JP5202762B2 - アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法 - Google Patents
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Description
本発明はアルブミンを自己組織化膜上に固定する方法に関する。
試料に含有される標的物質を検出または定量するために、バイオセンサが用いられる。いくつかのバイオセンサは、抗体を検出または定量するために抗原を具備する。
抗体を含有する試料が、抗原であるアルブミンを具備するバイオセンサに供給されると、抗体はアルブミンに結合することによって、検出または定量される。
特許文献１は、抗原を具備する従来のバイオセンサを開示している。この特許文献１は、特表２００２−５２０６１８号公報に対応する（特許文献１における、第２４頁第２３行から２６行まで、第２５頁第３行から第２０行まで、第２５頁第２７行から第２６頁第１３行、および第２６頁第１４行から第２２行まで、第２８頁第２１行から第２３行、または対応する公報の段落番号００８０、００８２、００８４、００８５、００９５、０１０９、０１１８、および０１１９を参照）。図２は、特許文献１の図７に開示されたバイオセンサを示す。
特許文献１の図７に関する記述によれば、当該バイオセンサは、生体分子の活性をスクリーニングするために用いられる。当該バイオセンサは、単層７、親和性タグ８、アダプター分子９、およびタンパク質１０を具備している。単層７は、化学式Ｘ−Ｒ−Ｙによって表される自己組織化膜から構成される（特許文献１における、第２４頁第２３行から２６行まで、第２５頁第３行から第２０行まで、第２５頁第２７行から第２６頁第１３行、および第２６頁第１４行から第２２行までを参照。または、対応する公報の段落番号００８０、００８２、００８４、００８５を参照）。Ｘ、Ｒ、およびＹの一例は、それぞれ、ＨＳ−、アルカン、およびカルボキシル基である（特許文献１における、第２５頁第３行から第２０行まで、第２５頁第２７から第２６頁第１３行、および第２８頁第２１行から第２３行までを参照。または、対応する公報の段落００８４、００８５、および００９５）。
抗体の検出感度または定量精度を向上させるためには、当該バイオセンサに固定されるアルブミンの量を増やすことが必要とされる。
本発明者は、自己組織化膜に１分子のアミノ酸を結合させ、そしてアルブミンを固定することによって、単位面積あたりのアルブミンの固定量が著しく増加されるという知見を見いだした。本発明はこの知見を元に完成された。
本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるアルブミンの量を増加させる方法、及び当該方法に従って固定されたアルブミンを有するセンサを提供することである。
以下の項目Ａ１〜Ｃ６は、上記課題を解決する。
Ａ１．アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に具備する、方法：
１分子のアミノ酸および前記自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記基材上にアルブミンを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記アルブミンのアミノ基との反応の結果として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）。
Ａ２． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する、方法：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）。
Ａ３． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する、方法：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。
Ａ４． 項目Ａ２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する、方法：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａ１ｂ）。
Ａ５． 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目Ａ１に記載の方法。
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）。
Ａ６． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
Ａ７． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
Ａ８． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
Ａ９． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
Ｂ１． 自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記アルブミンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
Ｂ２． 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目Ｂ１に記載のセンサ。
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
Ｂ３． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、センサ。
Ｂ４． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、センサ。
Ｂ５． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、センサ。
Ｂ６． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、センサ。
Ｃ１． センサを用いて試料に含まれる抗体を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する、方法：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記アルブミンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記アルブミンに抗体を結合させる工程（ｂ）、および
工程（ｂ）において結合した抗体を検出するか、または工程（ｂ）において結合した抗体の量から前記試料に含有される抗体を定量する工程（ｃ）。
Ｃ２． Ｃ１に記載の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、方法。
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
Ｃ３． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
Ｃ４． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
Ｃ５． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
Ｃ６． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
Ａ１．アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に具備する、方法：
１分子のアミノ酸および前記自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記基材上にアルブミンを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記アルブミンのアミノ基との反応の結果として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
Ａ２． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する、方法：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）。
Ａ３． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する、方法：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。
Ａ４． 項目Ａ２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する、方法：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａ１ｂ）。
Ａ５． 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目Ａ１に記載の方法。
Ａ６． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
Ａ７． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
Ａ８． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
Ａ９． 項目Ａ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
Ｂ１． 自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記アルブミンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
Ｂ２． 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目Ｂ１に記載のセンサ。
Ｂ３． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、センサ。
Ｂ４． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、センサ。
Ｂ５． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、センサ。
Ｂ６． 項目Ｂ１に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、センサ。
Ｃ１． センサを用いて試料に含まれる抗体を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する、方法：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記アルブミンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記アルブミンに抗体を結合させる工程（ｂ）、および
工程（ｂ）において結合した抗体を検出するか、または工程（ｂ）において結合した抗体の量から前記試料に含有される抗体を定量する工程（ｃ）。
Ｃ２． Ｃ１に記載の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、方法。
Ｃ３． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
Ｃ４． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
Ｃ５． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
Ｃ６． Ｃ１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
本発明は、単位面積あたりに固定されるアルブミンの量を著しく増加する。
図１を参照しながら、本発明の実施の形態が、以下、説明される。
（実施の形態１）
図１は、アルブミンを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
図１は、アルブミンを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
基材１は、好ましくは金基板である。金基板の一例は、表面に金を一様に有する基板である。具体的には、金基板は、ガラス、プラスチック、またはＳｉＯ2の表面にスパッタリング法により形成された金膜を有する基板であり得る。
まず、アルカンチオールを含有する溶液に基材１は浸漬される。好ましくは、基材１が浸漬される前に基材１は洗浄される。当該アルカンチオールは、末端にカルボキシル基を有する。アルカンチオールは、６〜１８の範囲内の炭素数を有することが好ましい。このようにして、基材１上に自己組織化膜２が形成される。
アルカンチオールの好ましい濃度はおよそ１〜１０ｍＭである。アルカンチオールを溶解する限り、溶媒は限定されない。好ましい溶媒の一例は、エタノール、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と記される）、またはジオキサンである。好ましい浸漬時間はおよそ１２〜４８時間である。
次に、自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される。自己組織化膜２の上端に位置するカルボキシル基(-COOH)はアミノ酸３のアミノ基(-NH2)と反応して、以下の化学式（Ｉ）によって表されるペプチド結合を形成する。
化学式（Ｉ）においては、１分子のアミノ酸３が自己組織化膜２と結合する。
アミノ酸３は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される。すなわち、化学式（Ｉ）において、Ｒはこれら２０種類のアミノ酸から選択される１つのアミノ酸の側鎖である。
自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される際に、２種類以上のアミノ酸が同時に供給され得る。すなわち、自己組織化膜２にアミノ酸３を含有する溶液が供給される際に、当該溶液は２種類以上のアミノ酸３を含有し得る。後述するアルブミンのアミノ酸３への均一な結合を考慮すれば、当該溶液は１種類のみのアミノ酸を含有することが好ましい。
続いて、アルブミン４が供給される。アルブミン４のＮ末端のアミノ基が、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。アルブミン４に含まれるリジンのアミノ基も、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。このようにして、以下の化学式（ＩＩ）によって示される２つのペプチド結合が形成され、センサを得る。
１分子のアルブミン４は、そのＮ末端のアミノ基として１つのみを有する一方、１分子のアルブミン４は、アミノ基を有する多数のリジン基を有する。従って、ほとんど全ての化学式（ＩＩ）は、詳細には、以下の化学式（ＩＩＩ）によって表される。
（ここで、Ｒは１分子のアミノ酸の側鎖を表す）
このようにして得られたセンサは、試料に含有される抗体を検出または定量するために用いられる。
（実施例）
以下の実施例および比較例は、本発明をさらに詳細に説明する。本願明細書に記載された実施例は、例示目的のみのためものであり、それに鑑みて種々の改変および変形例が当業者にとって示唆されるものと理解され、そして、そのような改変および変形例も、本願明細書の趣旨および範囲ならびに添付の請求の範囲に当然含まれるべきものであると理解される。
以下の実施例および比較例は、本発明をさらに詳細に説明する。本願明細書に記載された実施例は、例示目的のみのためものであり、それに鑑みて種々の改変および変形例が当業者にとって示唆されるものと理解され、そして、そのような改変および変形例も、本願明細書の趣旨および範囲ならびに添付の請求の範囲に当然含まれるべきものであると理解される。
（比較例）
図３に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、アルブミンがアミドカップリング反応により結合され、アルブミンを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
図３に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、アルブミンがアミドカップリング反応により結合され、アルブミンを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
[試料溶液の調製]
１０ｍＭの最終濃度を有する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic
acid）の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
１０ｍＭの最終濃度を有する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic
acid）の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
［自己組織化膜の形成］
基材１として、ガラス上に蒸着された金を有する金基板（ＧＥヘルスケア社製；ＢＲ−１００４−０５）が用いられた。当該基材１は、濃硫酸および３０％過酸化水素水を含有するピラニア溶液で１０分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液に含有される濃硫酸の３０％過酸化水素水に対する体積比は３：１であった。
基材１として、ガラス上に蒸着された金を有する金基板（ＧＥヘルスケア社製；ＢＲ−１００４−０５）が用いられた。当該基材１は、濃硫酸および３０％過酸化水素水を含有するピラニア溶液で１０分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液に含有される濃硫酸の３０％過酸化水素水に対する体積比は３：１であった。
続いて、金基板は試料溶液中に１８時間浸漬され、金基板の表面に自己組織化膜を形成した。最後に、純水により基材１は洗浄され、乾燥された。
［アルブミンの固定］
自己組織化膜を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にアルブミンが結合され、アルブミンが固定された。
自己組織化膜を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にアルブミンが結合され、アルブミンが固定された。
具体的には、０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；N-Hydroxysuccinimide)および０．４Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)の３５マイクロリットルの混合液により、１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、３５マイクロリットルのアルブミン（４０マイクログラム／ｍｌ）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はアルブミンのアミノ基にカップリングされた。
（実施例１）
自己組織化膜の形成とアルブミンの固定との間に、１分子のアミノ酸としてグリシンが供給されたこと以外は、比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
自己組織化膜の形成とアルブミンの固定との間に、１分子のアミノ酸としてグリシンが供給されたこと以外は、比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
[アミノ酸（グリシン）の固定化]
自己組織化膜２を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic
acid）の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
自己組織化膜２を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic
acid）の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
具体的には、比較例と同様にカルボキシル基が活性化された後に、３５マイクロリットルの０．１Ｍグリシン（ｐH：８．９）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基がグリシンのアミノ基にカップリングされた。
[アルブミンの固定]
続いて、グリシンのカルボキシル基にアルブミンが結合され、アルブミンを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された後に、３５マイクロリットルのアルブミン（濃度：２５０マイクログラム／ｍｌ）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、アルブミンのＮ末端のアミノ基またはアルブミンに含まれるリジンのアミノ基にカップリングされた。
続いて、グリシンのカルボキシル基にアルブミンが結合され、アルブミンを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された後に、３５マイクロリットルのアルブミン（濃度：２５０マイクログラム／ｍｌ）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、アルブミンのＮ末端のアミノ基またはアルブミンに含まれるリジンのアミノ基にカップリングされた。
［固定量の比較］
SPR装置Biacore3000（GEヘルスケア社製）を用いて、実施例１および比較例におけるアルブミンの固定量が測定された。
本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたアルブミンの量を意味する。
比較例において測定された固定量に対する実施例１において測定された固定量の比は、およそ１４．４：１であった。
SPR装置Biacore3000（GEヘルスケア社製）を用いて、実施例１および比較例におけるアルブミンの固定量が測定された。
本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたアルブミンの量を意味する。
比較例において測定された固定量に対する実施例１において測定された固定量の比は、およそ１４．４：１であった。
（実施例２〜２０）
グリシンに代え、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トロプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リジン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが用いられ、実施例１と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸である。表１は、測定された固定量を示す。
グリシンに代え、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トロプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リジン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが用いられ、実施例１と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸である。表１は、測定された固定量を示す。
当業者は以下のことを表１から理解するであろう。
２０種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
２０種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸が好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は５以上であるからである。
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンがより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は１０以上であるからである。
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンがさらにより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は平均値（１０．７）以上であるからである。
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンが最も好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は平均値の１．２倍を超えるからである。
本発明は、単位面積あたりに固定されるアルブミンの量を著しく増加させ得る。このことにより、バイオセンサの感度を向上させることが可能になる。当該バイオセンサは、臨床現場において患者由来の生体試料に含有される抗体の検出または定量を必要とする検査および診断に用いられ得る。
１：金基材
２：アルカンチオール
３：アミノ酸
４：アルブミン
２：アルカンチオール
３：アミノ酸
４：アルブミン
Claims (21)
- アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に具備する、方法：
１分子のアミノ酸および前記自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記基材上にアルブミンを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記アルブミンのアミノ基との反応の結果として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
- 請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する、方法：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）。 - 請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する、方法：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。 - 請求項２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する、方法：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａ１ｂ）。 - 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
- 自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記アルブミンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。 - 前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１０に記載のセンサ。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、センサ。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、センサ。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、センサ。
- 請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、センサ。
- センサを用いて試料に含まれる抗体を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する、方法：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記アルブミンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記アルブミンに抗体を結合させる工程（ｂ）、および
工程（ｂ）において結合した抗体を検出するか、または工程（ｂ）において結合した抗体の量から前記試料に含有される抗体を定量する工程（ｃ）。 - 請求項１６に記載の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、方法。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
- 請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
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