FI102922B

FI102922B - Fluoresenssiin perustuva immunomääritysmenetelmä

Info

Publication number: FI102922B
Application number: FI962686A
Authority: FI
Inventors: Kari Keinaenen; Hans Soederlund; Marja-Leena Laukkanen
Original assignee: Valtion Teknillinen
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 1999-03-15
Also published as: FI102922B1; ATE226323T1; DK0932830T3; AU3264797A; NZ333472A; EP0932830A1; JP3436374B2; WO1998000714A1; FI962686A0; PT932830E; JP2000515965A; CA2257941A1; DE69716454D1; AU722353B2; EP0932830B1; NO986043L; NO986043D0; DE69716454T2; ES2181007T3; US6235535B1

Description

102922

Fluoresenssiin perustuva immunomääritysmenetelmä Tämä keksintö koskee fluoresenssiin perustuvaa immunomääri-tysmenetelmää analyytin osoittamiseksi tai sen pitoisuuden 5 määrittämiseksi biologisessa näytteessä. Menetelmä perustuu multivalentin analyytin kykyyn saattaa yhteen lipidikal-volle kiinnitettyjä ja siinä vapaasti liikkuvia, fluorofo-rilla leimattuja reseptorimolekyylejä, ja saada aikaan fluoresenssin muutoksia.

10

Perinteisissä fluoresenssiin perustuvissa immunomääritys-menetelmissä käytetään konventionaalisen inununomäärityksen periaatteita - mitattava analyytti sidotaan kiinteään kantajaan, minkä jälkeen se osoitetaan esim. fluoresoivan 15 vasta-aineen tai fluoresenssia synnyttävän entsyymireaktion avulla (Hemmilä, 1991, Kricka, 1994). Fluoresoivan määrityksen etuja ovat mm. huomattava herkkyys sekä riippumattomuus radioisotooppien käytöstä. Haittana voidaan pitää sitä, että useimpien muiden konventionaalisten immunomää-20 ritysten tavoin nämä fluoresenssiin perustuvat mittaukset ovat luonteeltaan heterogeenisiä, ts. niissä sitoutumaton vasta-aine tai antigeeni erotetaan ja analyytti määritetään epäsuorasti. Nämä pesu- ja erotusvaiheet lisäävät työmäärää ja kustannuksia.

25

Fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET) on fysikaalinen prosessi, jossa energia siirtyy korkeaan energiatilaan virittyneeltä molekyylikromoforilta (donori, D) toiselle kromoforille (akseptori, A) molekyylien välisen dipoli-30 dipolikytkeytymisen kautta (Clegg, 1995, Selvin, 1995).

Välttämätön ehto energiansiirrolle on se, että molekyylien välinen etäisyys on pieni (10-100 Ä), että donorin fluore-senssispektri ja akseptorin absorptiospektri ovat osittain päällekkäiset, ja että donorin kvanttisaanto (quantum 35 yield, φ0) ja akseptorin absorptiokerroin (eA) ovat riittävän korkeat. FRET:iä on käytetty nukleiinihappomolekyylien välisen hybridisaation mittaamisessa (Mergny et ai., 1994) ja lipidien ja kalvoproteiinien välisten interaktioiden \ * 2 102922 osoittamisessa (Watts et ai., 1986). Ilmiötä on sovellettu myös immunomääritykseen leimaamalla vasta-aine ja antigeeni fluoroforeilla, jotka muodostavat FRET-donori-akseptoripa-rin. Liuoksessa suoritettava määritys perustui antigeenin 5 (määritettävä aine) kykyyn syrjäyttää leimattu antigeeni ja näin estää FRET-ilmiö (Barnard ja Walt, 1991).

Proteiinien leimaaminen fluoresoiviksi on tunnettua tekniikkaa, joka perustuu kaupallisesti saatavilla oleviin ja 10 karakterisoituihin fluoroforeihin ja niiden johdannaisiin (Waggoner, 1995). Fluoroforit ovat joko synteettisiä, suhteellisen pienimolekyylisiä orgaanisia yhdisteitä (esim. fluoreskiini ja rodamiini johdannaisineen ja lantanidike-laatit) tai proteiineja (esim. fykoerytriini ja GFP = 15 vihreä fluoresoiva proteiini). Monia fluoroforien emittoiman fluoresenssin parametreja voidaan mitata: fluoresenssin intensiteetti, elinaika, polarisaatio. Näitä voidaan käyttää myös FRET-ilmiön seuraamiseen ja kvantitoimiseen.

20 Suomalaisissa patenteissa n:o 81680 ja 93997 on kuvattu homogeenisia immunomääritysmenetelmiä, joissa käytetään fluoresenssileimoja. Näistä ensinmainitussa kuvataan kiin-teäfaasi-immunomääritys, jossa nestefaasissa olevan vapaan leiman fluoresenssi vaimennetaan valoa absorboivalla ai-25 neella, jolloin sitoutuneen leiman määrä voidaan mitata ilman erotusvaiheita. Jälkimmäisessä patentissa kuvataan tavanomainen kvantitatiivinen immunofluoresenssimenetelmä, jonka ideana on saada aikaan herkkä määritys torjumalla lyhytikäinen taustafluoresenssi. Nämä menetelmät eivät 30 kuitenkaan liity mitenkään FRET-ilmiöön.

Lipidikaksoiskalvot ovat tunnetusti rakenteita, joita fosfolipidit ja eräät muut polaariset lipidit muodostavat spontaanisti vesiliuoksessa. Niissä lipidimolekyylien 35 polaariset päät ovat kontaktissa ulospäin veden kanssa ja ei-polaariset hiilivetyketjut ovat suuntautuneina sisään-: päin. Tasomaisia lipidikalvoja voidaan rakentaa mm. Lang- 3 102922 muir-Blodgett-tekniikan avulla (Arya et ai., 1985, Zasad-zinski et ai., 1994) ja siirtää kiinteän kantajan päälle (Mrksich ja Whitesides, 1995, Sackmann, 1996). Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa vesikulaarisia, suljettuja lipidi-5 kaksoiskalvorakenteita eli liposomeja (New, 1992). Lipidi-kalvoa voidaan pitää kaksidimensionaalisena nesteenä, jossa lipidimolekyylit ja kalvolle kiinnittyneet (luonnolliset kaivorakenteet kuten solukalvot) tai siihen kiinnitetyt muut molekyylit, kuten proteiinit liikkuvat suhteellisen 10 vapaasti kalvon tasossa (lateraalinen diffuusio, Tamm, 1988, Glaser, 1993). On sovelluksia, jotka perustuvat lipidikalvolle kiinnitettyjen, spesifisiin sitoutumis- ja tunnistusreaktioihin osallistuvien molekyylien toimintaan (Odashima et ai., 1991). Tällaisilla funktionaalisilla

H

15 lipidikalvoilla on huomattavaa potentiaalia esimerkiksi tunnistuspintoina biosensoreissa (Kiefer et ai., 1991, Mrksich ja Whitesides, 1995). Erityisen mielenkiintoisia tunnistusmolekyylejä ovat vasta-aineet, joita voidaan valmistaa tunnettujen tekniikoiden avulla lähes mille 20 tahansa makromolekyylille ja lukuisille pienille molekyyleille (Lerner et ai., 1992, Nissim et ai., 1994).

Olemme kehittäneet menetelmän bakteerisoluissa tuotettujen vasta-aineiden ja muiden proteiinien kiinnittämiseksi 25 lipidikalvolle. Menetelmä perustuu ns. biosynteettiseen "lipid tagging" -tekniikkaan (Laukkanen et ai., 1993, Keinänen & Laukkanen, 1994), jossa vasta-aine-lipoprote-iinifuusion aminoterminaaliseen kysteiiniin liitetään biosynteesin yhteydessä kovalenttisesti lipidirakenne. Tämä 30 hydrofobinen lipidi ankkuroi vasta-aineen (proteiinin) bakteerin ulkokalvolle. Puhdistettu lipidiankkurilla varustettu vasta-aine voidaan vastaavasti kiinnittää liposomin pintaan esim. detergenttidialyysimenetelmän avulla (Laukkanen et ai., 1994).

35 102922 4

Edellä esitettyyn perustuen olemme nyt kehittäneet aivan uudenlaisen homogeenisen immunomääritysmenetelmän, jonka avulla voidaan yksinkertaisesti ja helposti osoittaa näytteessä mahdollisesti läsnäoleva analyytti, joka edullisesti 5 on antigeeni, tai määrittää sen pitoisuus.

Keksintömme lähtee oivalluksesta, että lipidikalvolle kiinnitettyjen vasta-aineiden ja liuoksessa olevan antigeenin välinen sitoutumisreaktio voidaan kytkeä FRET-ilmiön 10 syntyyn, kun antigeeni on multivalenttinen (Kuva 1). "Mul-tivalenttisella antigeenillä" tarkoitetaan tämän hakemuksen puitteissa sellaista antigeeniä, joka sisältää useampia vasta-ainetta sitovia epitooppeja. Keksinnön mukaisessa homogeenisessa immunomääritysmenetelmässä lipidikalvolla on 15 kaksi lipidiankkurilla varustettua vasta-ainepopulaatiota, joista toinen on leimattu FRET-donorifluoroforilla ja toinen FRET-akseptorifluoroforilla. Kun vasta-aine kohtaa multivalenttisen antigeenin, tapahtuu vasta-aineiden pat-ching-ilmiö lipidikalvolla. Tällöin ko. antigeeni saattaa 20 lipidikalvolla vapaasti liikkuvat, akseptori- ja donori-fluoroforin sisältävät vasta-aineet lähikontaktiin eli tapahtuu mikroaggregaatio, jolloin energian siirto virittyneeltä donorifluoroforilta akseptorifluoroforille on mahdollista (FRET-ilmiö). Vasta-aineen vapaa lateraalinen 25 liikkuvuus immunoliposomeissa mahdollistaa FRET-ilmiön. Liikkuvuus saadaan aikaan lipidiankkurin avulla, joka liittää vasta-aineen liposomin lipidikaksoiskalvolle ("bi-layer"). Koska lipidikalvoja (esim. tasomaiset kalvot) voidaan kiinnittää kiinteän kantajan pinnalle em. Langmuir-30 Blodgett-tekniikalla (Mrksich ja Whitesides, 1995, Sack-• mann, 1996), ja liposomeja esim. biotiini-streptavidiini- kerrostekniikan avulla (Orellana et ai., 1996), mahdollistaa keksintö suoran ("homogeenisen") immunomäärityksen, joka ei sisällä erillisiä pesu- ja erotusvaiheita vaan 35 ainoastaan näytteen lisäyksen ja signaalin mittauksen.

_ X· 5 102922

Vastaavasti tällaisessa määrityksessä monovalenttisen antigeenin läsnäollessa ei ole mitään mekanismia, joka saattaisi yhteen vasta-ainemolekyylit, vaan ne liikkuvat edelleen vapaasti lipidikalvolla eikä FRET-ilmiötä havaita.

5 Monovalenttinen antigeeni on kuitenkin mitattavissa, mikäli analyysiliuokseen lisätään vakiomäärä samaa antigeeniä, joka on saatettu polyvalentiksi, jolloin "vapaa" monovalenttinen antigeeni syrjäyttää polymeerisen ja siten vaimentaa FRET-ilmiötä.

10

Keksintömme ei rajoitu edellä kuvatulla biosynteettisellä menetelmällä valmistettujen lipidiankkuroitujen vasta-aineiden käyttöön, sillä liukoisten proteiinien, erityisesti vasta-aineiden, kiinnittämiseksi lipidikalvolle on 15 käytössä erilaisia tunnettuja tekniikoita; vasta-ainemole-kyyliin voidaan liittää kovalenttisesti rasvahappoja (Huang et ai., 1980, Ho et ai., 1986) tai muita lipidejä (Heath et ai., 1981, Martin et ai., 1981, Pinnaduwage ja Huang, 1992), joiden avulla vasta-aine ankkuroituu lipidikalvolle; 20 vaihtoehtoisesti lipidikalvoon voidaan lisätä biotiinilei-mattua lipidiä, johon voidaan sitoa avidiini/streptavidii-ni, ja edelleen biotinyloitu vasta-aine (Loughrey et ai., 1987, 1990).

25 Piirustusten kuvaus i

Kuva 1. Fluoresenssienergian siirtoon perustuvan homo geenisen immunomääritysmenetelmän periaate.

30 Kuva 2. Bakteerisoluissa käytettävä, 2-fenyylioksatso- lonia sitovaa, lipidihännällistä yksiketjuista vasta-ainetta koodaava tuottovektori pML3.7H. Tärkeimmät restriktio-entsyymien pilkkomiskohdat on merkitty- Kuvassa olevien kirjainlyhenteiden selvennykset: ptac - tac-promoottorialue; 35 lpp - lipoproteiini; VH - vasta-aineen raskaan ketjun vaihteleva alue; Li - liitosalue; VL - vasta-aineen kevyen ketjun vaihteleva alue; amp - β-laktamaasigeeni; ori - 6 102922 plasmidi-DNA:n monistumisen aloituskohta; laclq - laktoo-sirepressorigeeni.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä eikä niiden 5 ole tarkoitus rajoittaa sitä. Esimerkeissä kuvataan lipidi-modifioidun vasta-aineen valmistus, leimaus ja kiinnittäminen liposomien pintaan, sekä näin saadun leimatun vasta-aineen avulla suoritettu immunomääritys.

10

Esimerkki 1: Lipidimodifioidun 2-fenyylioksatsolonia sitovan yksiketjuisen vasta-aineen (Ox lpp-scFv-H) kloonaus DNA:n kloonauksessa ja muokkaamisessa käytettiin yleisesti 15 tunnettua rekombinantti-DNA-metodiikkaa (Sambrook et ai., 1989, Griffin ja Griffin, 1994). Escherichia coll DH5a (F‘, endAl, hsdRl7(rk_, mk+), supE44, thi-1, λ-, recAl, gyrA96, relAl, Δ(argF-IacZYA)U169, 08OdIacZAM15) -solukanta oli isäntänä eri rekombinantti-DNA-plasmidien valmistuksessa ja 20 RV308 (su', AlacX74, gallSII::OP308, strA) -kanta toimi proteiinien tuottoisäntänä.

Lipidimodifikaatiolle välttämättömät aminoterminaaliset lipoproteiinisekvenssit monistettiin PCR:n (polymerase 25 chain reaction, Saiki et ai., 1988) avulla käyttäen temp- laattina pKEN125-plasmidia (Laukkanen et ai., 1993) ja DNA-alukkeina oligonukleotideja 1 ja 2 (Taulukko I). Vastaavasti yksiketjuista anti-2-fenyylioksatsolonivasta-ainetta koodaava DNA-alue käyttäen templaattina pML5-plasmidia 30 (Takkinen et ai., 1991) ja DNA-alukkeina oligonukleotideja 3 ja 4 (Taulukko I). DNA-alukkeet syntetisoitiin Applied Biosystems 391 DNA-syntetisaattorilla ja niitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

7 102922

Taulukko ί: Lipidimuokatun vasta-aineen (Ox lpp-scFv-H) kloonauksessa tarvittavat DNA-alukkeet. Restriktioentsyy-mien pilkkomiskohdat, joita käytettiin kloonauksessa, on alleviivattu ja templaatti-DNA:ta vastaava komplementaa-5 rinen DNA-sekvenssi on lihavoitu.

ψ

Aluke 1: EcoRI

5'-TCATGAATTCATGAAAGCTACTAAACTGG-3' 10

Aluke 2: BamHI

5'-AAGTAGCTAGCGGATCCCTGATCGATTTTAGCGTTGC-3’

15 Aluke 3: BamHI

5'-TATGAATTCGCTAGCGGATCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGG-3'

Aluke 4: HindiII

20 5'-ACATCAAGCTTCTATTTCAGCTCCAGCTTG-3'

Aluke 5: Hindlll

5'-AAGATAAGCTTCTAATGATGGTGATGATGATGTTTCAGCTC

25 CAGCTTGGTCCCAGCACC-3'

Monistettu lipoproteiinisekvenssejä koodaava DNA (114 emäsparia, ep) pilkottiin EcoRI- ja Bamffl-restriktioentsyy- 30 meillä ja ko. DNA-fragmentti kloonattiin ensin samoilla entsyymeillä käsiteltyyn pUC18-vektoriin. Sen jälkeen yksiketjuista vasta-ainetta koodaava DNA (776 ep) pilkottiin BamHI- ja HindUJ-restriktioentsyymeillä ja kloonattiin edellä valmistettuun lpp-pUC18-vektoriin ja lopuksi Ox 35 lpp-scFv-proteiinia koodaava, EcoRI- ja Hindlll-restriktio-entsyymeillä käsitelty DNA-fragmentti kloonattiin pKKtac-vektoriin, ja saatu rekombinantti-DNA-plasmidi nimettiin pML3.7:ksi (Laukkanen et ai., 1993).

40 Puhdistusta varten Ox lpp-scFv-proteiinia koodaavaa DNA:ta lisämuokattiin siten, että sen karboksyylipäähän lisättiin kuutta histidiiniä koodaava DNA-sekvenssi käyttäen temp-laattina pML3.7-plasmidia ja 3'-pään DNA-alukkeena oli- 8 102922 gonukleotidia 5 (Taulukko I). Lopullinen rekombinantti-DNA-plasmidi nimettiin pML3.7H:ksi (Kuva 2).

Monistettujen DNA-sekvenssien virheettömyys tarkistettiin 5 dideoksisekvensoinnilla (Sanger et ai., 1977).

Esimerkki 2: Ox lpp-scFv-H -vasta-aineen tuotto E. colissa

Vasta-aineen tuotto bakteerisolussa tehtiin artikkelissa 10 Laukkanen et ai. (1993) kuvatun menetelmän mukaisesti. Ensiksi menetelmässä rekombinantti-DNA-plasmidi pML3.7H siirrettiin Escherichia coll RV308 -tuottokantaan. Sitten +30 °C:ssa 16-18 tunnin ajan ravistelussa ollut pML3.7H/E. coli-RV308-kasvusto nuorennettiin 1:50 laimentamalla LB-15 mediumiin (Sambrook et ai., 1989), joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliinia. Kasvatusta jatkettiin +30 eC:ssa kunnes bakteerisolususpension spektrofotometrillä 600 nm:ssä mitattu absorbanssi saavutti arvon 1,5, minkä jälkeen yhdis-telmäproteiinin tuotto käynnistettiin lisäämällä isopropyy-20 litio-p-D-galaktosidia (IPTG) siten, että lopullinen pitoisuus oli 1 mM. Tämän jälkeen kasvatusta jatkettiin edelleen +30 °C:ssa 16-18 tunnin ajan ravistelussa. Lopuksi bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla (5000 g, 10 min, +4 °C).

• 25 Solunäytteet analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektro- foreesilla (Laemmli, 1979) ja immunoblottauksen ja -värjäyksen avulla (Towbin et ai., 1979), jossa käytettiin yk-siketjuiselle anti-2-fenyylioksatsolonivasta-aineelle (Ox scFv) spesifistä kanin antiseerumia (Takkinen et ai., 30 1991). Primaarivasta-aineen jälkeen blotteja inkuboitiin alkalinen fosfataasi-anti-IgG konjugaatin kanssa ja lopuksi alkalinen fosfataasi osoitettiin värireaktiolla käyttämällä kaupallisia substraatteja (NBT ja BCIP, Promega).

35 Indusoiduista bakteerisolunäytteistä, jotka sisälsivät pML3.7H-plasmidin, havaittiin immunoblottauksen ja -vär- 9 102922 jäyksen jälkeen immunoreaktiivinen proteiini, joka kooltaan vastasi lipidihännällisen yksiketjuisen vasta-aineen laskettua kokoa (31 kDa). Bakteerisoluja, jotka sisälsivät pKKtac-plasmidin, käytettiin kontrollisolunäytteenä, jossa 5 ei havaittu iinmunoreaktiivista proteiinia inununovärj äyksen jälkeen. Immunoreaktiivisen proteiinimäärän perusteella Ox lpp-scFv-H:n tuottotaso ko. bakteerisoluissa oli noin 5 mg/ml.

10 Esimerkki 3: Ox lpp-scFv-H -vasta-aineen puhdistus

Vasta-ainejohdannainen tuotettiin kuten yllä on kuvattu ja puhdistettu käyttäen sekä metallikelaatio- (Porath ja Olin, 1983, Hochuli et ai., 1988, Smith et ai., 1988) että hap-15 teeniaffiniteettikromatografiaa artikkelin Laukkanen et ai. (1994) mukaisesti. Bakteerisolut, jotka kerättiin yhden litran kasvustosta, suspensoitiin 50 ml:aan lyysipuskuria (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1 mM PMSF). Suspensioon lisättiin lysotsyymi (1-2 mg/ml) ja sitä inku-20 boitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen suspensioon lisättiin membraaniproteiinien liuottamista varten Triton X-100:aa siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 1 % (w/v), ja suspensiota sekoitettiin 16-18 tuntia +4 °C:ssa. Tämän jälkeen liukoiset proteiinit (mm. Ox lpp-25 scFvH -vasta-aine) erotettiin solulysaatista sentrifugoi-malla (35 000 g, 40 min, +4 eC).

Metallikelaatiokromatografiapuhdistusta varten superna-tantti eli liukoinen proteiinifraktio laimennettiin 1:5 30 puskuriin A [10 mM HEPES, pH 7,4, IM NaCl, 10 % (v/v) glyseroli, 0,1 mM PMSF, 1 mM imidatsoli], jolloin Triton X-100:n lopullinen pitoisuus oli 0,2 %. Proteiiniliuokseen (50 ml) lisättiin 0,5 - 1 ml nikkelillä ladattua kelatoivaa agaroosigeeliä (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia) 35 ja proteiinien annettiin sitoutua pylväsmateriaaliin 16-18 tunnin ajan jatkuvassa sekoituksessa +4 eC:ssa. Pylvääseen · pakattua pylväsmateriaalia pestiin 5-10 ml:11a puskuria A, 10 102922 johon oli lisätty 0,2 % (w/v) Triton X-100:a. Pylväsmateri-aaliin tarttuneet proteiinit eluoitiin 5-10 ml:11a puskuria A, jossa oli 0,2 % (w/v) Triton X-100:a sekä 50, 75, 100 ja 200 mM imidatsolia.

5

Osittain puhdistunut vasta-aine (31 kDa proteiini) eluoitui immunoreaktion (immunoblottaus ja -värjäys, kts. yllä) perusteella 75 ja 100 mM imidatsolifraktioihin, jotka sitten yhdistettiin seuraavaa puhdistusvaihetta eli immobi-10 lisoituun hapteeniin perustuvaa affiniteettikromatografiaa varten. Lopullinen imidatsolifraktio laimennettiin 1:5 puskuriin B [10 mM HEPES, pH 7,4, IM NaCl, 10 % glyseroli, 0,2 % (w/v) Triton X-100] ja agaroosigeeliin (CNBr activated Sepharose 4B, Pharmacia) immobilisoitiin 2-fenyyliok-15 satsoloni-BSA-johdannainen, Ox21BSA (Mäkelä et ai., 1978), valmistajan ohjeen mukaisesti. Laimennettu proteiiniliuos ja Ox21BSA-Sepharose-geeli sekoitettiin keskenään ja proteiinien annettiin tarttua geeliin 16-18 tunnin ajan +4 °C:ssa. Tämän jälkeen geeli pakattiin pylvääseen ja sitä 20 pestiin ja tarttuneet proteiinit eluoitiin aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti (Takkinen et ai., 1991) paitsi, että puskureissa oli 0,2 % (w/v) Triton X-100:aa ja vasta-aineen eluutiovaiheessa alhaisella pH:11a detergentti vaihdettiin 1 % (w/v) 0G:ksi (n-oktyyli-p-D-glukopyranosidi).

25

Metallikelaatioaffiniteetti- ja hapteeniaffiniteettikro-matografiapuhdistusten jälkeen proteiininäytteet analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin (kts. yllä) avulla. Coomassie-värjätystä 15 % SDS-polyakryyliami-30 digeelistä havaittiin 31 kDa:n kokoisen proteiinin rikastuminen eri puhdistuvaiheiden jälkeen. Näytteet analysoitiin myös immunoblottauksella (kts. yllä), ja immunoreaktiivi-seksi proteiiniksi osoittautui 31 kDa:n kokoinen proteiini. Tuloksen perustella todettiin, että lipidihännällinen 35 vasta-aine pystyttiin puhdistamaan käyttäen edellä esitettyä puhdistusmenetelmää.

11 102922

Lipidimuokatun vasta-aineen hapteenin sitomisaktiivisuus määritettiin ELISA-menetelmällä (enzyme-linked immunosorbent assay) käyttäen 2-fenyylioksatsoloni-BSA-konjugaatilla pinnoitettuja mikrotiitterilevyjä kuten aiemmin on kuvattu 5 (Takkinen et ai., 1991, Laukkanen et ai., 1993). Vasta-aineen spesifinen sitoutuminen immobilisoituun hapteeniin määritettiin ELISA:11a siten, että proteiininäytteisiin lisättiin eri määriä liukoista hapteenia, Ox-kaproiinihap-po- (Ox-KA) tai Ox2iBSA-konjugaattia, (jossa jokaiseen BSA-10 molekyyliin on liitetty keskimäärin 21 fenyylioksatsoloni-molekyyliä), jolloin ko. vapaa hapteeni kilpaili vasta-aineen sitomispaikasta ja pystyi siten syrjäyttämään Ox lpp-scFv-H -vasta-aineen sitoutumisen immobilisoituun hapteeni -BSA-konjugaattiin.

15 Näytteistä, jotka sisälsivät puhdistettua Ox lpp-scFv -vasta-ainetta, pystyttiin havaitsemaan keltainen väri-reaktio (mitattu A405) alkalinen fosfataasi -substraatin lisäyksen jälkeen. ELISA-analyysistä, jossa käytettiin 20 liukoista hapteenia syrjäyttämään vasta-aineen sitoutuminen, saadun tuloksen mukaan puhdistetun proteiinin sitoutuminen immobilisoituun Ox21BSA:han estyi, mikä osoitti, että proteiini sitoutui spesifisesti hapteeniin.

25 Proteiinipitoisuudet puhdistetuista näytteistä mitattiin spektrofotometrisesti (A280). Puhdistetun vasta-aineen määrä oli 1-2 mg:n luokkaa, kun solut, joista puhdistus aloitettiin, oli otettu yhden litran kasvustosta.

30 Esimerkki 4: Ox lpp-scFv-Η -vasta-aineen leimaus

Fluoresoivien merkkiaineiden liittäminen vasta-aineen aminoryhmiin (vapaat aminoterminaaliset päät ja lysiinien 6-aminoryhmät) on tehty valmistajan (Molecular Probes, 35 U.S.A.) ohjeiden mukaisesti käyttäen Texas Red -fluoroforin sulfonyylikloridi- (T-353) ja fluoreskiinifluoroforin sukkinimidyyliesterijohdannaista (C-1311).

12 102922

Leimahtaessa Texas Red -fluoroforilla metallikelaatiokro-matografialla puhdistettu proteiiniliuos tehtiin 0,lM:i-seksi Na-bikarbonaattipuskurin (pH 9,2), jossa oli 1 % (w/v) OG:ia, suhteen. Leimausreaktiossa käytettiin kym-5 menkertainen massamäärä proteiinia (1 mg) fluoroforiin (0,1 mg) verrattuna. Texas Red -fluorofori liuotettiin pieneen määrään dimetyyliformamidia (DMF) ja sekoitettiin prote-iiniliuoksen kanssa. Leimausreaktion annettiin jatkua 16-18 tuntia +4 °C:ssa valolta suojattuna ja ravistelussa. Tämän 10 jälkeen vapaa leima poistettiin puhdistamalla proteiini hapteeniaffiniteettikromatografialla, kuten edellä on kuvattu (kts. Esimerkki 3). Proteiinin leimautuvuusaste määritettiin valmistajan antaman kaavan mukaisesti seuraavasti : 15

Ax Proteiinin molekyylipaino (Da) Leima (mol) _ x _ = _ e Proteiinin pitoisuus (mg/ml) Proteiini (mol) 20 jossa

Ax = fluoroforin absorbanssin arvo mitattuna ko. fluoro- forin absorption maksimiaallonpituudella 6 - f luoroforin molaarinen ekstinktiokerroin ( €Texae Red = 85 000) 25

Leimattu vasta-aine puhdistettiin hapteeniaffiniteetti-kromatografiällä (kts. yllä). Saaduista proteiinifraktioista mitattiin absorbanssiarvot sekä 280 (proteiinipitoisuus) että 592 nm:n (Texas Red -fluoroforin detektio) 30 kohdalla. Mitattujen arvojen perusteella voitiin todeta, että vapaa leima ei sitoutunut pylväsmateriaaliin ja poistui näytteestä heti, kun pylväsmateriaali pakattiin pylvääseen, minkä jälkeen pylväsmateriaalia pestiin edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Leimattu proteiini eluoitui « 35 vasta, kun pylväsmateriaalia pestiin alhaisella pH:11a. Ko. eluoitunut proteiini tarkistettiin SDS-PAGE:11a, jolloin todettiin, että Coomassie-värillä värjäytynyt, puhdas proteiini oli 31 kDa:n kokoinen. Proteiininäytteille teh- 13 102922 tiln myös ELISA-analyysi, ja havaittiin ko. proteiinin sitovan immobilisoitua Ox21BSA:ta. Tulosten perusteella voitiin todeta, että hapteenia sitovaan lipidihännälliseen vasta-aineeseen oli liittynyt Texas Red -fluorofori.

5

Proteiinin leimaaminen fluoreskiinilla tehtiin yllä esitetyn ohjeen mukaisesti, paitsi että proteiini oli 0,1 M Na-bikarbonaatti (pH 8,9) - 1 % (w/v) OG-puskurissa ja ko. fluorofori liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Lei-10 mattu proteiini analysoitiin ja leimautuvuusaste (efluoreekilnl - 68 000) määritettiin kuten edellä. Lipidihännällisen vasta-aineen todettiin leimautuneen myös fluoreskiini-fluoroforilla.

15 Esimerkki 5: Immunoliposomien valmistus

Puhdistettu ja leimattu Ox lpp-scFv-H -vasta-aine kiinnitettiin liposomien pintaan käyttämällä aiemmin kuvattuja ja yleisesti tunnettuja menetelmiä (New, 1992, Laukkanen et 20 ai., 1994). Viisi milligrammaa munankeltuaisesta eristettyjen fosfolipidien (fosfatidyylikoliini, PC, fosfatidyyli-etanoliamiini, PE) ja kolesterolin (Cho) seosta (PC:PE:Cho; 10:1:5 moolisuhde) liuotettiin 5 ml:aan sellaista liuosta, jossa oli 40 pg puhdistettua Ox lpp-scFv-H -proteiinia ja 1 ; 25 % (w/v) 0G:ia 10 mM HEPES (pH 7,4) -puskurissa. Kontrol liksi valmistettiin liposomeja, joihin ei ollut lisätty proteiinia, mutta jotka muuten valmistettiin samalla tavalla kuin immunoliposomit. Kirkkaasta liuoksesta detergentti poistettiin dialysoimalla 10 mM HEPES (pH 7,4) -puskuria 30 vastaan käyttäen LIPOSOMAT dialysaattoria (Dianorm, Saksa) ja selluloosakalvoja (cut-off 10 kDa). Detergentin poiston jälkeen näytteen todettiin hieman samentuneen, mikä viittasi siihen, että immunoliposomeja oli muodostunut detergen-tin poiston myötä. Samentunutta näyteliuosta ultrasentrifu-35 goitiin (150 000 g, 1 h, +4 eC), ja todettiin, että ultra-sentrifuugiputken pohjalla oli pelletti, joka suspensoitiin 14 102922 1-2 ml 10 mM HEPES (pH 7,4) -puskuria. Liposomit ja immuno-liposomit säilytettiin suspensiona +4 eC:ssa.

*

Pelletti analysoitiin elektronimikroskopian avulla, kuten 5 on kuvattu artikkelissa Laukkanen et ai., 1994. Näytepisara kuivattiin hiilipäällystetylle kuparihilalle (150-200 mesh) ja värjättiin 1 % kaliumfosfotungstaatilla (pH 7,4). Näyte tutkittiin transmissioelektronimikroskoopilla (Jeol JEM-100CX) käyttäen 60 V:ia. Näytteessä havaittiin liposomeja, 10 joiden halkaisija oli 100-200 nm. Lisäksi ultraesentrifu-goinnin supernatantti ja pelletti analysoitiin immunoblot-tauksella (ks. yllä). Pellettinäytteessä todettiin 31 kDa:n kokoinen, immunoreaktiivinen vyöhyke, kun taas supernatant-tinäytteessä ei havaittu immunoreaktiivisuutta. Näytteet 15 analysoitiin myös ELISA:11a (ks. yllä), jossa havaittiin pellettinäytteen sisältävän hapteenin sitomisaktiivisuutta.

Tulosten perusteella voidaan todeta pellettinäytteen sisältävän hapteenia sitovan lipidihännällisen vasta-aineen ankkuroituneena liposomeihin.

20

Vaihtoehtoisesti immunoliposomit valmistettiin laimentamalla nopeasti korkean ns. kriittisen misellikonsentraation (CMC) omaava detergentti alle CMC-arvon, jolloin hydrofobinen, detergentin liukoisena pitänyt proteiini kiinnittyy • 25 liposomien pintaan (New, 1992, Laukkanen et ai., 1995). Ox

lpp-scFv-H -vasta-ainetta [40 pg proteiinia 10 mM HEPES, pH

7,4, 0,7 % (w/v) OG -liuoksessa] sekoitettiin 5 mg fosfoli-pidi-kolesteroli-seosta sisältävään liposomipreparaattiin (Vtot = 5 ml). Seosta, jossa 0G:n lopullinen pitoisuus 30 laimennuksen jälkeen oli 0,02 %, sekoitettiin 16-18 tunnin ajan +4 °C:ssa. Tämän jälkeen immunoliposomit kerättiin ultrasentrifugoimalla kuten edellä on kuvattu.

e 15 102922

Esimerkki 6: Fluoresenssiin perustuva immunomääritys mitattaessa multivalenttia antigeeniä

Immunoliposomit valmistettiin kuten Esimerkissä 3 siten, 5 että vasta-aineena käytettiin kahta eri fluoroforilla leimattua preparaattia, jotka sekoitettiin massasuhteessa 1:1 ennen liposomien valmistamista. Puolet vasta-ainemo-lekyyleistä oli leimattu fluoreskiinilla ja puolet Texas Red -fluoroforilla. Tällöin jokaisessa immunoliposomissa on 10 tilastollisesti 50 % fluoreskiini- ja 50 % Texas Red -leimattua vasta-ainetta. Kontrollikokeita varten valmistettiin liposomeja, joissa oli ainoastaan fluoreskiinilla tai ainoastaan Texas Redillä leimattua vasta-ainetta. Valmistettujen fluoresoivien immunoliposomien fluoresenssi mitattiin 15 Shimadzu RF-5000 spektrofluorometrillä kvartsikyvetissä lOmM HEPES, pH 7,4 -puskurissa. Fluoreskiinin fluoresenssi viritettiin 492 nm aallonpituudella ja emissio mitattiin 516 nm aallonpituudella, kun taas Texas Red viritettiin 596 nm aallonpituudella ja emissioenergia mitattiin 620 nm 20 aallonpituudella. Vaihtoehtoisesti fluoresenssiemissio mitattiin spektrinä alueella 500-700 nm. Fluoreskiini/Texas Red -liposomipreparaatissa havaittiin voimakas fluoresenssi fluoreskiinin emissiomaksimin kohdalla, kun viritysaallon-pituus oli 492 nm ja vain hyvin heikko fluoresenssi 620 25 nm:n kohdalla, kun taas käytettäessä 596 nm:n viritysaal-lonpituutta mitattiin voimakas fluoresenssi Texas Redin emissiomaksimin (620 nm) kohdalla. Kontrolliliposomeissa, joissa oli ainoastaan fluoreskiini- tai Texas Red -leimattua vasta-ainetta, voitiin mitata vain kullekin fluorofo-30 rille ominainen fluoresenssispektri.

*

Yllä kuvattuun fluoreskiini/Texas Red -leimatun immuno-liposomipreparaatin 492 nm:n aallonpituudella viritettyä ’ fluoresenssia mitattiin kahdella aallonpituusarvolla, 516 35 nm (fluoreskiini) ja 620 nm (Texas Red) jatkuvatoimisesti magneettisekoittimellä varustetussa kyvetissä. Kun preparaattiin lisättiin multivalenttia antigeeniä, OX16BSA, 16 102922 havaittiin fluoresenssin vahvistuminen 620 nm:n kohdalla ja fluoresenssin heikkeneminen 516 nm:n kohdalla. Kontrolliko-keissa, joissa OX16BSA:n sijasta lipsomipreparaattiin lisättiin liukoista hapteenia, fenyylioksatsolonin kaproiinihap-5 pojohdannaista, tai pelkkää BSA:ta, ei tällaista fluo- resenssimuutosta havaittu. Kun vastaavassa koejärjestelyssä käytettiin liposomeja, joissa oli vain fluores-kiinileimattua vasta-ainetta, havaittiin vastaavasti 0X16-BSA:n lisäyksen jälkeen 516 nm:n kohdalla fluoresenssin 10 vähäinen heikkeneminen (mutta ei fluoresenssia 620 nm:n kohdalla). Kun taas käytettiin ainoastaan Texas Redillä leimattuja liposomeja ja viritysaallonpituus oli 492 nm, ei havaittu sanottavaa fluoresenssia 516 nm:n tai 620 nm:n kohdalla. Näin ollen multivalentin antigeenin lisäys li-15 posomipreparaattiin aikaansai spesifisen fluoresenssisig-naalin (Taulukko II).

Havainto on selitettävissä fluoresenssin resonanssienergian siirron avulla siten, että multivalentin hapteenin (OX16BSA) 20 sitoutuminen aikaansaa liposomien pinnalla olevien leimattujen vasta-ainemolekyylien kerääntymisen yhteen, jolloin fluoreskiinifluoroforin (donori) eksitaatioenergia voi siirtyä suoraan virittämään Texas Redin (akseptori) fluoresenssia. Näin ollen Texas Redin fluoresenssiemissio (620 . , 25 nm) kasvaa, kun taas fluoreskiinin emissio (516 nm) heikke- nee, koska osa eksitaatioenergiasta purkautuu muuten kuin fluoreskiinin omana fluoresenssina (quenching).

m 17 102922

Taulukko II LIPOSOMIPREPARAATTIEN FLUORESENSSIMUUTOKSET

VIRITYSAALLONPITUUDELLA 492 nm.

Merkkien ja lyhenteiden selitykset: F/TXR: liposomit, 5 joissa on sekä fluoreskiini- että Texas Red -leimattua vasta-ainetta; F: liposomit, joissa on vain fluoreskiinilla leimattua vasta-ainetta; TXR: liposomit, joissa on vain Texas Red -leimattua vasta-ainetta; t , fluoresenssi kasvaa; 1 , fluoresenssi heikkenee; -: fluoresenssissa ei 10 muutosta; OX16BSA: fenyylioksatsoloni-BSA-konjugaatti; OX: fenyylioksatsolonin kaproiinihappojohdannainen.

Liposomit Lisätty näy- Fluoresenssi Fluoresenssi te (516 nm) (620 nm) F/TXR OX16BSA 1 t

15 BSA

OX -

F 0X16BSA I

F OX -

TXR OX16BSA

20 ie 102922

Esimerkki 7: Fluoresenssiin perustuva immunomääritys mitattaessa monovalenttista hapteenia 5 Esimerkissä 6 kuvattua koejärjestelyä voidaan käyttää epäsuorasti myös monovalenttisen hapteenin, 2-fenyyliok-satsolonin kapronihappojohdannaisen, määrittämiseen. Fluoreskiini/Texas Red -leimattuun immunoliposomiprepa-raattiin lisättiin Ox16BSA:ta vapaan, liukoisen hapteenin 10 läsnäollessa. Tällöin havaittiin fluoresenssimuutosten (λβΒ 516 nm I , λβ„ 620 nm f ) heikkeneminen, joka oli verrannollinen lisätyn vapaan hapteenin määrään. Vapaan hapteenin aiheuttama multivalentin antigeenin syrjäytyminen vasta-aineesta havaittiin myös kokeissa, joissa multivalentti 15 vasta-aine oli lisätty liposomeihin ennen hapteenia.

19 102922

KIRJALLISUUSVIITTEET

Arya, A., Krull, U.J., Thompson, M. ja Wong, H.E. (1985) Langmuir-Blodgett deposition of lipid films on hydrogel as a basis for biosensor development. Anal. Chim. Acta 173: 5 331-336.

- Barnard, S.M. ja Walt, D.R. (1991) Chemical sensors based on controlled-release polymer systems, Science 251: 927-929.

10

Clegg, R.M. (1995) Fluorescence resonance energy transfer. Curr. Opin. Biotechnology 6: 103-110.

Glaser, M. (1993) Lipid domains in biological membranes.

15 Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 475-481.

Griffin, H.G. ja Griffin, A.M. (1994) PCR technology. Current innovations. CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, U.S.A.

20

Heath, T.D., Macher, B.A. ja Papahadjopoulos, D. (1981) Covalent attachment of immunoglobulins to liposomes via glycosphingolipids. Biochem. Biophys. Acta 640:66-81.

25 Hemmilä, I. (1991) Application of fluorescence in immunoassays. Wiley-Interscience, New York, U.S.A.

Ho, R.J.Y., Rouse, B.T. ja Huang, L. (1986) Target-sensitive immunoliposomes: preparation and characterization.

30 Biochemistry 25:5500-5506.

Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R. ja Stuber, D. (1988) Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with novel metal chelate 35 adsorbent. Bio/Techology 6: 1321-1325.

Huang, A., Huang, L. ja Kennel, S.J. (1980) Monoclonal antibody covalently coupled with fatty acids. A reagent for in vitro liposome targeting. J. Biol. Chem. 225:8015-8018. 40

Keinänen, K. ja Laukkanen, M.-L. (1994) Biosynthetic lipidtagging of antibodies, FEBS. Lett. 346: 123-126.

Kiefer, H., Klee, B., John, E., Stierhof Y.-D. ja Jähnig 45 (1991) Biosensors based on membrane transport proteins.

Biosensors & Bioelectronics 6: 233-237.

Kricka, L.J. (1994) Selected strategies for improving „ sensitivity and reliability of immunoassays. Clin. Chem.

50 40: 347-357.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature 222: 680-685.

20 102922

Laukkanen, M.-L., Alfthan, K. ja Keinänen, K. (1994)

Functional immunoliposomes harboring a biosynthetically lipid-tagged single-chain antibody. Biochemistry 33: 11664-11670.

5

Laukkanen, M.-L., Orellana, A. ja Keinänen, K. (1995) Use of genetically engineered lipid-tagged antibody to generate v functional europium chelate-loaded liposomes: application in fluoroimmunoassay. J. Immunol. Methods 185: 95-102.

10

Laukkanen, M.-L., Teeri, T.T. ja Keinänen, K. (1993) Lipid-tagged antibodies: bacterial expression and characterization of a lipoprotein-single-chain antibody fusion protein.

Protein Eng. 6: 449-454.

15 '

Lerner, R. A., Kang, A.S., Bain, J.D., Burton, D.R. ja Barbas, III C.F. (1992) Antibodies without immunization.

Science 285: 1313-1314.

20 Loughrey, H.C., Bally, M.B. ja Cullis, P.R. (1987) A non-covalent method of attaching antibodies to liposomes.

Biochem. Biophys. Acta 910:157-160.

Loughrey, H.C., Choi, L.S., Cullis, P.R. ja Bally, M.B.

25 (1990) Optimized procedure for the coupling of proteins to liposomes. J. Immunol. Methods 132:25-35.

Martin, F.J., Hubbell, W.L. ja Papahadjopoulos, D. (1981) Immunospecific targeting of liposomes to cells: A novel and 30 efficient method for covalent attachment of Fab' fragments via disulfide bonds. Biochemistry 20:4229-4238.

Mergny, J.-L., Boutorine, A.S., Garestier, T., Belloc, F.,

Roug6e, M., Bulychev, N.V., Koshkin, A.A., Bourson, J., 35 Lebedev, A.V., Valeur, B., Thuong, N.T. ja Helöne, C.

(1994) Fluorescence energy transfer as a probe for nucleic acid structures and sequences. Nucleic Acids Res. 22: 920-928.

40 Mrksich, M ja Whitesides, G.M. (1995) Patterning self-assembled monolayers using microcontact printing: a new technology for biosensors? TIBTECH 13: 228-235.

Mäkelä, 0., Kaartinen, M., Pelkonen, J.K. ja Karjalainen, 45 K. (1978) Inheritance of antibody specificity V. Anti-2- phenyloxazolone in the mouse. J. Exp. Med. 148: 1644-1660.

New, R.R.C. (1992) Preparation of liposomes, In: New, R.R.C. (ed.) Liposomes, a practical approach. Oxford Uni-50 versity Press, Oxford, U.K., sivut 33-104.

Nissim,, A., Hoogenboom, H.R., Tomlinson, I.M., Flynn, G.,

Midgley, C., Lane, D. ja Winter, G. (1994) Antibody fragments from a "single pot" phage display library as immuno-55 chemical reagents. EMBO J. 13: 692-698.

21 102922

Odashima, K.f Sugawara,. M. ja Umezawa, Y. (1991) Biomem-brane mimetic sensing chemistry. Trends Anal. Chem. 10: 207-215.

5 Orellana, A., Laukkanen, M.-L. ja Keinänen, K. (1996)

Europium chelate-loaded liposomes: a tool for the study of binding and integrity of liposomes. Biochim. Biophys. Acta, - 1284: 29-34.

10 Pinnaduwage, P. ja Huang, L. (1992) Stable target-sensitive immunoliposomes. Biochemistry 31:2850-2855.

Porath, J. ja Olin, B. (1983) Immobilized metal ion affinity adsorption and immobilized metal ion affinity 15 chromatography of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions. Biochemistry 22: 1621-1630.

Sackmann, E. (1996) Supported membranes: scientific and 20 practical applications. Science 271: 43-48.

Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. ja Erlich, H.A.

(1988) Primer directed enzymatic amplification of DNA with 25 thermostable DNA polymerase. Science 239: 478-491.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. ja Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 30 U.S.A.

Sanger, F., Nickel, S. ja Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 5463-5467.

35

Selvin, P.R. (1995) Fluorescence resonance energy transfer. Meth. Enzymol. 246: 300-334.

• ·

Smith, M.C.7 Furman, T.C., Ingolia, T.D. ja Pidgeon, C.

40 (1988) Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. J. Biol. Chem. 263: 7211-7215.

Takkinen, K., Laukkanen, M.-L., Sizmann, D., Alithan, K., 45 Immonen, T., Vanne, L., Kaartinen, M. ja Teeri, T.T. (1991) : An active single-chain antibody containing a cellulase ’ . linker domain is secreted by Escherichia coli. Protein Eng.

4: 837-841.

„ 50 Tamm, L.K., (1988) Lateral diffusion and fluorescence microscope studies on a monoclonal antibody specifically bound to supported phospholipid bilayers. Biochemistry 27: 1450-1457.

22 102922

Towbin, H., Staehelin, T. ja Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76: 4350-4354.

5

Waggoner, A. (1995) Covalent labeling of proteins and nucleic acids with fluorophores. Meth. Enzymol. 246: 362-373.

10 Watts, T.H., Gaub, H.E. ja McConnell, H.M. (1986) T-cell-mediated association of peptide antigen and major histocompatibility complex protein detected by energy transfer in an evanescent wave-field. Nature 320: 179-181.

15 Zasadzinski, J.A., Viswanathan, R., Madsen, L., Garnaes, J. ja Schwartz, D.K. (1994) Langmuir-Blodgett films. Science 263: 1726-1733.

♦ e

Claims

102922

1. Fluoresenssiin perustuva immunomääritysmenetelmä ana-lyytin läsnäolon osoittamiseksi tai sen pitoisuuden määrit- 5 tämiseksi näytteessä, tunnettu siitä, että mainitulle ana-lyytille spesifisiä reseptorimolekyylejä, joista osa on leimattu ensimmäisellä fluoroforilla (donori) ja osa toisella fluoroforilla (akseptori), kiinnitetään lipidikal-volle, jolla ne pääsevät liikkumaan vapaasti, analyytin 10 mahdollisesti sisältävä näyte saatetaan kosketukseen mainittujen reseptorimolekyylien kanssa, ja mitataan fluoresenssin muutos, joka tapahtuu, kun reseptorimolekyylien aggregoitumisaste kalvolla analyytin sitoutumisen seurauksena muuttuu. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyytti on antigeeni ja reseptori on vasta-aine.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-20 tä, että analyytti on monovalenttinen antigeeni, jolloin antigeenin sisältävään näytteeseen lisätään tunnettu määrä sellaisia molekyylejä, joissa on kaksi tai useampia erillisiä vasta-aineeseen sitoutuvia antigeenirakenteita.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että lipidikalvo on liposomin muodossa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidikalvo on planaarisen kalvon muodossa. 30

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • I . I ' tä, että reseptorimolekyylit kiinnitetään lipidikalvolle niihin kemiallisesti tai geeniteknisesti kiinnitettyjen lipidimolekyylien välityksellä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fluoresenssidonorina käytetään fluoreskeiinia tai 35 102922 sen johdannaista ja akseptorina rodamiinia tai sen johdannaista.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että määritettävässä antigeenissä on kaksi tai useampia erilaisia epitooppeja.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritettävässä antigeenissä on kaksi tai useampia 10 samanlaisia epitooppeja.