JPS63503224A - レクチン複合体及びそれを製造する方法及びプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レクチン複合体及びそれを製造する方法及びグローブ 本発明は非特異的毒性が減少せしめられた細胞毒性レクチン複合体の製造方法及 びかかる細胞毒性レクチン複合体を製造する際に有用な新規なりガント−担体（ ５ｕｐｐｏｔ　）　複合体又はプローブに関する。

発　明　の　背　景 リジン、アブリン、モデシン、ポルケンシン及びビスクミンのような数種の公知 の細胞毒性レクチンがあり、これらは真核細胞を非常に有効に殺す。これらのレ クチンは、ジスルフィド結合によって連結されている二個のサブユニットを含有 しているヘテロ二量体性蛋白質である。八−鎖と称する一方のサブユニットはリ ポソームの接触失活により細胞毒性活性を発揮する一方、他方のサブユニットで あるＢ−鎖はガラクトース末端オリゴ糖に対して特異的な結合部位を含有する。

オリゴ糖成分を含有する分子は細Ｐｊ！、表面に遍在しているためレクチンは識 別不可能であり、したがってその細胞毒性は非特異的である。この特性のために 腫瘍細胞のような病的又は異常な細胞を選択して殺す有用性が太き（制限される 。

従来、レクチンは二つのサブユニットに分割されＡ鎖のみがモノクローナル抗体 に結合され特異的活性を有する毒素を与えるのであるがかかる複合生成物は全レ クチンのものと比べて有意に減少された毒性を示す。

また、レクチンのオリゴ糖結合部位であるコンカナバリンＡを、コンカナバリン 人結合部位に特異的に結合する光活性化しうるアリールアジドのマンノース誘導 体で処理した後紫外線に暴露してコンカナバリンＡと多糖類誘導体との間に共有 結合を形成することＫより該結合部位を保護することがＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ７８巻、１０１３−１０１９頁（１９７５年）に記載のごと（Ｂｅｐｐｕ等によ って提案されている。上記生成物はその４個の結合部位において活性を保持し、 かつ減少した赤血球凝集活性を示した。コハク酸化コンカナバリンＡを用いてｐ ｒａｓｅｒは類似の操作により同様の結果が記録されている。同様Ｉｃ　Ｂａｅ ｎｚｉｇｅｒ等によりＪ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７巻、４４２１〜４４２ ５頁（１９８２年）においてレクチンであるコンカナバリンＡ、リチン及び肝臓 レクチンを適当なグリコペプチドの光活性化しうる誘導体で処理し、次いで光暴 露によりレクチンとグリコペプチド誘導体との間に共有結合が形成されることが 記載されている。しかしながら、どの場合においてもグリコペプチド誘導体は１ 〜２Ｘ包含せしめることかできたにすぎなかった。

細胞毒性（リチンの場合）又は赤血球凝集（コンカナバリンＡの場合）のいずれ かの測定によりレクチンの極微有効性を決定する試みが行われていないことは明 らかであった。ＨｏｕｓｔｏｎによりＪ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８巻、７ ２０８〜７２１２頁（１９８３年）Ｋ記載されているようにリチンとガラクトー スの光活性化しうる誘導体を用いて類似の操作が適用されている。Ａ鎖のみが細 胞リゼート（溶解産物）中で蛋白質合成阻害に十分な活性を示したが、生成物は 細胞に対して未処理リチンよりも２８０倍も毒性が低いことが見出された。

’Ｉ’ｈｏｒｐｅ　等はＥｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４０巻、６３〜７１ 頁（１９８４年）において完全なりチンに対するモノクローナル抗体を結合せし め、次にアフィニティークロマトグラフイーによって生成物を精留すると収率２ ０％の７ラクシヨンが単離される。この場合、モノクローナル抗体かりシンのオ リゴ糖結合部位を偶然保護しており、それにより複合体が細胞に非特異的に結合 する力が減少せしめられると記載している。

光活性化しうるオリゴ抛又はモノクローナル抗体をレクチンのオリゴ糖結合部位 の保護剤として用いた場合に得られる最終的な結果にあられれるはらりきは、レ クチンの細胞毒性特性を減少しすぎることなくその非特異的毒性を有効にかつ再 現可能に減少する不発明により排除される。

本発明は非特異的毒性が減少せしめられた細胞毒性レクチンを製造する方法であ って、該レクチン上のオリゴ糖結合部位に対して特異的リガンドを与え、該リガ ンドを固体担体に共有結合させてプローブを形成し、該レクチンを該結合部位と 該リガンドとの間の特異的相互作用によって該プローブと接触せしめ、更に該レ クチンと該リガンドとの間に共有結合を形成することにより、該リガンドと眼レ クチンとの複合体が得られ、該リガンドが該支持体に共有結合せしめられること を特徴とする。本発明はまたリガンドと支持体との間の共有結合を切断してリガ ンドに共有結合しているレクチンを含む複合体を離脱せしめる更なる操作から成 る。本発明はまた複合体とモノクローナル抗体との間の共有結合を形成する更な る工程を含む。その他の更なる特色は以下の記載から明らかＫなるであろう。

本発明の方法はりシン、アブリン、モデシン、ポルケンシン又はビスクミンのよ うな細胞毒性活性を有するいかなるレクチンにも用いることかできる。

第１図は、実施例１の活性化リガンド担持プローブが生成する反応を示す模式図 ； 第２図は、実施例２の活性化リカンド担持プローブが生成する反応を示す模式図 であり、 第３Ａ及び３Ｂ図は、実施例３の活性化リガンド担持プローブが生成する反応を 示す模式図である。

本発明において用いる固体担体は、架橋ポリアクリルアミド及びその誘導体、例 えはアミノエテルポリアクリルアミド、誘導多孔ガラスピーズ、ラテックスと− ズ、ポリビニルアルコールビーズなどのような、アフィニティークロットゲラフ ィーに通常用いられる固体担体のいずれであってもよい。

本方法において用いるリガンドはレクチンのオリゴ糖結合部位に％異的に結合す るいかなる化合物であってもよい。好ましくは、リガンドは二楯又はより高級な 多糖のような多糖類を含み、好ましくは、最適の結合能のためのガラクトース成 分を含有する。

プローブを与えるリガンドと担体との間の共有結合はいかなる通常の方法によっ ても形成することができる。

そのほとんどが公知であり、市販されている、いかなる好適なヘテロニ官能性架 橋剤を用いることができる。場合によっては、複合体を引き続いて使用する間担 体に結合したままにしてもよいが、架橋剤は、選択された条件又は試薬を施して 、リガンド−レクチン複合体の担体が形成された後にそれから分離せしめる場合 は分離可能でなければならない。一方、担体及びリガンドの一方又は両方を改質 して、他方と反応してリガンドと担体との間の共有結合を形成しうる官能基を包 含せしめ、別々の架橋剤を用いる必要性を除去する。リガンドが共有結合してい る担体からのリガンドの分離能を与える成分は、レクチン自身の内部ジスルフィ ド結合基がそれはと速やかに分離しないような選択された条件下で還元すること によって好適に分離することができるジスルフィド基、アミツリシスによって分 離することができるチオエーテル基、好ましくはジチオナイトによって還元する ことによって分離することができるアゾ基、約３６０　ｎｍの波長の光によって 分離することができるオルト−ニトロベンジルエステル又はオルト−ニトロベン ジルカルバメート、過ヨウ素酸エステル（又は塩）で酸化するととくよって分離 することができるビシナルのグリコール基などの形態をとってよい。

同様に、リガンドとレクチンとの間の共有結合は、例えば、適当な架橋剤を用い ることによって蛋白質又はポリヘプチド類を他の化合物又は基に結合せしめる通 常の化学的な方法によって形成することができる。

リガンドと担体との共有結合並びにリガンドとレクチンとの共有結合は、所望に より２以上の連続工程においてそれぞれ形成することができる。例えば、２−ピ リジルジチオプロピオン酸をアミノエチル−ポリアクリルアミドのような担体と 反応させて２−ピリジルジチオ基が結合せしめられた担体な得ることができる。

三糖成分を含むリガンドは、ラクトースを変性してＮ−（２’　−メルカプトエ チル）ラクトアミンを形成してから担体上の２−ピリジル基をジスルフィド父侠 によって置換し、ラクトアミンのアミン残基を次に官能基として用いることによ り、レクチンとの共有結合を形成することができる。

これは、２．４−ジクロロ−６−メドキシトリアジンのような、一方の塩素原子 の反応性がｐ　Ｈ８において大である二官能性の架橋剤を用いることによって達 成するととができ、反応は数分で完了する。残りの塩素原子はより緩やかに、ｐ Ｈ＆５以上において２４時間を要してアミノ基と反応する。この架橋剤は、まず ｐ　Ｈ８でラクトアミンの７ミノ残基と反応せしめ、次いでレクチンをラクトア ミンのガラクトース成分に特異的に結合せしめることによって正しく配置してか ら、より高いｐＨでレクチンのアミノ基と反応せしめられる。

この第２の架橋剤は、リガンドがレクチンに永久的に結合した状態にあって後者 のオリゴ糖結合部位を保護していることが望ましいので、分離性である必要はな い。

他の笑施態様においては、リガンド自体を、レクチンに反応性の官能基を有する ように化学的に変性してその間の共有結合を形成することができる。

リガンド自体が２つの官能基を有するように改質される場合、一方の官能基は担 体と共有結合を形成することができ、他方はレクチンと共有結合を形成すること ができる。２つの官能基は、反応性又は反応条件を異にして、リガンドがある一 連の条件下では担体に結合し、また他の一連の条件下ではレクチン自身合するよ うにすることが好ましい。この場合、リガンド自体か、レクチンのオリゴ糖結合 部位に％異的に結合し得る二線又は多糖類を含むヘテロニ官能性架橋剤とみなさ れろ。リガンド中に包含せしめられる２つの官能基は従来のへテロニ官能性架橋 剤中に存在するものと同様のものであってよい。

リガンドを固体担体に結合せしめてプローブを形成し、レクチンを特異的結合に よってプローブ上に配備してからりガント−レクチン複合体を形成した後、所望 により、従来の操作によってリガンド−担体結合の分離により、担体から分離さ せてもよい。

上記複合体は、遊離状であるか又は固体担体に結合したままであり、リガンドに よって保護されたオリゴ糖結合部位を有しているため、結果的に細１１１に対し て非特異的又は非選択的結合を示すことはなくなり、非特異的毒性の大部分を失 う。次に、特定の細胞に対して特異的な免疫学的結合能を示す選択されたモノク ローナル抗体に共有結合させることによって複合体を、攻撃すべき所望の特定の 細胞に対して特異性を示すように処理することができる。複合体のモノクローナ ル抗体への共有結合は、Ｔｈｏｒｐｅ　等ｆ）　１ｏｃＩＣｉｔ　に記載される ものをはじめとする従来の操作又は架慎剤を用いて担体かも分離又は離脱せしめ る前又は後に行うことができる。

好ましい実施態様において、実施例１に示すように、還元によって分離し得るジ スルフィド基を介し、支持体にリガンドによって結合せしめることができる。次 に、リガンド上に残δれたチオール残基を官能基として用いてモノクローナル抗 体との共有結合を形成する。この目的のためには、チオール基とアミノ基又はモ ノクローナル抗体のその他の基と結合し得る好適な二官能性架橋剤であればいか なるものを用いてもよい。好ましくは、チオール基と反応して共有結合を形成す る官能基なモノクローナル抗体に導入して複合体の官能基と直接反応し得るよう にする。例えば、複合体上の官能基がチオールの場合、モノクローナル抗体をス クシンイミジ＃４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ Ｖ−）（ＳＭＣＣ）のような試薬と反応させて抗体上にマレイミド基を存在せし めてもよい。

他の好ましい実施態様においては、実施例２に示すように、リガンド（並びに得 られるレクチン−リガンド複合体）は輻射今によって分離し得るオルト−ニトロ ベンジルカルバメートである光分解性基を介して担体に結合せしめられ、二官能 性架橋試薬を用いてレクチンとリガンド−担体プローブのリガンドとの間に輻射 線に対して安定な共有結合が形成される。

また更なる好ましい実施態様においては、実施例３に示すように、リガンドはジ チオナイトナトリウムによって優先的還元により分解し得るアゾ基を介して担体 に結合せしめられる一方、レクチン−リガンド共有結合は、かかる還元に対して 不活性な結合を形成する二官能性架橋剤によって形成される。

下記の特定の実施例は本発明の方法をより詳細に説明するためのものであって、 本発明の範囲を制限するもの（１９７４年）に記載のように、固体ビーズの形態 の７ミノエチルポリアクリルアミドＰ−１５０（Ｂ、。−Ｒａｄ製）を、塩化ア ンモニウム水溶液中の水溶性カルボジイミドと反応させることによって処理し、 すべての残留カルボキシル基をキャップした。ビーズを次に、ピリジルジチオ基 によって官能化せしめるととＫより第１図の右上部に既述した反応によって示さ れるように、ジスルフィド連結基を介したリガンドの付着位置を与えた。この目 的のために、カルボキシーキャップトーアミノエチルポリアクリルアミド３（充 横ビーズ３ｏｙ）Ｐａ濁液及びα１Ｍ塩化ナトリウム溶液１０ｔ／に、ジメチル ホルムアミド１０ｄ及び水１１中の２−ピリジルジチオプロピオン酸（Ｐｙ−８ −８−Ｃ２Ｈ４−Ｃｏ２Ｈ）　０．０１１！（ｓミリモル）を加えた。希釈した 塩酸を加えて混合物のｐｎを４７に調整し、１−エチル−３−（３−ジメチルア ミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ・ＭＣＩ　）ｔ１５，９ （６ミ’ｊモル）を含有する水５ゴの懸濁液と混合した。室温で７時間攪拌した 後、更にカルボジイミド［ｌＬ７６６ｇ（４ミリモル）を加え、混合物のｐＨを 塩酸でＬ７に再ｙ４Ｍした。室温で４日間振盪後、懸濁液から液体を除去し、改 質ゲルビーズ４を［Ｌ２Ｍ塩化ナトリウム溶液で長時間にわたって洗浄した。過 剰の２−ピリジルジチオプロビオン酸を確実に完全に除去するために、懸濁液を ＣＬＩＭ塩酸で酸性化し、酢酸エチル５ｄナトリウム緩衝液で洗浄した。過剰の ジチオエリトリトールで処理した場合は、洗浄は、洗浄溶液の一部が非常に低い 濃度の２−ピリジンチオンを示し、５４３　ｎｍにおいてｃＬｌａ、ｕ０未満の 吸光度を示すまで続けた。

変性ビーズ４０カラムにおけるジチオピリジル基の表面濃度を、該ビーズの試料 を、過剰の、１ｏｏｍＭの重炭酸ナトリウム溶液中のジチオエリトリトール（Ｄ ＴＥ　）と、室温で３０分間反応させることによって測定した。

ビーズを次にα２ｍＭ塩化ナトリウム溶液で繰り返し洗浄し、５４３　ｎｍ　Ｋ おける吸光度によって測定した洗浄液中の２−ピリジンチオンの霊（Ｔ、５ｔｕ ｃｈｂｕｒｙ　等のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、１５１巻、４１７〜４３２頁（１ ９７５年）〕カ充填ビーズ１−あたり３８マイクロモルの濃度に相当することが 認められた。

２−ピリジルジチオ含有ポリマービーズ４上に存在する全ての過剰アミン基をキ ャップするために、ビーズ（２７ｒｎｌ　）を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液 ５０　’ｙｎｌ中に懸濁させ、これに室温でクロロギ酸メチル４．８．９（５， ２ミリモル）を加えた。５分後、過剰のクロロギ酸エステルを、酢酸エチル２０ ａｔ／で抽出することによって除去し、改質ゲルビーズをｐ　Ｈ７，０の１ｏ０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。

リガンドの調製 第１図の左上部に示したようにリガンドを製造した。

（１五５ミリモル）を溶解した。上記溶液に、シスタミンニ酢酸塩入６８ｇ（１ Ｎ５ミリモル）を、メタノール７２ゴ中のナトリウムシアノボロヒドリド’Ｌ７ ０９（２ｙ、　ｏ　ミｙモル）溶液と共に加えた。混合物のｐ）（を酢酸で６２ に調整した後、溶液を室温で３６時間攪拌し、その間メタノールを蒸発によって 除去し、残留水溶液のｐＨを酢酸で５．０に調整し、溶液を、ｐＨ５，０の２ｍ Ｍ酢酸ピリジニウム緩衝液中で平衡化したカルボキシメチルセルロースの３６０ ｄカラムに通した。２倍の容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、結合物質 をｃＬ１Ｍアンモニア水溶液で溶出した。溶出物を含有する溶液を蒸発乾固し、 固形分を水２００１中に再溶解し、室温でジチオエリトリトール（ＤＴＥ）ｚｏ ＆１　１５　ミリモル）を加えた。１時間静置後、Ｎ　−（２’−メルカプトエ チル）ラクトアミンス及びシステアミンの混合物を含有する得られた溶液を、１ ｍＭのＤＴＥを含有するｐＨ７の１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液 中のカルボキシメチルセルロースの３７０ｄカラムに通した。

カラムを同じ緩衝液５００１で洗浄し、次に、１ｍＭのＤＴＥを含有するｐ　Ｈ ７の１０〜１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムの直線勾配（１１＋ＩＡり の浴液で展開した。水からの蒸発及び凍結乾燥を繰り返すことによって、Ｎ−（ ２’−メルカプトエチル）ラクトアミンリガンド主　４８５ｇ（理論量の３５Ｘ ）が白色の粉末として得られた。

上記記載のように製造され精製されたりガント主を用いる直前に、ｐＨ８の水１ ０ｍ中にリガンドｔ５Ｉ！（五７ミリモル）を溶解し、ＤＴＥｌ　５４１１９（ １ミリモル）を加え、室温で１時間静置することによって、ラクトアミンの２分 子間に形成されるすべての二量体を還元処理した。次に、ｐＨを酢酸で５．２に 低下させ、溶液をｐＨ５，２の２ｍＭ酢酸ピリジニウム緩衝液中のカルボキシメ チルセルロースの１００ｄカラムに通した。すべてのＤＴＥが除去されるまで、 カラムを同じ緩衝液２００ｄで洗浄した。純粋なＮ　−（２’−メルカプトエチ ／Ｉ／）ラクトアミン２を、α１Ｍ塩酸で遊離チオールの形態に溶出せしめた。

エルマン試薬による分析の結果、溶液はチオール五２ミリモル（理論量の８５Ｘ ）を含有することが認められた。

配位子−担体プローブの調製 ラクトアミンのｐ　Ｈ５の水溶液５０ｄ（Ａ２ｍモル）を室温でゲルビーズ２７ ｄに加えてｐＨ６Ｌ５の懸濁液を生じ、これを室温において１５分間振盪し、次 いでα２Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて逐次遠心分離及びデカンテーション工 程により錬り返し、次いで洗液が２−ピリジンチオン副生物が実質的に全て３４ ５　ａｍにおける吸光度の測定によって示される通りに除去されたことを示すま で洗浄することによって、配位子２を予め調製したキャップト及び活性化ポリア クリルアミドゲルビーズ４に共有結合させた。生成したビーズは、ポリマービー ズに共有結合させた配位子を含有するプローブ５の形で、３８ｍＭの表面ラクト ース濃度を有していた。

リシンを配位子−担体プローブ５に共有結合させるために、１００ｍＭの重炭酸 ナトリウムの溶液１０ｔ／中にプローブ１０ｍを含有する懸濁液に１０ｄのジオ キサン中にトリアジン試薬３６０５９（２ｍモル）を含有する溶液を加えること によって、プローブを二官能価架橋剤ｚ４−ジクロロ−６−メドキシトリアジン で活性化した。

懸濁液を１分間旋回させた後に、ジエチルエーテル４１で抽出して過剰のトリア ジンを除き、活性化したプローブビーズ６に次いでｐ　Ｈ７，０のリン酸ナトリ ウム緩衝液１００ｍＭを平衡にさせてカラムに充填した。

レクチン−配位子−一体　合　の調製 １１５ＭのＮａＣＩ　を含有するｐＨ７のａｏＩＭリン酸ナトリウム緩衝液中リ シン２．１Ｔｖ／ＩＬｌを含有する溶液２．５コの形でリシンを活性化プローブ カラムに適用した。

リシンとトリアジン架橋剤の第２官能価塩素基との間の共有結合を形成するため に、カラムを次いでｐＨ８，６の５０ｍＭ）リエタノールアミン塩酸塩緩衝液の ３カラム容積で洗浄した。室温においてｐＨ＆６で２４時間靜Ｉｂた後に、共有 結合したりシン−配位子複合体を形成しなかったりシンを全て除くために、カラ ムを３容積のｐ　Ｈ７の１１５Ｍガラクトース溶液で洗浄した。

レフ　ンー−ム　−・　、 上述した通りＫしてＨＡ＞した共有結合したりシン−配位子複合体を、配位子と ポリマーとの間のジスルフィド基を開裂することＫよって担体から切断した。こ のジスルフィド基は、リシン自体のＡ−鎖及びＢ−鎖を結合するジスルフィド基 よりもｐＨ７の１０ｍＭのＤＴＥで還元して一層容易に開裂或は切断されること がわかった。

ｐＨ値７〜ＢのＤＴＥを種々の濃度で調量したが、リシン鎖の開裂が最小の最適 の結果はＤＴＥ濃度１０ｍＭ。

ｐ　Ｈ７，０で４５分間室温において得られ理論の５６Ｘの収量を生じた。この ようにして得た遊離の複合体はアシ上述した通りにして調製したリシン−配位゛ 子複合体をｐＨ６の１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中のコンカナバリンＡ −セファローズのカラムで親和（アフイニテイ）精製した。複合体はりシン成分 の炭水化物鎖を経てコンカナバリンＡに結合し、これより汚染物、吾に共役反応 を妨げる低分子量のチオールを無くすことかできる。リシン−配位子複合体を、 ＩＭのメチルα−Ｄ−マンノピラノシドを含有するｐＨ６の１１００ｒｎのリン 酸ナトリウム緩衝液で浴出し、リシン−配位子複合体１５〇−２００μｇか存在 する浴１１２ｍ７を生じた。生成物の試験体により、Ａ鎖は網状赤血球リゼイト において天然のりシンから誘導されるＡｕと同じ程度にまでタンパク質合成を抑 制することが示された。このＷ質か所望の方法で改質されたことは、固定化アジ アレフェツインのカラムを通過することによってＮ認され、およそα１μＭのり シンについて会合定数を有することが示された。この基準により、リシン結合部 位はブロックされていると考えた。

レクチン−配位子複合体のモノクローナル抗体への共有結合 リシン−配位子複合体に選択細胞に対する所望の特異性を付与するために、鈑複 合体をフロリダ、ハイアリア在コウルターインコーボレーテツドから市販されて いるネズミ（ｍｕｒｉｎｅ　）　モノクローナル抗−ＣＡＬＬＡ抗体Ｊ５に結合 させた。複合のために、ランバー）　（Ｌａｍｂｅｒｔ）等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、２６０巻、１２０５５−１２０４１（１９８５）に記載されている 通りにしてＪ５を精製し、次いでＳＭＣＣで改質した。

上述した通りのりシン−配位子複合体の溶液を次いでｐＨ７の緩衝液中の精製し 及び改質したＪ５抗体と混合し及び４℃において１時間静置させた。１時間した 彼に、反応混合物がモノクローナル抗体とりシン−配位子複合体との間の共有結 合した抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）、並びに過剰のモノクローナル抗体及び いくらかの未反応のりシン−配位子複合体を含有することが５ＤＳ−ＰＡＧＥＫ 酸ナトリタナトリウム緩衝液中ィンＡ−セファローズにより親和精製を行ない、 未反応のりシン−配位複合体を除いた。この工程はまた初めの方で導入したメチ ルα−Ｄ−マンノピラノシドを除去し、それによりコンカナ／くリン人−セファ ローズのカラムをそれ以上の精製工程として用いることを可能にした。プロティ ンＡ−セファローズカラムから溶出した物質は抱合体及び過剰のモノクローナル 抗体を含み、これを次いでコンカナバリン人−セ７アローズに適用し、そこで前 の通りにして抱合体をリシン−配位子複合体の炭水化物鎖を通して結合させた。

過剰のモノクローナル抗体を次いで広範囲の洗浄によって除き及び結合した抱合 体をｐ　Ｈ７，０の１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の１Ｍのメチルα− Ｄマンノピラノシドで溶出した。

ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ　）細胞、平均で１細胞当り６　Ｑ、０００ＣＡＬＬ Ａ及びリシンについて６０Ｑ、０００より多い結合部位を表わすパーキットの（ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ　）　’）ンバ腫系統を用いて、リシン−配位子複合体及び モノクローナル抗体に結合した複合体の両方の細胞毒性を試験した。リシン−配 位子複合体は天然リシンに比べて約１０倍毒性が低いことがわかった。この非特 異性毒性の減小は、Ａ鎖が複合体から遊離させた際に十分に活性であること力； 示された（上記を参照）通りに、Ｂ鋲止の結合部位のフ。

ロッキングによる。リシン−配位子複合体を５５に結合した場合に、その毒性は ＣＡＬＬＡを表わす標的細胞について３倍増太し及びその毒性はＣＡＬＬＡの無 〜λ非標的細胞について５倍減小した。最も有意には、抱合体の毒性は、飽和量 のＪ５を加えることによって５倍低下され、明らかに抗体が改質された毒素にあ る程度の特異性を授与することを示す。

伝」。

この例のプローブ製造のための反応式を第２図に示した。

改Ｊｕｌ主厩１ 例１に記載したようにして製造したカルボキシキャップドアミノエチルポリアク リルアミドＰ−１５０３（パックドビーズ２６ｍβ）の０．１　Ｍ重炭酸ナトリ ウム中の懸濁液（１３ｍｌ２）に、ジオキサン（６ｍβ）中の１−（５−マレイ ミドメチル−２−二トロフェニル）−エチルクロロホルメート７　（１，０２ｇ 、３．４８ミリモル）を添加した。５分間激しく振盪した後に、あらゆる過剰の アミノ基をキャップするためにメチルクロロホルメート（５ｍρ）を添加し、さ らに５分間振盪を続けた０次いでか過によって改質ポリアクリルアミドゲルビー ズ８を回収し、これをｐ　Ｈ７，０の０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ　 Ｈ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液とジメチルホルムアミドとの混合物 （１：　１、容量／容ｊＩ）及びジメチルホルムアミドで連続的に洗浄し、そし て次いで同じ溶液で逆の順に洗浄した。

立　−一　プローブの′。。

改質ポリアクリルアミドビーズ８（パックドビーズ２４ｍρ）をｐＨ７，０の０ ．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍβ）中に懸濁させ、例１に記載したよう にして製造した配位子Ｎ−（２°−メルカプトエチル）ラクトアミン２　（７０ ０ｍｇ、１．７４ミリモル）のｐ　Ｈ７，０の水溶液で処理した。この混合物を 終夜振盪し、次いでブフナー漏斗上で濾過することによって、ポリマービーズに 共有結合した配位子を含有するプローブ９を回収し、これをｐ　Ｈ７，０のリン 酸ナトリウム緩衝液で充分に洗浄した。配位子−担体プローブ９の試料（０，３ ｍｎ）を用いて小さいカラムを製造し、そしてリシンについてのプローブビーズ の特異的な結合能力を測定した。ｐＨ７，０においてプローブビーズ１ｍβが特 異的態様で１．０　ｍ　ｇ過剰のりシンに結合したことがわかった。特異的に結 合したりシン全部をラクトース０．２Ｍを含有する緩衝液で溶離させることがで きた。

プローブビーズ９のカラムを二官能価架橋剤２．４−ジクロロ−６−メドキシー トリアジンを用いて以下の方法で賦活した。０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（１０ｍ ｌ２）中のラクトース配位子含有ポリアクリルアミドビーズ（１０ｍ　１２　） の懸濁液に、ジオキサン（６，６ｍｇ）中の２．４−ジクロロ−６−メドキシト リアジン（０，２４ｇ、１．３４ミリモル）の溶液を添加した。この懸濁液を１ 分間激しく振盪し、次いでジエチルエーテルを用いた抽出（５ｍＪＺずつ３回） で過剰のトリアジンを除去した。賦活されたプローブビーズ１０を次いでｐ　Ｈ ６，５の０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し０、カラム中に充填した。

レクチン−１一旦　八　の：。゛ リシンの溶液（塩化ナトリウム０．１５　Ｍを含有するｐ　Ｈ７，０の０．０１ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５ｒｎＪ２中に１０ｍｇ）を賦活プローブカラムに２ 回通し、次いでこのカラムをカラム容積の３倍量のｐ　Ｈ８，６の０．０５Ｍト リエタノールアミン塩酸塩で洗浄し、そして周囲温度において２４時間放置した 。結合はしているがしかし共有架橋していないリシンを、ラクトース０．２　Ｍ を含有するｐ　Ｈ７，０の０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄することに よってビーズから除去した。

レクチン−己−八　の−からの 配位子との共有結合によって保持されたりシンを以下の方法で光分解することに よって担体ビーズから分離させた。ビーズを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ １０ｍＩ２）を用いてカラムからガラスペトリ皿に移し、ここで懸濁液を０．５ 　ｃ　ｍを越えない厚さの屡に形成せしめた０次いで配位子と担体との間の結合 を開裂させるためにこの懸濁液を、黒線長波紫外線ランプ（Ｂ−１００Ａ型、ウ ルトラバイオレット・プロダクツ社、カリフォルニア州、サンガブリエル、放射 ビーク３６５ｎｍ。

１５ｃｍにおける強度約１．１　ｍＷ／　ｃｒｒｉ’）から１５ｃｍの距離で１ ０分間照射した。照射した懸濁液をカラムに注ぎ戻し、ｐ　Ｈ７，０の０．１　 Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でビーズを充分に洗浄した。担体から分離されたりシ ン−配位子複合体を含有する一緒にした洗浄液（５０ｍ℃）を、存在し得る痕跡 量のりシン不純物を除去するためにａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ−ＴＳＫ　（２ｍ 　１２、リシンについての結合能過（ＹＭ−１０半透膜、アミコン社、マサチュ ーセッツ州、ダンバース）によって２ｍｇまで濃縮し、次いで塩化ナトリウム（ １５０ｍＭ）とＥＤＴＡ（１ｍＭ）とを含有するｐ　Ｈ８，０の０．０５Ｍ）− リエタノールアミン塩酸塩緩衝液中で平衡化させたバイオゲルＰ−６の小さいカ ラムに通して、緩衝液２．８　ｍ　１２中の純粋なりシン−配位子複合体１．２ 　ｍ　ｇが得られた。

モノクロナール　へのレクチン−立　Ａ　の北韮 複合体を抗体Ｊ５に共有結合させるために、下記に詳細に記載したようにして、 ヘテロニ官能価架橋剤２−イミノチオラン塩酸塩（ピース・ケミカル社、イリノ イ州、ロックホード）を用いて複合体中にスルフヒドリル基を導入し、ヘテロニ 官能価架橋剤スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（ピース・ケミカル社、イリノイ州、ロック ホード）を用いてモノクロナール抗体中にマレイミド基を導入した。

リシン−配位子複合体の溶液（２，８’　ｍ　Ｉ２）を氷上で冷却し、ｐ　Ｈ８ ，０の０．５　Ｍ　２−イミノチオラン塩酸塩溶液（０，０４４ｍ１２）で処理 して２−イミノチオランの最終濃度を８ｍＭにした。塩化ナトリウム（５０ｍＭ ）とＥＤ　Ｔ　Ａ　（１ｍＭ）とを含有するｐＨ５，８の５ｍＭのビストリス− アセテート緩衝液で平衡化させたバイオゲルＰ−６のカラムに通すゲル濾過によ って氷上で９０分後に反応を停止させた。こうして、リシン−配位子複合体１分 子につき平均０．８のチオール基が導入された。

ｐ　Ｈ７，０の０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中のＩ５の溶液（１５ｍ　ｆ ｌ中にＩ５が３ｍｇ）に、乾燥ジオキサン（０，０２ｍｌ２）中の１２当量のＳ ＭＣＣ（０，０７５ｍｇ）を添加した。３０℃において３０分間のインキュベー ションの後に、反応溶液を４℃においてセファデックスＧ−２５のカラムに通し て、抗体１分子につき平均１．５のマレイミド基を有する改質Ｊ５が得られた。

改質リシン−配位子複合体溶液と改質Ｊ５溶液とを混（０，０２８ｍβ）を添加 することによってｐＨを７．０に調節した。４℃において終夜放置した後に、ヨ ードアセトアミドを最終濃度５ｍＭになるように添加し、この溶液を限外濾過（ ＹＭ−１０フイルター、アミコン社）によって約２ｍＪ２に濃縮した。リン酸塩 緩衝塩水中のＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−３００のカラム（１，５ｘ９６ｃｍ）に通すゲ ル濾過によって精製を実施した。

リシン−配位子複合体及びモノクロナール抗体に結合した複合体の両方とも、例 １の生成物と同様に低下した非特異的毒性特性を示した。

匠ｌ 配位子はアゾ官能基によって結合され、ｐ　Ｈ８，５の０、５　Ｍナトリウムジ チオナイトで処理することによって分離させることができる（例えばコーヘン（ Ｃｏｈｅｎ）によるｒＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｊ　、第３４巻（１ ９７４年）、第１０２〜１０８頁を参照されたい）、プローブ製造のための反応 式は第３Ａ及び３Ｂ図に示した。

藍血王り旦ｌ 水（４０ｍＩ２）中の　−ラクトース（４，０ｇ、１水和物として１１．１ミリ モル）の攪拌された溶液に、メタノール（８ｍＩ２）中のアニリン（２，０７ｇ 、　２２．２ミリモル）の溶液及びメタノール（６ｍｇ）中のシアン硼水素化ナ トリウム（０，７ｇ、　１１．１ミリモル）の溶液を添加した。酢酸を用いて混 合物のｐＨを６．５に調節し、この溶液を室温において攪拌した。

１５時間後に蒸発によってメタノールを除去し、過剰のシアノ硼水素化ナトリウ ムを破壊するためにアセトン（１２ｍｇ）を添加し、この溶液を室温において１ 時間攪拌した１次いでこの溶液を蒸発乾固させ、残渣を水（７５ｍＩ２）中に再 び溶解させ、酢酸を用いてこの溶液をｐ　Ｈ５，５に調節し、水中で平衡化され たアンバーライトＩＲＡ−１１８）１イオン交換樹脂のカラム（６０ｍｇ）に適 用した。このカラムを水（６００ｍｊＮで洗浄し、１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液 で糖を溶離させて、多少の塩で汚染されたＮ−フェニルラクトアミン配位子１３ を含有する白色固体５．４ｇが得られた。

豪ｌ且生豆１１ カルボキシキャップドアミノエチルポリアクリルアミドＰ−１５０３（パックド ビーズ１２ｍｌ２）の０．２　ＭＮａＣＪ２中の懸濁液（合計容量２０ｍＪ２） に、ＴＨＦ（５ｍｌ２）中のｐ−ニトロベンゾイルアジド（５７６ｍｇ％　３ミ リモル）とトリエチルアミン（３０４ｍｇ。

３ミリモル）とを添加した。このゲルを２０分間ゆるやかに振盪し、次いでさら にトリエチルアミン３０４ｍｇ（３ミリモル）を添加した。この懸濁液をさらに ２５分間振盪した後に、ｐ−ニトロベンゾイル置換担体ビーズをＴＨＦと０．２ 　Ｍ　−Ｎ　ａ　Ｃ！ｌ溶液との混合物（１：１、容量／容ｊり　、ホルムアミ ド及び０．２　Ｍ　−Ｎ　ａ　Ｃ１２溶液で連続して洗浄した。

次いでこのビーズを１００ｍＭ−ＮａＨＣＯ，の溶液（１０ｍｇ）中に懸濁させ 、あらゆる過剰のアミノ基をキャップするためにメチルクロロホルメート（２ｍ ｇ）と共に激しく振盪した。過剰のクロロホルメートを除去するためにこの懸濁 液をジエチルエーテルで抽出（１５ｍｇずつ２回）し、ビーズをｐ　Ｈ７，０の １００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。ｐＨ７，０の１００ｍＭリン酸 ナトリウム緩衝液中のゲルの懸濁液（最終容量２０ｒｎＪ２）に、ナトリウムジ チオナイト（２，６１ｇ。

１５ミリモル）を添加した０次いでこの懸濁液を水浴中で５５℃に保持し、周期 的に取り出して振盪した。４５分後に、ｐ−アミノベンゾイル置換担体ゲルビー ズを０、２　Ｍ　−Ｎ　ａ　ＣＡ溶液で洗浄した。これら改質ポリアクリルアミ ドゲルビーズ（パックドビーズ５ｍ℃）のＩＭ−ＨＣｆ２中の懸濁液（最終容量 １０ｍρ）に０℃において、亜硝酸ナトリウム（６９ｍｇ、１ミリモル）の冷却 水溶液（１ｍ℃）を添加した。この懸濁液を４℃において２０分間ゆるやかに振 盪し、次いでこのビーズを０．２Ｍ−ＮａＣＩ２冷溶液で迅速に洗浄して、ｐ− ジアゾベンゾイル置換担体ビーズ１２を得た。

己立　−担　プローブの札り ほう酸ナトリウム飽和溶液（１０ｍｇ）中のＮ−フェニルラクトアミン配位子１ ３　（８１０ｍｇ、　１．９ミリモル）の溶液を冷却ジアゾ改質担体１２に添加 し、これはすぐに深赤色になった。この懸濁液を４℃において終夜ゆるやかに振 盪し、次いで０．２’Ｍ−ＮａＣρ溶液で充分に洗浄して、配位子がアゾ基を介 して担体に共有結合した深赤色の配位子−担体プローブ１４を分離させた。配位 子−担体プローブ１４の一部（０，５０ｍＩ２．）を用いて小さいカラムを製造 し、これを用いて、特異的な結合能力がパックドビーズ１ｍρにつき０．５　ｍ 　ｇであることが示された。結合したりシンを２通りの方法で溶離させることが できるということを示すことによって、リシンが特異的に結合したということが 証明された。高濃度ガラクトースとの競争によってリシン−配位子の特異的な相 互作用を分裂させることができ、また、ｐＨ８の０．２〜０．５　Ｍナトリウム ジチオナイト溶液で処理することによって配位子−担体結合を開裂させることが できる１両方の場合において、リシン又はリシン−配位子複合体はカラムから定 量的に溶離された。ジチオナイトでの処理が担体からの配位子の開裂によってリ シンを放出するということのさらなる証明として、このゲルはアゾ基の発色によ る深赤色を即座に失う。

配位子−担体プローブ１４を二官能価架橋剤２．４−ジクロロ−６−メドキシト リアジンを用いて以下の方法で賦活した。乾燥ＤＭＦ中の配位子−担体プローブ ビーズ１４（ｐＨ７，０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中のパックドビー ズ容量５ｍｌ２）の懸濁液（２０ｍｇ）に、乾燥ＤＭＦ　（１０ｍｎ）中の２． ４−ジクロロ−６−を添加した。この懸濁液を室温において２２時間ゆるやかに 攪拌した。賦活されたプローブビーズ１５を次いでＤＭＦ、ＤＭＦ−ｐＨ７，０ の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液及び最後にｐ　Ｈ７，０の１００ｍＭリン 酸ナトリウム緩衝液で連続的に洗浄し、カラム中に充填した。

レクチン−立　−−Ａ　の・、′ リシンの溶液（塩化ナトリウム０．１５Ｍを含有するｐ　Ｈ７，０の０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液３ｍβ中に５、７　ｍ　ｇ　）を、賦活プローブカラム １５に適用し、この流動通過を２回適用した。このカラムをカラム容積の３倍量 のｐ　Ｈ８，６の０．０５Ｍトリエタノールアミン塩酸塩で洗浄し、そして周囲 温度において２４時間放置した。

結合はしているがしかし共有架橋していないリシンを、ガラクトース０．５　Ｍ を含有するｐ　Ｈ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄する ことによって除去した０次いで以下の方法で共有結合を切断することによってリ シン−配位子複合体な担体から分離させた。カラムを、残留ガラクトースを除去 するためにｐ　Ｈ８，６の０．０５Ｍｔ−リエタノールアミン塩酸塩緩衝液で、 そして次いで塩化ナトリウム０．３Ｍを含有するｐ　Ｈ８，０の０．２Ｍナトリ ウムジチオナイト溶液で洗浄した０次いでビーズを分離容器に移し、ｐ　Ｈ８， ０の０．２　Ｍナトリウムジチオナイトと０．３　Ｍ塩化ナトリウムとの溶液と 共に２０分間攪拌した。この懸濁液を濾過し、ビーズを同様の方法でさらに２回 ジチオナイトで処理した。このジチオナイト溶液を貯蔵し、担体から遊離したり シンー配位子複合体約０．８　ｍ　ｇを含有する溶液１２ｍβが得られた。

この複合体は、慣用の二官能価架橋剤を用いてＪ５のようなモノクロナール抗体 に対して共有結合することができる。

同様の結果でリシンを他のレクチンに置き換えることができる。レクチン−配位 子−モノクロナール抗体複合体は生体内並びに生体外で選択された細胞を殺すの に使用することができる。

ＦＩＧ　ＢＢ 手続補正書（方式） ％式％ 補正をする者 住　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号油脂工業会館電話２７３−６４ ３６番 補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の欄 明細書及び請求の範匠の翻訳文　各１通委任状及びＰ訳文　各１通 補正の内容　別紙の通り 明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告 １′″′Ｊｈａ″＋＋　ＭＤＩ＜″””’　ＤＭ／１Ｉｓ１１７１００６１１

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．非特異性毒性の減小した細胞毒性レクチン複合体の製造方法であつて、 該レクチン上のオリゴ糖結合部位に特異的に結合することができる特異性配位子 を与え、 該配位子を固体超体に共有結合させてプローブを形成し、 該レクチンを該プローブに接舷させて該結合部位と該邑位子との間の特異的結合 を形成し、 その後で該レクチンと該配位子との間の共有結合を形成し、 それにより該レクチンと該担体に共有結合させた該配位子との複合体とする方法 。
2. ２．前記配位子と前記担体との間の前記共有結合を切断して前記レクチンを該配 位子に共有結合させて成る複合体を解放する追加の工程を含む特許請求の範囲第 １項記載の方法。
3. ３．前記複合体とモノクローナル抗体との間の共有結合を形放する追加の工程を 含む特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。
4. ４．前記複合体とモノクローナル抗体との間の共有結合を形成し及び前記配位子 と前記担体との間の前記共有結合を切断する追加の工程を含む特許請求の範囲第 １項記載の方法。
5. ５．前記レクチンがリシンを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．前記配位子がガラクトース成分を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記配位子がＮ−（２′−メルカプトエチル）ラクトアミンを含む特許請求 の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記配位子がＮ−フエニルラクトアミンを含む特許請求の範囲第１項記載の 方法。
9. ９．レクチンに特異的に結合して非特異性細胞毒性の低下した複合体を形成する ことができるプローブの製造方法であつて、 該レクチン上のオリゴ糖部位に特異的に結合することができる配位子を与え、 該配位子を固体の担体に共有結合させて該プローブを形成する ことを含む方法。
10. １０．前記共有結合が前記レクチンに不活性な試薬により開製し得る特許請求の 範囲第９項記載の方法。
11. １１．前記配位子がガラクトース成分を含む特許請求の範囲第９又は１０項記載 の方法。
12. １２．前記配位子がＮ−（２′−メルカプトエチル）ラクトアミンを含む特許請 求の範囲第９又は１０項記載の方法。
13. １３．前記配位子がＮ−フエニルラクトアミンを含む特許請求の範囲第９又は１ ０項記載の方法。
14. １４．前記共有結合がジスルフイド基を含む特許請求の範囲第１０項記載の方法 。
15. １５．前記共有結合がアゾ基を含む特許請求の範囲第１０項記載の方法。
16. １６．前記共有結合が光開裂性基を含む特許請求の範囲第１０項記載の方法。
17. １７．固体超休をレクチン上のオリゴ糖結合部位に特異的に結合し及び配位子と 特異的に結合したレクチンとの間で共有結合を形成することができる配位子に共 有結合させて成るレクチンに特異的に結合して非特異性細胞毒性の低下した複合 体を形成することができるプローブ。
18. １８．前記配位子がガラクトース成分を含む特許請求の範囲第１７項記載のプロ ーブ。
19. １９．前記担体と配位子との間の前記共有結合が開裂性である特許請求の範囲第 １８項記載のプローブ。
20. ２０．前記担体と配位子との間の前記共有結合がジスルフイド結合を含む特許請 求の範囲第１８項記載のプローブ。
21. ２１．前記担体と配位子との間の前記共有結合がアゾ基を含む特許請求の範囲第 １８項記載のプローブ。
22. ２２．前記担体と配位子との間の前記共有結合が光開裂性基を含む特許請求の範 囲第１８項記載のプローブ。