JP3436374B2

JP3436374B2 - 脂質皮膜における蛍光エネルギー移動リガンド相互作用検定

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Publication number: JP3436374B2
Application number: JP50386198A
Authority: JP
Inventors: ケイネネン，カリ; ラウッカネン，マルヤ―レーナ; ソョデルルンド，ハンス
Original assignee: ヴァルティオン・テクニッリネン・トゥトキムスケスクス
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2003-08-11
Anticipated expiration: 2017-06-30
Also published as: NZ333472A; EP0932830A1; EP0932830B1; FI102922B1; FI962686A; FI102922B; DK0932830T3; NO986043L; DE69716454T2; ES2181007T3; FI962686A0; PT932830E; NO986043D0; US6235535B1; ATE226323T1; JP2000515965A; AU3264797A; AU722353B2; WO1998000714A1; CA2257941A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、生物学的試料中の分析物の検出のため、ま
たはその濃度の測定のための蛍光に基づく免疫検定法に
関する。この方法は、蛍光団でラベルされた受容体分子
（この分子は、脂質膜にアンカーされ、膜上を自由に動
き、これにより蛍光の変化を引き起こす）の集合を誘導
する多価分析物の能力に基づいている。

従来の蛍光に基づく免疫測定法は、通常の免疫検定の
原理を利用する。即ち、測定しようとする分析物を固体
基材上に固体化し、次いでこれを、例えば蛍光抗体また
は蛍光発生酵素反応を用いて検出する［Hemmmil,199
1,Kricka,1994］。蛍光に基づく検定の利点には、高い
感度および放射性同位体の使用に依存しないことが含ま
れる。ほとんどの他の通常の免疫検定と同様に、これら
蛍光に基づく検定が不均一の性質のものであること、即
ち、未結合の抗体または抗原を分離し、分析物を間接的
に測定するということは、欠点であるとみなすことがで
きる。これらの洗浄および分離工程は、作業量およびコ
ストを増加させる。

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、高エネルギー状
態に励起された分子発色団（ドナー、Ｄ）からのエネル
ギーが、分子間の双極子−双極子カップリングによって
別の発色団（アクセプター、Ａ）に移動する物理的過程
である［Clegg,1995,Selvin,1995］。このエネルギー移
動のための必要前提条件は、分子間の距離が短いこと
（10〜100Å）、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプタ
ーの吸収スペクトルが部分的に重なること、ならびに、
ドナーの量子収率（Φ_Ｄ）およびアクセプターの消衰係
数（E_A）が十分に高いことである。FRETは、核酸分子間
のハイブリダイゼーションの測定［Mergnyら,1994］お
よび脂質と膜タンパク質の間の相互作用の検出［Watt
ら,1986］に利用されている。また、この現象は、FRET
ドナー−アクセプターの対を構成する蛍光団で抗体と抗
原をラベルすることにより、免疫検定に利用されてい
る。この溶液相検定は、ラベル化抗原を置換し、従って
FRET現象を妨げる抗原（被測定物質）の能力に基づくも
のであった［BarnardおよびWalt,1991］。

タンパク質の蛍光ラベル化は、市販の蛍光団およびそ
の誘導体に基づく既知の技術である［Waggoner,199
5］。蛍光団は、合成の比較的低分子の有機化合物（例
えば、フルオレセイン、ローダミンおよびその誘導体、
およびランタニドキレート）またはタンパク質（例え
ば、フィコエリトリンおよびGFP、緑色蛍光タンパク
質）のいずれかである。蛍光団により放射される蛍光の
種々のパラメーター（蛍光強度、寿命、偏光）を測定す
ることができる。これらを用いてFRET現象をモニターお
よび定量することもできる。

フィンランド特許No.81680およびNo.93997は、蛍光ラ
ベルを用いる均一免疫検定法を記載している。最初の特
許は、液相中に存在する遊離ラベルの蛍光を光吸収物質
で消光させ、分離工程を行うことなく結合ラベルの測定
を可能にする固相免疫検定を記載している。後者の特許
においては、短命なバックグラウンド蛍光を妨げること
によって高感度の検定を達成するアイデアを伴う通常の
定量免疫検定法が記載されている。しかし、これらの方
法は、FRET現象とは全く関係がない。

脂質二重層は、リン脂質およびある種の他の極性脂質
により水溶液中で自然に形成される構造であることが知
られている。この構造においては、脂質分子の極性頭部
は水と接触して外側に向っており、一方、非極性炭化水
素鎖は内側に配向している。例えば、ラングミュア−ブ
ロジェット法を用いて平面脂質膜を調製することができ
［Aryaら,1985,Zasadzinskiら,1994］、これを固体基材
上に移動させることができる［MrksichおよびWhiteside
s,1995,Sackmann,1996］。また、小胞性の密閉された脂
質二重層構造またはリポソームを調製することができる
［New,1992］。脂質膜は２次元の液体であるとみなすこ
とができ、ここでは、脂質分子およびタンパク質などの
他の分子［膜と会合している（細胞膜などの天然膜構
造）かまたは膜に結合している］は、膜平面上を比較的
自由に移動する［横拡散;Tamm,1988,Glaser,1993］。特
異的な結合および認識反応に関与し、脂質膜に結合する
分子の機能に基づく応用が存在する［Odashimaら,199
1］。この種の機能的な脂質膜は、例えばバイオセンサ
ーにおける認識表面として大きな可能性を有する［Kief
erら,1991,MrksichおよびWhitesides,1995］。既知の方
法を用いてほとんど全ての巨大分子および多くの比較的
小さい分子に対して生成させることができる抗体「Lern
erら,1992,Nissimら,1994」は、認識分子として特に重
要である。

本発明者らは、細菌産生の抗体および他のタンパク質
を脂質膜に結合させるための方法を開発した。この方法
はいわゆる生合成脂質タッグ化法［Laukkanenら,1993,K
einnenおよびLaukkanen,1994］に基づくものであり、
ここでは脂質構造が、生合成中に抗体−リポタンパク質
融合体のＮ−末端システイン残基に結合されている。こ
の疎水性脂質は、抗体（タンパク質）を細菌の外側膜に
アンカー（固定）する。同様に、精製した脂質タッグ化
抗体を、例えば清浄剤透析法を用いてリポソームの表面
に結合させることができる［Laukkanenら,1993］。

上記のことに基づいて、ここに本発明者らは、試料中
の分析物の存在可能性の検出またはその濃度の測定を簡
単かつ容易に行うことができる新規な均一免疫検定法を
開発した。本発明によれば、抗原を測定するのが好まし
く、この場合には、脂質膜に結合させる受容体分子は分
析物に特異的な抗体である。

本発明は、液相中の抗原と脂質膜に結合した抗体の間
の結合反応を、抗原が多価であるときにFRET現象と組合
せることができるというアイデアに基づくものである
（図１）。本明細書中で用いる「多価抗原」なる用語
は、１を越える抗体結合エピトープを保持する抗原を指
す。本発明の均一免疫検定法は、脂質膜上の２種類の脂
質タッグ化抗体集団を含み、一方の集団をFRETドナー蛍
光団でラベルし、他方の集団をFRETアクセプター蛍光団
でラベルする。抗体が多価抗原と接触するようになる
と、脂質膜上で抗体の継ぎ合わせが起こる。そこで該抗
原は、アクセプターおよびドナー蛍光団を含有する抗体
を、密接に接触するように脂質膜上を自由に移動させ、
即ちミクロ集合が起こり、この場合に、励起されたドナ
ー蛍光団からアクセプター蛍光団へのエネルギー移動が
起こるであろう（FRET現象）。免疫リポソームにおける
抗体の自由な横移動はFRET現象を可能にする。この移動
は、抗体を脂質二重層に結合する脂質アンカーの存在に
よって達成される。脂質膜（例えば、平面膜）は、例え
ばラングミュア−ブロジェット法［MrksichおよびWhite
sides,1995,Sackmann,1996］を用いて固体基材の表面に
結合させることができ、また、リポソームは、例えばビ
オチン−ストレプトアビジン層法［Orellanaら,1996］
を用いて結合させることができるので、本発明は直接的
な（「均一な」）免疫検定を可能にするものである（こ
の免疫検定は、独立した洗浄および分離工程を含まず、
試料の添加とシグナルの測定のみを含む）。

測定においては、蛍光がドナーに賦課され（例えば、
適当な波長を有する光供給源を用いて）、膜に結合した
抗体の比較的多量が密接に接触し、励起エネルギーの比
較的大部分がアクセプターに移動し、ドナーに特徴的な
蛍光としては直接的に放射しない。従って、正味の結果
は、ドナーに特徴的な蛍光の減少およびアクセプターに
特徴的な蛍光の増加である。測定においては、試料と接
触している表面の蛍光を、試料を含まない対照表面と比
較し、次いでドナーの蛍光またはアクセプターの蛍光の
いずれかと比較することができるか、あるいは、ほとん
どの場合にはこれらの比率（時間の関数として）を測定
することができる。これらの全ては、膜上の抗体の「集
合レベル」が抗原の結合の結果として変化するときに変
化する。

対応して、一価抗原の存在下では、抗体分子を一緒に
する上記検定におけるような機構は存在せず、抗体分子
は脂質膜上を自由に移動し続け、FRET現象は観察されな
い。しかし、一価抗原を間接的に測定することができ
る。この場合には、既知量の同一抗原を検定溶液に加え
る。この抗原は多価形態（即ち、２またはそれ以上の独
立した抗原構造を有する）に変換されており、この結
果、多価抗原が一価「遊離」抗原によって置換され、FR
ET現象が消失することになり、これにより、得られる蛍
光の変化を測定することができる。

また、分析物−受容体の対として、抗体−抗原の対を
抗原−抗体の対の代わりに用いることもできる。この場
合には、抗原を脂質膜にアンカーし、抗体が溶液中にあ
り、抗体またはその量を測定する。天然の抗体は常に多
価であるので、これらは常に直接検定で測定することが
できる。

脂質膜への可溶性タンパク質（特に、抗体）の結合の
ために異なる既知の方法が利用可能であるので、本発明
は、上記の生合成法によって調製された脂質アンカー化
抗体の使用に限定されない。脂肪酸［Huangら,1980,Ho
ら,1986］または他の脂質［Heathら,1981,Martinら,198
1］を抗体分子と共有結合させることができ、脂質膜に
抗体をアンカー化することができる。また、ビオチン含
有脂質を脂質膜に導入することができ、次いでこれをア
ビジン／ストレプトアビジン、さらにビオチニル化抗体
を結合することができる［Loughreyら,1987,1990］。

図面の説明図１は、蛍光エネルギー移動に基づく均一免疫検定法
の原理を示す模式図である。

図２は、脂質タッグ化一本鎖２−フェニルオキサゾロ
ン結合抗体をコードしている細菌性発現ベクターpML3.7
Hを示す模式図である。最も重要な制限部位が示されて
いる。この図において用いた短縮形は、次の通りであ
る:ptac＝tacプロモーター領域;lpp＝リポタンパク質;V
H＝抗体重鎖の可変領域;Li＝リンカー領域;VL＝抗体軽
鎖の可変領域;amp＝β−ラクタマーゼ遺伝子;ori＝プラ
スミドDNAの複製起点;laqIq＝ラクトースリプレッサー
遺伝子。

以下に挙げる限定のためのものではない実施例は、本
発明をさらに詳しく説明するものである。これら実施例
には、脂質タッグ化抗体の調製、ラベル化およびリポソ
ーム表面への結合、ならびに、このようにして得た抗体
を用いて行った免疫検定が含まれる。

実施例1:一本鎖の脂質修飾した抗−２−フェニルオキサ
ゾロン抗体（Ox lpp−scFv−Ｈ）のクローニング DNAクローニングおよび修飾に、通常の組換え法を用
いた［Sambrookら,1989,GriffinおよびGriffin,199
4］。大腸菌DH5α株［F^-,endA1,hsdR17（r_k-,m_k+）,sup
E44,thi−1,λ−,recA1,gyrA96,relA1,Δ（argF−lacZY
A）U169,Φ80dlacZΔM15］を組換えDNAプラスミド調製
のための宿主として用い、RV308株［su^-,ΔlacX74,galI
S II::OP308,strA］をタンパク質産生のための宿主とし
て用いた。

脂質修飾のために必要なアミノ末端リポタンパク質配
列を、DNAプライマーとしてオリゴヌクレオチド１およ
び２（表Ｉ）ならびに鋳型としてpKEN125プラスミド［L
aukkanenら,1993］を用いて、PCR［ポリメラーゼ連鎖反
応;Saiki,1988］によって増幅した。これに対応して、
一本鎖の抗−２−フェニルオキサゾロン抗体をコードし
ているDNA領域を、DNAプライマーとしてオリゴヌクレオ
チド３および４（表Ｉ）ならびに鋳型としてプラスミド
pML5［Takkinenら,1991］を用いて増幅した。DNAプライ
マーはApplied Biosystems 391 DNA合成機を用いて合成
し、これらをさらに精製することなく用いた。

リポタンパク質配列をコードしている増幅したDNA（1
14塩基対、bp）を、制限酵素EcoR IおよびBamH Iで消化
し、まずこのDNAフラグメントを、同じ酵素で処理したp
UC18ベクター中にクローン化した。次いで、一本鎖抗体
をコードしているDNA（776bp）を制限酵素BamH Iおよび
Hind IIIで消化し、上記のように調製したlpp−pUC18ベ
クター中にクローン化し、最後に、EcoR IおよびHind I
IIで消化することによって得たOx lpp−scFv−タンパク
質をコードしているDNAフラグメントをpKKtacベクター
中にクローン化し、pML3.7と命名した（Laukkanenら,19
93）。

精製を容易にするために、Ox lpp−scFvタンパク質を
コードしているDNAを、３′末端のDNAプライマーとして
オリゴヌクレオチド５（表Ｉ）および鋳型としてプラス
ミドpML3.7を用いて、Ｃ−末端に６個のヒスチジンをコ
ードしているDNA配列を付加することによって、さらに
修飾した。この最後の組換えDNAプラスミドをpML3.7H
（図２）と命名した。

増幅したDNA配列の正しさを、ジデオキシヌクレオチ
ド配列決定［Sangerら,1977］によって確認した。

実施例2:大腸菌における抗体Ox lpp−scFv−Ｈの産生細菌細胞における抗体の産生を、Laukkanenら（199
3）の記載のように行った。初めに、組換えDNAプラスミ
ドpML3.7を、生産株である大腸菌RV308に転移させた。
次いで、＋30℃で16〜18時間振盪して増殖させた大腸菌
pML3.7H/RV308培養物を、100μｇアンピシリン/mlを含
むLB培地［Sambrookら,1989］に1:50希釈することによ
って継代培養した。分光光度計において600nmで測定し
た細菌懸濁液の吸収が1.5の値に到達するまで＋30℃で
培養を続け、次いで、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラ
クトシド（IPTG）を最終濃度1mMで添加することによっ
て組換えタンパク質の産生を誘導した。次いで、培養を
＋30℃でさらに16〜18時間続けた。最後に細菌細胞を遠
心（5000g、10分、＋４℃）により集めた。

細胞試料を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
［Laemmli,1979］および免疫ブロットおよび免疫染色
［Towbinら,1979］によって分析した。ここで、一本鎖
の抗−２−フェニルオキサゾロン抗体（Ox scFv）に特
異的なウサギ抗血清を用いた［Takkinenら,1991］。一
次抗体の後、ブロットをアルカリホスファターゼ−抗Ig
Gコンジュゲートと共にインキュベートし、最後に、市
販の基質（NBTおよびBCIP、Promega）を、アルカリホス
ファターゼ活性の検出のために加えた。

脂質タッグ化した一本鎖抗体に対して計算される大き
さに一致する大きさ（31kDa）の免疫反応性タンパク質
が、プラスミドpML3.7Hを保持する細菌細胞の誘導によ
り調製した試料において、免疫ブロットおよび免疫染色
の後に観察された。対照として用いたプラスミドpKKtac
を保持する細菌細胞から調製した試料の免疫染色後に
は、免疫反応性タンパク質は観察されなかった。免疫反
応性に基づいて、該細菌におけるOx lpp−scFv−Ｈの産
生レベルは約5mg/lであった。

実施例3:Ox lpp−scFv−Ｈ抗体の精製抗体誘導体を上記のように産生させ、金属キレート化
アフィニティークロマトグラフィー［PorathおよびOli
n,1983;Hochuliら,1988;Smithら,1988］およびハプテン
アフィニティークロマトグラフィー［Laukkanenら,199
4］の両方を用いて精製した。1Lの培養物から集めた細
菌細胞を、溶解緩衝液［10mM HEPES、pH7.4、1mM EDT
A、1M NaCl、0.1mM PMSF］（50ml）に懸濁した。リゾチ
ーム（１〜2mg/ml）を懸濁液に加え、次いでこれを室温
で15分間インキュベートした。次に、Triton X−100を
最終濃度１％（w/v）で加えて膜タンパク質を可溶化
し、懸濁液を＋４℃で16〜18撹拌した。次に、可溶性タ
ンパク質（Ox lpp−scFv−Ｈ抗体を含む）を、遠心（3
5,000g、40分、＋４℃）により細胞溶解液から分離し
た。

金属キレート化クロマトグラフィーによる精製のため
に、上清または可溶性タンパク質分画を緩衝液Ａ［10mM
HEPES、pH7.4、1M NaCl、10％（v/v）グリセロール、
0.1mM PMSF、1mMイミダゾール］で1:5希釈し、次いでTr
iton X−100の最終濃度を0.2％にした。このタンパク質
溶液（50ml）に、Niを入れたキレート化アガロースゲル
［Chelating Sepharose Fast Flow,Pharmacia］（0.5〜
1ml）を加え、＋４℃で継続撹拌下に16〜18時間、タン
パク質をカラム物質に結合させた。カラムに充填したカ
ラム物質を、0.2％（w/v）のTriton X−100を含む緩衝
液Ａ（５〜10ml）で洗浄した。カラム物質に結合したタ
ンパク質を、0.2％（w/v）のTriton X−100と50、75、1
00および200mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（５〜10m
l）で溶離した。

免疫反応（免疫ブロットおよび免疫染色、上記を参
照）に基づいて、部分精製した抗体（31kDaタンパク
質）は75および100mMイミダゾール分画に溶出した。次
いで、これら分画を一緒にし、次の精製工程、即ち固定
化ハプテンに基づくアフィニティークロマトグラフィー
用とした。最終イミダゾール分画を緩衝液Ｂ［10mM HEP
ES、pH7.4、1M NaCl、10％グリセロール、0.2％（w/v）
Triton X−100］で1:5希釈し、２−フェニルオキサゾロ
ン−BSAコンジュゲート（Ox₂₁BSA）［Ｍkelら,197
8］を、製造元の指示に従い、アガロースゲル（CNBr活
性化したSepharose 4B、Pharmacia）に結合させた。希
釈したタンパク質溶液およびOx₂₁BSA−Sepharoseゲルを
一緒にし、＋４℃で16〜18時間、タンパク質をゲルに結
合させた。次いで、ゲルをカラムに充填し、これを洗浄
し、結合タンパク質を溶離した［以前に記載された方法
（Takkinenら,1991）に従う；ただし、緩衝液は0.2％
（w/v）のTriton X−100を含み、低pHで抗体を溶離する
ときに清浄剤を１％（w/v）のOG（ｎ−オクチル−β−
Ｄ−グルコピラノシド）に置換した］。

金属キレート化アフィニティークロマトグラフィーお
よびハプテンアフィニティークロマトグラフィーによる
精製に続いて、タンパク質試料をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（上記を参照）を用いて分析した。ク
ーマッシー染色した15％SDS−ポリアクリルアミドゲル
において、31kDaタンパク質の豊富化が、種々の精製工
程後に観察された。また、試料を免疫ブロット（上記を
参照）によっても分析し、免疫反応性が31kDaタンパク
質によるものであることがわかった。これらの結果か
ら、上記の精製プロトコールの使用が脂質タッグ化され
た抗体を精製する結果になると結論された。

脂質タッグ化された抗体のハプテン結合活性を、以前
に記載されたように［Takkinenら,1991;Laukkanenら,19
93］、２−フェニルオキサゾロン−BSAコンジュゲート
を被覆した微量液定プレートを用いるELISA（酵素結合
イミノソルベント検定）法によって測定した。固定化ハ
プテンに対する抗体の特異的結合のELISAによる証明
は、異なる量の可溶性ハプテン、２−フェニルオキサゾ
ロンのカプロン酸誘導体（Ox−CA）またはOx₂₁BSAコン
ジュゲート（全てのBSA分子は平均して21個のフェニル
オキサゾロン分子を担持する）をタンパク質試料に添加
することによって行った。この添加の結果、抗体の結合
部位を添加ハプテンが競合し、従って、固定化したハプ
テン−BSAコンジュゲートに対するOx lpp−scFv−Ｈ抗
体の結合が置換されることになる。

アルカリホスファターゼのための基質の添加後の黄色
反応の生成（A₄₀₅を測定する）を、精製Ox lpp−scFv−
Ｈ抗体を含む試料において観察することができた。可溶
性ハプテンを用いて抗体の結合を置換したELISA分析に
おいて、得られた結果は、固定化Ox₂₁BSAに対するタン
パク質の結合の妨害であり、このことはタンパク質がハ
プテンに特異的に結合したことを示すものである。

精製試料のタンパク質濃度を分光光度計（A₂₈₀）を用
いて測定した。1L培養の細胞からの抗体の精製は、１〜
2mgの精製抗体を与えた。

実施例4:抗体Ox lpp−scFv−Ｈのラベル化蛍光指示物質と抗体のアミノ基（遊離のアミノ末端お
よびリシン残基のε−アミノ基）との結合を、Texas Re
d^R蛍光団のスルホニルクロリド誘導体（Ｔ−353）およ
びフルオレセイン蛍光団のスクシンイミジルエステル誘
導体（Ｃ−1311）を用いて、製造元（Molecular Probe
s、米国）の指示に従って行った。

Texas Red蛍光団によるラベル化においては、金属キ
レート化クロマトグラフィーによって精製したタンパク
質溶液を、１％（w/v）OGを含む0.1M炭酸水素ナトリウ
ム（pH9.2）に調整した。ラベル化反応において、蛍光
団（0.1mg）に対して10倍質量過剰のタンパク質（1mg）
を用いた。Texas Red蛍光団を少量のジメチルホルムア
ミド（DMF）に溶解し、タンパク質溶液と混合した。ラ
ベル化反応を、振盪下に光から保護して＋４℃で16〜18
時間続けた。続いて、上記（実施例３を参照）のように
ハプテンアフィニティークロマトグラフィーを用いてタ
ンパク質を精製することによって、遊離ラベルを除去し
た。タンパク質のラベル化度を、製造元により示された
以下の式に従って決定した：ラベル化抗体をハプテンアフィニティークロマトグラ
フィー（上記を参照）によって精製した。タンパク質分
画の280nm（タンパク質濃度）および592nm（Texas Red
蛍光団の検出）の両方での吸光度を測定した。測定値か
ら、遊離ラベルはカラム物質に結合せず、カラム物質を
カラムに充填し、上記のように洗浄したときに試料から
速やかに除去されるものと結論することができた。ラベ
ル化タンパク質は、低pH洗浄においてのみカラムから溶
出した。この溶出したタンパク質をSDS−PAGEによって
分析した。この場合、精製したタンパク質は、31kDaの
クーマッシー染色されたバンドとして現れた。また、タ
ンパク質試料をELISAによっても分析した。これによ
り、該タンパク質は固定化Ox₂₁BSAに結合することがわ
かった。これらの結果から、Texas Red蛍光団は、ハプ
テン結合生の脂質タッグ化抗体に結合したと言うことが
できた。

フルオレセインによるタンパク質のラベル化を上記の
ように行った。ただし、タンパク質を0.1M炭酸水素ナト
リウム（pH8.9）、１％（w/v）OG緩衝液中とし、蛍光団
をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。上記のよ
うにラベル化タンパク質を分析し、ラベル化度を測定し
た（ε_{フルオレセイン}＝68,000）。脂質タッグ化した抗
体は、フルオレセイン蛍光団でラベル化されたことがわ
かった。

実施例5:免疫リポソームの調製精製しラベル化したOx lpp−scFv−Ｈ抗体を、以前に
記載され広く知られている方法［New,1992,Laukkanen
ら,1994］を用いて、リポソームの表面に結合させた。
卵黄リン脂質［ホスファチジルコリン（PC）；ホスファ
チジルエタノールアミン（PE）］およびコレステロール
（Cho）の混合物［モル比PC:PE:Cho＝10:1:5］（5mg）
を、10mM HEPES（pH7.4）緩衝液中に40μｇの精製Ox lp
p−scFv−Ｈおよび１％（w/v）のOGを含む溶液（5ml）
に溶解した。対照として、タンパク質を添加しないリポ
ソームを、その他は同じ方法で調製した。セルロース膜
（カットオフ 10kDa）を有するLIPOSOMAT透析機（Dian
orm、ドイツ）を用いて、10mM HEPES（pH7.4）緩衝液に
対して透析することによって、透明溶液から清浄剤を除
去した。清浄剤の除去後に、試料はわずかに乳白光を放
つことがわかった。このことは、清浄剤を除去したとき
に免疫リポソームが生成したことを示唆するものであ
る。この乳白光を放つ溶液を超遠心（150,000g、１時
間、＋４℃）にかけると、遠心管の底にペレットが生成
することがわかった。次いで、このペレットを10mM HEP
ES（pH7.4）緩衝液（１〜2ml）に懸濁した。このリポソ
ームおよび免疫リポソームを懸濁液として＋４℃で保存
した。

ペレットを、Laukkanenら（1994）の記載のように電
子顕微鏡で分析した。試料小滴を、炭素被覆した銅格子
板（150〜200メッシュ）上で乾燥し、１％リンタングス
テン酸カリウム（pH7.4）で染色した。試料を、60Vで透
過電子顕微鏡（Jeol JEM−100CX）を用いて分析した。
この試料において、直径100〜200nmのリポソームが観察
された。さらに、超遠心からの上清およびペレットを免
疫ブロット（上記を参照）によって分析した。ペレット
試料において31kDaの免疫反応性バンドが観察された
が、上清試料においては免疫反応性は存在しなかった。
また、試料をELISA（上記を参照）によって分析し、ペ
レットがハプテン結合性活性を含むことがわかった。こ
れらの結果は、ペレットが、リポソームにアンカーされ
たハプテン結合性の脂質タッグ化抗体を含有することを
示すものである。

また、高いいわゆる臨界ミセル濃度（CMC）の清浄剤
を含む試料を、CMC以下の濃度まで急速希釈することに
よって免疫リポソームを調製した（リポソームの膜上に
疎水性タンパク質が結合することになる；タンパク質は
清浄剤によって可溶性に維持されている）［New,1992,L
aukkanenら,1995］。Ox lpp−scFv−Ｈ抗体「10mM HEPE
S、pH7.4、0.7％（w/v）OG溶液中に40μｇのタンパク
質］を、リン脂質−コレステロール混合物（5mg）を含
むリポソーム調製物と混合した（V_tot＝5ml）。最終濃
度0.02％でOGを含む混合物を＋４℃で16〜18時間撹拌し
た。次いで、上記のように超遠心によって免疫リポソー
ムを集めた。

実施例6:蛍光に基づく多価抗原の免疫検定免疫リポソームを実施例３のように調製した。ただ
し、抗体は異なる蛍光団でラベルされた２種類の調製物
からなり、リポソームの調整前に1:1重量比で混合し
た。抗体分子の半分はフルオレセインでラベルし、他の
半分はTexas Red蛍光団でラベルした。これにより、統
計学的に50％のフルオレセインラベルされた抗体と50％
のTexas Redラベルされた抗体を有する免疫リポソーム
が得られる。対照実験のために、フルオレセインのみま
たはTexas Redのみでラベルされた抗体を含むリポソー
ムを調製した。調製した蛍光免疫リポソームの蛍光は、
10mM HEPES（pH7.4）緩衝液中、石英キュベットにおい
てShimadzu FR−5000蛍光分光光度計で測定した。フル
オレセインの蛍光は492nmの波長で励起し、放射は516nm
の波長で測定した。一方、Texas Redについては、励起
波長は596nmであり、放射エネルギーは620nmの波長で測
定した。また、蛍光放射スペクトルを500〜700nmの波長
範囲で記録した。492nmの励起波長を用いると、強い蛍
光が、フルオレセイン放射最大値のところでフルオレセ
イン/Texas Redリポソーム調製物において観察され、62
0nmのところでは極めて弱い蛍光のみが観察された。一
方、596nmの励起波長を用いると、強い蛍光が、Texas R
edの放射最大値（620nm）のところで記録された。フル
オレセインのみまたはTexas Redのみでラベルされた抗
体を含む対照リポソームは、使用した蛍光団のそれぞれ
に典型的な蛍光スペクトルのみを生じた。

上記のフルオレセイン/Texas Redラベルした免疫リポ
ソーム調製物を492nmで励起し、その放射を、磁気撹拌
子を入れたキュベットにおいて継続して、２つの波長51
6nm（フルオレセイン）および620nm（Texas Red）で記
録した。多価抗原OX₁₆BSAを添加すると、620nmにおける
蛍光の増加および516nmにおける蛍光の減少が観察され
た。可溶性ハプテンであるフェニルオキサゾロンのカプ
ロン酸誘導体またはBSA単独をOX₁₆BSAの代わりにリポソ
ーム調製物に添加した対照実験においては、このような
蛍光の変化は観察されなかった。同様の実験でフルオレ
セインラベル化抗体のみを含むリポソームを用いたとき
には、OX₁₆BSAの添加後に、516nmにおける蛍光のわずか
な減少が対応して観察された（しかし、620nmでの蛍光
は観察されなかった）。Texas Redのみでラベルされた
リポソームを用いたときには、492nmの励起波長を用い
て516nmまたは620nmにおいて観察しうる蛍光は測定され
なかった。即ち、リポソーム調製物への多価抗原の添加
は、特異的な蛍光シグナルを引き起こした（表II）。

この観察は、蛍光共鳴エネルギー移動によって説明す
ることができる。即ち、多価ハプテン（OX₁₆BSA）の結
合が、リポソーム表面でのラベル化抗体分子の集合を引
き起こし、ここでフルオレセイン蛍光団（ドナー）の励
起エネルギーが直接的に移動してTexas Red（アクセプ
ター）の蛍光を励起することができる。この結果、Texa
s Red（620nm）の蛍光放射が増加し、一方、フルオレセ
イン（516nm）の放射が減少する。これは、その励起エ
ネルギーの一部が、それ自体の蛍光以外の機構で散逸す
るためである（消光）。

実施例7:蛍光に基づく一価ハプテンの免疫検定実施例６に記載した実験手順を、一価ハプテンである
２−フェニルオキサゾロンのカプロン酸誘導体の検定と
して間接的な方法で用いることができる。OX₁₆BSAを、
遊離の可溶性ハプテンの存在下に、フルオレセイン/Tex
as Redラベル化免疫リポソーム調製物に添加した。次い
で、添加した遊離ハプテンの量に比例する蛍光変化（λ
_em 516nm↓、λ_em 620nm↑）の減少を観察した。また、
このハプテンの前に多価抗体をリポソームに添加した実
験において、遊離ハプテンによって引き起こされる多価
抗原の置換を観察した。

参考文献・Arya,A.,Krull,u.j.,Thompson,M.およびWong,H.E.（1
985）、「バイオセンサー開発の基礎としてのヒドロゲ
ル上の脂質皮膜のラングミュア−ブロジェット堆積」、
Anal.Chim.Acta 173:331−336。

・Barnard,S.M.およびWalt,D.R.（1991）、「制御され
た放出のポリマー系に基づく化学センサー」、Science
251:927−929。

・Clegg,R.M.（1995）、「蛍光共鳴エネルギー移動」、
Curr.Opin.Biotechnology 6:103−110。

・Glaser,M.（1993）、「生物学的膜における脂質ドメ
イン」、Curr.Opin.Struct.Biol.3:475−481。

・Griffin,H.G.およびGriffin A.M.（1994）、「PCR技
術、最新の革新」、CRC Press Inc.,Boca Raton,Florid
a,米国。

・Heath,T.D.,Macher,B.A.およびPapahadjopoulos,D.
（1981）、「グリコスフィンゴ脂質によるリポソームへ
の免疫グロブリンの共有結合」、Biochem.Biophys.Acta
640:66−81。

・Hemmil,I.（1991）、「免疫検定における蛍光の応
用」、Wiley−Interscience,ニューヨーク、米国。

・Ho,R.J.Y.,Rouse,B.T.およびHuang,L.（1986）、「標
的感受性の免疫リポソーム：調製と特性化」、Biochemi
stry 25:5500−5506。

・Hochuli,E.,Bannwarth,W.,Dbeli,H.,Gentz,R.およ
びStber,D.（1988）、「新規な金属キレート吸着剤に
よる組換えタンパク質の精製を容易にするための遺伝学
的アプローチ」、Bio/Technology 6:1321−1325。

・Huang,A.,Huang,L.およびKennel,S.J.（1980）、「脂
肪酸と供給結合したモノクローナル抗体、インビトロで
のリポソーム標的化のための試薬」、J.Biol.Chem. 22
5:8015−8018。

・Keinnen,K.およびLaukkanen,M.−L.（1994）、「抗
体の生合成脂質タッグ化」、FEBS.Lett.346:123−126。

・Kiefer,H.,Klee,B.,John,E.,Stierhof Y.−D.および
Ｊhnig（1991）、「膜輸送タンパク質に基づくバイオ
センサー」、Biosensors＆Bioelectronics 6:233−23
7。

・Kricka,L.J.（1994）、「免疫検定の感度および信頼
性を改善するための選択した戦略」、Clin.Chem.40:347
−357。

・Laemmli,U.K.（1970）、「バクテリオファージT4の頭
部の組立て中の構造タンパク質の切断」、Nature 222:6
80−685。

・Laukkanen,M.−L.,Alfthan,K.およびKeinnen,K.（1
994）、「生合成により脂質タッグ化した一本鎖抗体を
保持する機能的免疫リポソーム」、Biochemistry 33:11
664−11670。

・Laukkanen,M.−L.,Orellana,AおよびKeinnen,K.（1
995）、「機能的なユーロピウムキレートを付与したリ
ポソームを生成させるための遺伝子工学による脂質タッ
グ化抗体の使用：蛍光免疫検定における応用」、J.Immu
nol.Methods 185:95−102。

・Laukkanen,M.−L.,Teeri,T.T.およびKeinnen,K.（1
993）、「脂質タッグ化抗体：リポタンパク質−一本鎖
抗体融合タンパク質の細菌発現および特性化」、Protei
n Eng.6:449−454。

・Lerner,R.A.,Kang,A.S.,Bain,J.D.,Burton,D.R.およ
びBarbas,III C.F.（1992）、「免疫化のない抗体」、S
cience 285:1313−1314。

・Loughrey,H.C.,Bally,M.B.およびCullis,P.R.（198
7）、「リポソームへの抗体の非共有結合法」、Bioche
m.Biophys.Acta 910:157−160。

・Loughrey,H.C.,Choi,L.S.,Cullis,P.R.およびBally,
M.B.（1990）、「リポソームにタンパク質を結合するた
めの最適化法」、J.Immunol.Methods 132:25−35。

・Martin,F.J.Hubbell,W.L.およびPapahadjopoulos,D.
（1981）、「細胞に対するリポソームの免疫特異的標的
化：ジスルフィド結合によるFab′フラグメントの共有
結合のための新規かつ効率的な方法」、Biochemstry 2
0:4229−4238。

・Mergny,J.−L.,Boutorine,A.S.,Garestier,T.,Bello
c,F.,Rouge,M.,Bulychev,N.V.,Koshkin,A.A.,Bourso
n,J.,Lebedev,A.V.,Valeur,B.Thuong,N.T.およびＨｌ
ne,C.（1994）、「核酸構造および配列のためのプロ
ーブとしての蛍光エネルギー移動」、Nucleic Acids Re
s.22:920−928。

・Mrksich,M.およびWhitesides,G.M.（1995）、「微接
触プリントを用いる自己組立て単層のパターン化：バイ
オセンサーのための新しい技術？」、TIBTECH 13:228−
235。

・Ｍkel,O.,Kaartinen,M.,Pelkonen,J.K.およびKar
jalainen,K.（1978）、「抗体特異性の遺伝Ｖ、マウス
における抗−２−フェニルオキサゾロン」、J.Exp.Med.
148:1644−1660。

・New,R.R.C.（1992）、「リポソームの調製」［New.R.
R.C.（編）の「リポソーム、実際的アプローチ」中］、
Oxford University Press、オックスフォード、英国、3
3−104頁。

・Nissim,A.,Hoogenboom,H.R.,Tomlinson,I.M.,Flynn,
G.,Midgley,C.,Lane,D.およびWinter,G.,（1994）、
「免疫化学試薬としての「１ポット」ファージ表示ライ
ブラリーからの抗体フラグメント」、EMBO J.13:692−6
98。

・Odashima,K.,Sugawara,M.およびUmezawa,Y.（199
1）、「生物膜模倣の感応化学」、Trends Anal.Chem.1
0:207−215。

・Orellana,A.,Laukkanen,M.−L.およびKeinnen,K.
（1996）、「ユーロピウムキレートを付与したリポソー
ム：リポソームの結合および完全性の研究のための手
段」、Biochem.Biophys.Acta、印刷中。

・Pinnaduwage,P.およびHuang,L.（1992）、「安定な標
的感受性の免疫リポソーム」、Biochemistry 31:2850−
2855。

・Porath,J.およびOlin B.（1983）、「生物物質の固定
化金属イオンアフィニティー吸着および固定化金属イオ
ンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル固定化した
鉄およびニッケルイオンに対する血清タンパク質親和
性」、Biochemistry 22:1621−1630。

Sackmann,E.（1996）、「支持された膜：科学的および
実際的応用」、Science 271:43−48。

・Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,H
iguchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.およびErlich,H.A.
（1988）、「熱安定性DNAポリメラーゼを用いるDNAのプ
ライマー指向性酵素増幅」、Science 239:478−491。

・Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.（198
9）、「分子クローニング：実験室マニュアル（第２
版）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold S
pring Harbor,ニューヨーク、米国。

・Sanger,F.,Nickel,S.およびCoulson,A.R.（1977）、
「鎖終止抑制物質を用いるDNA配列決定」、Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.74:5463−5467。

・Selvin,P.R.（1995）、「蛍光共鳴エネルギー移
動」、Meth.Enzymol.246:300−334。

・Smith,M.C.,Furman,T.C.,Ingolia,T.D.およびPidgeo
n,C.（1988）、「キレート化ペプチドで固定した金属イ
オンアフィニィティークロマトグラフィー、組換えタン
パク質用のアフィニィティークロマトグラフィーにおけ
る新しい概念」、J.Biol.Chem.263:7211−7215。

・Takkinen,K.,Laukkanen,M.−L.,Sizmann,D.,Alfthan,
K.,Immonen,T.,Vanne,L.,Kaartinen,M.およびTeeri,T.
T.（1991）、「セルラーゼリンカードメインを含む活性
な一本鎖抗体が大腸菌により分泌される」、Protein En
g.4:837−841。

・Tamm,L.K.（1988）、「支持されたリン脂質二重層に
特異的に結合したモノクローナル抗体についての横拡散
および蛍光の顕微鏡による研究」、Biochemistry 27:14
50−1457。

・Towbin,H.,Staehelin,T.およびGordon,J.（1979）、
「ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシート
へのタンパク質の電気泳動移動：方法およびいくつかの
応用」、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:4350−4354。

・Waggoner,A.（1995）、「蛍光団によるタンパク質お
よび核酸の共有結合ラベル化」、Meth.Enzymol.246:362
−373。

・Watts,T.H.,Gaub,H.E.およびMcConnell,H.M.（198
6）、「消去る波動領域におけるエネルギー移動によっ
て検出される主要組織適合性複合体タンパク質およびペ
プチド抗原のＴ細胞媒介の結合」、Nature 320:179−18
1。

・Zasadzinski,J.A.,Viswanathan,R.,Madsen,L.,Garnae
s,J.およびSchwartz,D.K.（1994）、「ラングミュア−
ブロジェット皮膜」、Science 263:1726−1733。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ソョデルルンド，ハンスフィンランド、エフイーエン―02940エスポー、サロンキティエ19番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 595 G01N 33/533 G01N 33/536 G01N 33/542 G01N 33/544

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の分析物の検出またはその濃度の測
定のための蛍光に基づく免疫検定法であって、該分析物に特異的な受容体分子集団において、一方の集
団が第１の蛍光団（ドナー）でラベルされ、他方の集団
が第２の蛍光団（アクセプター）でラベルされた受容体
分子集団を、脂質膜に結合させ、ここで、該受容体分子
集団は該脂質膜の面を自由に移動することができ；該分析物を含む可能性のある試料を、該受容体分子集団
と接触させ；そして分析物の結合の結果として膜上の受容体分子集団の集合
レベルが変化することによって引き起こされる蛍光の変
化を測定する；ことからなる方法。
【請求項２】分析物が抗原であり、受容体が抗体である
請求項１に記載の方法。
【請求項３】分析物が一価抗原であり、２またはそれ以
上の独立した抗体結合性の抗原構造を有する既知量の分
子を、抗原含有試料に添加することを含む請求項２に記
載の方法。
【請求項４】分析物が抗体であり、受容体が抗原である
請求項１に記載の方法。
【請求項５】脂質膜がリポソームの形態にある請求項１
に記載の方法。
【請求項６】脂質膜が平面膜の形態にある請求項１に記
載の方法。
【請求項７】受容体分子が、遺伝子工学によってまたは
化学的に該分子に結合した脂質分子により脂質膜に結合
している請求項１に記載の方法。
【請求項８】フルオレセインまたはその誘導体を蛍光ド
ナーとして用い、ローダミンまたはその誘導体をアクセ
プターとして用いる請求項１に記載の方法。
【請求項９】検定すべき抗原が２またはそれ以上の異な
るエピトープを含む請求項２に記載の方法。
【請求項１０】検定すべき抗原が２またはそれ以上の同
一のエピトープを含む請求項２に記載の方法。