させ苑。残渣を酢酸エチルに再溶解させた
。その有機層を水で２回抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し
、蒸発乾固させた。結晶化しない生成物が得られるが、
それをＮＭＲス波ク波層トル分析法り同定した。

１）Ｎ−エチルマレイミドによる保護 実施例１に同じ。

２）リシン人類のアミンの修飾 ＴＨＦに溶解したカップリング試薬４０マイクロモルを
、８　ｍ９　（Ｑ、２６マイクロモル）のＡ鎖（ＮＥＭ
　）をＰ１］７の１２５　ｍＭのり７６１１１緩衝液１
０Ｍに溶かした溶液に加えた。反応溶液を２５℃にて５
時間静置した。過剰の試薬を除くためにｐＨ７の１２５
ｍＭリン−酸緩衝液に対して透析して精製し、遠心した
。　　Ｃ−７ステインによりマレイミド基を測定したと
ころ、得られた修飾Ａ鎖（ＮＥＭ　）は１分子当り０．
５個の活性基を有していることが分った。

（Ｃ）　　修飾抗体の調製 ＤＭＦに濃度１４０　ｒｖ／ｍｌとなるように溶かした
Ｓ　ＡＭＳ　ＡのＤＭＦ溶液２０　ｔｔｌを、濃度１０
１Ｖ／ｒＬｌのＴｉＯ２抗体溶液４ｍ１（Ｑ、３マイク
ｏ　モル）　Ｋ加えた。その混合物を４℃にて２時間攪
拌し１、続いて試薬を除くために２４時間ｐＨ７の１２
５ｍＭ　リン酸緩衝液に対して連続的（４００１ｎｌ／
時で２０時間）に透析し、精製し庭。この結果、１ｍｌ
！当り８．．６ｍｇの修飾抗体を含む溶液４．１ｄを得
た。ヒドロキシアミンによる反応後、エルマンの方法に
より遊離したＳＨ基を分光測定法で解析したところ、得
られた抗体は１分子当り３．５個のＳＨ基を有している
ことが分った。

（９）免疫毒素の調製 修飾されたリシンＡ銀溶液０．５　ｍｌ！（０，００７
マイクロモル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液５
３μＩｃ０１００３マイクロモル）に加えた。ヒドロキ
シアミン塩酸塩の１．０Ｍ溶液１０μノをこの反応溶液
に加えた。２５℃にて１００時間静置て反応させた。濃
度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べたと
ころ免疫毒素が検出された。

この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、　　ＳＨ基がＮ−エチルマレイミドで保護され
たリシン人類のラジカル。

′Ｐ′は、抗ＤＮＰ抗体のラジカル。および、Ｗ′は、
次の式で示される原子団。

上式中、 ・Ｚ（ま−ＮＨ− ・　Ｙｌま　−ＣＯ− ・Ｅは−（ＣＩ’（２）６− ・Ｅ′は−ＣＨ− ■ Ｃ１（２ＣＯＯＨ ・Ｙ’＆−１−ＣＯ− ・２′は−ＮＨ− ・ｎは１゜ （Ｄ）　　活性試験 ａ・　テスト−１（無細胞系） 修飾されたＡ鎖の阻害活性を測定した。工Ｃ５゜は０．
２５Ｘ１０”モル／ｌであった。この実験で１、対照の
Ａ鎖の■Ｃ５ｏは０．７８Ｘ１０　　モル／ｌでありた
。この結果から、修飾してもＡ鎖の活性は全く減少しな
かった。

ｂ、テスト−２（有細胞系） 実施例１と次の点以外同じ条件下で試験を実施した。フ
ランス特許第７８／２７８３８号゛に記載の方法に従っ
てＴＮＰで標識したＣＥＭ細胞な用いた。その方法は、
ヒーラ細胞をＴＮＰで標識する技法と類似している。活
性剤（１０ｍＭ塩化アンモニウム）存在下での工Ｃ５ｏ
は１×１０　モル／ｌであった。この値は、Ａ鎖のそれ
より１０倍高かった。

実施例６ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＨ基を有するＴｌ
０Ｉ抗体。

Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型ジ
スルフィド基を有するリシンのＡ鎖。

偽）　カップリング試薬の調製 カッシリング試薬には、３−（ビリ・シン２イルノスル
フアニル）ｆロビオン酸（ＰＤＰＡ）カラ誘導したイミ
ダゾリドを用いた。このイミダゾリドはＰＤＰＡとカル
？ソイミダゾール（ＣＤＩ　）とから１工程で得られた
。

ＰＤＰＡ　４３０’＆をＴＨＦ２ｒＩＬｌに溶解した。

ＣＤＩ４０５ｍｇをこの溶液に加えた。この混合物を、
２５℃にて１５分間攪拌したところ炭酸ガスが発生した
。この反応溶液を精製せずに直接かつ迅速に使用した。

１）　　Ｎ−エチルマレイミドによる保護実施例１に同
じ。

２）チロシンの修飾 ＴＨＦに溶解したカッシリング試薬３００マイ？ロモル
を、１８〜（０，６マイクロモル）のＡ鎖（ＮＥＭ　）
をＰ）（７の１２５ｍＭのリン酸緩衝液１０ゴに溶かし
た溶液に滴下した。反応溶液を２５℃にて１５分間攪拌
した。過剰の試薬を除くためにｐＨ７の１２５　ｍＭ　
Ｕン酸緩衝液に対して透析して精製した。この結果、タ
ン・す］度Ｉ１５５　ｍ９／ｍｌの修飾Ａ銀溶液９．５
ｄを得た。２−メルカゾトエタノールとの交換反応によ
り放出されるピリジン２−チオンを３４３　ｎｍにて分
光測定法で解析したところ、得られた修飾Ａ鎖（ＮＥＭ
　）は１分子当り１．６個の活性基を有していることが
分った。

（Ｑ　修飾抗体の調製 ＤＭＦに濃度１７０ｍ９７ｍ１となるように溶かしたＳ
ＡＭＳＡのＤＭＦ溶液２５　ｕｌを、濃度９ｒｔｙ／１
ｒｔｌのＴｉＯ２抗体溶液４５７ｍ（０，３マイクロモ
ル）に加えた。その混合物を４℃にて２時間攪拌し、続
いて試薬を除くために２４時間Ｐ）（７０１２５ｍＭリ
ン酸緩衝液に対して連続的（４００ｄ／時）透析し、Ｎ
製した。この結果、１４当り８．６１ｎ９の修飾抗体を
含む溶液４．１フを得た。ヒドロキシアミン塩酸塩の０
．５Ｍ溶液０．６４ｍをこの抗体溶液に加えた。３０℃
にて１時間インキュベーションしたのち、試薬を除くた
めに２４時間−７０１２５ｍＭリン酸緩衝液に対して透
析し、精製した。エルマンの方法にｉり遊離したＳｌ（
基を分光測定法で解析したところ、得られた抗体は１分
子当り５個の活性基を有していることが分った０ Ｑ））　　免疫毒素の調製 修飾されたリシン人類溶液５．２ｍ／（０，２７マイク
ロモル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液２．１　
ｍ　（０，１’　１マイクロモル）に加えた。

続いて、その混合物を３０℃にて５時間インキュベーシ
ョンした。この反応溶液を、実施例ＩＫ記載した方法通
りセファデックスＧ１００を詰めたブＪラム上でｒル濾
過して精製した。この結果、濃度１．１ｍ９７ｍ１の免
疫毒素溶液１７ｄ（１８，７ダ）を得た。この溶液は、
■ｄ当り修飾されたＡ鎖（ＮＥＭ　）　０．３２■を含
んでいた。

、従って、この調製物のカッシリングの程度は、抗体１
分子当りＡ鎖（ＮＥＭ　）　２であった。′この結果、
前記■式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、ＳＨ基がＮ−エチルマレイミドで保護されたリ
シン人類のラジカル。

Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団。

−（ＮＨ−Ｙ’−Ｅ’へ−８−８−Ｅ−Ｙ−Ｚ−上式中
、 ・Ｙ′は−ＣＯ− ・Ｅ′は一〇Ｈ２ＣＨ２− −Ｅ＆よ−ＣＨ− ＣＨ２ＣＯＯＨ ・Ｙ（ま−〇〇− ・２に家−〇− ・ｎは１゜ （ト））活性試験 ａ、テスト−°１（無細胞系） 修飾されたＡ鎖の阻害活性を測定した。ＩＣ５゜は３．
６×１０　　モル／ｌであった。この実験で、対照のＡ
鎖の工Ｃ５ｏは１，２　Ｘ　１０−１０モル／ｌであっ
た。この結果から、修飾してもＡ鎖の活性は全く減少し
なかったら す、テスト−２（有細胞系） 実施例２と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
ｎＭモネンノン）琶在下での■Ｃ５ｏは１．２　Ｘ　１
０−１２モル／ｌであった。この値は、Ａ鎖のそれ（■
Ｃ５ｏは６　Ｘ　１０−８モル／ｌ）より５Ｘ１０’倍
高かった。

実施例７ Ｐｌは、アミンを介して導入されたＳＲ基を有するＴｌ
０Ｉ抗体。

Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型マ
レイミド基を有するリシンのＡ鎖。

カッシリング試薬にはマレイミドカシロン酸から誘導し
たイミダゾリドを用いた。このイミダゾリドはマレイミ
ドカシロン酸とカルデジイミドから１工程で得られた。

マレイミドカッロン酸４２２ｊψをＴＨＦ　２　ｄに溶
解した。ＣＤＩ４０５１＃をこの溶液に加えた。

この混合物を、室温にて１５分間攪拌したところ炭酸ガ
スが発生した。この反応溶液を精製せずに直接に使用し
た。

（Ｂ）　　適切な官能基が導入されたリシン人類の調製
１）Ｎ−エチルマレイミドによる保護 実施例１に同じ。

２）チロシンの修飾 ＴＨＦに溶解したカニ、ｆリング試薬３００マイクロモ
ルを、１８Ｉｎ９（０，６マイクロモル）のＡ鎖（、Ｎ
ＥＭ　）をＰＨ７の１２５　ｍＭのリン酸緩衝液Ｌ　Ｏ
ｍｌに溶かした溶液に滴下した。反応溶液を２５℃にて
１５分間攪拌した。過剰の試薬を除くためにＰＨ７の１
２５　ｍＭリン酸緩衝液に対して透析して精製した。こ
の結果、タンパク濃度１、４５　ｍ９７ｍ１の修飾Ａ銀
溶液２０ｍ１を得た。Ｃ−システィンによるマレイミド
基を測定したところ、得られた修飾Ａ鎖（ＮＥＭ　）は
１分子当り１個の活性基を有していることが分った。

（Ｃ）　　修飾抗体の調製 実施例６に同じ。

（Ｄ）　　免疫毒素の調製 修飾されたリシンＡ銀溶液ｓ、５ｙ（ｏ、２８マイクロ
モル）を、上記で得られた活性型抗体の溶液２．１ｍ１
Ｏ，１１マイクロモル〕に加えた。′続いて、その混合
物を３０℃にて１時間インキエベーションした。残った
マレイミド基を５マイクロモルのシスティンで保護した
。３０℃にて１時間インキユペーシツンし、この反応混
合物を、実施例１に記載した方法通りセファデックスＧ
１００を詰めたカラム上でグル濾過して精製した。この
結果、濃度１．０５〜／ｍｌの免疫毒素溶液１９．５＃
ｌｌ（２０，５〜）を得た。この溶液は、ｌ　ｍｌ当り
修飾されたＡ鎖（ＮＥＭ　）　０．３１■を含んでいた
。−従って、この調製物のカップリングの程度は、抗体
１分子当りＡ鎖（ＮＥＭ　）　２であったり この結果、前記１式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、ＳＨ基がＮ−エチルマレイミドで保護されたリ
シン人類のラジカル。

Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団。

上式中、 ・２′は−ＮＨ− ・Ｙ′は−ＣＯ− ・　Ｅ′は−ＣＨ− ＣＨ２Ｃ０ＯＨ ・Ｅは−ＣＨ２−Ｃ）（２− ・Ｙは−ＣＯ− ・２（ま−〇− ・ｎは１゜ （匂　活性試験 ａ、テスト−１（無細胞系） 修飾されたＡ鎖の阻害活性を測定した。ＩＣ５゜は１０
×１０　　モル／Ｉｔであった。この実験で、対照のＡ
鎖のＩＣ５ｏは１．Ｉ　ＸＩ　Ｏ”モル／ｊであった。

活性がかなり消失しているものの、修飾Ａ鎖のタン・そ
り合成阻害能はまだ高かった。

ｂ、テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
０ｎＭモネンシン）存在下でのＩＣ５゜は３Ｘ１０　　
　モル／ｌでありた。この値は、Ａ鎖のそれ（ＩＣ，。

は６Ｘ１０　モル／ｌ）より３Ｘ１０３倍高かった。　
　　　。

実施例８ Ｐｌは、天然状態のリシン人類。

Ｐ２は、アミンを介して導入されたマレイミド基を有す
るＡＴ１５に抗体。

（Ａ）　　修飾抗体の調製 実施例２に記載の方法によりＡＴ１５“Ｅ抗体を修飾し
た。　　Ｃ−７ステインにより測定したところ、抗体１
分子当り２．４個のマレイミド基が導入されていた。

（Ｂ）　　免疫毒素の調製 ｐＨ７の１２５ｍＭリン酸緩衝液にリシン人類を溶かし
た溶液８．３１ｎｌ（０，２マイクロモル）を、上記で
得られた活性型抗体の溶液２５１ｄ（０，６５マイクロ
モル）に加えた。続いて、その混合物を３０℃にて１時
間インキュベーションした。

残ったマレイミド基を９：２５マイクロモルのシスナイ
ンで保護した。３０℃にて１時間インキエペーシ、ンし
、この反応混合物を、実験例１に記載した方沃通りセフ
ァデックスＧ１００を詰めたカラム上でｒル濾過して精
製した。この結果、濃度１ｍｙ／ｍ１ｏ溶液９０ｆｆｌ
Ｊ（２０，５η）を得た。この溶液は、１ゴ当り修飾さ
れたＡ鎖（ＮＹ、Ｍ　）　０．２７■を含んで−た。従
って、この調製物のカノノ、リングの程度は、抗体１分
子当りＡ鎖（ＮＥＭ　）　１．８であった。

この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 Ａ′は、リシン人類のラジカル。

Ｐ′は、ＡＴＬ５Ｅ抗体のラジカル。および、Ｗ／は、
次の式で示される原子団。

上式中、 ・２しま−ＮＨ− ・Ｙをま−ＣＯ− ・Ｅは−（ＣＨ２）５− ・　ｎは　セ°′・ロ ーｍ＆＄１．８゜ （ｑ　活性試験 テスト−２（有細胞系） このテストは、Ｔｈｙ　１．２抗原を有するマウスＴ細
胞白血病の細胞を用いた以外は実施例１と同じ条件下で
実施した。活性剤（５０ｎＭモネンシン）存在下でのＩ
Ｃ５ｏは１０　モル／１１でありた。この値は、Ａ鎖の
それ（工Ｃ５ｏは５×１０モ〃／ｌ〕より５００倍高か
った。

実施例９ Ｐｌは、天然状態のリシン人類。

Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入された活性型ジ
スルフィド基を有するＴｌ０Ｉ抗体。

実施例６に同じ ２倍希釈した前記ＴＨＦ溶液３４μＪ（ＩｇＧ濃度は２
００描量１モル）を、Ｔｌ０Ｉ抗体１２．８ダを１．８
コのｐＨ７の１２５　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液に溶かした
溶液に滴乍した。この反応溶液を室温にて１５分間攪拌
し、続いて透析により精製したところ、濃度４．５５ｍ
ｑ／ｍｌの修飾抗体の溶液２．６ゴを得た。２−メルカ
ゾトエタノールとの交換反応により放出されたピリノン
２−チオンを３４３　ｎｍで分光測定法により解°析し
たところ、得られた抗体は１分子当り２．２個の活性基
を有していることが分った。

（Ｃ）　　免疫毒素の調製 濃度４．５５　ｍ９／ｒｎｌの活性型抗体の溶液２．５
コ（０，０７５マイクロモル）を、濃度７．１１ｎ９／
ｍＪノリシンＡ鎖の溶液７５０μ１（ｃ）Ａ７７７７マ
イクロ）に加えた。続いて、その混合物を２５℃にて１
８時間インキュベーションした。この反応混合物を、実
施例１に記載した方法通りセファデックスＧ１００を詰
めたカラム上でケ９ル濾過して精製した。この結果、濃
度０．８　ｒｌＱ／ｍｌの溶液１３ｍｌ　（１０，４Ｉ
ｎ９）を得た。コノ溶液ハ、１ｍｉ当りＡ鎖（、ＮＥＭ
　）　０．２　ｍ９を含んでいた。従って、この調製物
のカップリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖（ＮＥＭ
　）　１．５であった。

この結果、前記■式の免疫毒素が得ら些た〇この式中で
、 Ａ′は、リシン人類のラジカル。　′ Ｐ′ハ、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、Ｗ′は、次
の式で示される原子団。

−２“−Ｙ−Ｅ−８−８−（−Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’八−上
式中、 ・２“レジＬ−〇− ・Ｙしま−ＣＯ− ・Ｅは−ＣＥＩ２−ＣＨ２− ・ｎはａ”ｎ、　； −ｍしま１．５゜ ■）活性試験 テスト−２（有細胞系） 実施例１と同じ条件下で試験を実施した。活性剤（５０
ｎＭモネンシン）存在下での工Ｃ５ｏは３．５　Ｘ　１
０−”モル／ｌであった。この値は、その細胞ｉ活性が
Ａ鎖のそれ（工Ｃ５ｏは０．６　Ｘ　１０−８モル／ｌ
）より１．５×１０　倍高かった。

実施例１、Ｏ Ｐ、は、天然状態のリシン人類。

Ｐ２は、チロシンの水酸基を介して導入されたマレイミ
ド基を有するＴｉＯ２抗体。

実施例７に同じ。

（Ｂ）　　修飾抗体の調製 ２倍希釈した前記ＴＨＦ溶液３４μｌ（、ＩｇＧ濃・度
。

は２００当叫１モル）を、ＴｉＯ２抗体１２．８ｍ９を
ｌ、　３　ｍ／のｐを１７の１２５　ｍＭリン酸緩衝液
に溶かした溶液に面下した。この反応溶液を室温にて１
５分間撹拌し、続いて透析により精製したと、ころ、濃
度４．５　ｍｌｌ／ｍｌの修飾抗体の溶液２．６威を得
た。＋４Ｃ−システィンによるマレイミド基を測定した
ところ、得られた抗体は１分子当り４個の活性基を有し
ていることが分った。

（Ｃ）　　免疫毒素の調製 濃度４．５ｍＱ／ｒｕｌの活性型抗体の溶液２．５４（
０，０７５マイクロモル）を、濃度７．１４佃のリシン
人類の溶液８５０μｌ（０，２ｏマイクロモル）に加え
た。続いて、その混合物を２５℃にて１時間インキュベ
ーションした。残ったマレイミド基を６マイクロモルの
システィンで保護した。この灰化混合物を、実施例１に
記載した方法通りセファデックスＧ１００を詰めたカラ
ム上でｒル濾過して精製した。この結果、濃度０、７６
　ｍｇ／ｍｌの免疫置県溶液１，１　ｍｌ（１０，４’
ｌｌ！ｉ？　）を得た。この溶液は、１ｍｌ当りＡ鎖（
ＮＥＭ　）０．２９ηを含んでいた。従って、この調製
物の平均のカップリングの程度は、抗体１分子当りＡ鎖
（ＮＥＭ　）　３であった。

この結果、前記■式の免疫毒素が得られた。

この式中で、 ・　Ａ′は、リクン人類のラジカル。

Ｐ′は、ＴｉＯ２抗体のラジカル。および、ｗ’は、次
の式で示される原子団。

上式中、 ・２は一〇− ・Ｙ（ま−ＣＯ− ・Ｅは−（ＣＨ２）５− ・　ｎはピ゛口）； −ｍは３゜ ［Ｆ］）活性試験 テスト−２（有細胞系） このテストは、実施例１と同じ条件下で実施した。活性
剤（５０ｎＭモネンシン）存在下での■Ｃ５ｏは１．７
Ｘ１０　　　モル／ｌであった。この値は１．−同実験
においてＡ鎖のそれより３×１０　倍高かった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リシンのＡ鎖と抗体をカップリングさせて得られ
   る次の一般式を有する免疫毒素。 Ｐ′−Ｗ−Ａ′ （上式中、ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパク
   のラジカルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを
   示す。Ａ′はリシンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそ
   れ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。Ｗは、
   チオエーテル基またはジスルフィド基を含む２価の共有
   結合構造を示す。この場合ジスルフィド基においては、
   両イオウ原子はＰおよびＡのシスティンのそれか、また
   は両イオウ原子はＰおよびＡ若しくはそのいずれかに属
   する原子団に結合している。 この後者の場合、両イオウ原子はＰおよびＡ若しくはそ
   のいずれかに属する前記原子団に結合している官能基を
   有する分子が介在して前記原子団と結合している。但し
   、Ｗがジスルフィド基を含む場合、前記ジスルフィド基
   のイオウ原子の１つがＡのシスティンのうちの１つに属
   するものであるときは、他方のイオウはアミノ基以外の
   タンパクＰの基に結合した官能官を有する介在分子によ
   りタンパクＰに結合している。）（２）リシンのＡ鎖と
   抗体Ｐとをカップリングさせて得られる次の一般式を有
   する免疫毒素。 Ｐ′−Ｗ′−Ａ′ 〔上式中、Ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパク
   のラジカルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを
   示す。Ａ′はリシンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそ
   れ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。Ｗ′は
   次の群から選ばれる共有結合構造を示す。 （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｃ）−（ＮＨ−Ｙ′−Ｅ′）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−
   Ｚ−または （ｄ）−Ｚ″−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）
   ＿ｎ−（上式中、ＺおよびＺ′はタンパクＡおよびＰに
   属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸基に由
   来する酸素原子、ＡおよびＰのグルタミン酸およびアス
   パラギン酸またはそのいずれかの末端ないし遊離カルボ
   キシル基の１つに由来のカルボニル基、Ｐの糖鎖を過ヨ
   ウ素酸で酸化したあと得られるジアルデヒド構造に由来
   の基、および１つのリシン残基のε位のアミンの１つ若
   しくはＡおよびＰの末端アミンの１つに由来の−ＮＨ−
   基から選ばれる。Ｚ″は上記のＺおよびＺ′と同じであ
   るが、−ＮＨ−ではあり得ない。ＹおよびＹ″はタンパ
   クＰおよびＡのＺ、Ｚ′およびＺ″基のいずれか１つと
   共有結合し得る官能基を示す。ＥおよびＥ′は不活性な
   介在分子を示す。 そして、ｎは０または１である。）〕 （３）抗体ＰをリシンのＡ鎖でカップリングして得られ
   る次の一般式を有する免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ′）＿ｍ 〔上式中、ｍは０．３ないし１２の数値を示す。 Ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパクのラジカル
   それ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。Ａ′
   はリシンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそれ自体また
   は適宜化学的に修飾したものを示す。Ｗ′は次の群から
   選ばれる共有結合構造を示す。 （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｃ）−（ＮＨ−Ｙ′−Ｅ′）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−
   Ｚ−または （ｄ）−Ｚ″−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）
   ＿ｎ−（上式中、ＺおよびＺ′はタンパクＡおよびＰに
   属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸基に由
   来する酸素原子、ＡおよびＰのグルタミン酸およびアス
   パラギン酸またはそのいずれかの末端ないし遊離カルボ
   キシル基の１つに由来のカルボニル基、Ｐの糖鎖を過ヨ
   ウ素酸で酸化したあと得られるジアルデヒド構造に由来
   の基、および１つのリシン残基のε位のアミンの１つ若
   しくはＡおよびＰの末端アミンの１つに由来の−ＮＨ−
   基から選ばれる。Ｚ″は上記のＺおよびＺ′と同じであ
   るが、−ＮＨ−ではあり得ない。ＹおよびＹ″はタンパ
   クＰおよびＡのＺ、Ｚ′およびＺ″基のいずれか１つと
   共有結合し得る官能基を示す。 ＥおよびＥ′は不活性な介在分子を示す。そして、ｎは
   ０または１である。）〕。 （４）次の一般式で表わされる特許請求の範囲第３項記
   載の免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ′）＿ｍ （上式中、Ｗ′およびＡ′は特許請求の範囲第３項記載
   の通りであり、ｐ′は抗体断片ＦａｂまたはＦａｂ′を
   示し、およびｍは０．３ないし２の範囲の数を示す。） （５）次の一般式で表わされる特許請求の範囲第３項記
   載の免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ′）＿ｍ （上式中、Ｗ′およびＡ′は特許請求の範囲第３項記載
   の通りであり、Ｐ′は抗体断片Ｆ（ａｂ′）＿２を示し
   、およびｍは０．５ないし４の範囲の数を示す。）（６
   ）次の一般式で表わされる特許請求の範囲第３項記載の
   免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ′）ｍ （上式中、Ｗ′およびＡ′は特許請求の範囲第３項記載
   の通りであり、Ｐ′はＩｇＭ型の抗体を示し、およびｍ
   は０．５ないし６の範囲の数を示す。）（７）次の一般
   式で表わされる特許請求の範囲第３項記載の免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ′）＿ｍ （上式中、Ｗ′およびＡ′は特許請求の範囲第３項記載
   の通りであり、ｐ′はＩｇＭ型の抗体を示し、およびｍ
   は１ないし１２の範囲の数を示す。）（８）一般式 Ｐ′−Ｗ−Ａ′ 〔上式中、ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパク
   のラジカルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを
   示す。Ａ′はリシンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそ
   れ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。Ｗは、
   チオエーテル基またはジスルフィド基を含む２価の共有
   結合構造を示す。この場合ジスルフィド基においては、
   両イオウ原子はＰおよびＡのシスティンのそれか、また
   は両イオウ原子はＰおよびＡ若しくはそのいずれかに属
   する原子団に結合している。 この後者の場合、両イオウ原子はＰおよびＡ若しくはそ
   のいずれかに属する前記原子団に結合している官能基を
   有する分子が介在して前記原子団と結合している。但し
   、Ｗがジスルフィド基を有する場合、前記ジスルフィド
   基のイオウ原子の１方がリシンＡ鎖のシスティンに属す
   るものであるとき、他方のイオウ原子はアミノ基以外の
   タンパクＰの基に結合した官能基を有する介在分子によ
   りタンパクＰに結合したものである〕で示される免疫毒
   素の製造方法であって、直接または介在基を介して結合
   した少なくとも１つの遊離チオール基を有するタンパク
   であって場合に応じて修飾されているリシンのＡ鎖また
   は抗体または抗体の断片であるものＰ＿１を、タンパク
   Ｐ＿１の遊離チオールと結合してチオールエーテルまた
   はジスルフィド結合を形成し得る原子団を有する、タン
   パクＰ＿１とは異なるタンパクであってリシンのＡ鎖ま
   たは抗体または抗体の断片であるものＰ＿２と、室温に
   て水溶液中で反応させることを特徴とする免疫毒素の製
   造方法。 但し、ジスルフィド結合が形成される場合にタンパクＰ
   ＿１がリシンのＡ鎖であるときは、該ジスルフィド結合
   はアミノ基以外の前記タンパクＰ＿２の基との間に形成
   される。 （９）一般式 Ｐ′−Ｗ′−Ａ′ 〔上式中、Ｐ′は抗体または抗体の断片であるタンパク
   のラジカルそれ自体または適宜化学的に修飾したものを
   示す。Ａ′はリシンのＡ鎖であるタンパクのラジカルそ
   れ自体または適宜化学的に修飾したものを示す。Ｗ′は
   次の群から選ばれる共有結合構造を示す。 （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｃ）−（ＮＨ−Ｙ′−Ｅ′）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−
   Ｚ−または （ｄ）−Ｚ″−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）
   ＿ｎ−（上式中、ＺおよびＺ′はタンパクＡおよびＰに
   属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸基に由
   来する酸素原子、ＡおよびＰのグルタミン酸およびアス
   パラギン酸またはそのいずれかの末端ないし遊離カルボ
   キシル基の１つに由来のカルボニル基、Ｐの糖鎖を過ヨ
   ウ素酸で酸化したあと得られるジアルデヒド構造に由来
   の基、および１つのリシン残基のε位のアミンの１つ若
   しくはＡおよびＰの末端アミンの１つに由来の−ＮＨ−
   基から選ばれる。Ｚ″は上記のＺおよびＺ′と同じであ
   るが、−ＮＨ−ではあり得ない。ＹおよびＹ″はタンパ
   クＰおよびＡのＺ、Ｚ′およびＺ″基のいずれか１つと
   共有結合し得る官能基を示す。ＥおよびＥ′は不活性な
   介在分子を示す。 そして、ｎは０または１である。）で示される免疫毒素
   の製造方法であって式 Ｐ＿１′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）＿ｎ−ＳＨ で示されるタンパクを次の一般式のタンパクと室温にて
   水溶液中で反応させることを特徴とする免疫毒素の製造
   方法。 Ｐ＿２′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′−Ｇ （上式中、Ｐ＿１′およびＰ＿２′はＰ＿１およびＰ＿
   ２の原子団であって前記タンパクに属する基に結合して
   いる、または抗体若しくは抗体断片の糖鎖を過ヨウ素酸
   との反応により開裂して得られるタンパクＰ＿１または
   Ｐ＿２の１つの原子団である。またＺ、Ｚ′、Ｙ、Ｙ′
   、ＥおよびＥ′は上記のとおりであり、Ｇは次の基を示
   す。 ▲数式、化学式、表等があります▼ またはＧは−Ｓ−Ｓ−Ｘ基（Ｘは活性基）である。 Ｇが−Ｓ−Ｓ−Ｘ基であり、Ｐ＿１′がリシンのＡ鎖で
   ある場合、ｎは１であるが０であることもある。 しかしこの場合Ｚ′は−ＮＨ−以外である。）〕（１０
   ）以下の一般式で表わされる生成物。 Ｐ＿２″−Ｏ−ＣＯ−Ｅ−Ｇ　VI 〔上式中、Ｐ＿２″は次の（ａ）、（ｂ）から選ばれる
   タンパクのラジカルを示す。 （ａ）抗体または抗体断片、免疫グロブリンまたは免疫
   グロブリン断片、または官能基のどれか１つを人工的に
   修飾させることによりこれらの分子から由来する分子。 （ｂ）リシンのＡ鎖または官能基のどれか１つを人工的
   に修飾させることによりこれらの分子から由来する分子
   。前記タンパクの一部から除かれたチロシンのフェノー
   ル性水酸基の１つ以上は上記ラジカルから除去されてい
   る。 ・酸素原子は、タンパクのラジカルＰ＿２″から欠失す
   るフェノール性水酸基に属するもの。 ・Ｅは不活性介在分子を示す。および ・Ｇは ▲数式、化学式、表等があります▼ または−Ｓ−Ｓ−Ｘ（Ｘは活性基）を示す。〕