JPH08269093A - レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブ - Google Patents
レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブInfo
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- JPH08269093A JPH08269093A JP8045604A JP4560496A JPH08269093A JP H08269093 A JPH08269093 A JP H08269093A JP 8045604 A JP8045604 A JP 8045604A JP 4560496 A JP4560496 A JP 4560496A JP H08269093 A JPH08269093 A JP H08269093A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ブロックされたレクチンを提供すること。
【解決手段】 ブロックされたレクチンであって、各リ
ガンド上に存在する光活性化可能でない反応性の基によ
って該レクチンのオリゴ糖結合部位の１つ以上をブロッ
クするように該レクチンの該オリゴ糖結合部位に特異的
に共有結合された１つ以上のアフィニティーリガンドを
包含する上記のブロックされたレクチンを提供する。
ガンド上に存在する光活性化可能でない反応性の基によ
って該レクチンのオリゴ糖結合部位の１つ以上をブロッ
クするように該レクチンの該オリゴ糖結合部位に特異的
に共有結合された１つ以上のアフィニティーリガンドを
包含する上記のブロックされたレクチンを提供する。
Description
【０００１】本発明は非特異的毒性が減少せしめられた
細胞毒性レクチン複合体の製造方法及びかかる細胞毒性
レクチン複合体を製造する際に有用な新規なリガンド−
担体(support)複合体又はプローブに関する。
細胞毒性レクチン複合体の製造方法及びかかる細胞毒性
レクチン複合体を製造する際に有用な新規なリガンド−
担体(support)複合体又はプローブに関する。
【０００２】
【発明の背景】リシン、アブリン、モデシン、ボルケン
シン及びビスクミンのような数種の公知の細胞毒性レク
チンがあり、これらは真核細胞を非常に有効に殺す。こ
れらのレクチンは、ジスルフィド結合によって連結され
ている二個のサブユニットを含有しているヘテロ二量体
蛋白質である。Ａ−鎖と称する一方のサブユニットはリ
ボソームの触媒不活性化により細胞毒性活性を発揮する
一方、他方のサブユニットであるＢ−鎖はガラクトース
末端オリゴ糖に対して特異的な結合部位を含有する。オ
リゴ糖成分を含有する分子は細胞表面に遍在しているた
めレクチンは識別不可能であり、したがってその細胞毒
性は非特異的である。この特性のために腫瘍細胞のよう
な病的又は異常な細胞を選択して殺す有用性が大きく制
限される。
シン及びビスクミンのような数種の公知の細胞毒性レク
チンがあり、これらは真核細胞を非常に有効に殺す。こ
れらのレクチンは、ジスルフィド結合によって連結され
ている二個のサブユニットを含有しているヘテロ二量体
蛋白質である。Ａ−鎖と称する一方のサブユニットはリ
ボソームの触媒不活性化により細胞毒性活性を発揮する
一方、他方のサブユニットであるＢ−鎖はガラクトース
末端オリゴ糖に対して特異的な結合部位を含有する。オ
リゴ糖成分を含有する分子は細胞表面に遍在しているた
めレクチンは識別不可能であり、したがってその細胞毒
性は非特異的である。この特性のために腫瘍細胞のよう
な病的又は異常な細胞を選択して殺す有用性が大きく制
限される。
【０００３】従来、レクチンは二つのサブユニットに分
割されＡ鎖のみがモノクローナル抗体に結合され特異的
活性を有する毒素を与えるのであるがかかる複合生成物
は全レクチンのものと比べて有意に減少された毒性を示
す。
割されＡ鎖のみがモノクローナル抗体に結合され特異的
活性を有する毒素を与えるのであるがかかる複合生成物
は全レクチンのものと比べて有意に減少された毒性を示
す。
【０００４】また、レクチン、コンカナバリンＡのオリ
ゴ糖結合部位を、コンカナバリンＡの結合部位に特異的
に結合する光活性化しうるマンノースのアリールアジド
誘導体で処理した後に紫外線に暴露してコンカナバリン
Ａと多糖類誘導体との間に共有結合を形成することによ
ってブロックすることが J. Biochem.７８巻、１０１３
〜１０１９頁（１９７５年）に記載のごとくBeppu 等に
よって提案されている。上記生成物はその４個の結合部
位のうちの２個において活性を保持し、かつ減少した赤
血球凝集活性を示した。スクシニル化コンカナバリンＡ
を用いて Fraser 等の Proc, Nat, Acad. Sci.（ＵＳ
Ａ）７３巻、７９０〜７９４頁（１９７６年）で、さら
に Thomas の methods Enzymol. ４６巻、３６２〜４１
４頁（１９７７年）では類似の操作により同様の結果が
記録されている。同様に Baenziger等により J. Biol.
Chem. ２５７巻、４４２１〜４４２５頁（１９８２年）
においてレクチンであるコンカナバリンＡ、リシン及び
肝臓レクチンを適当なグリコペプチドの光活性化しうる
誘導体で処理し、次いで光暴露によりレクチンとグリコ
ペプチド誘導体との間に共有結合が形成されることが記
載されている。しかしながら、どの場合においてもグリ
コペプチド誘導体は１〜２％包含せしめることができた
にすぎなかった。細胞毒性（リシンの場合）又は赤血球
凝集（コンカナバリンＡの場合）のいずれかの測定によ
りレクチンの標識有効性を決定する試みが行われていな
いことは明らかであった。 Houstonにより J. Biol. Ch
em. ２５８巻、７２０８〜７２１２頁（１９８３年）に
記載されているようにリシンとガラクトースの光活性化
しうる誘導体を用いて類似の操作が適用されている。Ａ
鎖のみが細胞溶解物中で蛋白質合成阻害に十分な活性を
示したが、この生成物は細胞に対して未処理リシンより
も２８０倍も毒性が低いことが見出された。
ゴ糖結合部位を、コンカナバリンＡの結合部位に特異的
に結合する光活性化しうるマンノースのアリールアジド
誘導体で処理した後に紫外線に暴露してコンカナバリン
Ａと多糖類誘導体との間に共有結合を形成することによ
ってブロックすることが J. Biochem.７８巻、１０１３
〜１０１９頁（１９７５年）に記載のごとくBeppu 等に
よって提案されている。上記生成物はその４個の結合部
位のうちの２個において活性を保持し、かつ減少した赤
血球凝集活性を示した。スクシニル化コンカナバリンＡ
を用いて Fraser 等の Proc, Nat, Acad. Sci.（ＵＳ
Ａ）７３巻、７９０〜７９４頁（１９７６年）で、さら
に Thomas の methods Enzymol. ４６巻、３６２〜４１
４頁（１９７７年）では類似の操作により同様の結果が
記録されている。同様に Baenziger等により J. Biol.
Chem. ２５７巻、４４２１〜４４２５頁（１９８２年）
においてレクチンであるコンカナバリンＡ、リシン及び
肝臓レクチンを適当なグリコペプチドの光活性化しうる
誘導体で処理し、次いで光暴露によりレクチンとグリコ
ペプチド誘導体との間に共有結合が形成されることが記
載されている。しかしながら、どの場合においてもグリ
コペプチド誘導体は１〜２％包含せしめることができた
にすぎなかった。細胞毒性（リシンの場合）又は赤血球
凝集（コンカナバリンＡの場合）のいずれかの測定によ
りレクチンの標識有効性を決定する試みが行われていな
いことは明らかであった。 Houstonにより J. Biol. Ch
em. ２５８巻、７２０８〜７２１２頁（１９８３年）に
記載されているようにリシンとガラクトースの光活性化
しうる誘導体を用いて類似の操作が適用されている。Ａ
鎖のみが細胞溶解物中で蛋白質合成阻害に十分な活性を
示したが、この生成物は細胞に対して未処理リシンより
も２８０倍も毒性が低いことが見出された。
【０００５】Thorpe 等は Eur. J. Biochem. １４０
巻、６３〜７１頁（１９８４年）において完全なリシン
にモノクローナル抗体を結合せしめ、次にアフィニティ
ークロマトグラフィーによって生成物を分画すると収率
２０％のフラクションが単離される。この場合、モノク
ローナル抗体がリシンのオリゴ糖結合部位を偶然ブロッ
クしており、それによりこの複合体が細胞に非特異的に
結合する力が減少せしめられると記載している。
巻、６３〜７１頁（１９８４年）において完全なリシン
にモノクローナル抗体を結合せしめ、次にアフィニティ
ークロマトグラフィーによって生成物を分画すると収率
２０％のフラクションが単離される。この場合、モノク
ローナル抗体がリシンのオリゴ糖結合部位を偶然ブロッ
クしており、それによりこの複合体が細胞に非特異的に
結合する力が減少せしめられると記載している。
【０００６】光活性化しうるオリゴ糖又はモノクローナ
ル抗体をレクチンのオリゴ糖結合部位のブロック剤とし
て用いた場合に得られる最終的な結果にあらわれるばら
つきは、レクチンの細胞毒性特性を減少しすぎることな
くその非特異的毒性を有効にかつ再現可能に減少させる
本発明により排除される。
ル抗体をレクチンのオリゴ糖結合部位のブロック剤とし
て用いた場合に得られる最終的な結果にあらわれるばら
つきは、レクチンの細胞毒性特性を減少しすぎることな
くその非特異的毒性を有効にかつ再現可能に減少させる
本発明により排除される。
【０００７】本発明は非特異的毒性が減少せしめられた
細胞毒性レクチンを製造する方法であって、該レクチン
上のオリゴ糖結合部位に対して特異的なリガンドを与
え、該リガンドを固体担体に共有結合させてプローブを
形成し、該レクチンを該結合部位と該リガンドとの間の
特異的相互作用によって該プローブと接触せしめ、更に
該レクチンと該リガンドとの間に共有結合を形成するこ
とにより、該リガンドと該レクチンとの複合体（該リガ
ンドは該支持体に共有結合している）を提供することを
含む。本発明はまたリガンドと支持体との間の共有結合
を切断してリガンドに共有結合しているレクチンを含む
複合体を離脱せしめる更なる操作から成る。本発明はま
た複合体とモノクローナル抗体との間の共有結合を形成
する更なる工程を含む。その他の更なる特色は以下の記
載から明らかになるであろう。
細胞毒性レクチンを製造する方法であって、該レクチン
上のオリゴ糖結合部位に対して特異的なリガンドを与
え、該リガンドを固体担体に共有結合させてプローブを
形成し、該レクチンを該結合部位と該リガンドとの間の
特異的相互作用によって該プローブと接触せしめ、更に
該レクチンと該リガンドとの間に共有結合を形成するこ
とにより、該リガンドと該レクチンとの複合体（該リガ
ンドは該支持体に共有結合している）を提供することを
含む。本発明はまたリガンドと支持体との間の共有結合
を切断してリガンドに共有結合しているレクチンを含む
複合体を離脱せしめる更なる操作から成る。本発明はま
た複合体とモノクローナル抗体との間の共有結合を形成
する更なる工程を含む。その他の更なる特色は以下の記
載から明らかになるであろう。
【０００８】本発明の方法はリシン、アブリン、モデシ
ン、ボルケンシン又はビスクミンのような細胞毒性活性
を有するいかなるレクチンにも用いることができる。
ン、ボルケンシン又はビスクミンのような細胞毒性活性
を有するいかなるレクチンにも用いることができる。
【０００９】本発明において用いる固体担体は、架橋ポ
リアクリルアミド及びその誘導体、例えばアミノエチル
ポリアクリルアミド、誘導多孔ガラスビーズ、ラテック
スビーズ、ポリビニルアルコールビーズなどのような、
アフィニティークロマトグラフィーに通常用いられる固
体担体のいずれであってもよい。
リアクリルアミド及びその誘導体、例えばアミノエチル
ポリアクリルアミド、誘導多孔ガラスビーズ、ラテック
スビーズ、ポリビニルアルコールビーズなどのような、
アフィニティークロマトグラフィーに通常用いられる固
体担体のいずれであってもよい。
【００１０】本方法において用いるリガンドはレクチン
のオリゴ糖結合部位に特異的に結合するいかなる化合物
であってもよい。好ましくは、リガンドは二糖又はより
高級な多糖のような多糖類を含み、好ましくは、最適の
結合能のためのガラクトース成分を含有する。
のオリゴ糖結合部位に特異的に結合するいかなる化合物
であってもよい。好ましくは、リガンドは二糖又はより
高級な多糖のような多糖類を含み、好ましくは、最適の
結合能のためのガラクトース成分を含有する。
【００１１】プローブを与えるリガンドと担体との間の
共有結合はいかなる通常の方法によっても形成すること
ができる。そのほとんどが公知であり、市販されてい
る、いかなる好適なヘテロ二官能性架橋剤をも用いるこ
とができる。場合によっては、複合体を引き続いて使用
する間担体に結合したままにしてもよいが、架橋剤は、
選択された条件又は試薬を施して、リガンド−レクチン
複合体が形成された後に担体から分離せしめる場合は開
裂可能でなければならない。或は、担体及びリガンドの
一方又は両方を改質して、他方と反応してリガンドと担
体との間の共有結合を形成しうる官能基を包含せしめ、
別個の架橋剤を用いる必要性を除去する。リガンドが共
有結合している担体からのリガンドの開裂可能性を与え
る成分は、レクチン自身の内部ジスルフィド結合基がそ
れほど速やかに開裂しないような選択された条件下で還
元することによって好適に開裂することができるジスル
フィド基、アミノリシスによって開裂することができる
チオエーテル基、好ましくはジチオナイトによって還元
することによって開裂することができるアゾ基、約３６
０ｎｍの波長の光によって開裂することができるオルト
−ニトロベンジルエステル又はオルト−ニトロベンジル
カルバメート、過ヨウ素酸エステル（又は塩）で酸化す
ることによって開裂することができるビシナルのグリコ
ール基などの形態をとってよい。
共有結合はいかなる通常の方法によっても形成すること
ができる。そのほとんどが公知であり、市販されてい
る、いかなる好適なヘテロ二官能性架橋剤をも用いるこ
とができる。場合によっては、複合体を引き続いて使用
する間担体に結合したままにしてもよいが、架橋剤は、
選択された条件又は試薬を施して、リガンド−レクチン
複合体が形成された後に担体から分離せしめる場合は開
裂可能でなければならない。或は、担体及びリガンドの
一方又は両方を改質して、他方と反応してリガンドと担
体との間の共有結合を形成しうる官能基を包含せしめ、
別個の架橋剤を用いる必要性を除去する。リガンドが共
有結合している担体からのリガンドの開裂可能性を与え
る成分は、レクチン自身の内部ジスルフィド結合基がそ
れほど速やかに開裂しないような選択された条件下で還
元することによって好適に開裂することができるジスル
フィド基、アミノリシスによって開裂することができる
チオエーテル基、好ましくはジチオナイトによって還元
することによって開裂することができるアゾ基、約３６
０ｎｍの波長の光によって開裂することができるオルト
−ニトロベンジルエステル又はオルト−ニトロベンジル
カルバメート、過ヨウ素酸エステル（又は塩）で酸化す
ることによって開裂することができるビシナルのグリコ
ール基などの形態をとってよい。
【００１２】同様に、リガンドとレクチンとの間の共有
結合は、例えば、適当な架橋剤を用いることによって蛋
白質又はポリペプチド類を他の化合物又は基に結合せし
める通常の化学的な方法によって形成することができ
る。
結合は、例えば、適当な架橋剤を用いることによって蛋
白質又はポリペプチド類を他の化合物又は基に結合せし
める通常の化学的な方法によって形成することができ
る。
【００１３】リガンドと担体との共有結合並びにリガン
ドとレクチンとの共有結合は、所望により２以上の連続
工程においてそれぞれ形成することができる。例えば、
２−ピリジルジチオプロピオン酸をアミノエチル−ポリ
アクリルアミドのような担体と反応させて２−ピリジル
ジチオ基が結合せしめられた担体を得ることができる。
二糖類成分を含むリガンドは、ラクトースを変性してＮ
−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミンを形成して
から担体上の２−ピリジル基をジスルフィド交換によっ
て置換し、ラクトアミンのアミン残基を次に官能基とし
て用いることにより、レクチンとの共有結合を形成する
ことができる。これは、２，４−ジクロロ−６−メトキ
シトリアジンのような、一方の塩素原子の反応性がｐＨ
８において大である二官能性の架橋剤を用いることによ
って達成することができ、反応は数分で完了する。残り
の塩素原子はより緩やかに、ｐＨ８．５以上において２
４時間を要してアミノ基と反応する。この架橋剤は、ま
ずｐＨ８でラクトアミンのアミノ残基と反応せしめ、次
いでレクチンをラクトアミンのガラクトース成分に特異
的に結合せしめることによって正しく配置してから、よ
り高いｐＨでレクチンのアミノ基と反応せしめられる。
ドとレクチンとの共有結合は、所望により２以上の連続
工程においてそれぞれ形成することができる。例えば、
２−ピリジルジチオプロピオン酸をアミノエチル−ポリ
アクリルアミドのような担体と反応させて２−ピリジル
ジチオ基が結合せしめられた担体を得ることができる。
二糖類成分を含むリガンドは、ラクトースを変性してＮ
−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミンを形成して
から担体上の２−ピリジル基をジスルフィド交換によっ
て置換し、ラクトアミンのアミン残基を次に官能基とし
て用いることにより、レクチンとの共有結合を形成する
ことができる。これは、２，４−ジクロロ−６−メトキ
シトリアジンのような、一方の塩素原子の反応性がｐＨ
８において大である二官能性の架橋剤を用いることによ
って達成することができ、反応は数分で完了する。残り
の塩素原子はより緩やかに、ｐＨ８．５以上において２
４時間を要してアミノ基と反応する。この架橋剤は、ま
ずｐＨ８でラクトアミンのアミノ残基と反応せしめ、次
いでレクチンをラクトアミンのガラクトース成分に特異
的に結合せしめることによって正しく配置してから、よ
り高いｐＨでレクチンのアミノ基と反応せしめられる。
【００１４】この第２の架橋剤は、リガンドがレクチン
に永久的に結合した状態にあって後者のオリゴ糖結合部
位をブロックしていることが望ましいので、開裂性であ
る必要はない。他の実施態様においては、リガンド自体
を、レクチンに反応性の官能基を有するように化学的に
変性してそれらの間の共有結合を形成することができ
る。
に永久的に結合した状態にあって後者のオリゴ糖結合部
位をブロックしていることが望ましいので、開裂性であ
る必要はない。他の実施態様においては、リガンド自体
を、レクチンに反応性の官能基を有するように化学的に
変性してそれらの間の共有結合を形成することができ
る。
【００１５】リガンド自体が２つの官能基を有するよう
に改質される場合、一方の官能基は担体と共有結合を形
成することができ、他方はレクチンと共有結合を形成す
ることができる。２つの官能基は、反応性又は反応条件
を異にして、リガンドがある一連の条件下では担体に結
合し、また他の一連の条件下ではレクチンに結合するよ
うにすることが好ましい。この場合、リガンド自体が、
レクチンのオリゴ糖結合部位に特異的に結合し得る二糖
又は多糖類を含むヘテロ二官能性架橋剤とみなされる。
リガンド中に包含せしめられる２つの官能基は従来のヘ
テロ二官能性架橋剤中に存在するものと同様のものであ
ってよい。
に改質される場合、一方の官能基は担体と共有結合を形
成することができ、他方はレクチンと共有結合を形成す
ることができる。２つの官能基は、反応性又は反応条件
を異にして、リガンドがある一連の条件下では担体に結
合し、また他の一連の条件下ではレクチンに結合するよ
うにすることが好ましい。この場合、リガンド自体が、
レクチンのオリゴ糖結合部位に特異的に結合し得る二糖
又は多糖類を含むヘテロ二官能性架橋剤とみなされる。
リガンド中に包含せしめられる２つの官能基は従来のヘ
テロ二官能性架橋剤中に存在するものと同様のものであ
ってよい。
【００１６】リガンドを固体担体に結合せしめてプロー
ブを形成し、レクチンを特異的結合によってプローブ上
に配備してからリガンド−レクチン複合体を形成した
後、所望により、従来の操作によってリガンド−担体結
合の開裂により、担体から分離させてもよい。
ブを形成し、レクチンを特異的結合によってプローブ上
に配備してからリガンド−レクチン複合体を形成した
後、所望により、従来の操作によってリガンド−担体結
合の開裂により、担体から分離させてもよい。
【００１７】上記複合体は、遊離状であるか又は固体担
体に結合したままであり、リガンドによってブロックさ
れたオリゴ糖結合部位を有しているため、結果的に細胞
に対して非特異的又は非選択的結合を示すことはなくな
り、非特異的毒性の大部分を失う。次に、特定の細胞に
対して特異的な免疫学的結合能を示す選択されたモノク
ローナル抗体に共有結合させることによって複合体を、
攻撃すべき所望の特定の細胞に対して特異性を示すよう
に処理することができる。複合体のモノクローナル抗体
への共有結合は、Thorpe等のloc. cit. に記載されるも
のをはじめとする従来の操作又は架橋剤を用いて担体か
ら分離又は開裂せしめる前又は後に行うことができる。
体に結合したままであり、リガンドによってブロックさ
れたオリゴ糖結合部位を有しているため、結果的に細胞
に対して非特異的又は非選択的結合を示すことはなくな
り、非特異的毒性の大部分を失う。次に、特定の細胞に
対して特異的な免疫学的結合能を示す選択されたモノク
ローナル抗体に共有結合させることによって複合体を、
攻撃すべき所望の特定の細胞に対して特異性を示すよう
に処理することができる。複合体のモノクローナル抗体
への共有結合は、Thorpe等のloc. cit. に記載されるも
のをはじめとする従来の操作又は架橋剤を用いて担体か
ら分離又は開裂せしめる前又は後に行うことができる。
【００１８】好ましい実施態様において、実施例１に示
すように、複合体を、還元によって開裂し得るジスルフ
ィド基を介し、担体にリガンドによって結合せしめるこ
とができる。次に、リガンド上に残されたチオール残基
を官能基として用いてモノクローナル抗体との共有結合
を形成する。この目的のためには、チオール基とアミノ
基又はモノクローナル抗体のその他の基と結合し得る好
適な二官能性架橋剤であればいかなるものを用いてもよ
い。好ましくは、チオール基と反応して共有結合を形成
する官能基をモノクローナル抗体に導入して複合体の官
能基と直接反応し得るようにする。例えば、複合体上の
官能基がチオールの場合、モノクローナル抗体をスクシ
ンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のような試薬と
反応させて抗体上にマレイミド基を存在せしめてもよ
い。
すように、複合体を、還元によって開裂し得るジスルフ
ィド基を介し、担体にリガンドによって結合せしめるこ
とができる。次に、リガンド上に残されたチオール残基
を官能基として用いてモノクローナル抗体との共有結合
を形成する。この目的のためには、チオール基とアミノ
基又はモノクローナル抗体のその他の基と結合し得る好
適な二官能性架橋剤であればいかなるものを用いてもよ
い。好ましくは、チオール基と反応して共有結合を形成
する官能基をモノクローナル抗体に導入して複合体の官
能基と直接反応し得るようにする。例えば、複合体上の
官能基がチオールの場合、モノクローナル抗体をスクシ
ンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のような試薬と
反応させて抗体上にマレイミド基を存在せしめてもよ
い。
【００１９】他の好ましい実施態様においては、実施例
２に示すように、リガンド（並びに得られるレクチン−
リガンド複合体）は輻射線によって開裂し得るオルト−
ニトロベンジルカルバメートである光開裂性基を介して
担体に結合せしめられ、二官能性架橋試薬を用いてレク
チンとリガンド−担体プローブのリガンドとの間に輻射
線に対して安定な共有結合が形成される。
２に示すように、リガンド（並びに得られるレクチン−
リガンド複合体）は輻射線によって開裂し得るオルト−
ニトロベンジルカルバメートである光開裂性基を介して
担体に結合せしめられ、二官能性架橋試薬を用いてレク
チンとリガンド−担体プローブのリガンドとの間に輻射
線に対して安定な共有結合が形成される。
【００２０】また更なる好ましい実施態様においては、
実施例３に示すように、リガンドはジチオナイトナトリ
ウムによって優先的還元により開裂し得るアゾ基を介し
て担体に結合せしめられる一方、レクチン−リガンド共
有結合は、かかる還元に対して不活性な結合を形成する
二官能性架橋剤によって形成される。
実施例３に示すように、リガンドはジチオナイトナトリ
ウムによって優先的還元により開裂し得るアゾ基を介し
て担体に結合せしめられる一方、レクチン−リガンド共
有結合は、かかる還元に対して不活性な結合を形成する
二官能性架橋剤によって形成される。
【００２１】下記の特定の実施例は本発明の方法をより
詳細に説明するためのものであって、本発明の範囲を制
限するものではない。
詳細に説明するためのものであって、本発明の範囲を制
限するものではない。
【００２２】
【実施例】例１ 改質担体の調製 Inman の Methods Enzymology ３４，３０〜５８頁（１
９７４年）に記載のように、固体ビーズの形態のアミノ
エチルポリアクリルアミドＰ−１５０（Ｂ10−Rad 製）
を、塩化アンモニウム水溶液中の水溶性カルボジイミド
と反応させることによって処理し、すべての残留カルボ
キシル基をキャップした。ビーズを次に、ピリジルジチ
オ基によって官能化せしめることにより図１の右上部に
既述した反応によって示されるように、ジスルフィド連
結基を介したリガンドの付着位置を与えた。この目的の
ために、カルボキシ−キャップト−アミノエチルポリア
クリルアミド３（充填ビーズ３０ｍｌ）懸濁液及び０．
１Ｍ塩化ナトリウム溶液１０ｍｌに、ジメチルホルムア
ミド１０ｍｌ及び水１ｍｌ中の２−ピリジルジチオプロ
ピオン酸（Ｐy −Ｓ−Ｓ−Ｃ2 Ｈ4 −ＣＯ2 Ｈ）０．０
１ｇ（５ミリモル）を加えた。希釈した塩酸を加えて混
合物のｐＨを４．７に調整し、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリ
ド（ＥＤＣ・ＨＣｌ）１．１５ｇ（６ミリモル）を含有
する水５ｍｌの懸濁液と混合した。室温で７時間撹拌し
た後、更にカルボジイミド０．７６６ｇ（４ミリモル）
を加え、混合物のｐＨを塩酸で４．７に再調整した。室
温で４日間振盪後、懸濁液から液体を除去し、改質ゲル
ビーズ４を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で長時間にわた
って洗浄した。過剰の２−ピリジルジチオプロピオン酸
を確実に完全に除去するために、懸濁液を０．１Ｍ塩酸
で酸性化し、酢酸エチル５ｍｌで抽出した。ビーズ４
を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で
洗浄した。過剰のジチオエリトリトールで処理した場合
は、洗浄は、洗浄溶液の一部が非常に低い濃度の２−ピ
リジンチオンを示し、３４３ｎｍにおいて０．１ａ．
ｕ．未満の吸光度を示すまで続けた。
９７４年）に記載のように、固体ビーズの形態のアミノ
エチルポリアクリルアミドＰ−１５０（Ｂ10−Rad 製）
を、塩化アンモニウム水溶液中の水溶性カルボジイミド
と反応させることによって処理し、すべての残留カルボ
キシル基をキャップした。ビーズを次に、ピリジルジチ
オ基によって官能化せしめることにより図１の右上部に
既述した反応によって示されるように、ジスルフィド連
結基を介したリガンドの付着位置を与えた。この目的の
ために、カルボキシ−キャップト−アミノエチルポリア
クリルアミド３（充填ビーズ３０ｍｌ）懸濁液及び０．
１Ｍ塩化ナトリウム溶液１０ｍｌに、ジメチルホルムア
ミド１０ｍｌ及び水１ｍｌ中の２−ピリジルジチオプロ
ピオン酸（Ｐy −Ｓ−Ｓ−Ｃ2 Ｈ4 −ＣＯ2 Ｈ）０．０
１ｇ（５ミリモル）を加えた。希釈した塩酸を加えて混
合物のｐＨを４．７に調整し、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリ
ド（ＥＤＣ・ＨＣｌ）１．１５ｇ（６ミリモル）を含有
する水５ｍｌの懸濁液と混合した。室温で７時間撹拌し
た後、更にカルボジイミド０．７６６ｇ（４ミリモル）
を加え、混合物のｐＨを塩酸で４．７に再調整した。室
温で４日間振盪後、懸濁液から液体を除去し、改質ゲル
ビーズ４を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で長時間にわた
って洗浄した。過剰の２−ピリジルジチオプロピオン酸
を確実に完全に除去するために、懸濁液を０．１Ｍ塩酸
で酸性化し、酢酸エチル５ｍｌで抽出した。ビーズ４
を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で
洗浄した。過剰のジチオエリトリトールで処理した場合
は、洗浄は、洗浄溶液の一部が非常に低い濃度の２−ピ
リジンチオンを示し、３４３ｎｍにおいて０．１ａ．
ｕ．未満の吸光度を示すまで続けた。
【００２３】変性ビーズ４のカラムにおけるジチオピリ
ジル基の表面濃度を、該ビーズの試料を、過剰の、１０
０ｍＭの重炭酸ナトリウム溶液中のジチオエリトリトー
ル（ＤＴＥ）と、室温で３０分間反応させることによっ
て測定した。ビーズを次に０．２ｍＭ塩化ナトリウム溶
液で繰り返し洗浄し、３４３ｎｍにおける吸光度によっ
て測定した洗浄液中の２−ピリジンチオンの量［T. Stu
chbury等のBiochem. J. 、１５１巻、４１７〜４３２頁
（１９７５年）］が充填ビーズ１ｍｌあたり３８マイク
ロモルの濃度に相当することが認められた。
ジル基の表面濃度を、該ビーズの試料を、過剰の、１０
０ｍＭの重炭酸ナトリウム溶液中のジチオエリトリトー
ル（ＤＴＥ）と、室温で３０分間反応させることによっ
て測定した。ビーズを次に０．２ｍＭ塩化ナトリウム溶
液で繰り返し洗浄し、３４３ｎｍにおける吸光度によっ
て測定した洗浄液中の２−ピリジンチオンの量［T. Stu
chbury等のBiochem. J. 、１５１巻、４１７〜４３２頁
（１９７５年）］が充填ビーズ１ｍｌあたり３８マイク
ロモルの濃度に相当することが認められた。
【００２４】２−ピリジルジチオ含有ポリマービーズ４
上に存在する全ての過剰アミノ基をキャップするため
に、ビーズ（２７ｍｌ）を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム
溶液５０ｍｌ中に懸濁させ、これに室温でクロロギ酸メ
チル４．８ｇ（５．２ミリモル）を加えた。５分後、過
剰のクロロギ酸エステルを、酢酸エチル２０ｍｌで抽出
することによって除去し、改質ゲルビーズをｐＨ７．０
の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。
上に存在する全ての過剰アミノ基をキャップするため
に、ビーズ（２７ｍｌ）を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム
溶液５０ｍｌ中に懸濁させ、これに室温でクロロギ酸メ
チル４．８ｇ（５．２ミリモル）を加えた。５分後、過
剰のクロロギ酸エステルを、酢酸エチル２０ｍｌで抽出
することによって除去し、改質ゲルビーズをｐＨ７．０
の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。
【００２５】リガンドの調製 図１の左上部に示したようにリガンドを製造した。水３
６ｍｌ中にα−ラクトース一水和物１ ９．７２ｇ（１
３．５ミリモル）を溶解した。上記溶液に、シスタミン
二酢酸塩３．６８ｇ（１３．５ミリモル）を、メタノー
ル７２ｍｌ中のナトリウムシアノボロヒドリド１．７０
ｇ（２７．０ミリモル）溶液と共に加えた。混合物のｐ
Ｈを酢酸で６．２に調整した後、溶液を室温で３６時間
撹拌し、その間メタノールを蒸発によって除去し、残留
水溶液のｐＨを酢酸で５．０に調整し、溶液を、ｐＨ
５．０の２ｍＭ酢酸ピリジニウム緩衝液中で平衡化した
カルボキシメチルセルロースの３６０ｍｌカラムに通し
た。２倍の容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、
結合物質を０．１Ｍアンモニア水溶液で溶出した。溶出
物を含有する溶液を蒸発乾固し、固形分を水２００ｍｌ
中に再溶解し、室温でジチオエリトリトール（ＤＴＥ）
２．０ｇ（１３．５ミリモル）を加えた。１時間静置
後、Ｎ−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミン２及
びシステアミンの混合物を含有する得られた溶液を、１
ｍＭのＤＴＥを含有するｐＨ７の１０ｍＭ重炭酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液中のカルボキシメチルセルロー
スの３７０ｍｌカラムに通した。カラムを同じ緩衝液５
００ｍｌで洗浄し、次に、１ｍＭのＤＴＥを含有するｐ
Ｈ７の１０〜１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム
の直線勾配（１リットル＋１リットル）の溶液で展開し
た。水からの蒸発及び凍結乾燥を繰り返すことによっ
て、Ｎ−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミンリガ
ンド２ ３．８５ｇ（理論量の３５％）が白色の粉末と
して得られた。
６ｍｌ中にα−ラクトース一水和物１ ９．７２ｇ（１
３．５ミリモル）を溶解した。上記溶液に、シスタミン
二酢酸塩３．６８ｇ（１３．５ミリモル）を、メタノー
ル７２ｍｌ中のナトリウムシアノボロヒドリド１．７０
ｇ（２７．０ミリモル）溶液と共に加えた。混合物のｐ
Ｈを酢酸で６．２に調整した後、溶液を室温で３６時間
撹拌し、その間メタノールを蒸発によって除去し、残留
水溶液のｐＨを酢酸で５．０に調整し、溶液を、ｐＨ
５．０の２ｍＭ酢酸ピリジニウム緩衝液中で平衡化した
カルボキシメチルセルロースの３６０ｍｌカラムに通し
た。２倍の容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、
結合物質を０．１Ｍアンモニア水溶液で溶出した。溶出
物を含有する溶液を蒸発乾固し、固形分を水２００ｍｌ
中に再溶解し、室温でジチオエリトリトール（ＤＴＥ）
２．０ｇ（１３．５ミリモル）を加えた。１時間静置
後、Ｎ−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミン２及
びシステアミンの混合物を含有する得られた溶液を、１
ｍＭのＤＴＥを含有するｐＨ７の１０ｍＭ重炭酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液中のカルボキシメチルセルロー
スの３７０ｍｌカラムに通した。カラムを同じ緩衝液５
００ｍｌで洗浄し、次に、１ｍＭのＤＴＥを含有するｐ
Ｈ７の１０〜１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム
の直線勾配（１リットル＋１リットル）の溶液で展開し
た。水からの蒸発及び凍結乾燥を繰り返すことによっ
て、Ｎ−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミンリガ
ンド２ ３．８５ｇ（理論量の３５％）が白色の粉末と
して得られた。
【００２６】上記記載のように製造され精製されたリガ
ンド２を用いる直前に、ｐＨ８の水１０ｍｌ中にリガン
ド１．５ｇ（３．７ミリモル）を溶解し、ＤＴＥ１５４
ｍｇ（１ミリモル）を加え、室温で１時間静置すること
によって、ラクトアミンの２分子間に形成されるすべて
の二量体を還元処理した。次に、ｐＨを酢酸で５．２に
低下させ、溶液をｐＨ５．２の２ｍＭ酢酸ピリジニウム
緩衝液中のカルボキシメチルセルロースの１００ｍｌカ
ラムに通した。すべてのＤＴＥが除去されるまで、カラ
ムを同じ緩衝液２００ｍｌで洗浄した。純粋なＮ−
（２’−メルカプトエチル）ラクトアミン２を、０．１
Ｍ塩酸で遊離チオールの形態に溶出せしめた。エルマン
試薬による分析の結果、溶液はチオール３．２ミリモル
（理論量の８５％）を含有することが認められた。
ンド２を用いる直前に、ｐＨ８の水１０ｍｌ中にリガン
ド１．５ｇ（３．７ミリモル）を溶解し、ＤＴＥ１５４
ｍｇ（１ミリモル）を加え、室温で１時間静置すること
によって、ラクトアミンの２分子間に形成されるすべて
の二量体を還元処理した。次に、ｐＨを酢酸で５．２に
低下させ、溶液をｐＨ５．２の２ｍＭ酢酸ピリジニウム
緩衝液中のカルボキシメチルセルロースの１００ｍｌカ
ラムに通した。すべてのＤＴＥが除去されるまで、カラ
ムを同じ緩衝液２００ｍｌで洗浄した。純粋なＮ−
（２’−メルカプトエチル）ラクトアミン２を、０．１
Ｍ塩酸で遊離チオールの形態に溶出せしめた。エルマン
試薬による分析の結果、溶液はチオール３．２ミリモル
（理論量の８５％）を含有することが認められた。
【００２７】リガンド−担体プローブの調製 ラクトアミンのｐＨ５の水溶液５０ｍｌ（３．２ｍモ
ル）を室温でゲルビーズ２７ｍｌに加えてｐＨ６．５の
懸濁液を生じ、これを室温において１５分間振盪し、次
いで０．２Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて逐次遠心分
離及びデカンテーション工程により繰り返し、次いで洗
液が２−ピリジンチオン副生物が実質的に全て３４３ｎ
ｍにおける吸光度の測定によって示される通りに除去さ
れたことを示すまで洗浄することによって、リガンド２
を予め調製したキャップト及び活性化ポリアクリルアミ
ドゲルビーズ４に共有結合させた。生成したビーズは、
ポリマービーズに共有結合させたリガンドを含有するプ
ローブ５の形で、３８ｍＭの表面ラクトース濃度を有し
ていた。
ル）を室温でゲルビーズ２７ｍｌに加えてｐＨ６．５の
懸濁液を生じ、これを室温において１５分間振盪し、次
いで０．２Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて逐次遠心分
離及びデカンテーション工程により繰り返し、次いで洗
液が２−ピリジンチオン副生物が実質的に全て３４３ｎ
ｍにおける吸光度の測定によって示される通りに除去さ
れたことを示すまで洗浄することによって、リガンド２
を予め調製したキャップト及び活性化ポリアクリルアミ
ドゲルビーズ４に共有結合させた。生成したビーズは、
ポリマービーズに共有結合させたリガンドを含有するプ
ローブ５の形で、３８ｍＭの表面ラクトース濃度を有し
ていた。
【００２８】リシンをリガンド−担体プローブ５に共有
結合させるために、１００ｍＭの重炭酸ナトリウムの溶
液１０ｍｌ中にプローブ１０ｍｌを含有する懸濁液に１
０ｍｌのジオキサン中にトリアジン試薬３６０ｍｇ（２
ｍモル）を含有する溶液を加えることによって、プロー
ブを二官能価架橋剤２，４−ジクロロ−６−メトキシト
リアジンで活性化した。懸濁液を１分間旋回させた後
に、ジエチルエーテル４ｍｌで抽出して過剰のトリアジ
ンを除き、活性化したプローブビーズ６に次いでｐＨ
７．０のリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍＭを平衡にさ
せてカラムに充填した。
結合させるために、１００ｍＭの重炭酸ナトリウムの溶
液１０ｍｌ中にプローブ１０ｍｌを含有する懸濁液に１
０ｍｌのジオキサン中にトリアジン試薬３６０ｍｇ（２
ｍモル）を含有する溶液を加えることによって、プロー
ブを二官能価架橋剤２，４−ジクロロ−６−メトキシト
リアジンで活性化した。懸濁液を１分間旋回させた後
に、ジエチルエーテル４ｍｌで抽出して過剰のトリアジ
ンを除き、活性化したプローブビーズ６に次いでｐＨ
７．０のリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍＭを平衡にさ
せてカラムに充填した。
【００２９】レクチン−リガンド−担体複合体の調製 ０．１５ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７の０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液中リシン２．１ｍｇ／ｍｌを含有
する溶液２．５ｍｌの形でリシンを活性化プローブカラ
ムに適用した。リシンとトリアジン架橋剤の第２官能価
塩素基との間の共有結合を形成するために、カラムを次
いでｐＨ８．６の５０ｍＭトリエタノールアミン塩酸塩
緩衝液の３カラム容積で洗浄した。室温においてｐＨ
８．６で２４時間静置した後に、共有結合したリシン−
リガンド複合体を形成しなかったリシンを全て除くため
に、カラムを３容積のｐＨ７の０．５Ｍガラクトース溶
液で洗浄した。
ン酸ナトリウム緩衝液中リシン２．１ｍｇ／ｍｌを含有
する溶液２．５ｍｌの形でリシンを活性化プローブカラ
ムに適用した。リシンとトリアジン架橋剤の第２官能価
塩素基との間の共有結合を形成するために、カラムを次
いでｐＨ８．６の５０ｍＭトリエタノールアミン塩酸塩
緩衝液の３カラム容積で洗浄した。室温においてｐＨ
８．６で２４時間静置した後に、共有結合したリシン−
リガンド複合体を形成しなかったリシンを全て除くため
に、カラムを３容積のｐＨ７の０．５Ｍガラクトース溶
液で洗浄した。
【００３０】レクチン−リガンド複合体の担体からの切
断 上述した通りにして調製した共有結合したリシン−リガ
ンド複合体を、リガンドとポリマーとの間のジスルフィ
ド基を開裂することによって担体から切断した。このジ
スルフィド基は、リシン自体のＡ−鎖及びＢ−鎖を結合
するジスルフィド基よりもｐＨ７の１０ｍＭのＤＴＥで
還元して一層容易に開裂或は切断されることがわかっ
た。ｐＨ値７〜８のＤＴＥを種々の濃度で調査したが、
リシン鎖の開裂が最小の最適の結果はＤＴＥ濃度１０ｍ
Ｍ、ｐＨ７．０で４５分間室温において得られ理論の３
６％の収量を生じた。このようにして得た遊離の複合体
はアシアロフェツインに結合せず、このことはリシンの
オリゴ糖結合部位がブロックされたことを立証する。
断 上述した通りにして調製した共有結合したリシン−リガ
ンド複合体を、リガンドとポリマーとの間のジスルフィ
ド基を開裂することによって担体から切断した。このジ
スルフィド基は、リシン自体のＡ−鎖及びＢ−鎖を結合
するジスルフィド基よりもｐＨ７の１０ｍＭのＤＴＥで
還元して一層容易に開裂或は切断されることがわかっ
た。ｐＨ値７〜８のＤＴＥを種々の濃度で調査したが、
リシン鎖の開裂が最小の最適の結果はＤＴＥ濃度１０ｍ
Ｍ、ｐＨ７．０で４５分間室温において得られ理論の３
６％の収量を生じた。このようにして得た遊離の複合体
はアシアロフェツインに結合せず、このことはリシンの
オリゴ糖結合部位がブロックされたことを立証する。
【００３１】上述した通りにして調製したリシン−リガ
ンド複合体をｐＨ６の１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液中のコンカナバリンＡ−セファローズのカラムで親
和（アフイニティ）精製した。複合体はリシン成分の炭
水化物鎖を経てコンカナバリンＡに結合し、これより汚
染物、特に共役反応を妨げる低分子量のチオールを無く
すことができる。リシン−リガンド複合体を、１Ｍのメ
チルα−Ｄ−マンノピラノシドを含有するｐＨ６の１０
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、リシン−リ
ガンド複合体１５０−２００μｇが存在する溶液１２ｍ
ｌを生じた。生成物の試験体により、Ａ鎖は網状赤血球
溶解物において天然のリシンから誘導されるＡ鎖と同じ
程度にまでタンパク質合成を抑制することが示された。
この物質が所望の方法で改質されたことは、固定化アシ
アロフェツインのカラムを通過することによって確認さ
れ、およそ０．１μＭのリシンについて会合定数を有す
ることが示された。この基準により、リシン結合部位は
ブロックされていると考えた。
ンド複合体をｐＨ６の１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液中のコンカナバリンＡ−セファローズのカラムで親
和（アフイニティ）精製した。複合体はリシン成分の炭
水化物鎖を経てコンカナバリンＡに結合し、これより汚
染物、特に共役反応を妨げる低分子量のチオールを無く
すことができる。リシン−リガンド複合体を、１Ｍのメ
チルα−Ｄ−マンノピラノシドを含有するｐＨ６の１０
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、リシン−リ
ガンド複合体１５０−２００μｇが存在する溶液１２ｍ
ｌを生じた。生成物の試験体により、Ａ鎖は網状赤血球
溶解物において天然のリシンから誘導されるＡ鎖と同じ
程度にまでタンパク質合成を抑制することが示された。
この物質が所望の方法で改質されたことは、固定化アシ
アロフェツインのカラムを通過することによって確認さ
れ、およそ０．１μＭのリシンについて会合定数を有す
ることが示された。この基準により、リシン結合部位は
ブロックされていると考えた。
【００３２】レクチン−リガンド複合体のモノクローナ
ル抗体への共有結合 リシン−リガンド複合体に選択細胞に対する所望の特異
性を付与するために、該複合体をフロリダ、ハイアリア
在コウルターインコーポレーテッドから市販されている
ネズミ(murine)モノクローナル抗−ＣＡＬＬＡ抗体Ｊ５
に結合させた。複合のために、ランバート(Lambert)
等、J. Biol. Chem.２６０巻、１２０３５−１２０４１
（１９８５）に記載されている通りにしてＪ５を精製
し、次いでＳＭＣＣで改質した。
ル抗体への共有結合 リシン−リガンド複合体に選択細胞に対する所望の特異
性を付与するために、該複合体をフロリダ、ハイアリア
在コウルターインコーポレーテッドから市販されている
ネズミ(murine)モノクローナル抗−ＣＡＬＬＡ抗体Ｊ５
に結合させた。複合のために、ランバート(Lambert)
等、J. Biol. Chem.２６０巻、１２０３５−１２０４１
（１９８５）に記載されている通りにしてＪ５を精製
し、次いでＳＭＣＣで改質した。
【００３３】上述した通りのリシン−リガンド複合体の
溶液を次いでｐＨ７の緩衝液中の精製し及び改質したＪ
５抗体と混合し及び４℃において１時間静置させた。１
時間した後に、反応混合物がモノクローナル抗体とリシ
ン−リガンド複合体との間の共有結合した結合体、並び
に過剰のモノクローナル抗体及びいくらかの未反応のリ
シン−リガンド複合体を含有することがＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって示された。次いで、反応混合物にｐＨ７．０
のリン酸ナトリウム緩衝液中のプロテインＡ−セファロ
ーズにより親和精製を行ない、未反応のリシン−リガン
ド複合体を除いた。この工程はまた初めの方で導入した
メチルα−Ｄ−マンノピラノシドを除去し、それにより
コンカナバリンＡ−セファローズのカラムをそれ以上の
精製工程として用いることを可能にした。プロテインＡ
−セファローズカラムから溶出した物質は結合体及び過
剰のモノクローナル抗体を含み、これを次いでコンカナ
バリンＡ−セファローズに適用し、そこで前の通りにし
て結合体をリシン−リガンド複合体の炭水化物鎖を通し
て結合させた。過剰のモノクローナル抗体を次いで広範
囲の洗浄によって除き及び結合した結合体をｐＨ７．０
の１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の１Ｍのメチ
ルα−Ｄマンノピラノシドで溶出した。
溶液を次いでｐＨ７の緩衝液中の精製し及び改質したＪ
５抗体と混合し及び４℃において１時間静置させた。１
時間した後に、反応混合物がモノクローナル抗体とリシ
ン−リガンド複合体との間の共有結合した結合体、並び
に過剰のモノクローナル抗体及びいくらかの未反応のリ
シン−リガンド複合体を含有することがＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって示された。次いで、反応混合物にｐＨ７．０
のリン酸ナトリウム緩衝液中のプロテインＡ−セファロ
ーズにより親和精製を行ない、未反応のリシン−リガン
ド複合体を除いた。この工程はまた初めの方で導入した
メチルα−Ｄ−マンノピラノシドを除去し、それにより
コンカナバリンＡ−セファローズのカラムをそれ以上の
精製工程として用いることを可能にした。プロテインＡ
−セファローズカラムから溶出した物質は結合体及び過
剰のモノクローナル抗体を含み、これを次いでコンカナ
バリンＡ−セファローズに適用し、そこで前の通りにし
て結合体をリシン−リガンド複合体の炭水化物鎖を通し
て結合させた。過剰のモノクローナル抗体を次いで広範
囲の洗浄によって除き及び結合した結合体をｐＨ７．０
の１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の１Ｍのメチ
ルα−Ｄマンノピラノシドで溶出した。
【００３４】ナマルワ(Namalwa) 細胞、平均で１細胞当
り６０，０００ＣＡＬＬＡ及びリシンについて６００，
０００より多い結合部位を表わすバーキットの(Burkit
t's)リンパ腫系統を用いて、リシン−リガンド複合体及
びモノクローナル抗体に結合した複合体の両方の細胞毒
性を試験した。リシン−リガンド複合体は天然リシンに
比べて約１０倍毒性が低いことがわかった。この非特異
性毒性の減少は、Ａ鎖が複合体から遊離させた際に十分
に活性であることが示された（上記を参照）通りに、Ｂ
鎖上の結合部位のブロッキングによる。リシン−リガン
ド複合体をＪ５に結合した場合に、その毒性はＣＡＬＬ
Ａを表わす標的細胞について３倍増大し及びその毒性は
ＣＡＬＬＡの無い非標的細胞について５倍減小した。最
も有意には、結合体の毒性は、飽和量のＪ５を加えるこ
とによって３倍低下され、明らかに抗体が改質された毒
素にある程度の特異性を授与することを示す。
り６０，０００ＣＡＬＬＡ及びリシンについて６００，
０００より多い結合部位を表わすバーキットの(Burkit
t's)リンパ腫系統を用いて、リシン−リガンド複合体及
びモノクローナル抗体に結合した複合体の両方の細胞毒
性を試験した。リシン−リガンド複合体は天然リシンに
比べて約１０倍毒性が低いことがわかった。この非特異
性毒性の減少は、Ａ鎖が複合体から遊離させた際に十分
に活性であることが示された（上記を参照）通りに、Ｂ
鎖上の結合部位のブロッキングによる。リシン−リガン
ド複合体をＪ５に結合した場合に、その毒性はＣＡＬＬ
Ａを表わす標的細胞について３倍増大し及びその毒性は
ＣＡＬＬＡの無い非標的細胞について５倍減小した。最
も有意には、結合体の毒性は、飽和量のＪ５を加えるこ
とによって３倍低下され、明らかに抗体が改質された毒
素にある程度の特異性を授与することを示す。
【００３５】例２ この例のプローブ製造のための反応式を図２に示した。改質担体の調製 例１に記載したようにして製造したカルボキシキャップ
トアミノエチルポリアクリルアミドＰ−１５０ ３（パ
ックトビーズ２６ｍｌ）の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中
の懸濁液（１３ｍｌ）に、ジオキサン（６ｍｌ）中の１
−（５−マレイミドメチル−２−ニトロフェニル）−エ
チルクロロホルメート７（１．０２ｇ、３．４８ミリモ
ル）を添加した。５分間激しく振盪した後に、あらゆる
過剰のアミノ基をキャップするためにメチルクロロホル
メート（５ｍｌ）を添加し、さらに５分間振盪を続け
た。次いで濾過によって改質ポリアクリルアミドゲルビ
ーズ８を回収し、これをｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液とジメチルホルムアミドとの混合物（１：１、
容量／容量）及びジメチルホルムアミドで連続的に洗浄
し、そして次いで同じ溶液で逆の順に洗浄した。
トアミノエチルポリアクリルアミドＰ−１５０ ３（パ
ックトビーズ２６ｍｌ）の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中
の懸濁液（１３ｍｌ）に、ジオキサン（６ｍｌ）中の１
−（５−マレイミドメチル−２−ニトロフェニル）−エ
チルクロロホルメート７（１．０２ｇ、３．４８ミリモ
ル）を添加した。５分間激しく振盪した後に、あらゆる
過剰のアミノ基をキャップするためにメチルクロロホル
メート（５ｍｌ）を添加し、さらに５分間振盪を続け
た。次いで濾過によって改質ポリアクリルアミドゲルビ
ーズ８を回収し、これをｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液とジメチルホルムアミドとの混合物（１：１、
容量／容量）及びジメチルホルムアミドで連続的に洗浄
し、そして次いで同じ溶液で逆の順に洗浄した。
【００３６】リガンド−担体プローブの調製 改質ポリアクリルアミドビーズ８（パックトビーズ２４
ｍｌ）をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（１０ｍｌ）中に懸濁させ、例１に記載したようにして
製造したリガンドＮ−（２’−メルカプトエチル）ラク
トアミン２（７００ｍｇ、１．７４ミリモル）のｐＨ
７．０の水溶液で処理した。この混合物を終夜振盪し、
次いでブフナー漏斗上で濾過することによって、ポリマ
ービーズに共有結合したリガンドを含有するプローブ９
を回収し、これをｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液
で充分に洗浄した。リガンド−担体プローブ９の試料
（０．３ｍｌ）を用いて小さいカラムを製造し、そして
リシンについてのプローブビーズの特異的な結合能力を
測定した。ｐＨ７．０においてプローブビーズ１ｍｌが
特異的態様で１．０ｍｇ過剰のリシンに結合したことが
わかった。特異的に結合したリシン全部をラクトース
０．２Ｍを含有する緩衝液で溶離させることができた。
ｍｌ）をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（１０ｍｌ）中に懸濁させ、例１に記載したようにして
製造したリガンドＮ−（２’−メルカプトエチル）ラク
トアミン２（７００ｍｇ、１．７４ミリモル）のｐＨ
７．０の水溶液で処理した。この混合物を終夜振盪し、
次いでブフナー漏斗上で濾過することによって、ポリマ
ービーズに共有結合したリガンドを含有するプローブ９
を回収し、これをｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液
で充分に洗浄した。リガンド−担体プローブ９の試料
（０．３ｍｌ）を用いて小さいカラムを製造し、そして
リシンについてのプローブビーズの特異的な結合能力を
測定した。ｐＨ７．０においてプローブビーズ１ｍｌが
特異的態様で１．０ｍｇ過剰のリシンに結合したことが
わかった。特異的に結合したリシン全部をラクトース
０．２Ｍを含有する緩衝液で溶離させることができた。
【００３７】プローブビーズ９のカラムを二官能価架橋
剤２，４−ジクロロ−６−メトキシ−トリアジンを用い
て以下の方法で賦活した。０．１Ｍ重炭酸ナトリウム
（１０ｍｌ）中のラクトースリガンド含有ポリアクリル
アミドビーズ（１０ｍｌ）の懸濁液に、ジオキサン
（６．６ｍｌ）中の２，４−ジクロロ−６−メトキシト
リアジン（０．２４ｇ、１．３４ミリモル）の溶液を添
加した。この懸濁液を１分間激しく振盪し、次いでジエ
チルエーテルを用いた抽出（５ｍｌずつ３回）で過剰の
トリアジンを除去した。賦活されたプローブビーズ１０
を次いでｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
で平衡化し、カラム中に充填した。
剤２，４−ジクロロ−６−メトキシ−トリアジンを用い
て以下の方法で賦活した。０．１Ｍ重炭酸ナトリウム
（１０ｍｌ）中のラクトースリガンド含有ポリアクリル
アミドビーズ（１０ｍｌ）の懸濁液に、ジオキサン
（６．６ｍｌ）中の２，４−ジクロロ−６−メトキシト
リアジン（０．２４ｇ、１．３４ミリモル）の溶液を添
加した。この懸濁液を１分間激しく振盪し、次いでジエ
チルエーテルを用いた抽出（５ｍｌずつ３回）で過剰の
トリアジンを除去した。賦活されたプローブビーズ１０
を次いでｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
で平衡化し、カラム中に充填した。
【００３８】レクチン−リガンド−担体複合体の調製 リシンの溶液（塩化ナトリウム０．１５Ｍを含有するｐ
Ｈ７．０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５ｍｌ中
に１０ｍｇ）を賦活プローブカラムに２回通し、次いで
このカラムをカラム容積の３倍量のｐＨ８．６の０．０
５Ｍトリエタノールアミン塩酸塩で洗浄し、そして周囲
温度において２４時間放置した。結合はしているがしか
し共有架橋していないリシンを、ラクトース０．２Ｍを
含有するｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
で洗浄することによってビーズから除去した。
Ｈ７．０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５ｍｌ中
に１０ｍｇ）を賦活プローブカラムに２回通し、次いで
このカラムをカラム容積の３倍量のｐＨ８．６の０．０
５Ｍトリエタノールアミン塩酸塩で洗浄し、そして周囲
温度において２４時間放置した。結合はしているがしか
し共有架橋していないリシンを、ラクトース０．２Ｍを
含有するｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
で洗浄することによってビーズから除去した。
【００３９】レクチン−リガンド複合体の担体からの分
離 リガンドとの共有結合によって保持されたリシンを以下
の方法で光分解することによって担体ビーズから分離さ
せた。ビーズを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１０
ｍｌ）を用いてカラムからガラスペトリ皿に移し、ここ
で懸濁液を０．５ｃｍを越えない厚さの層に形成せしめ
た。次いでリガンドと担体との間の結合を開裂させるた
めにこの懸濁液を、黒線長波紫外線ランプ（Ｂ−１００
Ａ型、ウルトラバイオレット・プロダクツ社、カリフォ
ルニア州、サンガブリエル、放射ピーク３６５ｎｍ、１
５ｃｍにおける強度約１．１ｍＷ／ｃｍ2 ）から１５ｃ
ｍの距離で１０分間照射した。照射した懸濁液をカラム
に注ぎ戻し、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液でビーズを充分に洗浄した。担体から分離されたリ
シン−リガンド複合体を含有する一緒にした洗浄液（５
０ｍｌ）を、存在し得る痕跡量のリシン不純物を除去す
るために asialofetuin-TSK （２ｍｌ、リシンについて
の結合能力４ｍｇ／ｍｌ）のカラムに通した。最終溶液
を限外濾過（ＹＭ−１０半透膜、アミコン社、マサチュ
ーセッツ州、ダンバース）によって２ｍｌまで濃縮し、
次いで塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）とＥＤＴＡ（１ｍ
Ｍ）とを含有するｐＨ８．０の０．０５Ｍトリエタノー
ルアミン塩酸塩緩衝液中で平衡化させたバイオゲルＰ−
６の小さいカラムに通して、緩衝液２．８ｍｌ中の純粋
なリシン−リガンド複合体１．２ｍｇが得られた。
離 リガンドとの共有結合によって保持されたリシンを以下
の方法で光分解することによって担体ビーズから分離さ
せた。ビーズを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１０
ｍｌ）を用いてカラムからガラスペトリ皿に移し、ここ
で懸濁液を０．５ｃｍを越えない厚さの層に形成せしめ
た。次いでリガンドと担体との間の結合を開裂させるた
めにこの懸濁液を、黒線長波紫外線ランプ（Ｂ−１００
Ａ型、ウルトラバイオレット・プロダクツ社、カリフォ
ルニア州、サンガブリエル、放射ピーク３６５ｎｍ、１
５ｃｍにおける強度約１．１ｍＷ／ｃｍ2 ）から１５ｃ
ｍの距離で１０分間照射した。照射した懸濁液をカラム
に注ぎ戻し、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液でビーズを充分に洗浄した。担体から分離されたリ
シン−リガンド複合体を含有する一緒にした洗浄液（５
０ｍｌ）を、存在し得る痕跡量のリシン不純物を除去す
るために asialofetuin-TSK （２ｍｌ、リシンについて
の結合能力４ｍｇ／ｍｌ）のカラムに通した。最終溶液
を限外濾過（ＹＭ−１０半透膜、アミコン社、マサチュ
ーセッツ州、ダンバース）によって２ｍｌまで濃縮し、
次いで塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）とＥＤＴＡ（１ｍ
Ｍ）とを含有するｐＨ８．０の０．０５Ｍトリエタノー
ルアミン塩酸塩緩衝液中で平衡化させたバイオゲルＰ−
６の小さいカラムに通して、緩衝液２．８ｍｌ中の純粋
なリシン−リガンド複合体１．２ｍｇが得られた。
【００４０】モノクロナール抗体へのレクチン−リガン
ド複合体の共有結合 複合体を抗体Ｊ５に共有結合させるために、下記に詳細
に記載したようにして、ヘテロ二官能価架橋剤２−イミ
ノチオラン塩酸塩（ピース・ケミカル社、イリノイ州、
ロックホード）を用いて複合体中にスルフヒドリル基を
導入し、ヘテロ二官能価架橋剤スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣ）（ピース・ケミカル社、イリノ
イ州、ロックホード）を用いてモノクロナール抗体中に
マレイミド基を導入した。
ド複合体の共有結合 複合体を抗体Ｊ５に共有結合させるために、下記に詳細
に記載したようにして、ヘテロ二官能価架橋剤２−イミ
ノチオラン塩酸塩（ピース・ケミカル社、イリノイ州、
ロックホード）を用いて複合体中にスルフヒドリル基を
導入し、ヘテロ二官能価架橋剤スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣ）（ピース・ケミカル社、イリノ
イ州、ロックホード）を用いてモノクロナール抗体中に
マレイミド基を導入した。
【００４１】リシン−リガンド複合体の溶液（２．８ｍ
ｌ）を氷上で冷却し、ｐＨ８．０の０．５Ｍ２−イミノ
チオラン塩酸塩溶液（０．０４４ｍｌ）で処理して２−
イミノチオランの最終濃度を８ｍＭにした。塩化ナトリ
ウム（５０ｍＭ）とＥＤＴＡ（１ｍＭ）とを含有するｐ
Ｈ５．８の５ｍＭのビストリス−アセテート緩衝液で平
衡化させたバイオゲルＰ−６のカラムに通すゲル濾過に
よって氷上で９０分後に反応を停止させた。こうして、
リシン−リガンド複合体１分子につき平均０．８のチオ
ール基が導入された。
ｌ）を氷上で冷却し、ｐＨ８．０の０．５Ｍ２−イミノ
チオラン塩酸塩溶液（０．０４４ｍｌ）で処理して２−
イミノチオランの最終濃度を８ｍＭにした。塩化ナトリ
ウム（５０ｍＭ）とＥＤＴＡ（１ｍＭ）とを含有するｐ
Ｈ５．８の５ｍＭのビストリス−アセテート緩衝液で平
衡化させたバイオゲルＰ−６のカラムに通すゲル濾過に
よって氷上で９０分後に反応を停止させた。こうして、
リシン−リガンド複合体１分子につき平均０．８のチオ
ール基が導入された。
【００４２】ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液中のＪ５の溶液（１．５ｍｌ中にＪ５が３ｍｇ）
に、乾燥ジオキサン（０．０２ｍｌ）中の１２当量のＳ
ＭＣＣ（０．０７５ｍｇ）を添加した。３０℃において
３０分間のインキュベーションの後に、反応溶液を４℃
においてセファデックスＧ−２５のカラムに通して、抗
体１分子につき平均１．５のマレイミド基を有する改質
Ｊ５が得られた。
衝液中のＪ５の溶液（１．５ｍｌ中にＪ５が３ｍｇ）
に、乾燥ジオキサン（０．０２ｍｌ）中の１２当量のＳ
ＭＣＣ（０．０７５ｍｇ）を添加した。３０℃において
３０分間のインキュベーションの後に、反応溶液を４℃
においてセファデックスＧ−２５のカラムに通して、抗
体１分子につき平均１．５のマレイミド基を有する改質
Ｊ５が得られた。
【００４３】改質リシン−リガンド複合体溶液と改質Ｊ
５溶液とを混合し、ｐＨ８．０の０．５Ｍトリエタノー
ルアミン塩酸塩（０．０２８ｍｌ）を添加することによ
ってｐＨを７．０に調節した。４℃において終夜放置し
た後に、ヨードアセトアミドを最終濃度５ｍＭになるよ
うに添加し、この溶液を限外濾過（ＹＭ−１０フィルタ
ー、アミコン社）によって約２ｍｌに濃縮した。リン酸
塩緩衝塩水中のＢｉｏｇｅｌ Ｐ−３００のカラム
（１．５×９６ｃｍ）に通すゲル濾過によって精製を実
施した。リシン−リガンド複合体及びモノクロナール抗
体に結合した複合体の両方とも、例１の生成物と同様に
低下した非特異的毒性特性を示した。
５溶液とを混合し、ｐＨ８．０の０．５Ｍトリエタノー
ルアミン塩酸塩（０．０２８ｍｌ）を添加することによ
ってｐＨを７．０に調節した。４℃において終夜放置し
た後に、ヨードアセトアミドを最終濃度５ｍＭになるよ
うに添加し、この溶液を限外濾過（ＹＭ−１０フィルタ
ー、アミコン社）によって約２ｍｌに濃縮した。リン酸
塩緩衝塩水中のＢｉｏｇｅｌ Ｐ−３００のカラム
（１．５×９６ｃｍ）に通すゲル濾過によって精製を実
施した。リシン−リガンド複合体及びモノクロナール抗
体に結合した複合体の両方とも、例１の生成物と同様に
低下した非特異的毒性特性を示した。
【００４４】例３ リガンドはアゾ官能基によって結合され、ｐＨ８．５の
０．５Ｍナトリウムジチオナイトで処理することによっ
て分離させることができる（例えばコーエン（Cohen ）
による「Methods Enzymol.」、第３４巻（１９７４
年）、第１０２〜１０８頁を参照されたい）。プローブ
製造のための反応式は図３Ａ及び図３Ｂに示した。
０．５Ｍナトリウムジチオナイトで処理することによっ
て分離させることができる（例えばコーエン（Cohen ）
による「Methods Enzymol.」、第３４巻（１９７４
年）、第１０２〜１０８頁を参照されたい）。プローブ
製造のための反応式は図３Ａ及び図３Ｂに示した。
【００４５】リガンドの調製 水（４０ｍｌ）中の−ラクトース（４．０ｇ、１水和物
として１１．１ミリモル）の撹拌された溶液に、メタノ
ール（８ｍｌ）中のアニリン（２．０７ｇ、２２．２ミ
リモル）の溶液及びメタノール（６ｍｌ）中のシアノ硼
水素化ナトリウム（０．７ｇ、１１．１ミリモル）の溶
液を添加した。酢酸を用いて混合物のｐＨを６．５に調
節し、この溶液を室温において撹拌した。
として１１．１ミリモル）の撹拌された溶液に、メタノ
ール（８ｍｌ）中のアニリン（２．０７ｇ、２２．２ミ
リモル）の溶液及びメタノール（６ｍｌ）中のシアノ硼
水素化ナトリウム（０．７ｇ、１１．１ミリモル）の溶
液を添加した。酢酸を用いて混合物のｐＨを６．５に調
節し、この溶液を室温において撹拌した。
【００４６】１５時間後に蒸発によってメタノールを除
去し、過剰のシアノ硼水素化ナトリウムを破壊するため
にアセトン（１２ｍｌ）を添加し、この溶液を室温にお
いて１時間撹拌した。次いでこの溶液を蒸発乾固させ、
残渣を水（７５ｍｌ）中に再び溶解させ、酢酸を用いて
この溶液をｐＨ５．５に調節し、水中で平衡化されたア
ンバーライトＩＲＡ−１１８Ｈイオン交換樹脂のカラム
（６０ｍｌ）に適用した。このカラムを水（６００ｍ
ｌ）で洗浄し、１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液で糖を溶離
させて、多少の塩で汚染されたＮ−フェニルラクトアミ
ンリガンド１３を含有する白色固体５．４ｇが得られ
た。
去し、過剰のシアノ硼水素化ナトリウムを破壊するため
にアセトン（１２ｍｌ）を添加し、この溶液を室温にお
いて１時間撹拌した。次いでこの溶液を蒸発乾固させ、
残渣を水（７５ｍｌ）中に再び溶解させ、酢酸を用いて
この溶液をｐＨ５．５に調節し、水中で平衡化されたア
ンバーライトＩＲＡ−１１８Ｈイオン交換樹脂のカラム
（６０ｍｌ）に適用した。このカラムを水（６００ｍ
ｌ）で洗浄し、１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液で糖を溶離
させて、多少の塩で汚染されたＮ−フェニルラクトアミ
ンリガンド１３を含有する白色固体５．４ｇが得られ
た。
【００４７】改質担体の調製 カルボキシキャップトアミノエチルポリアクリルアミド
Ｐ−１５０ ３（パックトビーズ１２ｍｌ）の０．２Ｍ
ＮａＣｌ中の懸濁液（合計容量２０ｍｌ）に、ＴＨＦ
（５ｍｌ）中のｐ−ニトロベンゾイルアジド（５７６ｍ
ｇ、３ミリモル）とトリエチルアミン（３０４ｍｇ、３
ミリモル）とを添加した。このゲルを２０分間ゆるやか
に振盪し、次いでさらにトリエチルアミン３０４ｍｇ
（３ミリモル）を添加した。この懸濁液をさらに２５分
間振盪した後に、ｐ−ニトロベンゾイル置換担体ビーズ
をＴＨＦと０．２Ｍ−ＮａＣｌ溶液との混合物（１：
１、容量／容量）、ホルムアミド及び０．２Ｍ−ＮａＣ
ｌ溶液で連続して洗浄した。
Ｐ−１５０ ３（パックトビーズ１２ｍｌ）の０．２Ｍ
ＮａＣｌ中の懸濁液（合計容量２０ｍｌ）に、ＴＨＦ
（５ｍｌ）中のｐ−ニトロベンゾイルアジド（５７６ｍ
ｇ、３ミリモル）とトリエチルアミン（３０４ｍｇ、３
ミリモル）とを添加した。このゲルを２０分間ゆるやか
に振盪し、次いでさらにトリエチルアミン３０４ｍｇ
（３ミリモル）を添加した。この懸濁液をさらに２５分
間振盪した後に、ｐ−ニトロベンゾイル置換担体ビーズ
をＴＨＦと０．２Ｍ−ＮａＣｌ溶液との混合物（１：
１、容量／容量）、ホルムアミド及び０．２Ｍ−ＮａＣ
ｌ溶液で連続して洗浄した。
【００４８】次いでこのビーズを１００ｍＭ−ＮａＨＣ
Ｏ3 の溶液（１０ｍｌ）中に懸濁させ、あらゆる過剰の
アミノ基をキャップするためにメチルクロロホルメート
（２ｍｌ）と共に激しく振盪した。過剰のクロロホルメ
ートを除去するためにこの懸濁液をジエチルエーテルで
抽出（１５ｍｌずつ２回）し、ビーズをｐＨ７．０の１
００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。ｐＨ７．
０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中のゲルの懸濁
液（最終容量２０ｍｌ）に、ナトリウムジチオナイト
（２．６１ｇ、１５ミリモル）を添加した。次いでこの
懸濁液を水浴中で５５℃に保持し、周期的に取り出して
振盪した。４５分後に、ｐ−アミノベンゾイル置換担体
ゲルビーズを０．２Ｍ−ＮａＣｌ溶液で洗浄した。これ
ら改質ポリアクリルアミドゲルビーズ（パックトビーズ
５ｍｌ）の１Ｍ−ＨＣｌ中の懸濁液（最終容量１０ｍ
ｌ）に０℃において、亜硝酸ナトリウム（６９ｍｇ、１
ミリモル）の冷却水溶液（１ｍｌ）を添加した。この懸
濁液を４℃において２０分間ゆるやかに振盪し、次いで
このビーズを０．２Ｍ−ＮａＣｌ冷溶液で迅速に洗浄し
て、ｐ−ジアゾベンゾイル置換担体ビーズ１２を得た。
Ｏ3 の溶液（１０ｍｌ）中に懸濁させ、あらゆる過剰の
アミノ基をキャップするためにメチルクロロホルメート
（２ｍｌ）と共に激しく振盪した。過剰のクロロホルメ
ートを除去するためにこの懸濁液をジエチルエーテルで
抽出（１５ｍｌずつ２回）し、ビーズをｐＨ７．０の１
００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。ｐＨ７．
０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中のゲルの懸濁
液（最終容量２０ｍｌ）に、ナトリウムジチオナイト
（２．６１ｇ、１５ミリモル）を添加した。次いでこの
懸濁液を水浴中で５５℃に保持し、周期的に取り出して
振盪した。４５分後に、ｐ−アミノベンゾイル置換担体
ゲルビーズを０．２Ｍ−ＮａＣｌ溶液で洗浄した。これ
ら改質ポリアクリルアミドゲルビーズ（パックトビーズ
５ｍｌ）の１Ｍ−ＨＣｌ中の懸濁液（最終容量１０ｍ
ｌ）に０℃において、亜硝酸ナトリウム（６９ｍｇ、１
ミリモル）の冷却水溶液（１ｍｌ）を添加した。この懸
濁液を４℃において２０分間ゆるやかに振盪し、次いで
このビーズを０．２Ｍ−ＮａＣｌ冷溶液で迅速に洗浄し
て、ｐ−ジアゾベンゾイル置換担体ビーズ１２を得た。
【００４９】リガンド−担体プローブの調製 ほう酸ナトリウム飽和溶液（１０ｍｌ）中のＮ−フェニ
ルラクトアミンリガンド１３（８１０ｍｇ、１．９ミリ
モル）の溶液を冷却ジアゾ改質担体１２に添加し、これ
はすぐに深赤色になった。この懸濁液を４℃において終
夜ゆるやかに振盪し、次いで０．２Ｍ−ＮａＣｌ溶液で
充分に洗浄して、リガンドがアゾ基を介して担体に共有
結合した深赤色のリガンド−担体プローブ１４を分離さ
せた。リガンド−担体プローブ１４の一部（０．５０ｍ
ｌ）を用いて小さいカラムを製造し、これを用いて、特
異的な結合能力がパックトビーズ１ｍｌにつき０．５ｍ
ｇであることが示された。結合したリシンを２通りの方
法で溶離させることができるということを示すことによ
って、リシンが特異的に結合したということが証明され
た。高濃度ガラクトースとの競争によってリシン−リガ
ンドの特異的な相互作用を分裂させることができ、ま
た、ｐＨ８の０．２〜０．５Ｍナトリウムジチオナイト
溶液で処理することによってリガンド−担体結合を開裂
させることができる。両方の場合において、リシン又は
リシン−リガンド複合体はカラムから定量的に溶離され
た。ジチオナイトでの処理が担体からのリガンドの開裂
によってリシンを放出するということのさらなる証明と
して、このゲルはアゾ基の発色による深赤色を即座に失
う。
ルラクトアミンリガンド１３（８１０ｍｇ、１．９ミリ
モル）の溶液を冷却ジアゾ改質担体１２に添加し、これ
はすぐに深赤色になった。この懸濁液を４℃において終
夜ゆるやかに振盪し、次いで０．２Ｍ−ＮａＣｌ溶液で
充分に洗浄して、リガンドがアゾ基を介して担体に共有
結合した深赤色のリガンド−担体プローブ１４を分離さ
せた。リガンド−担体プローブ１４の一部（０．５０ｍ
ｌ）を用いて小さいカラムを製造し、これを用いて、特
異的な結合能力がパックトビーズ１ｍｌにつき０．５ｍ
ｇであることが示された。結合したリシンを２通りの方
法で溶離させることができるということを示すことによ
って、リシンが特異的に結合したということが証明され
た。高濃度ガラクトースとの競争によってリシン−リガ
ンドの特異的な相互作用を分裂させることができ、ま
た、ｐＨ８の０．２〜０．５Ｍナトリウムジチオナイト
溶液で処理することによってリガンド−担体結合を開裂
させることができる。両方の場合において、リシン又は
リシン−リガンド複合体はカラムから定量的に溶離され
た。ジチオナイトでの処理が担体からのリガンドの開裂
によってリシンを放出するということのさらなる証明と
して、このゲルはアゾ基の発色による深赤色を即座に失
う。
【００５０】リガンド−担体プローブ１４を二官能価架
橋剤２，４−ジクロロ−６−メトキシトリアジンを用い
て以下の方法で賦活した。乾燥ＤＭＦ中のリガンド−担
体プローブビーズ１４（ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液中のパックトビーズ容量５ｍｌ）の懸
濁液（２０ｍｌ）に、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の２，
４−ジクロロ−６−メトキシトリアジン（１．８ｇ、１
０．０ミリモル）の溶液を添加した。この懸濁液を室温
において２２時間ゆるやかに撹拌した。賦活されたプロ
ーブビーズ１５を次いでＤＭＦ、ＤＭＦ−ｐＨ７．０の
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液及び最後にｐＨ７．
０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で連続的に洗浄
し、カラム中に充填した。
橋剤２，４−ジクロロ−６−メトキシトリアジンを用い
て以下の方法で賦活した。乾燥ＤＭＦ中のリガンド−担
体プローブビーズ１４（ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液中のパックトビーズ容量５ｍｌ）の懸
濁液（２０ｍｌ）に、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の２，
４−ジクロロ−６−メトキシトリアジン（１．８ｇ、１
０．０ミリモル）の溶液を添加した。この懸濁液を室温
において２２時間ゆるやかに撹拌した。賦活されたプロ
ーブビーズ１５を次いでＤＭＦ、ＤＭＦ−ｐＨ７．０の
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液及び最後にｐＨ７．
０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で連続的に洗浄
し、カラム中に充填した。
【００５１】レクチン−リガンド−担体複合体の調製 リシンの溶液（塩化ナトリウム０．１５Ｍを含有するｐ
Ｈ７．０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液３ｍｌ中
に５．７ｍｇ）を、賦活プローブカラム１５に適用し、
この流動通過を２回適用した。このカラムをカラム容積
の３倍量のｐＨ８．６の０．０５Ｍトリエタノールアミ
ン塩酸塩で洗浄し、そして周囲温度において２４時間放
置した。結合はしているがしかし共有架橋していないリ
シンを、ガラクトース０．５Ｍを含有するｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄するこ
とによって除去した。次いで以下の方法で共有結合を切
断することによってリシン−リガンド複合体を担体から
分離させた。カラムを、残留ガラクトースを除去するた
めにｐＨ８．６の０．０５Ｍトリエタノールアミン塩酸
塩緩衝液で、そして次いで塩化ナトリウム０．３Ｍを含
有するｐＨ８．０の０．２Ｍナトリウムジチオナイト溶
液で洗浄した。次いでビーズを分離容器に移し、ｐＨ
８．０の０．２Ｍナトリウムジチオナイトと０．３Ｍ塩
化ナトリウムとの溶液と共に２０分間撹拌した。この懸
濁液を濾過し、ビーズを同様の方法でさらに２回ジチオ
ナイトで処理した。このジチオナイト溶液を貯蔵し、担
体から遊離したリシン−リガンド複合体約０．８ｍｇを
含有する溶液１２ｍｌが得られた。この複合体は、慣用
の二官能価架橋剤を用いてＪ５のようなモノクロナール
抗体に対して共有結合することができる。
Ｈ７．０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液３ｍｌ中
に５．７ｍｇ）を、賦活プローブカラム１５に適用し、
この流動通過を２回適用した。このカラムをカラム容積
の３倍量のｐＨ８．６の０．０５Ｍトリエタノールアミ
ン塩酸塩で洗浄し、そして周囲温度において２４時間放
置した。結合はしているがしかし共有架橋していないリ
シンを、ガラクトース０．５Ｍを含有するｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄するこ
とによって除去した。次いで以下の方法で共有結合を切
断することによってリシン−リガンド複合体を担体から
分離させた。カラムを、残留ガラクトースを除去するた
めにｐＨ８．６の０．０５Ｍトリエタノールアミン塩酸
塩緩衝液で、そして次いで塩化ナトリウム０．３Ｍを含
有するｐＨ８．０の０．２Ｍナトリウムジチオナイト溶
液で洗浄した。次いでビーズを分離容器に移し、ｐＨ
８．０の０．２Ｍナトリウムジチオナイトと０．３Ｍ塩
化ナトリウムとの溶液と共に２０分間撹拌した。この懸
濁液を濾過し、ビーズを同様の方法でさらに２回ジチオ
ナイトで処理した。このジチオナイト溶液を貯蔵し、担
体から遊離したリシン−リガンド複合体約０．８ｍｇを
含有する溶液１２ｍｌが得られた。この複合体は、慣用
の二官能価架橋剤を用いてＪ５のようなモノクロナール
抗体に対して共有結合することができる。
【００５２】同様の結果でリシンを他のレクチンに置き
換えることができる。レクチン−リガンド−モノクロナ
ール抗体複合体は生体内並びに生体外で選択された細胞
を殺すのに使用することができる。
換えることができる。レクチン−リガンド−モノクロナ
ール抗体複合体は生体内並びに生体外で選択された細胞
を殺すのに使用することができる。
【図１】 実施例１の活性化リガンド担持プローブが生
成する反応を示す模式図である。
成する反応を示す模式図である。
【図２】 実施例２の活性化リガンド担持プローブが生
成する反応を示す模式図である。
成する反応を示す模式図である。
【図３】 実施例３の活性化リガンド担持プローブが生
成する反応を示す模式図である。
成する反応を示す模式図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/46 ＡＤＵ (72)発明者 ブレットラー，ウォルター エイ. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ，ブルックライン，メイソン テラス 197 (72)発明者 ラムバート，ジョン エム. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ，ブルックライン，リンデン プレイス 21 (72)発明者 ダラルカオ，リンダ ジェイ. アメリカ合衆国 02130 マサチューセッ ツ，ジャメイカ プレイン，ワン リージ ェント サークル（番地なし)
Claims (23)
- 【請求項１】 ブロックされたレクチンであって、各リ
ガンド上に存在する光活性化可能でない反応性の基によ
って該レクチンのオリゴ糖結合部位の１つ以上をブロッ
クするように該レクチンの該オリゴ糖結合部位に特異的
に共有結合された１つ以上のアフィニティーリガンドを
包含する上記のブロックされたレクチン。 - 【請求項２】 該共有結合されたアフィニティーリガン
ドの少なくとも１つが該リガンドをモノクローナル抗体
に共有結合させることのできる成分を含む請求項１に記
載のブロックされたレクチン。 - 【請求項３】 該レクチンが該レクチンをモノクローナ
ル抗体に共有結合させることができる成分を含む請求項
１に記載のブロックされたレクチン。 - 【請求項４】 該アフィニティーリガンドが細胞毒性レ
クチンに対し特異的な糖誘導体を含む請求項１、２又は
３の何れか１つに記載のブロックされたレクチン。 - 【請求項５】 該アフィニティーリガンドがリシンに対
し特異的な糖誘導体を含む請求項１、２又は３の何れか
１つに記載のブロックされたレクチン。 - 【請求項６】 該アフィニティーリガンドが少なくとも
１つの末端ガラクトース誘導体を含む請求項１、２又は
３の何れか１つに記載のブロックされたレクチン。 - 【請求項７】 該リガンドを該レクチンに共有結合させ
る該反応性の基が蛋白質を架橋させることのできる請求
項１、２又は３の何れか１つに記載のブロックされたレ
クチン。 - 【請求項８】 該１つ以上のアフィニティーリガンドが
Ｎ−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミンを含む請
求項１、２又は３の何れか１つに記載のブロックされた
レクチン。 - 【請求項９】 該１つ以上のアフィニティーリガンドが
Ｎ−フェニルラクトアミンを含む請求項１、２又は３の
何れか１つに記載のブロックされたレクチン。 - 【請求項１０】 該レクチンが、リシン、アブリン、モ
デシン、ボルケンシン、及びそれらの誘導体からなる群
から選択される請求項１、２又は３の何れか１つに記載
のブロックされたレクチン。 - 【請求項１１】 該細胞毒性レクチンがリシンである請
求項１０に記載のブロックされたレクチン。 - 【請求項１２】 （１）（ａ）アフィニティーリガンド
上に存在する光活性化可能でない反応性の基を通して１
つ以上のアフィニティーリガンドを固体担体に共有結合
させることにより、及び（ｂ）少なくとも１つの該１つ
以上のアフィニティーリガンドをレクチンに共有結合さ
せることのできる反応性の基を形成するために該アフィ
ニティーリガンドを活性化させることにより、アフィニ
ティー担体を生成し（但し、該（ａ）の共有結合及び該
（ｂ）の活性化の順序は問わない）、 （２）該レクチンに該レクチンの該オリゴ糖結合部位に
対して親和性を有する１つ以上の活性化されたアフィニ
ティーリガンドの少なくとも一部を結合させ、 （３）該リガンド上の反応性の基を通して該リガンドを
該レクチンに共有結合させることにより該細胞毒性レク
チンの１つ以上のオリゴ糖結合部位をブロックする、段
階を含むそれぞれのリガンド上に存在する該反応性の基
によって該レクチンの該オリゴ糖結合部位の１つ以上を
ブロックするように該レクチンのオリゴ糖結合部位に特
異的に共有結合された該１つ以上のアフィニティーリガ
ンドを包含するブロックされたレクチンの調製方法。 - 【請求項１３】 該（ａ）の共有結合が該（ｂ）の活性
化に先行して行なわれる請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 該ブロックされたレクチンを固体担体
から解放するために該１つ以上のリガンドと該固体担体
との間の該共有結合を切断する段階を含む請求項１２に
記載の方法。 - 【請求項１５】 ブロックされていないレクチンから該
ブロックされたレクチンを回収する段階を含む請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項１６】 該アフィニティーリガンドが細胞毒性
レクチンに対し特異的な糖誘導体を含む請求項１２、１
３、１４又は１５の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１７】 該アフィニティーリガンドがリシンに
対し特異的な糖誘導体を含む請求項１２、１３、１４又
は１５の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１８】 該アフィニティーリガンドが少なくと
も１つの末端ガラクトース誘導体を含む請求項１２、１
３、１４又は１５の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１９】 該リガンドを該レクチンに共有結合さ
せる該反応性の基が蛋白質を架橋させることのできる請
求項１２、１３、１４又は１５の何れか１つに記載の方
法。 - 【請求項２０】 該１つ以上のアフィニティーリガンド
がＮ−（２’−メルカプトエチル）ラクトアミンを含む
請求項１２、１３、１４又は１５の何れか１つに記載の
方法。 - 【請求項２１】 該１つ以上のアフィニティーリガンド
がＮ−フェニルラクトアミンを含む請求項１２、１３、
１４又は１５の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項２２】 該レクチンが、リシン、アブリン、モ
デシン、ボルケンシン、及びそれらの誘導体からなる群
から選択される請求項１２、１３、１４又は１５の何れ
か１つに記載の方法。 - 【請求項２３】 該レクチンがリシンである請求項２２
に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84155186A | 1986-03-20 | 1986-03-20 | |
| US841551 | 1986-03-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502185A Division JP2594803B2 (ja) | 1986-03-20 | 1987-03-18 | レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08269093A true JPH08269093A (ja) | 1996-10-15 |
Family
ID=25285164
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502185A Expired - Lifetime JP2594803B2 (ja) | 1986-03-20 | 1987-03-18 | レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブ |
| JP8045604A Pending JPH08269093A (ja) | 1986-03-20 | 1996-02-08 | レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502185A Expired - Lifetime JP2594803B2 (ja) | 1986-03-20 | 1987-03-18 | レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JP2594803B2 (ja) |
| AT (1) | ATE128361T1 (ja) |
| CA (1) | CA1338619C (ja) |
| DE (1) | DE3751543T2 (ja) |
| WO (1) | WO1987005515A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5239062A (en) * | 1986-03-20 | 1993-08-24 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Blocked lectins, methods and affinity support for making same using affinity ligands, and method of killing selected cell populations having reduced nonselective cytotoxicity |
| US5395924A (en) * | 1986-03-20 | 1995-03-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Blocked lectins; methods and affinity support for making the same using affinity ligands; and method of killing selected cell populations having reduced non-selective cytotoxicity |
| JPH1045601A (ja) * | 1996-08-08 | 1998-02-17 | Mitsuru Akashi | 抗ウイルス素材 |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2437213A1 (fr) * | 1978-09-28 | 1980-04-25 | Cm Ind | Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation |
| US4371515A (en) * | 1978-12-26 | 1983-02-01 | E-Y Laboratories, Inc. | Method for forming an isolated lectin-immunological conjugate |
| US4289747A (en) * | 1978-12-26 | 1981-09-15 | E-Y Laboratories, Inc. | Immunological determination using lectin |
| US4631190A (en) * | 1981-06-26 | 1986-12-23 | Shen Wei C | Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers |
| US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US4590071A (en) * | 1984-09-25 | 1986-05-20 | Xoma Corporation | Human melanoma specific immunotoxins |
| ATA10886A (de) * | 1986-01-17 | 1989-12-15 | Ebewe Arzneimittel | Verfahren zur herstellung von neuen proteinderivaten |
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- 1987-03-18 EP EP87902922A patent/EP0261225B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-18 JP JP62502185A patent/JP2594803B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-19 CA CA000532427A patent/CA1338619C/en not_active Expired - Fee Related
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| EP0261225A4 (en) | 1989-10-27 |
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| DE3751543D1 (de) | 1995-11-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19980203 |