JP5175584B2 - 局所表面プラズモン共鳴イメージング装置 - Google Patents
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Description
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置であって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の光透過性物質部分、および各光透過性物質部分を離間する非光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するようになされたチップを用いて、局所表面プラズモン共鳴を誘発させる、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴イメージング装置、ならびに、
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置であって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の非光透過性物質部分、および各非光透過性物質部分を離間する光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するようになされたチップを用いて、局所表面プラズモン共鳴を誘発させる、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴イメージング装置、
を提供する。
本発明におけるLSPR測定用チップ1は、たとえば図1に例示したように、透明なガラスやプラスチックなどの光透過性物質からなる基板101の上に、金属などの非光透過性物質のナノパターンを有する有機分子固定化部102が多数配列した構造を持つ。有機分子固定化部102に異なる抗体や酵素等の有機分子を固定化し、被測定物質を加えた場合、固定化した抗体や酵素等と反応する物質が存在していれば、透過光に対してLSPRが誘起し、可視光から近赤外光領域で発生する吸収ピークの増強及びそのシフトが発生する。ここでは、有機分子が本発明における捕捉分子である。
上述したように有機分子を固定化したLSPR測定用チップ1を用いて、図3に例示した2次元LSPRイメージング装置2により、有機分子と反応する物質を検出する場合、白色光源等の光源201から照射されLSPR測定用チップ1を通過した透過光には、LSPRの誘起により可視−近赤外領域内の特定波長での吸収が起こる。LSPRイメージング測定装置2に配置されているバンドパスフィルタ202は、この特定波長の光を除去するよう設定しておく。続いて、反応物質がチップ表面に結合した場合、透過光のLSPRの誘起による吸収位置のシフトと吸収量の増加が起こる。バンドパスフィルタ202の波長は、このシフトした吸収位置に設定しておく。反応物質がチップ表面に結合していない場合は、吸収位置のシフトが起こらないため、吸収のない透過光が、そのままバンドパスフィルタ202を通過し、CCDカメラ203の受光部に到達する。一方、反応物質がチップ表面に結合した場合は、吸収位置のシフトが起こるとともに、吸収量の増加が起こるため、バンドパスフィルタ22を通過する光量が著しく減少する。2次元LSPRイメージング装置は、この受光量の差異を2次元イメージング画像として表示することにより、同時に多種類の化学物質の定量および定性を行う。最高50μmの分解能で、2次元イメージング画像を表示することができる。
有機分子と反応する物質を検出する手段としては、図4に例示した表面増強ラマンスペクトルを用いる方法もが挙げられる。光源201であるレーザー光をLSPR測定用チップ1全体に照射すると、ラマン散乱光が発生する。特にナノパターン部分においては、ラマン散乱光がLSPRにより励起し、通常のラマン散乱より散乱光強度が104〜107程度増強される、いわゆる表面増強ラマン散乱が起こる。この現象を利用し、通常のバイオチップ基板表面で検出することが困難であった基板表面に結合した反応物質に帰属するラマン散乱をナノパターン部分において高感度に検出することができる。一般に、ラマンスペクトルは、物質の構造に依存し、スペクトルの位置および強度が変化する。この特徴を利用し、反応物質が存在している場合に特有に発生するラマンピークの波長の光だけを、集光レンズ204で集光し、バンドパスフィルタ202によって通過させ、CCDカメラ203に結像させる。有機分子と反応する物質が、チップ表面に結合した場合は、ラマンピークが発生するため明るく光り、結合していない場合は光らない。これを2次元で画像化することにより、同時に多種類の化学物質の定量および定性を行う。最高1μmの分解能で、2次元イメージング画像を表示することができる。また、レーザーを絞ることにより、特定位置の表面増強ラマン散乱を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定することができる。
有機分子と反応する物質を検出する手段としては、図5に例示した近接場顕微鏡3を用いた方法もさらに挙げられる。光源301からのレーザー光を、コリメートレンズ302、ハーフミラー303等の光学系を通してLSPR測定用チップ1のナノパターンに照射して透過させることにより、パターン表面にエバネッセント場を発生させ、そこに金属コーティングプローブであるカンチレバー304をPZTステージ305をスキャンさせて挿入する。これにより、プローブ先端でエバネッセント場を散乱させて、散乱光を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定する。これらの散乱光を対物レンズ306で集光し、レーリー散乱光をノッチフィルターなどのバンドパスフィルタ307で除去し、分光器308で分光した後、液体窒素冷却CCDで検出することにより、局所的な表面増強ラマンスペクトルを得ることができる。これにより、LSR測定用チップ1のナノパターンにより増強されたラマンスペクトルが、カンチレバー302によりさらに増強されるため、ナノ領域での生体分子認識が可能になる。たとえば、タンパク質が表面に存在する場合のみ、タンパク質の構造に依存したラマンピークが現れるので、タンパク質に帰属しないピークをフィルタでカットし、タンパク質由来のラマンピークの散乱強度をCCDで検出し画像化できる。さらに分光器308を通して測定を行うことで、より詳細なスペクトルを観察することができる。さらには、プローブを走査することにより、表面増強ラマンスペクトルの強度に依存した2次元イメージング画像を得ることができる。これにより最高50nmの分解能で、2次元イメージング画像を表示することができ、かつプローブを測定箇所に移動させることにより、特定位置の表面増強ラマン散乱を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定することができる。図5において、309は集光レンズ、310はハーフミラー、311はフォトンカウンタ、312は制御用計算機、313はコントローラ、314はPZTスキャナーである。
タンパク質の機能は他の分子との相互作用によって発現されるため、この相互作用を原子レベルで予測および解析することは、タンパク質の機能を明らかにし、新薬の開発につながると期待されている。ある機能性タンパク質と結合するタンパク質を正確に探索するためには、機能を保ったままタンパク質を基板上に固定化する必要がある。
DNAアレイは、ガラスやシリコン製の小基盤上にDNA分子を高密度に配置(アレイ)したものである。マイクロアレイを用いると数千から数万種といった規模の遺伝子発現を同時に観察することができる。
1.1次モールドの作製方法(Siモールド)
電子線描画によるSiモールドの作製は、電子ビーム描画装置(エリオニクス社ELS−7500EX)を用いて行った。電子線描画によるモールドの作製方法を図7に示す。はじめに、SiO2膜付Siウエハー面に電子線レジストを塗布し、電子ビーム描画装置により直接ナノパターンを描画し露光、現像後、露出部分をBHF、KOHでエッチングし、Siモールドを作製した。図8に電子線描画により作製されたSiモールドの走査電子顕微鏡(SEM)写真を示す。
PDMSモールドは、Siモールドおよび高分子ナノパターンモールド(マスターモールド)から作製した。マスターモールドをステンレス容器の中に入れポリジメチルシロキサン樹脂を流し込んだ。脱泡後、100℃で2時間乾燥し、樹脂を固化させ、PDMSモールドを得た。
1.1次モールドの作製方法(高分子ナノパターンモールド)
高分子ナノパターンモールドは、高分子溶液からのキャスト過程で起こる自己組織化現象を利用した。高分子ナノパターンモールドの作製方法を図11に示す。高分子溶液は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド10mgとp−スチレンスルホン酸ナトリウム10mg、ポリスチレン90mgをクロロホルム100mlに溶解したものを用いた。この高分子溶液を石英基板に0.2ml滴下し、高湿度空気(湿度約80%)で乾燥することにより作製した。図12に高分子ナノパターンモールドのSEM写真を示す。
上記作製方法1と同様に、PDMSモールドは、Siモールドおよび高分子ナノパターンモールド(マスターモールド)から作製した。マスターモールドをステンレス容器の中に入れポリジメチルシロキサン樹脂を流し込んだ。脱泡後、100℃で2時間乾燥し、樹脂を固化させ、PDMSモールドを得た。
金ナノパターン表面における、モデルタンパク質の吸着に伴う可視光スペクトル変化を測定した。モデルタンパク質としてフィブリノーゲンを用いた。フィブリノーゲンをリン酸緩衝液(PBS)に溶解させ、1mg/mlの濃度になるよう調整した。このフィブリノーゲン溶液に金ナノパターン基板を浸漬させ基板表面にタンパク質を吸着させた。清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルは、紫外可視近赤外分光光度計(島津UV−3100)により測定を行った。
金ナノパターン表面における、モデルタンパク質の吸着に伴う近赤外スペクトル変化を測定した。モデルタンパク質としてフィブリノーゲンを用いた。フィブリノーゲンをリン酸緩衝液(PBS)に溶解させ、1mg/mlの濃度になるよう調整した。このフィブリノーゲン溶液に金ナノパターン基板を浸漬させ基板表面にタンパク質を吸着させた。清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルは、紫外可視近赤外分光光度計(島津UV−3100)により測定を行った。
101 基板
102 有機分子固定化部
103 バックグランド部
104 薄膜
105 酸化クロム膜
2 LSPRイメージング装置
201 光源
202 バンドパスフィルタ
203 CCDカメラ
204 集光レンズ
3 LSPRイメージング装置(近接場顕微鏡)
301 光源
302 コリメートレンズ
303 ハーフミラー
304 カンチレバー
305 PZTステージ
306 集光レンズ
307 バンドパスフィルタ
308 分光器
309 集光レンズ
310 ハーフミラー
311 フォトンカウンタ
312 計算機
313 コントローラ
314 PZTスキャナー
Claims (15)
- 局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を測定するための局所表面プラズモン共鳴測定チップであって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の光透過性物質部分、および各光透過性物質部分を離間する非光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するように構成されており、
前記非光透過性物質部分は、チップ基板上に酸化クロム膜を介して設けられている、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴測定チップ。 - 局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を測定するための局所表面プラズモン共鳴測定チップであって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の非光透過性物質部分、および各非光透過性物質部分を離間する光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するように構成されており、
前記非光透過性物質部分は、チップ基板上に酸化クロム膜を介して設けられている、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴測定チップ。 - イメージング対象物と各光透過性物質部分又は各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して局所表面プラズモン共鳴が生じる膜厚を有する、請求項1または2に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 膜厚が5nmから200nmである、請求項3に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 光透過性物質が透明ガラス又は透明プラスチックである、請求項1から4いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 非光透過性物質が金属である、請求項1から5いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 金属が、白金、金、銀、銅、アルミニウム及びこれらの複合金属である、請求項6に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 光透過性物質部分の間隔が10nmから2μmの範囲である、請求項1に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 非光透過性物質部分の間隔が10nmから2μmの範囲である、請求項2に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 捕捉物質が核酸及びタンパク質の少なくともいずれかである、請求項1から9いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 捕捉物質が結合物質を介して固定化されている、請求項1から9いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 結合物質がシランカップリング剤又はアルカンチオールである、請求項11に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
- 請求項1から12いずれかに記載のチップを用いて局所表面プラズモン共鳴を誘発させ、該局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
- 前記チップを用いて局所表面プラズモン共鳴を誘発させる近接場顕微鏡である、請求項13に記載の局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
- 前記チップによる局所表面プラズモン共鳴により増強された光吸収変化が、近接場顕微鏡プローブによりさらに増強される、請求項14に記載の局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
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