JP5175584B2 - 局所表面プラズモン共鳴イメージング装置 - Google Patents

局所表面プラズモン共鳴イメージング装置 Download PDF

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Description

本発明は、局所表面プラズモン共鳴イメージング装置に関する。
バイオセンサーは、抗体やDNAなどの生体分子の分子認識機構を利用した化学センサーであり、医療の分野にとどまらず環境、食品の分野への応用が進んでいる。ポストゲノムシーケンス時代を向かえ、バイオセンサーの開発フェーズも、その中心がDNAからタンパク質の機能を利用したものへと変化している。特に、疾患の病因、病態に直接関与している分子の同定、機能解析は、発症メカニズムの解明や創薬につながり、先端医療への貢献が期待されている。このようなプロテオミクスの研究が進むにつれ、その情報は膨大な量となり、短時間に効率的に解析し得るシステムの開発が、今後の研究・診断において必要不可欠なものとなってきている。このため疾患に関連する複数のタンパク質発現のプロファイル解析による診断システム開発が活発に行われている。タンパク質解析には質量分析計等を用いる研究が多いが、臨床現場での実用化のためには、前処理の効率化・迅速化、再現性の確保、低コスト化等の技術開発課題への対応が必要である。また、タンパク質などの生体分子を迅速かつ大量に認識することができれば、検査期間の短縮につながり、より多くの情報を得ることが可能になる。最近、解析能力が飛躍的に向上しているタンパク質アレイは、酵素や蛍光分子などの標識剤を用いて、病因タンパク質を迅速かつ大量認識することができる。しかし、生体分子の認識能の低下を防ぐため、標識剤は、生体分子の特定の部位へ導入する必要があり、その分、煩雑な操作が必要となる。そのため、標識作業を必要としない非標識タンパク質アレイが求められている。
これに対し、標識物質を必要とすることなく、高感度で被測定物質中の化学物質の定性、定量測定の可能なセンサーとして表面プラズモン共鳴現象を利用したセンサーが提案、実用化されている。また、多検体同時測定の要望から、基板に測定試料を配置し、2次元画像として表示する方法が、報告されている(特許文献1、2参照)。
これらの方法は、近年開発が進んでいるマイクロアレイのように、数万という数の多検体を同時イメージングするという面で、検出システムやチップの構造等に改善の余地がある。
米国特許US6862094B2 特開2001−255267号公報
ところで、局所(もしくは局在)表面プラズモン現象は、光の波長よりも小さい金や銀などの貴金属のナノ構造が示す光学的特徴である。金属ナノ構造体は、そのサイズや形状により可視から赤外までの幅広い波長領域と共鳴し(つまり局所プラズモン共鳴。以下、LSPR(Localized Surface Plasmon Resonance)と呼ぶ。)、様々な色を呈する。このような特徴を持った金属ナノ構造体は、その表面に微量の物質が存在するとその共鳴によって生じるスペクトルが変化する。最近、金属ナノ粒微粒子や金属ナノロッドが合成され、LSPRの光学的性質、表面増強ラマン散乱分光法などの光学現象などを明らかにする研究が進められている。
本発明は、金ナノパターン基板上で発生するLSPRを利用して、DNAおよびタンパク質などの多検体試料を基板上に配置し、蛍光などのタンパク質標識を行うことなく検出する2次元LSPRイメージング装置を提供することを課題としている。
本発明は、上記課題を解決するものとして、
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置であって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の光透過性物質部分、および各光透過性物質部分を離間する非光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するようになされたチップを用いて、局所表面プラズモン共鳴を誘発させる、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴イメージング装置、ならびに、
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置であって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の非光透過性物質部分、および各非光透過性物質部分を離間する光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するようになされたチップを用いて、局所表面プラズモン共鳴を誘発させる、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴イメージング装置、
を提供する。
本発明のLSPRイメージング装置は、従来のものと比較して、共鳴角度の調整や測定といった複雑な検出機構を必要とせず、光源、LSPR用測定チップ、フィルタ、および受光手段といった簡易な配置により、抗原抗体反応やDNA−タンパク質−細胞間相互作用や生物や細胞の物質代謝を2次元イメージングにより同時に多種類の定量および定性を行うことができる。センシングだけでなく、スクリーニング用途にも適用可能である。
また、受光手段として、ナノパターンで発生した表面増強ラマン散乱をCCDカメラや近接場顕微鏡を用いることによって、従来では困難であった1μmから50nmの分解能で、DNAやタンパク質などの配列した検出対象を2次元イメージとして画像化することが可能にもなる。
さらに、これらの受光手段を用いることにより、これまでのバイオセンサーでは得ることができなかった、検出物の構造に関する情報を高感度で得ることができる。
<LSPR測定用チップ>
本発明におけるLSPR測定用チップ1は、たとえば図1に例示したように、透明なガラスやプラスチックなどの光透過性物質からなる基板101の上に、金属などの非光透過性物質のナノパターンを有する有機分子固定化部102が多数配列した構造を持つ。有機分子固定化部102に異なる抗体や酵素等の有機分子を固定化し、被測定物質を加えた場合、固定化した抗体や酵素等と反応する物質が存在していれば、透過光に対してLSPRが誘起し、可視光から近赤外光領域で発生する吸収ピークの増強及びそのシフトが発生する。ここでは、有機分子が本発明における捕捉分子である。
本発明のLSPRイメージング装置は、この吸収ピークの変化をCCD(charge coupled device)カメラなどの受光手段により検出し、被測定物質つまりイメージング対象物の2次元イメージングを得る。その際、各有機分子固定化部102が、非光透過物質からなるバックグラウンド部103で区切られることにより、多成分分析を容易に実現することができる。
有機分子固定化部102は、LSPRを誘発させるために、金属ナノパターン構造を有していることが必須である。LSPRの誘発は、金属間の長さ(例えばホールの孔径やドットの間隔)に依存しており、その長さが10nm以上から2μm以下で発生する。よって、ナノパターンにおける金属間の長さは、図1や図2aに例示したホールパターンの場合、孔径が10nm以上から2μm以下であることが好ましく、100nm以上1μm以下がより好ましい。10nm未満ではパターン形成が難しく、2μmを超えると本発明の効果を得るに必要なLSPRが生じにくくなる。ナノパターンは、図2bに例示したようなドットパターンも可能であり、この場合でも、ドット間の距離が10nm以上から2μm以下であることが好ましい。なお、図2bのドットパターンでは、各有機分子固定化部102が非光透過物質からなり、光透過物質からなるバックグランド部で区切られており、図2aのホールパターンとは逆の構成となっていることに留意されたい。両パターンにより有機分子固定については後述する。また、パターン形状については、さらにリングパターンや六角形パターンなども可能であり、固定化を実現できる限り特に限定されない。
図1および図2の実施形態では、基板101上に堆積された薄膜104に、ナノパターンが形成されている。薄膜104は酸化クロム膜105を介して基板101に堆積されており、その膜厚はナノパターンの高さと同一であり、LSPRを誘発させるための重要な要因である。この膜厚は5nm以上200nm以下であることが好ましい。5nm未満ではLSPRを誘発させることができず、200nmを超えると光透過がなくなってしまう。
薄膜104は、LSPRを誘発させるため、金、銀、銅、白金、アルミニウムのいずれかの単体金属あるいはこれらの複合金属であることが望ましい。また、非光透過物質は、前記金属以外に、非透過性樹脂なども挙げられる。
金属ナノパターンの作製には、たとえば、ナノインプリント法を用いることができる。ナノインプリント法は、最近、盛んに研究が進められている微細加工技術の一つで、電子回路、デジタル記録媒体、集積化ナノシステム、バイオ・有機材料デバイス等の数多くの応用にとって重要な技術である。この方法は、多様性、量産性に富み、かつ低コストで基板を作製することが可能である。ナノインプリント法は、解像限界が無く、解像度はモールドの作製精度によって決まる。本発明の一実施形態では、電子線描画によるモールドの作製およびソフトリソグラフィー法で得られた高分子ナノパターンモールドの作製により、ナノインプリント用1次モールドを作製することができる。これらのモールドを用いて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)樹脂を用いて1次モールドの転写により、2次モールドを作製する。たとえば膜厚1nm〜5nmのクロム酸化膜、膜厚5nm〜200nmの金薄膜の順で蒸着し、最上部にポリスチレン薄膜をコーティングした透明ガラス基板上に、前記2次モールドを圧着させ、ポリスチレン薄膜にナノパターンを転写する。基板表面に残った余分な残膜をICPドライエッチング装置で除去し、ウェットエッチングにより金パターンを作製する。そして、ポリスチレンマスクをトルエンにより除去し、ナノパターンを得る。図2からも分かるように、このナノパターンが図2aのホールパターンである場合には、金属薄膜の除去後に露出している基板表面の部分が光透過性物質からなる有機分子固定化部102となり、各々除去されずに残った金属薄膜からなるバックグランド部103により離間して区切られている。ナノパターンが図2bのドットパターンである場合には、除去後に残った金属薄膜の部分が非光透過性物質からなる有機分子固定化部102となり、金属薄膜の除去後に露出している基板表面の部分がバックグランド部103として各有機分子固定化部102を区切っている。
抗体や酵素等の有機分子は、上述したように作製できる金属ナノパターンを持つ有機分子固定化部102に固定化する必要がある。有機分子固定化部102は、金などの金属とガラスなどの無機物質との海島構造から成る。すなわち図2aの場合では非透過性物質のホールパターン、図2bの場合では光透過性物質のドットパターンである。有機分子の固定化は、これら金属および無機物質のいずれかの部分に行う。
金属部分への固定(図2aのホールパターンの場合)は、アルカンチオールのような金属表面に自己組織化単分子膜を形成する有機単分子を用いる。この単分子には、予め、抗体や酵素などの有機分子を結合することができるアミノ基、カルボキシル基、スクシンイミド基(NHS)などの活性部位を修飾しておき、金属表面に形成した自己組織化単分子膜上に抗体や酵素等の有機分子を固定化する。
一方、無機部分への固定(図2bのドットパターンの場合)は、シランカップリング剤のような金属表面に自己組織化単分子膜を形成する有機単分子を用いる。この場合も、単分子に予め、アミノ基、カルボキシル基、NHS基などの活性部位を修飾しておき、無機表面に形成した自己組織化単分子膜上に抗体や酵素等の有機分子を固定化する。アミノ基、カルボキシル基は、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩などのカルボジイミドを用いて、抗体や酵素などが持つフリーアミノ基、フリーカルボキシル基と脱水縮合反応により共有結合を導入する。NHS基は、抗体や酵素などが持つフリーアミノ基と中性緩衝液中で結合する。
多種有機分子は、たとえばノズルタイプマイクロアレイヤーやピンタイプマイクロアレイヤー等のスッポティング方法を用いて、有機分子固定化部102にスポットする。この際、図1および図2に示すバックグランド部103により区分けされた構造により、隣接する別の有機分子との混在を防ぐことができる。
<LSPRイメージング装置(可視−近赤外)>
上述したように有機分子を固定化したLSPR測定用チップ1を用いて、図3に例示した2次元LSPRイメージング装置2により、有機分子と反応する物質を検出する場合、白色光源等の光源201から照射されLSPR測定用チップ1を通過した透過光には、LSPRの誘起により可視−近赤外領域内の特定波長での吸収が起こる。LSPRイメージング測定装置2に配置されているバンドパスフィルタ202は、この特定波長の光を除去するよう設定しておく。続いて、反応物質がチップ表面に結合した場合、透過光のLSPRの誘起による吸収位置のシフトと吸収量の増加が起こる。バンドパスフィルタ202の波長は、このシフトした吸収位置に設定しておく。反応物質がチップ表面に結合していない場合は、吸収位置のシフトが起こらないため、吸収のない透過光が、そのままバンドパスフィルタ202を通過し、CCDカメラ203の受光部に到達する。一方、反応物質がチップ表面に結合した場合は、吸収位置のシフトが起こるとともに、吸収量の増加が起こるため、バンドパスフィルタ22を通過する光量が著しく減少する。2次元LSPRイメージング装置は、この受光量の差異を2次元イメージング画像として表示することにより、同時に多種類の化学物質の定量および定性を行う。最高50μmの分解能で、2次元イメージング画像を表示することができる。
<LSPRイメージング装置(表面増強ラマン)>
有機分子と反応する物質を検出する手段としては、図4に例示した表面増強ラマンスペクトルを用いる方法もが挙げられる。光源201であるレーザー光をLSPR測定用チップ1全体に照射すると、ラマン散乱光が発生する。特にナノパターン部分においては、ラマン散乱光がLSPRにより励起し、通常のラマン散乱より散乱光強度が104〜107程度増強される、いわゆる表面増強ラマン散乱が起こる。この現象を利用し、通常のバイオチップ基板表面で検出することが困難であった基板表面に結合した反応物質に帰属するラマン散乱をナノパターン部分において高感度に検出することができる。一般に、ラマンスペクトルは、物質の構造に依存し、スペクトルの位置および強度が変化する。この特徴を利用し、反応物質が存在している場合に特有に発生するラマンピークの波長の光だけを、集光レンズ204で集光し、バンドパスフィルタ202によって通過させ、CCDカメラ203に結像させる。有機分子と反応する物質が、チップ表面に結合した場合は、ラマンピークが発生するため明るく光り、結合していない場合は光らない。これを2次元で画像化することにより、同時に多種類の化学物質の定量および定性を行う。最高1μmの分解能で、2次元イメージング画像を表示することができる。また、レーザーを絞ることにより、特定位置の表面増強ラマン散乱を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定することができる。
<LSPRイメージング装置(近接場顕微鏡)>
有機分子と反応する物質を検出する手段としては、図5に例示した近接場顕微鏡3を用いた方法もさらに挙げられる。光源301からのレーザー光を、コリメートレンズ302、ハーフミラー303等の光学系を通してLSPR測定用チップ1のナノパターンに照射して透過させることにより、パターン表面にエバネッセント場を発生させ、そこに金属コーティングプローブであるカンチレバー304をPZTステージ305をスキャンさせて挿入する。これにより、プローブ先端でエバネッセント場を散乱させて、散乱光を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定する。これらの散乱光を対物レンズ306で集光し、レーリー散乱光をノッチフィルターなどのバンドパスフィルタ307で除去し、分光器308で分光した後、液体窒素冷却CCDで検出することにより、局所的な表面増強ラマンスペクトルを得ることができる。これにより、LSR測定用チップ1のナノパターンにより増強されたラマンスペクトルが、カンチレバー302によりさらに増強されるため、ナノ領域での生体分子認識が可能になる。たとえば、タンパク質が表面に存在する場合のみ、タンパク質の構造に依存したラマンピークが現れるので、タンパク質に帰属しないピークをフィルタでカットし、タンパク質由来のラマンピークの散乱強度をCCDで検出し画像化できる。さらに分光器308を通して測定を行うことで、より詳細なスペクトルを観察することができる。さらには、プローブを走査することにより、表面増強ラマンスペクトルの強度に依存した2次元イメージング画像を得ることができる。これにより最高50nmの分解能で、2次元イメージング画像を表示することができ、かつプローブを測定箇所に移動させることにより、特定位置の表面増強ラマン散乱を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定することができる。図5において、309は集光レンズ、310はハーフミラー、311はフォトンカウンタ、312は制御用計算機、313はコントローラ、314はPZTスキャナーである。
<LSPR測定用チップ(タンパク質アレイチップ)の作製>
タンパク質の機能は他の分子との相互作用によって発現されるため、この相互作用を原子レベルで予測および解析することは、タンパク質の機能を明らかにし、新薬の開発につながると期待されている。ある機能性タンパク質と結合するタンパク質を正確に探索するためには、機能を保ったままタンパク質を基板上に固定化する必要がある。
作製方法としては、単一組織や細胞からmRNAを精製し、逆転写酵素、ランダムプライマーを用いてcDNAライブラリーを作製し、cDNAを持ったλZAP−CMVファージを得る。予め、λZAP−CMVベクターには、開始メチオニンのコドンであるATG、クローニング用制限酵素部位、タグ(HisタグやHAタグ)用コドンとそれに続く終了コドンを挿入しておく。ファージのサブプールを作り、in vivo excisionで各プールのファージからプラスミド(cDNA発現ベクター)を調製し、このプラスミッドを培養細胞に導入し、C末端にタグが融合されたタンパク質を発現させる。
図6にタンパク質アレイチップの作製方法について示す。金ナノパターンのガラス部分に、アミノプロピルトリエトキシシランを気相蒸着法により自己組織化単分子膜(SAM膜)を形成させる。末端のアミノ基部分にNHS−PEG−NHSエステルを結合させ(NHS基は表面のNH2基と反応)、末端にNHS活性を有した自己組織化単分子膜を作製する。これにプロテインA溶液を加え、NHSとプロテインAを結合させる(プロテインAの固定化)。プロテインAは、抗タグ抗体(グロブリンIgG)のFc部とのみ結合するので、抗タグ部分の活性を失うことなく基板に固定化できる。
cDNAライブラリー由来のタグ付きタンパク質は、スポッティング装置を用いて、基板の独立した固定化部分に注入され、これらのタンパク質と抗タグ抗体を結合し基板に固定し、タンパク質アレイチップを作製する。
この基板に精製した解析を目的とする機能性タンパク質を滴下し、機能性タンパク質結合能を有するタンパク質部分に機能性タンパク質を結合させる。機能性タンパク質と結合したタンパク質が存在する部分は、LSPR効果によって近赤外領域でピーク形が変化する。この変化を検出装置で可視化することで、機能性タンパク質結合タンパク質をスクリーニングする。反応陽性のサブプール内のファージを大腸菌に戻して増幅し、さらにサブプールに分け同じ操作を繰り返し、最終的に機能性タンパク質結合タンパク質を発現するcDNAを含んだ1つのファージに絞り、cDNAの核酸配列の解析から機能性タンパク質結合タンパク質を同定する。
<LSPR測定用チップ(DNAアレイチップ)の作製>
DNAアレイは、ガラスやシリコン製の小基盤上にDNA分子を高密度に配置(アレイ)したものである。マイクロアレイを用いると数千から数万種といった規模の遺伝子発現を同時に観察することができる。
本発明における作製方法は、単一組織や細胞からmRNAを精製し、逆転写酵素、ランダムプライマーを用いてcDNAプローブを作製する。金ナノパターンのガラス部分に、アミノプロピルトリエトキシシランを気相蒸着法により自己組織化単分子膜を形成させる。cDNAプローブをスポッティング装置により、基板の独立した固定化部分に注入する。静電相互作用によりアミノ基末端部にcDNAプローブが固定化される。同じDNAチップを2つ用意し、一方に解析試料のcDNAをもう一方に参照試料のcDNAをDNAチップ上にそれぞれ導入してハイブリダイゼーション反応を行わせ、両者の2次元パターンと固定化されているDNAプローブの情報とから、解析試料のみで発現している遺伝子、参照試料のみで発現している遺伝子、両方の試料で発現している遺伝子、どちらでも発現していない遺伝子を並列的に解析する。
<LSPR測定用チップの作製方法1>
1.1次モールドの作製方法(Siモールド)
電子線描画によるSiモールドの作製は、電子ビーム描画装置(エリオニクス社ELS−7500EX)を用いて行った。電子線描画によるモールドの作製方法を図7に示す。はじめに、SiO2膜付Siウエハー面に電子線レジストを塗布し、電子ビーム描画装置により直接ナノパターンを描画し露光、現像後、露出部分をBHF、KOHでエッチングし、Siモールドを作製した。図8に電子線描画により作製されたSiモールドの走査電子顕微鏡(SEM)写真を示す。
2.2次モールドの作製方法(PDMS(ポリジメチルシロキサン)モールドの作製)
PDMSモールドは、Siモールドおよび高分子ナノパターンモールド(マスターモールド)から作製した。マスターモールドをステンレス容器の中に入れポリジメチルシロキサン樹脂を流し込んだ。脱泡後、100℃で2時間乾燥し、樹脂を固化させ、PDMSモールドを得た。
金ナノパターンの作製方法を図9に示す。基板となる金コート石英ガラスは、ECR成膜装置により作製された。金薄膜は、接着性をよくするためにあらかじめ成膜されていた酸化クロムの上に約40nmの膜厚になるよう成膜された。次にポリスチレン(PS)溶液(トルエン、1wt%)を基板表面に2ml滴下し、PDMSモールドを圧着させPSパターンを作製した。基板表面に残った残膜は、ICPドライエッチング装置で除去し、ウェットエッチングにより金パターンを作製した。PSマスクは、トルエンによって除去した。図10にナノインプリント法により作製した金ナノパターンのSEM写真を示す。孔径の大きさが約800nmの金パターンの形成が確認された。
<LSPR測定用チップ作製方法2>
1.1次モールドの作製方法(高分子ナノパターンモールド)
高分子ナノパターンモールドは、高分子溶液からのキャスト過程で起こる自己組織化現象を利用した。高分子ナノパターンモールドの作製方法を図11に示す。高分子溶液は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド10mgとp−スチレンスルホン酸ナトリウム10mg、ポリスチレン90mgをクロロホルム100mlに溶解したものを用いた。この高分子溶液を石英基板に0.2ml滴下し、高湿度空気(湿度約80%)で乾燥することにより作製した。図12に高分子ナノパターンモールドのSEM写真を示す。
2.2次モールドの作製方法(PDMS(ポリジメチルシロキサン)モールドの作製)
上記作製方法1と同様に、PDMSモールドは、Siモールドおよび高分子ナノパターンモールド(マスターモールド)から作製した。マスターモールドをステンレス容器の中に入れポリジメチルシロキサン樹脂を流し込んだ。脱泡後、100℃で2時間乾燥し、樹脂を固化させ、PDMSモールドを得た。
金ナノパターンの作製方法を図9に示す。基板となる金コート石英ガラスは、ECR成膜装置により作製された。金薄膜は、接着性をよくするためにあらかじめ成膜されていた酸化クロムの上に約40nmの膜厚になるよう成膜された。次にポリスチレン(PS)溶液(トルエン、1wt%)を基板表面に2ml滴下し、PDMSモールドを圧着させPSパターンを作製した。基板表面に残った残膜は、ICPドライエッチング装置で除去し、ウェットエッチングにより金パターンを作製した。PSマスクは、トルエンによって除去した。
<可視光スペクトル測定>
金ナノパターン表面における、モデルタンパク質の吸着に伴う可視光スペクトル変化を測定した。モデルタンパク質としてフィブリノーゲンを用いた。フィブリノーゲンをリン酸緩衝液(PBS)に溶解させ、1mg/mlの濃度になるよう調整した。このフィブリノーゲン溶液に金ナノパターン基板を浸漬させ基板表面にタンパク質を吸着させた。清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルは、紫外可視近赤外分光光度計(島津UV−3100)により測定を行った。
図13に清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルを示す。清浄金ナノパターン基板では、512nmの波長を中心とし、300nmから700nmの間でピークの存在が観察された。金コーティング基板の場合は、近赤外領域に明確なピークを観察することができなかったため、このピークは、金ナノパターニング表面で発生したLSPRによるものと考えられる。一方、フィブリノーゲン吸着後は、516nmの波長を中心とし、400nmから750nmの間でピークの存在が観察され、フィブリノーゲンの吸着により、ピーク位置が4nm高波長側にシフトした。これは、金ナノパターン表面にフィブリノーゲンが吸着することでLSPRスペクトルが大きく変化したことを示しており、この変化を利用することで吸着したタンパク質の吸着量を求めることが可能である。
<近赤外スペクトル測定>
金ナノパターン表面における、モデルタンパク質の吸着に伴う近赤外スペクトル変化を測定した。モデルタンパク質としてフィブリノーゲンを用いた。フィブリノーゲンをリン酸緩衝液(PBS)に溶解させ、1mg/mlの濃度になるよう調整した。このフィブリノーゲン溶液に金ナノパターン基板を浸漬させ基板表面にタンパク質を吸着させた。清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルは、紫外可視近赤外分光光度計(島津UV−3100)により測定を行った。
図14に清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルを示す。清浄金ナノパターン基板では、1522nmの波長を中心とし、1400nmから1800nmの間でピークの存在が観察された。金コーティング基板の場合は、近赤外領域に明確なピークを観察することができなかったため、このピークは、金ナノパターニング表面で発生したLSPRによるものと考えられる。一方、フィブリノーゲン吸着後は、1632nmの波長を中心とし、1400nmから2300nmの間でピークの存在が観察され、フィブリノーゲンの吸着により、ピーク位置が110nm高波長側にシフトし、吸光度が約2倍に増加した。これは、金ナノパターン表面にフィブリノーゲンが吸着することでLSPRスペクトルが大きく変化したことを示しており、この変化を利用することで吸着したタンパク質の吸着量を求めることが可能である。
(a)(b)は各々本発明のLSPR測定用チップの一実施形態を示した概略平面図および概略断面図である。 (a)(b)は各々本発明のLSPR測定用チップの一実施形態を示した概略平面図である。 本発明のLSPRイメージング装置の一実施形態を示した概略図である。 本発明のLSPRイメージング装置の一実施形態を示した概略図である。 本発明のLSPRイメージング装置の一実施形態を示した概略図である。 本発明のLSPR測定用チップの一作製方法について説明する図である。 本発明のLSPR測定用チップの一作製方法について説明する図である。 図7の作製方法により得られたSiモールドのSEM像である。 本発明のLSPR測定用チップの一作製方法について説明する図である。 図9の作製方法により得られた金モールドのSEM像である。 本発明のLSPR測定用チップの一作製方法について説明する図である。 図11の作製方法により得られた高分子ナノパターンモールドのSEM像である。 清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルを示す図である。 清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルを示す図である。
符号の説明
1 LSPR測定用チップ
101 基板
102 有機分子固定化部
103 バックグランド部
104 薄膜
105 酸化クロム膜
2 LSPRイメージング装置
201 光源
202 バンドパスフィルタ
203 CCDカメラ
204 集光レンズ
3 LSPRイメージング装置(近接場顕微鏡)
301 光源
302 コリメートレンズ
303 ハーフミラー
304 カンチレバー
305 PZTステージ
306 集光レンズ
307 バンドパスフィルタ
308 分光器
309 集光レンズ
310 ハーフミラー
311 フォトンカウンタ
312 計算機
313 コントローラ
314 PZTスキャナー

Claims (15)

  1. 局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を測定するための局所表面プラズモン共鳴測定チップであって、
    各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の光透過性物質部分、および各光透過性物質部分を離間する非光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するように構成されており
    前記非光透過性物質部分は、チップ基板上に酸化クロム膜を介して設けられている、
    ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  2. 局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を測定するための局所表面プラズモン共鳴測定チップであって、
    各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の非光透過性物質部分、および各非光透過性物質部分を離間する光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するように構成されており
    前記非光透過性物質部分は、チップ基板上に酸化クロム膜を介して設けられている、
    ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  3. イメージング対象物と各光透過性物質部分又は各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して局所表面プラズモン共鳴が生じる膜厚を有する、請求項1または2に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  4. 膜厚が5nmから200nmである、請求項3に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  5. 光透過性物質が透明ガラス又は透明プラスチックである、請求項1から4いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  6. 非光透過性物質が金属である、請求項1から5いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  7. 金属が、白金、金、銀、銅、アルミニウム及びこれらの複合金属である、請求項6に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  8. 光透過性物質部分の間隔が10nmから2μmの範囲である、請求項1に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  9. 非光透過性物質部分の間隔が10nmから2μmの範囲である、請求項2に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  10. 捕捉物質が核酸及びタンパク質の少なくともいずれかである、請求項1から9いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  11. 捕捉物質が結合物質を介して固定化されている、請求項1から9いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  12. 結合物質がシランカップリング剤又はアルカンチオールである、請求項11に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
  13. 請求項1から12いずれかに記載のチップを用いて局所表面プラズモン共鳴を誘発させ、該局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
  14. 前記チップを用いて局所表面プラズモン共鳴を誘発させる近接場顕微鏡である、請求項13に記載の局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
  15. 前記チップによる局所表面プラズモン共鳴により増強された光吸収変化が、近接場顕微鏡プローブによりさらに増強される、請求項14に記載の局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
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