ES2253224T3 - Polimero destinado a unir los ligandos contenedores de aminas y sus usos. - Google Patents
Polimero destinado a unir los ligandos contenedores de aminas y sus usos.Info
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Abstract
Procedimiento para la inmovilización de un ligando L-NH2 que contiene grupos amino mediante un componente dialdehido OHC-X-CHO y un componente polimerizable R-Z, donde R es una porción polimerizable y Z se selecciona entre -SH, , S-S-alquil, -CN y Sy -SO2, llevando a cabo las siguientes reacciones simultáneamente y/o secuencialmente en cualquier orden químicamente posible: i) polimerización de la porción R polimerizable, opcionalmente junto con uno o más comonómeros; ii) reacción de un componente que contiene -Z con el componente dialdehido; iii) reacción de L-NH2 con el componente dialdehido o con el producto de la reacción (ii).
Description
Polímero destinado a unir los ligandos
contenedores de aminas y sus usos.
La presente invención se refiere a un polímero
capaz de unirse a ligandos amina, a su preparación y a usos que
incluyen ensayos y cromatografía.
La necesidad por la medida y cuantificación de
las actividades de los humanos va en aumento. Los sensores
satisfacen parcialmente este requerimiento aunque para muchas
aplicaciones no se encuentran disponibles de manera fácil y en una
forma adecuada para la comercialización.
Una clase particular de sensores, como los
sensores de bio- y quimioreconocimento, requiere la integración de
ligandos (reconocimiento de elementos) a un transductor.
Normalmente, la integración debería permitir cambios en el
reconocimiento del elemento causados por la interacción con un
correspondiente analito para convertirse en una señal medible a
través del transductor.
La inmovilización de los ligandos a la superficie
de un transductor adecuado es una etapa necesaria en la fabricación
de los sensores. Las propiedades deseables en este procedimiento
incluyen: colocación de cantidades apropiadas de ligandos sobre la
superficie del detector usando procedimientos simples, mantenimiento
de la actividad de bioreconocimiento de los ligandos después de la
inmovilización y minimización de las interacciones no específicas
entre la muestra y el elemento de reconocimiento u otras partes del
sensor.
Recientemente se han descubierto una amplia
variedad de procedimientos para la unión de diferentes ligandos a
los transductores con el fin de crear bio- y quimiosensores
efectivos y sensibles.
Los ejemplos se describen en
US-A-4177038,
US-A-4250267,
US-A-4784962,
US-A-5242828,
US-A-5436161 y Löfas, S., Johnsson,
B., Tegendal, K., Rönnberg, I., "Superficies de oro modificadas
con dextrano para sensores de resonancia de plasma de superficie:
immunoreactividad de anticuerpos inmovilizados y estudios de
interacción de superficie-anticuerpo", (1993),
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 1:
83-89.
También resulta de interés Simons, S., Jr. Et
al., "Reacción de O-ftalaldehido y Tioles con
Aminas Primarias; Formación de 1-Alquil (y Aril)
Tio-.alfa-Alquil-isoindoles",
(1978), J. Org. Chem., 43, (14), 2886-2896.
Una aproximación común es el uso de superficies
de transductor modificadas con capas de hidrogel (patente US
5436161), tales como carboximetil-dextrano. De
manera típica, los polímeros de hidrogel se inmovilizan
covalentemente a una superficie de un transductor para formar una
fina capa de hidrogel. Los ligandos se pueden inmovilizar
covalentemente al polímero de hidrogel usando una activación
química. Dicho procedimiento en multietapas implica un aumento
significativo del coste de cualquier fabricación en masa de un
dispositivo sensor. Una aproximación alternativa que pudiera
eliminar esta desventaja resultaría un beneficio considerable.
En un primer aspecto, la invención proporciona un
procedimiento de inmovilización del ligando
L-NH_{2} que contiene un grupo amino mediante un
componente dialdehido OHC-X-CHO y un
componente polimerizable R-Z, en el que R es una
porción polimerizable y Z se selecciona entre -SH,
-S-alquilo, -CN y -SO_{2}, llevando a cabo las
siguientes reacciones simultáneamente y/o secuencialmente en
cualquier orden químicamente posible:
- i)
- polimerización de la porción R polimerizable, opcionalmente junto con uno o más comonómeros;
- ii)
- reacción de un componente que contiene -Z con el componente dialdehído;
- iii)
- reacción de L-NH_{2} con el componente dialdehído o con el producto de la reacción (ii).
Preferiblemente, el componente dialdehído es un
1,4-dialdehído, generalmente conjugado
(OHC --
\uelm{C}{\uelm{\para}{}} =
\uelm{C}{\uelm{\para}{}} --
CHO).
Formando parte, generalmente, de un sistema de
anillo aromático, p.e., puede ser o-ftalaldialdehído
(I):
La conjugación puede ser deseable para
proporcionar un producto detectable mediante procedimientos ópticos,
p.e., que impliquen fluorescencia.
La porción polimerizable R contiene generalmente
uno o más enlaces múltiples carbono-carbono. Por
ejemplo, R-Z puede ser alil mercaptano.
La polimerización puede implicar comonómeros así
como las porciones R. Se pueden utilizar para "diluir" los
grupos Z en el polímero. En particular, cuando Z es -SH, dicha
dilución puede ser deseable para reducir la ocurrencia de
reticulación a través de puentes de Z-Z (p.e.,
disulfuro). Los comonómeros se pueden también usar para regular la
solubilidad del polímero con el fin de conseguir aplicaciones
particulares.
Particularmente, cuando Z es -SH o
-S-alquilo, la reacción puede ser adecuada para
conseguir auto-reunión (congregación) de un
polímero sobre una superficie adecuada (en particular una superficie
metálica, especialmente metal noble, o una superficie que tenga
grupos -SH). Por tanto, una clase preferida de realización se basa
en la capacidad de un polímero sintético, que contiene grupos
tioacetal formados por un grupo mercapto y un dialdehido ftálico,
para autounirse sobre una superficie metálica y unirse a los
ligandos que contienen amino para formar un complejo fluorescente.
El polímero se puede sintetizar usando polimerización o
policondensación iónica o radicalaria. Resulta preferible que por
lo menos uno de los monómeros usados en la polimerización contenga
grupos SH libres. En otra variante, el polímero se puede preparar
primero usando un monómero que contenga un grupo -SH y a
continuación se trata con el dialdehido para formar un tioacetal.
También resulta posible utilizar, para la preparación del polímero,
monómeros que contengan grupos CN y SO_{2} en lugar de, o
simultáneamente con, el monómero que contiene
grupos -SH.
grupos -SH.
Las superficies recubiertas con un polímero de la
invención pueden constituir placas de microvaloración, pocillos,
transductores (p.e., para dispositivos de resonancia de plasma de
superficie o electroquímicos), o materiales de unión, p.e. para
cromatografía.
Un polímero de la invención puede comprender
unidades de fórmula II:
donde R' proviene de la
polimerización de un grupo
R.
La unidad
proviene preferiblemente de un
sistema de anillo aromático, p.e.
siendo
opcionalmente substituido y/o
fusionado para formar un
policiclo.
Un polímero de la invención que incorpora
L_NH_{2} puede comprender unidades de fórmula III:
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
\vskip1.000000\baselineskip
corresponde
a
\vskip1.000000\baselineskip
en la fórmula II, p.e.
siendo
\vskip1.000000\baselineskip
(opcionalmente substituido y/o
fusionado).
Los polímeros descritos anteriormente pueden
usarse en la cromatografía de afinidad o en sensores. El citado
polímero que contiene grupos -SH se puede adsorber sobre una
superficie metálica o sobre una superficie que contiene grupos -SH
(p.e. durante la síntesis) formando un recubrimiento homogéneo y
estable. Es posible preparar en primer lugar un recubrimiento de
una superficie con un polímero de RSH, con posterior tratamiento de
este polímero con un dialdehido, preferiblemente dialdehido ftálico
y a continuación un ligando conteniendo amino. De nuevo, el ligando
se puede inmovilizar mediante adición simultánea del compuesto
deseado con dialdehido al polímero que contiene grupos -SH. Sobre
el polímero, sintetizado tal como se ha descrito anteriormente, se
puede inmovilizar fácilmente especies tales como células, enzimas,
virus, hongos, anticuerpos, proteínas, péptidos, amino-ácidos,
ácidos nucleicos y derivados o mezclas. Las especies inmovilizadas
pueden servir ellas mismas para la unión de un segundo tipo de
ligando. La unión del segundo tipo de ligando puede afectar las
propiedades medibles, p.e. la fluorescencia, de manera que la unión
se puede detectar. Los ligandos del primer y segundo tipo pueden
constituir pares de unión específicos, p.e.
anticuerpo-antígeno.
La inmovilización del ligando sobre la superficie
del polímero incluye la interacción de una etapa entre el tioacetal
y el grupo amino sin activación química de los grupos funcionales
del polímero o del ligando. La formación de complejos fluorescentes
se puede usar para monitorizar la unión. Se ha encontrado que el
complejo de iso-indol formado por tioacetal con
grupos amino ligandos es muy estable, lo que permite el uso de
condiciones ácidas fuertes para la regeneración de la
superficie.
El dialdehido aromático homólogo,
o-ftaldialdehido, o tioacetal es esencialmente no
fluorescente hasta que ha reaccionado con la amina primaria en
presencia de exceso de cianuro o mercaptano para dar lugar al
isoindol fluorescente. El control de la fluorescencia del polímero
proporciona una oportunidad para controlar directamente la cantidad
de substancias unidas a la superficie del polímero, el cual puede
ser usado en sensores y ensayos.
La Figura 1 muestra esquemas de reacción de
posible uso en la invención;
La figura 2 describe una dependencia de los
espectros de emisión de
OPA-AM-polímero para diferentes
concentraciones de hidróxido amónico (1-100 mM). La
línea de puntos es el control sin hidróxido amónico. La mezcla de
reacción está constituida por 3 mg/ml de polímero en una mezcla 1:1
de acetonitrilo y tampón fosfato 0,1 M, pH 7,8. El tiempo de
incubación es de 30 min.
La figura 3 describe la dependencia de la
respuesta de OPA-AM-polímero para
amoníaco 100 mM con respecto al pH.
La figura 4 describe el cambio en la intensidad
del espectro de emisión de
OPA-AM-polímero
(l(lambda)_{exc} 355 nm) como respuesta a la
adición de peroxidasa de rábano picante.
La Figura 5 describe el depósito de un polímero
sobre la superficie de oro usando un sistema de flujo.
La Figura 6 describe una unión covalente de
inmunoglobulina humana en la superficie recubierta con
OPA-AM-polímero seguido de unión
con inmunoglobulina anti humana.
La figura 7 describe la regeneración de la
superficie recubierta con 0,1% de SDS/HCl 10 mM.
La Figura 8 describe el desplazamiento de
inmunoglobulina anti humana (HIGg) mediante la inmunoglobulina
humana de la superficie del prisma recubierto con
OPA-AM-polímero con la consiguiente
regeneración. Las concentraciones de HIGg y
anti-HIGg son 10 mg/ml.
La figura 9 es un diagrama de barras que muestra
la capacidad de unión del polímero OPA-AM con
diferentes proteínas.
La Figura 1 muestra algunos ejemplos de tipos de
reacción que se pueden usar en la invención.
La reacción (i) muestra la interacción de
o-ftal-dialdehido ("OPA"), (I)
con un tiol polimerizable R-SH y un ligando amina
L-NH_{2} para dar lugar a un isoindol fluorescente
(IV). Las reacciones (ii) y (iii) muestran el procedimiento llevado
a cabo en etapas secuenciales: reacción de OPA (I) con el tiol para
formar el tioacetal (V), el cual a continuación reacciona con el
ligando amina.
A continuación, se describe la preparación de un
polímero que realiza la invención y algunos experimentos llevados a
cabo con el mismo.
Se disuelven 134 mg de OPA y 82 mg de alil
mercaptano (AM) en 2 ml de metacrilato de
2-hidroxietilo y 2 ml de acetonitrilo. Como
catalizador para esta reacción se usa 50 mg de AIBIN. La mezcla de
reacción se incuba durante toda la noche a 80ºC. El polímero
(OPA-AM) se disuelve en etanol y se añade tampón de
fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0. El gránulo resultante se recoge y se
lava con agua usando un filtro de vidrio.
Se disuelven 30 mg de polímero
OPA-AM en 10 ml de acetonitrilo/H_{2}O (1:1). Para
ajustar la mezcla a pH básico se añaden 30 ml de NaOH 4%. Las
medidas de fluorescencia se efectúan con un Espectrofluorofotómetro
PC RF-5301 (Shimadzu, Japón).
El polímero se excita a una longitud de onda de
355 nm y se mide el espectro de emisión. Se ha encontrado que la
intensidad de la fluorescencia depende de la presencia de grupos
amino en la muestra (ver Fig. 2), del tiempo de incubación (no
indicado) y del pH (ver Fig. 3). Se efectuaron los mismos
experimentos usando peroxidasa de rábano picante obteniéndose
resultados similares (Fig. 4).
Se sumergen prismas de vidrio recubiertos con una
capa de oro de >> 50 nm en la solución de polímero en metanol
(1 mg/ml) durante 5 min., se lava dos veces con metanol y agua.
En otra variación del procedimiento, la solución
del polímero en metanol se hace pasar a través de la célula de
flujo (20 ml de volumen) con una velocidad de flujo de 5 ml/min
durante 10 min. A continuación se hace pasar metanol durante 10 min
para eliminar el exceso de polímero. El desplazamiento en la
posición del mínimo de la curva reflectiva (A_{SPR}) es el
resultado de la inmovilización del polímero (Fig. 5).
Se inyectan 100 ml de solución de IgG humana (0,1
mg/ml, tampón de borato sódico 100 mM, pH 9,0) y se mide la
velocidad de inmovilización usando barrido angular. Se mide el
desplazamiento de la posición del mínimo de la curva
reflectiva.
Se observa (Fig. 6) la adsorción de los segundos
anticuerpos específicos para las HIGg inmovilizadas covalentemente
(anti HIGg). La superficie se regenera con una mezcla al 0,1% de
SDS/HCl 10 mM (Fig. 7).
El tiempo de barrido se aplica a la medición de
los efectos unión/desplazamiento (Fig. 8). Se ha encontrado que la
matriz OPA-AM crea una superficie reactiva, que es
adecuada para los transductores ópticos. Resulta estable durante el
almacenamiento, sencillo de preparar y resulta adecuado para la
producción en masa de biosensores.
La capacidad de unión del polímero se demuestra
con diversas proteínas:
Microperoxidasa (FW(Peso Fórmula)=1 kD),
citocromo C (FW= 12,4 kD), peroxidasa de rábano picante (HRP) (FW=
44 kD), albúmina de suero bovino (BSA) (FW= 66 kD) y hemoglobina
(FW= 67 kD). Se incuban 10 mg de polímero con 400 ml de solución de
proteína (5 mg/ml) en tampón HEPES 10 mM, pH 8,6, durante 18 horas.
La concentración de proteína antes y después de la sorción se mide
espectrofotométricamente usando un procedimiento BCA (véase Osnes
T., Sandstad O., Skar V., Osnes M, Kierulf P., Scandinavian Journal
of Clinical & Laboratory Investigation, 1993, 53 (7):
757-763) y se calcula usando curvas de calibrado
obtenidas individualmente para cada proteína. Se ha calculado que 1
g del polímero puede unirse a 0,6 mg de BSA, 0,55 mg de citocromo C,
0,2 mg de microperoxidasa, 0,5 mg de peroxidasa de rábano picante y
1 mg de hemoglobina (Figura). Por tanto, la capacidad de unión del
polímero y la sensibilidad de la detección de la fluorescencia
depende del número de aminas disponibles, que es una función tanto
de la estructura de la proteína como de su composición de
aminoácidos. La velocidad de inmovilización se ha encontrado que es
comparable a los sorbentes comerciales usados para la inmovilización
de proteínas tales como la Sepharose 4B con CN activada (Pharmacia,
Suecia). Está anticipado que el polímero se puede usar como una
matriz de inmovilización alternativa eficaz en la cromatografía de
afinidad para la inmovilización de aminas orgánicas, proteínas y
ácidos nucleicos de bajo peso molecular así como en los componentes
de sensores/ensayos para la detección de aminas primarias.
Claims (18)
1. Procedimiento para la inmovilización de un
ligando L-NH_{2} que contiene grupos amino
mediante un componente dialdehido
OHC-X-CHO y un componente
polimerizable R-Z, donde R es una porción
polimerizable y Z se selecciona entre -SH,
-S-alquil, -CN y -SO_{2}, llevando a cabo las
siguientes reacciones simultáneamente y/o secuencialmente en
cualquier orden químicamente posible:
- i)
- polimerización de la porción R polimerizable, opcionalmente junto con uno o más comonómeros;
- ii)
- reacción de un componente que contiene -Z con el componente dialdehido;
- iii)
- reacción de L-NH_{2} con el componente dialdehido o con el producto de la reacción (ii).
2. Procedimiento de la reivindicación 1 en el que
el componente dialdehido es un 1,4-dialdehido.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 en el que
el componente dialdehido tiene la forma
OHC --
\uelm{C}{\uelm{\para}{A}} =
\uelm{C}{\uelm{\para}{B}}
CHO4. Procedimiento de la reivindicación 3 en el que
A-C=C-B constituye un sistema de
anillo aromático.
5. Procedimiento de la reivindicación 1 en el que
el componente dialdehido es un o-ftaldialdehido.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que R contiene uno o más dobles o
triples enlaces carbono-carbono.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el citado componente
polimerizable es un tiol R-SH.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el componente
R-Z o el producto resultante de su polimerización
y/o reacción con el componente dialdehido se adsorbe sobre una
superficie metálica o una superficie que contiene grupos SH; y que
efectuando el procedimiento da lugar a que el ligando se quede
inmovilizado sobre la citada superficie.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que lleva a un complejo fluorescente, y
en el que la inmovilización del ligando se detecta mediante la
monitorización de la fluorescencia.
10. Polímero que comprende unidades de la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R' proviene de una porción
polimerizable que contiene uno o más enlaces múltiples
carbono-carbono.
\newpage
11. Polímero que comprende unidades de la
fórmula
donde R' proviene de una porción
polimerizable que contiene uno o más enlaces múltiples
carbono-carbono
y
proviene de un ligando
L-NH_{2} que comprende un aminoácido, un péptido,
una proteína, un ácido nucleico o un derivado de cualquiera de los
mismos.
12. Polímero según la reivindicación 10 o la
reivindicación 11 en el que
es un sistema de anillo
aromático.
13. Medio de unión que comprende un material de
soporte que tiene una superficie que soporta un polímero según la
reivindicación 10 o la reivindicación 11.
14. Medio de unión según la reivindicación 13 que
es una fase estacionaria para cromatografía.
15. Columna o placa de cromatografía que tiene
una fase estacionaria según la reivindicación 14.
16. Dispositivo biosensor que comprende un medio
de unión según la reivindicación 13.
17. Procedimiento de ensayo para la detección de
ligandos mediante un dispositivo según la reivindicación 16, que
incluye la exposición del citado medio de unión a una muestra que se
supone que contiene dichos ligandos, y para la monitorización de
propiedades ópticas del citado medio de unión.
18. Procedimiento, medio o dispositivo según una
cualquiera de las reivindicaciones 13-17 en el que
el material de soporte contiene un polímero según la reivindicación
10 y sirve para la unión de ligandos que contienen grupos
amino.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9909245.4A GB9909245D0 (en) | 1999-04-22 | 1999-04-22 | Reactive polymers and their application in reactions and assays |
| GB9909245 | 1999-04-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ES00927443T Expired - Lifetime ES2253224T3 (es) | 1999-04-22 | 2000-04-25 | Polimero destinado a unir los ligandos contenedores de aminas y sus usos. |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1173761B1 (es) |
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| DE (1) | DE60024432T2 (es) |
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| GB (1) | GB9909245D0 (es) |
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