JP4921615B2 - プロテインａを自己組織化膜上に固定する方法 - Google Patents
プロテインａを自己組織化膜上に固定する方法 Download PDFInfo
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Description
本発明はプロテインＡを自己組織化膜上に固定する方法に関する。
試料に含有される標的物質（すなわち、抗原）を検出または定量するために、バイオセンサが用いられる。抗原と抗体との間の高い親和性およびプロテインＡと抗体との間の高い親和性がバイオセンサにおいて利用され得る。具体的には、プロテインＡが当該バイオセンサに固定されている。さらに、プロテインＡの上に、抗体が固定されている。抗原がバイオセンサに供給されると、抗原と抗体との間の高い親和性のために、抗原がバイオセンサに固定される。
特許文献１は、プロテインＡとビオチンとの間の高い親和性を利用した従来のバイオセンサを開示している。図２は、特許文献１の図７に開示されたバイオセンサを示す。
特許文献１の図７に関する記述によれば、当該バイオセンサは、生体分子の活性をスクリーニングするために用いられる。当該バイオセンサは、単層７、親和性タグ８、アダプター分子９、およびタンパク質１０を具備している。単層７は、化学式Ｘ−Ｒ−Ｙによって表される自己組織化膜から構成される（段落番号００８０、００８２、００８４、００８５を参照）。Ｘ、Ｒ、およびＹの一例は、それぞれ、ＨＳ−、アルカン、およびカルボキシル基である（００８４、００８５、および０１０９、０１１９）。
標的物質の検出感度または定量精度を向上させるためには、当該バイオセンサに固定されるプロテインＡの量を増やすことが必要とされる。
本発明者は、自己組織化膜に一分子のアミノ酸を結合させ、そしてプロテインＡを固定することによって、単位面積あたりのプロテインＡの固定量が著しく増加されるという知見を見いだした。本発明はこの知見を元に完成された。
本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるプロテインＡの量を増加させる方法、及び当該方法により固定されたプロテインＡを有するセンサを提供することである。
以下の項目Ａ１〜Ｃ６は、上記課題を解決する。
Ａ１：プロテインＡを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）をこの順に含有する。
一分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記一分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
(式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す)
前記一分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸より選択され、
前記基材上にプロテインＡを供給し、前記一分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記プロテインＡのアミノ基との間の反応により、以下の化学式（ＩＩ）によって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
(式中、Ｒは前記一分子の分子アミノ酸の側鎖を示す)
一分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記一分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
(式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す)
前記一分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸より選択され、
前記基材上にプロテインＡを供給し、前記一分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記プロテインＡのアミノ基との間の反応により、以下の化学式（ＩＩ）によって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
(式中、Ｒは前記一分子の分子アミノ酸の側鎖を示す)
Ａ２：前記項目Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）をこの順で具備する：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応により前記化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合を形成する工程（ａ２）
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応により前記化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合を形成する工程（ａ２）
Ａ３：前記項目Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）と前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）混合液により活性化する工程（ａｂ）。
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）混合液により活性化する工程（ａｂ）。
Ａ４：前記項目Ａ２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）と前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ（N-Hydroxysuccinimide）および（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ（N-Hydroxysuccinimide）および（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
Ａ５：前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、前記項目Ａ１に記載の方法。
（式中、Ｒは前記一分子の分子アミノ酸の側鎖を示す）
（式中、Ｒは前記一分子の分子アミノ酸の側鎖を示す）
Ａ６：前記項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される。
Ａ７：前記項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択される。
Ａ８：前記項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。
Ａ９：前記項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンからなる群から選択される。
Ｂ１：自己組織化膜、一分子のアミノ酸、およびプロテインＡを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記プロテインＡの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記プロテインＡが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸より選択される、センサ。
前記自己組織化膜および前記プロテインＡの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記プロテインＡが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸より選択される、センサ。
Ｂ２：前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、前記項目Ｂ１に記載のセンサ。
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
Ｂ３：前記項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される。
Ｂ４：前記項目にＢ１記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択される。
Ｂ５：前記項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。
Ｂ６：前記項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンからなる群から選択される。
Ｃ１：センサを用いて試料に含まれる標的物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびプロテインＡ、および抗体を備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記プロテインＡの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記抗体および前記１分子のアミノ酸の間には、前記プロテインＡが挟まれており、
前記抗体は、前記標的物質に特異的に結合し、
前記プロテインＡが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記一分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる群から選択され、前記Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖であり、
前記センサに前記試料を供給し、前記プロテインＡに前記標的物質を結合させる工程（ｂ）、および
前記結合された標的物質またはその量から試料に含まれる標的物質を検出または定量する工程（ｃ）。
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびプロテインＡ、および抗体を備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記プロテインＡの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記抗体および前記１分子のアミノ酸の間には、前記プロテインＡが挟まれており、
前記抗体は、前記標的物質に特異的に結合し、
前記プロテインＡが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記一分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる群から選択され、前記Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖であり、
前記センサに前記試料を供給し、前記プロテインＡに前記標的物質を結合させる工程（ｂ）、および
前記結合された標的物質またはその量から試料に含まれる標的物質を検出または定量する工程（ｃ）。
Ｃ２：前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、前記項目Ｃ１に記載の方法。
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
Ｃ３：前記項目Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される。
Ｃ４：前記項目Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択される。
Ｃ５：前記項目Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。
Ｃ６：前記項目Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンからなる群から選択される。
本発明は、単位面積あたりに固定されるプロテインＡの量の著しい増加を達成する。
図１を参照しながら、本発明の実施の形態が、以下、説明される。
（実施の形態１）
図１は、プロテインＡを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
図１は、プロテインＡを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
基材１は、好ましくは金基板である。金基板の一例は、表面に金を具備する基板である
。金基板は、ガラス、プラスチック、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の表面に金をスパッタすることにより形成され得る。
。金基板は、ガラス、プラスチック、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の表面に金をスパッタすることにより形成され得る。
まず、アルカンチオールを含有する溶液に基材１は浸漬される。好ましくは、浸漬前に基材１は洗浄される。当該アルカンチオールは、末端にカルボキシル基を有する。当該アルカンチオールとしては、炭素数６〜１８の第１級アルカンチオールを好ましく使用できる。このようにして、基材１上に自己組織化膜２が形成される。
アルカンチオールの好ましい濃度はおよそ１〜１０ｍＭである。アルカンチオールを溶解する限り、溶媒は限定されない。好ましい溶媒の一例は、エタノール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド(ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ)）、およびジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）である。好ましい浸漬時間はおよそ１２〜４８時間である。
次に、自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される。自己組織化膜２の上端に位置するカルボキシル基(-COOH)とアミノ酸３のアミノ基(-NH2)とが反応して、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合を形成する。
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
化学式（Ｉ）においては、一分子のアミノ酸３が自己組織化膜２と結合する。
アミノ酸３は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸から選択される。すなわち、化学式（Ｉ）において、Ｒはこれら１９種類のアミノ酸の側鎖である。
自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される際に、２種類以上のアミノ酸が同時に供給され得る。すなわち、自己組織化膜２にアミノ酸３を含有する溶液が供給される際に、当該溶液は２種類以上のアミノ酸３を含有し得る。後述するプロテインＡのアミノ酸３への均一な結合を考慮すれば、当該溶液は１種類のみのアミノ酸を含有することが好ましい。
自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される際に、２種類以上のアミノ酸が同時に供給され得る。すなわち、自己組織化膜２にアミノ酸３を含有する溶液が供給される際に、当該溶液は２種類以上のアミノ酸３を含有し得る。後述するプロテインＡのアミノ酸３への均一な結合を考慮すれば、当該溶液は１種類のみのアミノ酸を含有することが好ましい。
後述する実施例に示されるように、アミノ酸３としてアルギニンは用いられない。なぜならば、アルギニンを供給した場合のプロテインＡの固定量は、アミノ酸を供給しない場合の固定量と比較して少ないからである。アミノ酸が供給されていないと、自己組織化膜２の末端に位置するカルボキシル基が直接、プロテインＡに結合する。
続いて、プロテインＡ４が供給される。プロテインＡ４の５’末端のアミノ基が、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。プロテインＡ４に含有されるリシンのアミノ基も、
アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。このようにして、以下の式（ＩＩ）中に示される２つのペプチド結合が形成され、センサを得る。
アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。このようにして、以下の式（ＩＩ）中に示される２つのペプチド結合が形成され、センサを得る。
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
１分子のプロテインＡ４は、１つの５’末端のみを有する一方、１分子のプロテインＡ４は、多数のリシン基を有する。従って、ほとんど全ての化学式（ＩＩ）は、詳細には、以下の化学式（ＩＩＩ）によって表される。
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
得られたセンサは、試料に含有される標的物質を検出または定量するために用いられる。
具体的には、当該標的物質を特異的に結合し得る抗体がセンサ上に供給され、プロテインＡ４に当該抗体を結合させる。すなわち、抗体はプロテインＡ４に補足される。次に、試料をセンサに供給し、試料に含有される標的物質、すなわち抗原を、当該抗体に結合させる。いうまでもないが、抗体は標的物質に対して特異的に結合する。
最後に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析法のような一般的な分析法を使用して、標的物質が検出または定量される。ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス測定法：Quarts C
rystal Microbalance）のような他の分析法も用いられ得る。
rystal Microbalance）のような他の分析法も用いられ得る。
以下の実施例および比較例は、本発明をさらに詳細に説明する。
（比較例１）
図３に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、プロテインＡがアミドカップリング反応により結合され、プロテインＡを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
図３に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、プロテインＡがアミドカップリング反応により結合され、プロテインＡを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
[試料溶液の調製]
１０ｍＭの最終濃度を有する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
１０ｍＭの最終濃度を有する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
［自己組織化膜の形成］
基材１として、ガラス上に金が蒸着された金基板（ＧＥヘルスケア社製；ＢＲ−１００４−０５）が用いられた。当該基材１は、濃硫酸および３０％過酸化水素水を含有するピラニア溶液で１０分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液を構成する濃硫酸と３０％過酸化水素水との体積比は３：１であった。
続いて、金基板は試料溶液中に１８時間浸漬され、金基板の表面に自己組織化膜を形成した。最後に、純水により基材１は洗浄され、乾燥された。
基材１として、ガラス上に金が蒸着された金基板（ＧＥヘルスケア社製；ＢＲ−１００４−０５）が用いられた。当該基材１は、濃硫酸および３０％過酸化水素水を含有するピラニア溶液で１０分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液を構成する濃硫酸と３０％過酸化水素水との体積比は３：１であった。
続いて、金基板は試料溶液中に１８時間浸漬され、金基板の表面に自己組織化膜を形成した。最後に、純水により基材１は洗浄され、乾燥された。
［プロテインＡの固定］
自己組織化膜を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にプロテインＡが結合され、プロテインＡが固定された。
具体的には、０．１Ｍ ＮＨＳ(N-Hydroxysuccinimide)および０．４Ｍ ＥＤＣ(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)の３５μｌの混合液により、１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、３５μｌのプロテインＡ（４０ｕｇ／ｍｌ）が５μｌ／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はプロテインＡのアミノ基にカップリングされた。
自己組織化膜を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にプロテインＡが結合され、プロテインＡが固定された。
具体的には、０．１Ｍ ＮＨＳ(N-Hydroxysuccinimide)および０．４Ｍ ＥＤＣ(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)の３５μｌの混合液により、１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、３５μｌのプロテインＡ（４０ｕｇ／ｍｌ）が５μｌ／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はプロテインＡのアミノ基にカップリングされた。
（実施例１）
自己組織化膜の形成とプロテインＡの固定との間に、一分子のアミノ酸としてグリシンを供給したこと以外は比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
自己組織化膜の形成とプロテインＡの固定との間に、一分子のアミノ酸としてグリシンを供給したこと以外は比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
［アミノ酸（グリシン）の固定化］
自己組織化膜２を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
具体的には、比較例と同様にカルボキシル基が活性化された後に、３５μｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ８．９）が５μＬ／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基がグリシンのアミノ基にカップリングされた。
自己組織化膜２を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
具体的には、比較例と同様にカルボキシル基が活性化された後に、３５μｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ８．９）が５μＬ／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基がグリシンのアミノ基にカップリングされた。
［プロテインＡの固定］
続いて、グリシンのカルボキシル基にプロテインＡが結合され、プロテインＡを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された。３５μｌのプロテインＡ（濃度：２５０μｇ／ｍｌ）が５μＬ／分の流速で添加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、プロテインＡの５’末端のアミノ基またはプロテインＡに含有されるリシンのアミノ基にカップリングされた。
続いて、グリシンのカルボキシル基にプロテインＡが結合され、プロテインＡを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された。３５μｌのプロテインＡ（濃度：２５０μｇ／ｍｌ）が５μＬ／分の流速で添加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、プロテインＡの５’末端のアミノ基またはプロテインＡに含有されるリシンのアミノ基にカップリングされた。
［固定量の比較］
SPR装置Biacore3000（GEヘルスケア社製）を使用して、実施例１および比較例におけるプロテインＡの固定量が測定された。
本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたプロテインＡの量を意味する。
比較例１で測定された固定量と実施例１で測定された固定量の比は、およそ８：１であった。
SPR装置Biacore3000（GEヘルスケア社製）を使用して、実施例１および比較例におけるプロテインＡの固定量が測定された。
本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたプロテインＡの量を意味する。
比較例１で測定された固定量と実施例１で測定された固定量の比は、およそ８：１であった。
（実施例２〜１９）
グリシンに代え、それぞれ、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リシン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが用いられた。
実施例１と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸である。ただし、アルギニンは除外される。表１は、測定された固定量を示す。
グリシンに代え、それぞれ、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リシン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが用いられた。
実施例１と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸である。ただし、アルギニンは除外される。表１は、測定された固定量を示す。
（比較例２）
グリシンに代え、一分子のアミノ酸としてアルギニンを供給した以外は、実施例１と同様に実験が行われ、固定量を測定した。
グリシンに代え、一分子のアミノ酸としてアルギニンを供給した以外は、実施例１と同様に実験が行われ、固定量を測定した。
当業者は以下のことを表１から理解するであろう。
アルギニンを除く１９種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増
加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
アルギニンを除く１９種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増
加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸が好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ２０以上であるからである。
システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンがより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、５０以上であるからである。
システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンがさらにより好ましい。これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、平均値（８３．８％）よりも高いからである。
システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンが最も好ましい。これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、１００以上であるからである。
本発明は、単位面積あたりに固定されるプロテインＡの量を著しく増加させ得る。このことにより、バイオセンサの感度を向上させることが可能になる。当該バイオセンサは、臨床現場において患者由来の生体試料に含有される抗原または抗体の検出または定量を必要とする検査および診断に用いられ得る。
１：金基材
２：アルカンチオール
３：アミノ酸
４：プロテインＡ
２：アルカンチオール
３：アミノ酸
４：プロテインＡ
Claims (21)
- プロテインＡを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）をこの順に含有する。
一分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記一分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記一分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸より選択され、
前記基材上にプロテインＡを供給し、前記一分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記プロテインＡのアミノ基との間の反応により、以下の化学式（ＩＩ）によって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
- 請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）をこの順で具備する：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応により前記化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合を形成する工程（ａ２） - 請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）と前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）混合液により活性化する工程（ａｂ）。 - 請求項２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）と前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ（N-Hydroxysuccinimide）および（１−エチル‐3−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。 - 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択される。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンからなる群から選択される。
- 自己組織化膜、一分子のアミノ酸、およびプロテインＡを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記プロテインＡの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記プロテインＡが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる１９種類のアミノ酸より選択される、センサ。 - 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１０に記載のセンサ。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択される。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンからなる群から選択される。
- センサを用いて試料に含まれる標的物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびプロテインＡ、および抗体を備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記プロテインＡの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記抗体および前記１分子のアミノ酸の間には、前記プロテインＡが挟まれており、
前記抗体は、前記標的物質に特異的に結合し、
前記プロテインＡが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
前記一分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびバリンからなる群から選択され、前記Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖であり、
前記センサに前記試料を供給し、前記プロテインＡに前記標的物質を結合させる工程（ｂ）、および
前記結合された標的物質またはその量から試料に含まれる標的物質を検出または定量する工程（ｃ）。 - 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１６に記載の方法。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択される。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグリシンからなる群から選択される。
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