JP2000515965A - 脂質皮膜における蛍光エネルギー移動リガンド相互作用検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物学的試料中の分析物の検出またはその濃度の測定のための蛍光に基づく免疫検定法に関する。この方法は、多価分析物が、蛍光団でラベルされた受容体分子(この分子は、脂質膜にアンカーされ、膜上を自由に動き、これにより蛍光の変化を引き起こす)の集合を誘導しうることに基づいている。

Description

【発明の詳細な説明】 脂質皮膜における蛍光エネルギー移動リガンド相互作用検定 本発明は、生物学的試料中の分析物の検出のため、またはその濃度の測定のた めの蛍光に基づく免疫検定法に関する。この方法は、蛍光団でラベルされた受容 体分子(この分子は、脂質膜にアンカーされ、膜上を自由に動き、これにより蛍 光の変化を引き起こす)の集合を誘導する多価分析物の能力に基づいている。 従来の蛍光に基づく免疫検定法は、通常の免疫検定の原理を利用する。即ち、 測定しようとする分析物を固体基材上に固定化し、次いでこれを、例えば蛍光抗 蛍光に基づく検定の利点には、高い感度および放射性同位体の使用に依存しない ことが含まれる。ほとんどの他の通常の免疫検定と同様に、これら蛍光に基づく 検定が不均一の性質のものであること、即ち、未結合の抗体または抗原を分離し 、分析物を間接的に測定するということは、欠点であるとみなすことができる。 これらの洗浄および分離工程は、作業量およびコストを増加させる。 蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)は、高エネルギー状態に励起された分子発 色団(ドナー、Ｄ)からのエネルギーが、分子間の双極子-双極子カップリングに よって別の発色団(アクセプター、Ａ)に移動する物理的過程である[Clegg，1995 ，Selvin，1995]。このエネルギー移動のための必要前提条件は、分子間の距離 が短いこと(１０〜１００Å)、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収ス ペクトルが部分的に重なること、ならびに、ドナーの量子収率(Φ_D)およびアク セプターの消衰係数(Ｅ_A)が十分に高いことである。ＦＲＥＴは、核酸分子間の ハイブリダイゼーションの測定[Mergnyら，1994]および脂質と膜タンパク質の間 の相互作用の検出[Wattら,1986]に利用されている。また、この現象は、ＦＲＥ Ｔドナー-アクセプターの対を構成する蛍光団で抗体と抗原をラベルすることに より、免疫検定に利用されている。この溶液相検定は、ラベル化抗原を置換し、 従ってＦＲＥＴ現象を妨げる抗原(被測定物質)の能力に基づくものであった [BarnardおよびWalt,1991]。 タンパク質の蛍光ラベル化は、市販の蛍光団およびその誘導体に基づく既知の 技術である[Waggoner，1995]。蛍光団は、合成の比較的低分子の有機化合物(例 えば、フルオレセイン、ローダミンおよびその誘導体、およびランタニドキレー ト)またはタンパク質(例えば、フィコエリトリンおよびＧＦＰ、緑色蛍光タンパ ク質)のいずれかである。蛍光団により放射される蛍光の種々のパラメーター(蛍 光強度、寿命、偏光)を測定することができる。これらを用いてＦＲＥＴ現象を モニターおよび定量することもできる。 フィンランド特許No.81680およびNo.93997は、蛍光ラベルを用いる均一免疫検 定法を記載している。最初の特許は、液相中に存在する遊離ラベルの蛍光を光吸 収物質で消光させ、分離工程を行うことなく結合ラベルの測定を可能にする固相 免疫検定を記載している。後者の特許においては、短命なバックグラウンド蛍光 を妨げることによって高感度の検定を達成するアイデアを伴う通常の定量免疫蛍 光法が記載されている。しかし、これらの方法は、ＦＲＥＴ現象とは全く関係が ない。 脂質二重層は、リン脂質およびある種の他の極性脂質により水溶液中で自然に 形成される構造であることが知られている。この構造においては、脂質分子の極 性頭部は水と接触して外側に向っており、一方、非極性炭化水素鎖は内側に配向 している。例えば、ラングミュア-ブロジェット法を用いて平面脂質膜を調製す ることができ[Aryaら，1985，Zasadzinskiら，1994]、これを固体基材上に移動 させることができる[MrksichおよびWhitesides，1995，Sackmann，1996]。また 、小胞性の密閉された脂質二重層構造またはリポソームを調製することができる [New，1992]。脂質膜は２次元の液体であるとみなすことができ、ここでは、脂 質分子およびタンパク質などの他の分子[膜と会合している(細胞膜などの天然膜 構造)かまたは膜に結合している]は、膜平面上を比較的自由に移動する[横拡散 ；Tamm，1988，Glaser,1993]。特異的な結合および認識反応に関与し、脂質膜に 結合する分子の機能に基づく応用が存在する[Odashimaら，1991]。この種の機能 的な脂質膜は、例えばバイオセンサーにおける認識表面として大きな可能 性を有する[Kieferら，1991，MrksichおよびWhitesides，1995]。既知の方法を 用いてほとんど全ての巨大分子および多くの比較的小さい分子に対して生成させ ることができる抗体[Lernerら,1992,Nissimら，1994]は、認識分子として特に重 要である。 本発明者らは、細菌産生の抗体および他のタンパク質を脂質膜に結合させるた めの方法を開発した。この方法はいわゆる生合成脂質タッグ化法[Laukkanenら， 構造が、生合成中に抗体-リポタンパク質融合体のＮ-末端システイン残基に結合 されている。この疎水性脂質は、抗体(タンパク質)を細菌の外側膜にアンカー( 固定)する。同様に、精製した脂質タッグ化抗体を、例えば清浄剤透析法を用い てリポソームの表面に結合させることができる[Laukkanenら,1993]。 上記のことに基づいて、ここに本発明者らは、試料中の分析物の存在可能性の 検出またはその濃度の測定を簡単かつ容易に行うことができる新規な均一免疫検 定法を開発した。本発明によれば、抗原を測定するのが好ましく、この場合には 、脂質膜に結合させる受容体分子は分析物に特異的な抗体である。 本発明は、液相中の抗原と脂質膜に結合した抗体の間の結合反応を、抗原が多 価であるときにＦＲＥＴ現象と組合せることができるというアイデアに基づくも のである(図１)。本明細書中で用いる「多価抗原」なる用語は、１を越える抗体 結合エピトープを保持する抗原を指す。本発明の均一免疫検定法は、脂質膜上の ２種類の脂質タッグ化抗体集団を含み、一方の集団をＦＲＥＴドナー蛍光団でラ ベルし、他方の集団をＦＲＥＴアクセプター蛍光団でラベルする。抗体が多価抗 原と接触するようになると、脂質膜上で抗体の継ぎ合わせが起こる。そこで該抗 原は、アクセプターおよびドナー蛍光団を含有する抗体を、密接に接触するよう に脂質膜上を自由に移動させ、即ちミクロ集合が起こり、この場合に、励起され たドナー蛍光団からアクセプター蛍光団へのエネルギー移動が起こるであろう( ＦＲＥＴ現象)。免疫リポソームにおける抗体の自由な横移動はＦＲＥＴ現象を 可能にする。この移動は、抗体を脂質二重層に結合する脂質アンカーの存在によ って達成される。脂質膜(例えば、平面膜)は、例えばラングミュア-ブロジェッ ト法[MrksichおよびWhitesides，1995，Sackmann，1996]を用いて固体基材の表 面に結合させることができ、また、リポソームは、例えばビオチン-ストレプト アビジン層法[Orellanaら，1996]を用いて結合させることができるので、本発明 は直接的な(「均一な」)免疫検定を可能にするものである(この免疫検定は、独 立した洗浄および分離工程を含まず、試料の添加とシグナルの測定のみを含む) 。 測定においては、蛍光がドナーに賦課され(例えば、適当な波長を有する光供 給源を用いて)、膜に結合した抗体の比較的多量が密接に接触し、励起エネルギ ーの比較的大部分がアクセプターに移動し、ドナーに特徴的な蛍光としては直接 的に放射しない。従って、正味の結果は、ドナーに特徴的な蛍光の減少およびア クセプターに特徴的な蛍光の増加である。測定においては、試料と接触している 表面の蛍光を、試料を含まない対照表面と比較し、次いでドナーの蛍光またはア クセプターの蛍光のいずれかと比較することができるか、あるいは、ほとんどの 場合にはこれらの比率(時間の関数として)を測定することができる。これらの全 ては、膜上の抗体の「集合レベル」が抗原の結合の結果として変化するときに変 化する。 対応して、一価抗原の存在下では、抗体分子を一緒にする上記検定におけるよ うな機構は存在せず、抗体分子は脂質膜上を自由に移動し続け、ＦＲＥＴ現象は 観察されない。しかし、一価抗原を間接的に測定することができる。この場合に は、既知量の同一抗原を検定溶液に加える。この抗原は多価形態(即ち、２また はそれ以上の独立した抗原構造を有する)に変換されており、この結果、多価抗 原が一価「遊離」抗原によって置換され、ＦＲＥＴ現象が消失することになり、 これにより、得られる蛍光の変化を測定することができる。 また、分析物-受容体の対として、抗体-抗原の対を抗原-抗体の対の代わりに 用いることもできる。この場合には、抗原を脂質膜にアンカーし、抗体が溶液中 にあり、抗体またはその量を測定する。天然の抗体は常に多価であるので、これ らは常に直接検定で測定することができる。 脂質膜への可溶性タンパク質(特に、抗体)の結合のために異なる既知の方法が 利用可能であるので、本発明は、上記の生合成法によって調製された脂質アンカ ー化抗体の使用に限定されない。脂肪酸[Huangら，1980,Hoら,1986]または他の 脂質[Heathら，1981,Martinら，1981]を抗体分子と共有結合させることができ、 脂質膜に抗体をアンカー化することができる。また、ビオチン含有脂質を脂質膜 に導入することができ、次いでこれがアビジン／ストレプトアビジン、さらにビ オチニル化抗体を結合することができる[Loughreyら,1987,1990]。 図面の説明 図１は、蛍光エネルギー移動に基づく均一免疫検定法の原理を示す模式図であ る。 図２は、脂質タッグ化一本鎖２-フェニルオキサゾロン結合抗体をコードして いる細菌性発現ベクターpML3.7Hを示す模式図である。最も重要な制限部位が示 されている。この図において用いた短縮形は、次の通りである：ptac=tacプロモ ーター領域；lpp=リポタンパク質；VH=抗体重鎖の可変領域；Li=リンカー領域； ＶＬ=抗体軽鎖の可変領域；amp=β-ラクタマーゼ遺伝子；ori=プラスミドDNAの 複製起点；laqIq=ラクトースリプレッサー遺伝子。 以下に挙げる限定のためのものではない実施例は、本発明をさらに詳しく説明 するものである。これら実施例には、脂質タッグ化抗体の調製、ラベル化および リポソーム表面への結合、ならびに、このようにして得た抗体を用いて行った免 疫検定が含まれる。 実施例１：一本鎖の脂質修飾した抗-2-フェニルオキサゾロン抗体(Ox lpp-scF v-H)のクローニング DNAクローニングおよび修飾に、通常の組換え法を用いた[Sambrookら，1989， GriffinおよびGriffin，1994]。大腸菌DH5α株[F~,endA1,hsdR17(r_k-,m_k+),supE 44,thi-1，λ−,recA1,gyrA96,relA1，Δ(argF-lacZYA)U169，Φ80dlacZΔＭ15] を組換えDNAプラスミド調製のための宿主として用い、RV308株[su^-，ΔlacX74， galISII::OP308，strA]をタンパク質産生のための宿主として用いた。 脂質修飾のために必要なアミノ末端リポタンパク質配列を、DNAプライマー としてオリゴヌクレオチド１および２(表Ｉ)ならびに鋳型としてpKEN125プラス ミド[Laukkanenら，1993]を用いて、PCR[ポリメラーゼ連鎖反応；Saiki,1988]に よって増幅した。これに対応して、一本鎖の抗-2-フェニルオキサゾロン抗体を コードしているDNA領域を、DNAプライマーとしてオリゴヌクレオチド３および４ (表Ｉ)ならびに鋳型としてプラスミドpML5[Takkinenら，1991]を用いて増幅した 。DNAプライマーはApplied Biosystems 391 DNA合成機を用いて合成し、これら をさらに精製することなく用いた。 表Ｉ：脂質修飾した抗体(Oxlpp-scFv-H)のクローニングのための DNAプライマー （クローニングに用いた制限部位には下線を引き、鋳型中に 存在する配列に相補性の配列は太字で示す） リポタンパク質配列をコードしている増幅したDNA(１１４塩基対、bp)を、制 限酵素EcoRIおよびBamHIで消化し、まずこのDNAフラグメントを、同じ酵素で処 理したpUC18ベクター中にクローン化した。次いで、一本鎖抗体をコードしてい るDNA(７７６bp)を制限酵素BamHIおよびHindIIIで消化し、上記のように調製し たlpp-pUC18ベクター中にクローン化し、最後に、EcoRIおよびHindIIIで消化す ることによって得たOx lpp-scFv-タンパク質をコードしているDNAフラグメント をpKKtacベクター中にクローン化し、pML3.7と命名した(Laukkanenら,1993)。 精製を容易にするために、Ox lpp-scFvタンパク質をコードしているDNAを、3' 末端のDNAプライマーとしてオリゴヌクレオチド５(表Ｉ)および鋳型としてプラ スミドpML3.7を用いて、Ｃ-末端に６個のヒスチジンをコードしているDNA配列を 付加することによって、さらに修飾した。この最後の組換えDNAプラスミドをpML 3.7H(図２)と命名した。 増幅したDNA配列の正しさを、ジデオキシヌクレオチド配列決定[Sangerら，19 77]によって確認した。 実施例２：大腸菌における抗体Ox lpp-scFv-Hの産生 細菌細胞における抗体の産生を、Laukkanenら(1993)の記載のように行った。 初めに、組換えDNAプラスミドpML3.7Hを、生産株である大腸菌RV308に転移させ た。次いで、＋３０℃で１６〜１８時間振盪して増殖させた大腸菌pML3.7H／RV3 08培養物を、１００μｇアンピシリン／mlを含むLB培地[Sambrookら，1989]に１ ：５０希釈することによって継代培養した。分光光度計において６００nmで測定 した細菌懸濁液の吸収が１.５の値に到達するまで＋３０℃で培養を続け、次い で、イソプロピルチオ-β-Ｄ-ガラクトシド(IPTG)を最終濃度１mMで添加するこ とによって組換えタンパク質の産生を誘導した。次いで、培養を＋３０℃でさら に１６〜１８時間続けた。最後に、細菌細胞を遠心(５０００ｇ、１０分、＋４ ℃)により集めた。 細胞試料を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動[Laemmli,1979]および免疫 ブロットおよび免疫染色[Towbinら，1979]によって分析した。ここで、一本 鎖の抗-２-フェニルオキサゾロン抗体(Ox scFv)に特異的なウサギ抗血清を用い た[Takkinenら，1991]．一次抗体の後、ブロットをアルカリホスファターゼ-抗I gGコンジュゲートと共にインキュベートし、最後に、市販の基質(NBTおよびBCIP 、Promega)を、アルカリホスファターゼ活性の検出のために加えた。 脂質タッグ化した一本鎖抗体に対して計算される大きさに一致する大きさ(３ １kDa)の免疫反応性タンパク質が、プラスミドpML3.7Hを保持する細菌細胞の誘 導により調製した試料において、免疫ブロットおよび免疫染色の後に観察された 。対照として用いたプラスミドpKKtacを保持する細菌細胞から調製した試料の免 疫染色後には、免疫反応性タンパク質は観察されなかった。免疫反応性に基づい て、該細菌におけるOx lpp-scFv-Hの産生レベルは約５mg/lであった。 実施例３：Ox lpp-scFv-H抗体の精製 抗体誘導体を上記のように産生させ、金属キレート化アフィニティークロマト グラフィー[PorathおよびOlin,1983;Hochuliら，1988;Smithら,1988]およびハプ テンアフィニティークロマトグラフィー[Laukkanenら,1994]の両方を用いて精製 した。１Ｌの培養物から集めた細菌細胞を、溶解緩衝液[１０mM HEPES、pH７.４ 、１mM EDTA、１Ｍ NaCl、0.1mM PMSF](50ml)に懸濁した。リゾチーム(１〜２mg /ml)を懸濁液に加え、次いでこれを室温で１５分間インキュベートした。次に、 Triton X-100を最終濃度１％(w/v)で加えて膜タンパク質を可溶化し、懸濁液を ＋４℃で１６〜１８時間撹拌した。次に、可溶性タンパク質(Ox lpp-scFv-H抗体 を含む)を、遠心(３５,０００ｇ、４０分、＋４℃)により細胞溶解液から分離し た。 金属キレート化クロマトグラフィーによる精製のために、上清または可溶性タ ンパク質分画を緩衝液Ａ[10mM HEPES、pH7.4、1Ｍ NaCl、１０％(v/v)グリセロ ール、０.１mM PMSF、１mMイミダゾール]で１：５希釈し、次いでTriton X-100 の最終濃度を０.２％にした。このタンパク質溶液(50ml)に、Niを入れたキレー ト化アガロースゲル[Chelating Sepharose Fast Flow,Pharmacia](0.５〜1ml)を 加え、＋４℃で継続撹拌下に１６〜１８時間、タンパク質をカラム物質に結合さ せた。カラムに充填したカラム物質を、０.２％ (w/v)のTriton X-100を含む緩衝液Ａ(５〜１０ml)で洗浄した。カラム物質に結 合したタンパク質を、０.２％(w/v)のTriton X-100と５０、７５、１００および ２００mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ(５〜１０ml)で溶離した。 免疫反応(免疫ブロットおよび免疫染色、上記を参照)に基づいて、部分精製し た抗体（３１kDaタンパク質)は７５および１００mMイミダゾール分画に溶出した 。次いで、これら分画を一緒にし、次の精製工程、即ち固定化ハプテンに基づく アフィニティークロマトグラフィー用とした。最終イミダゾール分画を緩衝液Ｂ [１０mM HEPES、pH7.4、１M NaCl、１０％グリセロール、０.２％(w/v)Triton X -100]で１：５希釈し、２-フェニルオキサゾロン-BSAコンジュゲート 活性化したSepharose 4B、Pharmacia)に結合させた。希釈したタンパク質溶液お よびOx₂₁BSA-Sepharoseゲルを一緒にし、＋４℃で１６〜１８時間、タンパク質 をゲルに結合させた。次いで、ゲルをカラムに充填し、これを洗浄し、結合タン パク質を溶離した[以前に記載された方法(Takkinenら，1991)に従う；ただし、 緩衝液は０.２％(w/v)のTriton X-100を含み、低pHで抗体を溶離するときに清浄 剤を１％(w/v)のOG(n-オクチル-β-D-グルコピラノシド)に置換した]。 金属キレート化アフィニティークロマトグラフィーおよびハプテンアフィニテ ィークロマトグラフィーによる精製に続いて、タンパク質試料をSDS-ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動(上記を参照)を用いて分析した。クーマッシー染色した１ ５％SDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて、３１kDaタンパク質の豊富化が、種 々の精製工程後に観察された。また、試料を免疫ブロット(上記を参照)によって も分析し、免疫反応性が３１kDaタンパク質によるものであることがわかった。 これらの結果から、上記の精製プロトコールの使用が脂質タッグ化された抗体を 精製する結果になると結論された。 脂質タッグ化された抗体のハプテン結合活性を、以前に記載されたように[Tak kinenら,1991;Laukkanenら,1993]、２-フェニルオキサゾロン-BSAコンジュゲー トを被覆した微量滴定プレートを用いるELISA(酵素結合イムノソルベント検定) 法によって測定した。固定化ハプテンに対する抗体の特異的結合の ELISAによる証明は、異なる量の可溶性ハプテン、２-フェニルオキサゾロンのカ プロン酸誘導体(Ox-CA)またはOx₂₁BSAコンジュゲート(全てのBSA分子は平均して ２１個のフェニルオキサゾロン分子を担持する)をタンパク質試料に添加するこ とによって行った。この添加の結果、抗体の結合部位を添加ハプテンが競合し、 従って、固定化したハプテン-BSAコンジュゲートに対するOxlpp-scFv-H抗体の結 合が置換されることになる。 アルカリホスファターゼのための基質の添加後の黄色反応の生成(A₄₀₅を測定 する)を、精製Ox lpp-scFv-H抗体を含む試料において観察することができた。可 溶性ハプテンを用いて抗体の結合を置換したELISA分析において、得られた結果 は、固定化Ox₂₁BSAに対するタンパク質の結合の妨害であり、このことはタンパ ク質がハプテンに特異的に結合したことを示すものである。 精製試料のタンパク質濃度を分光光度計(A₂₈₀)を用いて測定した。１Ｌ培養の 細胞からの抗体の精製は、１〜２mgの精製抗体を与えた。 実施例４：抗体Ox lpp-scFv-Hのラベル化 蛍光指示物質と抗体のアミノ基(遊離のアミノ末端およびリシン残基のε-アミ ノ基)との結合を、Texas Red^R蛍光団のスルホニルクロリド誘導体(T-353)およ びフルオレセイン蛍光団のスクシンイミジルエステル誘導体(C-1311)を用いて、 製造元(Molecular Probes、米国)の指示に従って行った。 Texas Red蛍光団によるラベル化においては、金属キレート化クロマトグラフ ィーによって精製したタンパク質溶液を、１％(w/v)OGを含む0.1M炭酸水素ナト リウム(pH９.２)に調整した。ラベル化反応において、蛍光団(0.1ｍg)に対して １０倍質量過剰のタンパク質(1mg)を用いた。Texas Red蛍光団を少量のジメチル ホルムアミド(DMF)に溶解し、タンパク質溶液と混合した。ラベル化反応を、振 盪下に光から保護して＋４℃で１６〜１８時間続けた。次いで、上記(実施例３ を参照)のようにハプテンアフィニティークロマトグラフィーを用いてタンパク 質を精製することによって、遊離ラベルを除去した。タンパク質のラベル化度を 、製造元により示された以下の式に従って決定した： [式中、Axは吸収最大の波長で測定した蛍光団の吸光度値であり、 εはモル消衰係数(ε_{Texas Red}＝８５,０００)である]。 ラベル化抗体をハプテンアフィニティークロマトグラフィー(上記を参照)によ って精製した。タンパク質分画の２８０nm(タンパク質濃度)および５９２nm(Tex as Red蛍光団の検出)の両方での吸光度を測定した。測定値から、遊離ラベルは カラム物質に結合せず、カラム物質をカラムに充填し、上記のように洗浄したと きに試料から速やかに除去されるものと結論することができた。ラベル化タンパ ク質は、低pH洗浄においてのみカラムから溶出した。この溶出したタンパク質を SDS-PAGEによって分析した。この場合、精製したタンパク質は、３１kDaのクー マッシー染色されたバンドとして現れた。また、タンパク質試料をELISAによっ ても分析した。これにより、該タンパク質は固定化Ox₂₁BSAに結合することがわ かった。これらの結果から、Texas Red蛍光団は、ハプテン結合性の脂質タッグ 化抗体に結合したと言うことができた。 フルオレセインによるタンパク質のラベル化を上記のように行った。ただし、 タンパク質を0.1Ｍ炭酸水素ナトリウム(pH８.９)、１％(w/v)OG緩衝液中とし、 蛍光団をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。上記のようにラベル化タンパ ク質を分析し、ラベル化度を測定した(ε_{フルオレセイン}＝６８,０００)。脂質タッグ化 した抗体は、フルオレセイン蛍光団でラベル化されたことがわかった。 実施例５：免疫リポソームの調製 精製しラベル化したOx Ipp-scFv-H抗体を、以前に記載され広く知られている 方法[New,1992,Laukkanenら，1994]を用いて、リポソームの表面に結合させた。 卵黄リン脂質[ホスファチジルコリン(PC)；ホスファチジルエタノールアミン(PE )]およびコレステロール(Cho)の混合物[モル比PC：PE：Cho＝１０：１：５](5mg )を、１０mM HEPES(pH７.４)緩衝液中に４０μｇの精製Ox lpp-scFv-Hおよび１ ％(w/v)のＯＧを含む溶液(５ml)に溶解した。対照として、タン パク質を添加しないリポソームを、その他は同じ方法で調製した。セルロース膜 (カットオフ１０kDa)を有するLIPOSOMAT透析機(Dianorm、ドイツ)を用いて、１ ０mM HEPES(pH７.４)緩衝液に対して透析することによって、透明溶液から清浄 剤を除去した。清浄剤の除去後に、試料はわずかに乳白光を放つことがわかった 。このことは、清浄剤を除去したときに免疫リポソームが生成したことを示唆す るものである。この乳白光を放つ溶液を超遠心(１５０,０００ｇ、１時間、＋４ ℃)にかけると、遠心管の底にペレットが生成することがわかった。次いで、こ のペレットを１０mM HEPES(pH７.４)緩衝液(１〜２ml)に懸濁した。このリポソ ームおよび免疫リポソームを懸濁液として＋４℃で保存した。 ペレットを、Laukkanenら(1994)の記載のように電子顕微鏡で分析した。試料 小滴を、炭素被覆した銅格子板(１５０〜２００メッシュ)上で乾燥し、１％リン タングステン酸カリウム(pH７.４)で染色した。試料を、６０Ｖで透過電子顕微 鏡(Jeol JEM-100CX)を用いて分析した。この試料において、直径１００〜２００ nmのリポソームが観察された。さらに、超遠心からの上清およびペレットを免疫 ブロット(上記を参照)によって分析した。ペレット試料において３１kDaの免疫 反応性バンドが観察されたが、上清試料においては免疫反応性は存在しなかった 。また、試料をELISA(上記を参照)によって分析し、ペレットがハプテン結合性 活性を含むことがわかった。これらの結果は、ペレットが、リポソームにアンカ ーされたハプテン結合性の脂質タッグ化抗体を含有することを示すものである。 また、高いいわゆる臨界ミセル濃度(CMC)の清浄剤を含む試料を、CMC以下の濃 度まで急速希釈することによって免疫リポソームを調製した(リポソームの膜上 に疎水性タンパク質が結合することになる；タンパク質は清浄剤によって可溶性 に維持されている)[New,1992,Laukkanenら，1995]。Ox lpp-scFv-H抗体[１０mM HEPES、pH７.４、０.７％(w/v)OG溶液中に４０μｇのタンパク質]を、リン脂質- コレステロール混合物(５mg)を含むリポソーム調製物と混合した(V_tot＝５ml)。 最終濃度０.０２％でOGを含む混合物を＋４℃で１６〜１８時間撹拌した。次い で、上記のように超遠心によって免疫リポソームを集めた。実施例６：蛍光に基づく多価抗原の免疫検定 免疫リポソームを実施例３の記載のように調製した。ただし、抗体は異なる蛍 光団でラベルされた２種類の調製物からなり、リポソームの調製前に１：１重量 比で混合した。抗体分子の半分はフルオレセインでラベルし、他の半分はTexas Red蛍光団でラベルした。これにより、統計学的に５０％のフルオレセインラベ ルされた抗体と５０％のTexas Redラベルされた抗体を有する免疫リポソームが 得られる。対照実験のために、フルオレセインのみまたはTexas Redのみでラベ ルされた抗体を含むリポソームを調製した。調製した蛍光免疫リポソームの蛍光 は、１０mM HEPES(pH７.４)緩衝液中、石英キュベットにおいてShimadzu FR-500 0蛍光分光光度計で測定した。フルオレセインの蛍光は４９２nmの波長で励起し 、放射は５１６nmの波長で測定した。一方、Texas Redについては、励起波長は ５９６nmであり、放射エネルギーは６２０nmの波長で測定した。また、蛍光放射 スペクトルを５００〜７００nmの波長範囲で記録した。４９２nmの励起波長を用 いると、強い蛍光が、フルオレセイン放射最大値のところでフルオレセイン／Te xas Redリポソーム調製物において観察され、６２０nmのところでは極めて弱い 蛍光のみが観察された。一方、５９６nmの励起波長を用いると、強い蛍光が、Te xas Redの放射最大値(６２０nm)のところで記録された。フルオレセインのみま たはTexas Redのみでラベルされた抗体を含む対照リポソームは、使用した蛍光 団のそれぞれに典型的な蛍光スペクトルのみを生じた。 上記のフルオレセイン／Texas Redラベルした免疫リポソーム調製物を４９２n mで励起し、その放射を、磁気撹拌子を入れたキュベットにおいて継続して、２ つの波長５１６nm（フルオレセイン）および６２０nm(Texas Red)で記録した。 多価抗原OX₁₆BSAを添加すると、６２０nmにおける蛍光の増加および５１６nmに おける蛍光の減少が観察された。可溶性ハプテンであるフェニルオキサゾロンの カプロン酸誘導体またはBSA単独をOX₁₆BSAの代わりにリポソーム調製物に添加し た対照実験においては、このような蛍光の変化は観察されなかった。同様の実験 でフルオレセインラベル化抗体のみを含むリポソームを用いたときに は、OX₁₆BSAの添加後に、５１６nmにおける蛍光のわずかな減少が対応して観察 された(しかし、６２０ｎｍでの蛍光は観察されなかった)。Texas Redのみでラ ベルされたリポソームを用いたときには、４９２nmの励起波長を用いて５１６nm または６２０nmにおいて観察しうる蛍光は測定されなかった。即ち、リポソーム 調製物への多価抗原の添加は、特異的な蛍光シグナルを引き起こした(表II)。 この観察は、蛍光共鳴エネルギー移動によって説明することができる。即ち、 多価ハプテン(OX₁₆BSA)の結合が、リポソーム表面でのラベル化抗体分子の集合 を引き起こし、ここでフルオレセイン蛍光団(ドナー)の励起エネルギーが直接的 に移動してTexas Red(アクセプター)の蛍光を励起することができる。この結果 、Texas Red(６２０nm)の蛍光放射が増加し、一方、フルオレセイン(５１６nm) の放射が減少する。これは、その励起エネルギーの一部が、それ自体の蛍光以外 の機構で散逸するためである(消光)。 表II：４９２nmの励起波長におけるリポソーム調製物の蛍光変化 実施例７：蛍光に基づく一価ハプテンの免疫検定 実施例６に記載した実験手順を、一価ハプテンである２-フェニルオキサゾロ ンのカプロン酸誘導体の検定として間接的な方法で用いることができる。OX₁₆BS Aを、遊離の可溶性ハプテンの存在下に、フルオレセイン／Texas Redラベル化免 疫リポソーム調製物に添加した。次いで、添加した遊離ハプテンの量に比例する 蛍光変化(λ_em５１６nm↓、λ_em６２０nm↑)の減少を観察した。また、このハプ テンの前に多価抗体をリポソームに添加した実験において、遊離ハプテンによっ て引き起こされる多価抗原の置換を観察した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ソョデルルンド，ハンス フィンランド、エフイーエン―02940エス ポー、サロンキティエ19番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の分析物の検出またはその濃度の測定のための蛍光に基づく免疫検 定法であって、 分子の一部が第１の蛍光団(ドナー)でラベルされ、他の部分が第２の蛍光団( アクセプター)でラベルされた該分析物に特異的な受容体分子を脂質膜に結合さ せ(該分子は該脂質膜の面を自由に移動することができる)； 該分析物を含む可能性のある試料を、該受容体分子と接触させ；そして 分析物の結合の結果として膜上の受容体分子の集合レベルが変化することによ って引き起こされる蛍光の変化を測定する； ことからなる方法。 ２．分析物が抗原であり、受容体が抗体である請求項１に記載の方法。 ３．分析物が一価抗原であり、２またはそれ以上の独立した抗体結合性の抗原 構造を有する既知量の分子を、抗原含有試料に添加することを含む請求項２に記 載の方法。 ４．分析物が抗体であり、受容体が抗原である請求項１に記載の方法。 ５．脂質膜がリポソームの形態にある請求項１に記載の方法。 ６．脂質膜が平面膜の形態にある請求項１に記載の方法。 ７．受容体分子が、遺伝子工学によってまたは化学的に該分子に結合した脂質 分子により脂質膜に結合している請求項１に記載の方法。 ８．フルオレセインまたはその誘導体を蛍光ドナーとして用い、ローダミンま たはその誘導体をアクセプターとして用いる請求項１に記載の方法。 ９．検定すべき抗原が２またはそれ以上の異なるエピトープを含む請求項２に 記載の方法。 １０．検定すべき抗原が２またはそれ以上の同一のエピトープを含む請求項２ に記載の方法。