DE69817600T2

DE69817600T2 - Biodegradierbares polymeres stützgerüst

Info

Publication number: DE69817600T2
Application number: DE1998617600
Authority: DE
Inventors: E. Chantal HOLY; S. Molly SHOICHET; E. John DAVIES
Original assignee: Bonetec Corp
Current assignee: Bonetec Corp
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1998-11-13
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2018-11-14
Also published as: AU1138099A; EP1030697B1; AU2002300496B2; IL136093A0; DE69817600D1; CA2221195A1; WO1999025391A3; CN1285757A; CA2310070C; JP2001523483A; ATE247994T1; KR20010015819A; EP1030697A2; JP4636684B2; DK1030697T3; CN1212866C; CA2310070A1; BR9814036B1; KR100664772B1; NZ504973A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines biodegradierbaren polymeren Stützgerüsts für Anwendungen im Tissue Engineering. Im einzelnen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein neuartiges makroporiges polymeres Stützgerüst mit hochgradig untereinander verbundenen Makroporen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Behandlung von Knochen bei Verletzungen, genetisch bedingten Fehlbildungen und Krankheiten erfordert häufig das Implantieren von Transplantaten. Es ist allgemein bekannt, daß Autotransplantate und Allotransplantate die sichersten Implantate sind; allerdings wurden bislang angesichts der begrenzten Verfügbarkeit sowie der Risiken einer Krankheitsübertragung und Abstoßung vielfach auch synthetische Biomaterialien als Implantate verwendet. Bei einigen dieser Biomaterialien wurden In-vivo-Komplikationen beobachtet, wobei mechanische Fehlanpassungen (Lastabschirmung, "Stress Shielding") und das Auftreten von Verschleißrückständen zu Knochenatrophie, Osteoporose oder Osteolyse um die Implantate herum führten (Woo et al., 1976; Terjesen et al., 1988).
In der letzten Zeit findet ein neuer Ansatz, der als Tissue Engineering (TE, etwa "Gewebe-Rekonstruktion") bezeichnet wird, große Beachtung. Zum Tissue Engineering gehört unter anderem die Entwicklung einer neuen Generation von Biomaterialien, die imstande sind, auf spezifische Weise mit biologischen Geweben in Wechselwirkung zu treten und so funktionelle Gewebeäquivalente zu bilden. Diesem Konzept liegt die Tatsache zugrunde, daß sich von einem Patienten Zellen isolieren lassen, die anschließend in Zellkulturen vermehrt und dann zum Impfen eines aus einem speziellen Biomaterial hergestellten Stützgerüsts verwendet werden, so daß ein Verbund aus Stützgerüst und Biomaterial entsteht, der als "TE-Konstrukt" bezeichnet wird. Das Konstrukt kann anschließend auf denselben Patienten verpflanzt werden, wo es als Ersatzgewebe dient. Einige Systeme dieser Art eignen sich als Ersatz für Organgewebe, wenn die Verfügbarkeit von Spenderorganen begrenzt ist oder wenn in bestimmten Fällen (wie z. B. bei jungen Patienten) kein geeignetes natürliches Ersatzgewebe zur Verfügung steht. Das Gerüst selbst kann als Hilfsmittel für die Applizierung geringster Mengen von biologisch aktiven Wachstumsfaktoren, Genen und Medikamenten dienen. Für diesen revolutionären Ansatz der Chirurgie gibt es vielfältige Anwendungen, die sowohl für das Wohlbefinden des Patienten als auch für die Weiterentwicklung der Gesundheitsfürsorge Vorteile bringen.
Die Anwendung des Tissue Engineerings zum Wachsen von Knochengewebe beinhaltet das Entnehmen von osteogenen Stammzellen, die anschließend in Kulturen zu neuem In-vitro-Gewebe heranwachsen. Das so entstandene neue Gewebe kann anschließend als Autotransplantat verwendet werden. Biodegradierbare Polyestermaterialien – insbesondere Poly(Lactid-Coglycolid)e – wurden bislang als Stützgerüst für das Tissue Engineering mehrerer verschiedener Zellpopulationen verwendet, beispielsweise Chondrozyten (beschrieben von Freed et al. in The Journal of Biomedical Materials Research, 27: 11–13, 1993), Hepatozyten (beschrieben von Mooney et al. in The Journal of Biomedical Materials Research, 29, 959–965, 1995) und in jüngster Zeit aus Knochenmark gewonnene Zellen (beschrieben von Ishaug et al. in The Journal of Biomedical Materials Research, 36: 17–28, 1997 und Holy et al. in Cells and Materials, 7, 223–234, 1997). Konkret wurden porige Strukturen dieser Polyester präpariert und mit Zellen besiedelt; bei der Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen Zellen auf diesen porigen Strukturen erfolgte ein Einwachsen von Knochen allerdings nur im äußeren Randbereich des polymeren 3D-Gerüsts (Ishaug et al., supra; Holy et al., supra). Somit waren die in diesen Fällen präparierten polymeren Stützgerüste nicht geeignet, um das Zellwachstum zu ermöglichen, das erforderlich ist, damit Gewebe entsteht, das sich für eine Implantation oder für eine Verwendung als Autotransplantat eignet.
EP 0747068A1 bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen absorbierbarer Implantatmaterialien mit Porengrößen im Bereich von 0,1 mm bis 3,0 mm. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von gefrorenen Wassertröpfchen oder Öltröpfchen, die in eine vorgekühlte Kollagen-Faser-Dispersion gemischt werden. Der Schwamm mit den gewünschten Porengrößen entsteht nach dem Gefriertrocknen der Dispersion.
In dem an Bauer et al. erteilten US-Patent Nr. 5,338,772 wird ein Implantatmaterial beschrieben, bei dem es sich um ein Verbundmaterial aus Kalziumphosphat-Keramikpartikeln und einem bioadsorbierbaren Polymer handelt. Bei diesem Präparationsverfahren wird Kalziumphosphatpulver mit einem Polymer gemischt und das in der Mischung enthaltene Polymer durch Einwirkung von Mikrowellenenergie zum Schmelzen gebracht und in eine Flüssigkeit umgewandelt, die die Partikel umschließt.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun festgestellt, daß sich polymere Stützgerüste, die durch Makroporen im Größenbereich von Millimetern mit Verbindungen wie in strangförmigen Knochen gekennzeichnet sind, besonders gut für das Tissue Engineering eignen, da sie ein Einwachsen von Knochen ermöglichen, was eine unabdingbare Voraussetzung für das Entstehen von dreidimensionalem Gewebe ist. Solche polymeren Stützgerüste können nach einem Verfahren präpariert werden, bei dem die Techniken der Phasenumkehr und des "Particulate Leaching" (etwa "Partikelauslaugung") kombiniert angewandt werden.
Dementsprechend ist ein polymeres Stützgerüst vorgesehen, das Makroporen beinhaltet, deren Größe zwischen 0,5 mm und 3,5 mm liegt, und deren Verbindungsporigkeit derjenigen in menschlichen strangförmigen Knochen ähnlich ist.
Konkret ist ein makroporiges polymeres Stützgerüst von strangförmiger Morphologie mit einer Porigkeit von mindestens 50% vorgesehen, wobei das besagte makroporige polymere Stützgerüst Makroporen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von etwa 0,5 mm bis etwa 3,5 mm aufweist, deren Porenwände durch polymere Streben definiert sind, und wobei die Makroporen über makroporige Kanäle miteinander verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung sieht ein makroporiges polymeres Stützgerüst vor, umfassend polymere Streben, die Makroporen definieren, welche durch makroporige Kanäle miteinander verbunden sind, die mikroporige Kanäle enthalten, die sich durch die besagten polymeren Streben erstrecken, so daß besagte polymere Streben mikroporig sind und Makroporen auf jeder Seite einer vorgegebenen polymeren Strebe durch die besagte vorgegebene polymere Strebe in Verbindung sind, wobei die Makroporen einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 0,5 mm bis ungefähr 3,5 mm aufweisen, wobei die makroporigen Kanäle, die die Makroporen verbinden, einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 200 μm bis ungefähr 2 mm aufweisen, und wobei die mikroporigen Kanäle einen durchschnittlichen Durchmesser kleiner als ungefähr 200 μm aufweisen, und wobei das makroporige polymere Stützgerüst eine Porigkeit von mindestens 50% aufweist.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner einen Prozeß zur Synthetisierung eines makroporigen polymeren Stützgerüsts vor, umfassend die Schritte
Mischen von flüssigem Polymer mit Partikeln, um ein Gemisch daß flüssigen Polymers und der Partikel zu bilden;
Stabilisieren des Gemisches;
Eintauchen des Gemisches in ein Nichtlösemittel für das flüssige Polymer, um das flüssige Polymer auszufällen, indem ein verfestigtes Gemisch hergestellt wird; und
Eintauchen des verfestigten Gemisches in ein Lösemittel, das die Partikel für eine Zeit löst, die ausreichend ist, um die Partikel zu lösen, um das makroporige polymere Stützgerüst zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner ein makroporiges polymeres Stützgerüst mit mikroporigen polymeren Streben vor, die Makroporen definieren, die miteinander durch makroporige Kanäle verbunden sind, die durch Mischen von flüssigem Polymer mit Partikeln gebildet werden, um ein Gemisch des flüssigen Polymers und der Partikel zu bilden, indem das Gemisch in ein Nichtlösemittel für das flüssige Polymer eingetaucht wird, um das flüssige Polymer auszufällen, um ein verfestigtes Gemisch herzustellen, und indem das verfestigte Gemisch in ein Lösemittel eingetaucht wird, das die Partikel für eine Zeit löst, die ausreichend ist, um die Partikel zu lösen, um das makroporige polymere Stützgerüst mit mikroporigen polymeren Streben zu erhalten, die die besagten Makroporen definieren, die miteinander durch die makroporigen Kanäle verbunden sind, wobei besagte Makroporen einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von 0,5 bis 3,5 mm aufweisen, wobei die besagten makroporigen Kanäle, die die Makroporen miteinander verbinden, einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von 200 μm bis 2 mm aufweisen, wobei die besagten mikroporigen polymeren Streben mikroporige Kanäle enthalten, die sich durch die Streben erstrecken, die einen durchschnittlichen Durchmesser größer als 50 μm und kleiner als 200 μm aufweisen, und wobei das makroporige polymere Stützgerüst eine Porigkeit von mindestens 50% aufweist.
Ein Verfahren zum Wachsen von Gewebe mit durchdringender Verteilung in einem dreidimensionalen makroporigen polymeren Stützgerüst mit einer strangförmigen Morphologie bis in eine Tiefe von mindestens dem 2,5-fachen der mittleren Makroporengröße in dem Stützgerüst, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines makroporigen polymeren Stützgerüsts, umfassend
polymere Streben, die Makroporen definieren, welche miteinander durch makroporige Kanäle verbunden sind, die mikroporige Kanäle enthalten, die sich durch die polymeren Streben erstrecken, so daß besagte polymeren mikroporig sind und Makroporen auf jeder Seite einer vorgegebenen polymeren Strebe durch die besagte vorgegebene polymere Strebe in Verbindung sind, wobei besagte Makroporen einen durchschnittlichen Durchmessern einem Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 mm aufweisen, wobei die makroporigen Kanäle, die die Makroporen verbinden, einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 200 μm bis ungefähr 2 mm aufweisen, und wobei die besagten mikroporigen Kanäle einen durchschnittlichen Durchmesser kleiner als ungefähr 200 μm aufweisen, und wobei das besagte makroporige polymere Stützgerüst eine Porigkeit von mindestens 50% aufweist; Impfen des polymeren Stützgerüsts mit Gewebezellen; und Kultivieren der Gewebezellen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden noch ausführlicher unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen und am Computer digitalisierten Mikroskopaufnahmen beschrieben, in welchen
1 eine Diagrammdarstellung eines Teils eines polymeren Porensystems ist und verschiedene Komponenten veranschaulicht, die im folgenden definiert werden;
2 eine Lichtmikroskopaufnahme der Knochenstränge im Hals der Femora ist und die isotropen und anisotropen Bereiche zeigt (modifizierte Lichtmikroskopaufnahme von Tobin WJ in J. Bone lt Surg 37A(1) 57–72, 1955);
3A eine Lichtmikroskopaufnahme eines erfindungsgemäßen Polymers ist (Feldbreite = 1,8 cm);
3B eine Lichtmikroskopaufnahme eines 20-μm-Abschnitts des polymeren Stützgerüsts aus 3A ist (Feldbreite = 3,5 cm);
3C eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme der Porenwände des polymeren Stützgerüsts aus 3A ist;
4A ein Diagramm ist, das den Verlauf der Last-Festigkeits-Kurve der polymeren Stützgerüste veranschaulicht, wenn diese einem Druckbelastungstest mit einer Deformationsrate von 1% pro Sekunde unterzogen werden;
4B ein Diagramm ist, das die Auswirkung einer Polymerkonzentration auf die mechanischen Eigenschaften von polymeren Stützgerüsten veranschaulicht und in welchem der Young-Modul des ersten elastischen Bereichs als Y₁ und der Young-Modul des zweiten elastischen Bereichs als Y₂ bezeichnet werden;
5 eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme der Porenwandstruktur eines polymeren Stützgerüsts ist, das mit einer Konzentration von 0,05 g/ml Poly(Lactid-Coglycolid) (PLGA) 75 : 25 in Dimethylsulfoxid (DMSO) präpariert wurde;
6 eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme der Porenwandstruktur eines polymeren Stützgerüsts ist, das mit einer Konzentration von 0,2 g/ml PLGA 75 : 25 in DMSO präpariert wurde;
7A eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme von PLGA-75/25-Stützgerüsten ist, die unter Verwendung von Partikeln kleiner 0,35 mm gemacht wurde;
7B eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme von PLGA-75/25-Stützgerüsten ist, die unter Verwendung von Partikeln im Bereich von 0,54 bis 0,8 mm gemacht wurde;
7C eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme von PLGA-75/25-Stützgerüsten ist, die unter Verwendung von Partikeln im Bereich von 0,8 bis 2,0 mm gemacht wurde;
8 eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme einer PLGA-75/25-Membran ist, die ohne Anwesenheit von Partikeln präpariert wurde;
9A eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines PLGA-75/25-Schaumes ist, die bei Tmix = 11°C und Tnonsolvent = 0°C gemacht wurde;
9B eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines PLGA-75/25-Schaumes ist, die bei Tmix = –20°C und Tnonsolvent = 0°C gemacht wurde;
9C eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines PLGA-75/25-Schaumes ist, die bei Tmix = –20°C und Tnonsolvent = 40°C gemacht wurde;
10 eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme von blattförmigem CaP dient, mit dem ein PLGA-75/25-Stützgerüst beschichtet ist;
11 eine konfokale Mikroskopaufnahme eines über 42 Tage kultivierten Dex+-Stützgerüsts ist (Feldbreite = 1,8 mm);
12 eine bei UV-Licht hergestellte Lichtmikroskopaufnahme eines mit Tetracyclin gefärbten Dex+-Stützgerüsts ist (Feldbreite = 2,0 mm);
13 eine Lichtmikroskopaufnahme eines mit Markierungs-Antikörpern für Osteocalcin versehenen Stützgerüsts ist (Feldbreite = 1,1 mm);
14 eine Lichtmikroskopaufnahme eines mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Dex+-kultivierten Stützgerüstabschnitts ist (Feldbreite = 0,8 mm);
15 eine Lichtmikroskopaufnahme eines mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Dex+-kultivierten Stützgerüstabschnitts ist (Feldbreite = 0,6 mm);
16A eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines membranartigen PLGA-75/25-Stützgerüsts nach dem bisherigen Stand der Technik ist, das mit Partikeln kleiner 0,35 mm hergestellt wurde,
16B eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines membranartigen PLGA-75/25-Stützgerüsts nach dem bisherigen Stand der Technik ist, das mit Partikeln in einem Bereich von 0,54 bis 0,8 mm hergestellt wurde,
16C eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines membranartigen PLGA-75/25-Stützgerüsts nach dem bisherigen Stand der Technik ist, das mit Partikeln in einem Bereich von 0,8 bis 2,0 mm hergestellt wurde,
16D eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines intermediären PLGA-75/25-Stützgerüsts ist, das mit Partikeln kleiner 0,35 mm hergestellt wurde,
16E eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines intermediären PLGA-75/25-Stützgerüsts ist, das mit Partikeln in einem Bereich von 0,54 bis 0,8 mm hergestellt wurde,
16F eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines intermediären PLGA-75/25-Stützgerüsts ist, das mit Partikeln in einem Bereich von 0,8 bis 2,0 mm hergestellt wurde,
16G eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines knochenartigen PLGA-75/25-Stützgerüsts ist, das mit Partikeln kleiner 0,35 mm hergestellt wurde,
16H eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines knochenartigen PLGA-75/25-Stützgerüsts ist, das mit Partikeln in einem Bereich von 0,54 bis 0,8 mm hergestellt wurde, und
16I eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines knochenartigen PLGA-75/25-Stützgerüsts ist, das mit Partikeln in einem Bereich von 0,8 bis 2,0 mm hergestellt wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1 ist eine Diagrammdarstellung eines Teils eines polymeren Stützgerüstes und zeigt zwei Makroporen, die über ein makroporige Verbindung miteinander verbunden sind. Die beiden Makroporen sind außerdem mit den umliegenden Makroporen über mikroporige Kanäle verbunden (die auch als Mikroporen bezeichnet werden). Diese und verschiedene andere Begriffe, die in der Beschreibung des gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten polymeren Stützgerüsts verwendet werden, werden nachstehend definiert.
Stützgerüst: Vorrichtung, die als Zellträger für das Tissue Engineering oder damit verwandte Anwendungen verwendet wird. Diese Vorrichtung weist zur Kolonisierung mit Zellen vorzugsweise eine porige Morphologie auf. Im hier behandelten konkreten Fall weist das Stützgerüst eine offene Morphologie auf.
Makroporen: Leerräume innerhalb des polymeren Stützgerüsts, die durch Polymerwände festgelegt sind. Die Makroporen haben einen Durchmesser von typisch 0,5 bis 3,5 mm. Porenwände: Polymere Streben, die Makroporen festlegen. Wenn die polymeren Streben anisotrope Bündel bilden, in denen mikroporige Verbindungen Streben, die zum selben Bündel gehören, voneinander trennen, ist die Struktur der Porenwände als "lamellär" (in Lamellen angeordnet) definiert. Wenn die Streben isotropisch sind, keine Bündel bilden und über meist makroporige Verbindungen weit voneinander getrennt sind, ist die Porenwand als "strebenartig" definiert. Sowohl lamelläre als auch strebenartige Porenwandstrukturen weisen bei der Sektion Nanoporen auf.
Mikroporige Verbindungen (auch Mikroporen oder mikroporige Kanäle genannt): Leerstellen in lamellären Porenwänden. Alle Streben oder Polymerlamellen sind voneinander durch verlängerte parallele Porenstrukturen getrennt, die als Mikroporen bezeichnet werden. Die Größe dieser Poren liegt unter 200 μm. Mikroporen tragen zur Gesamtvernetzung der Stützgerüste bei.
Makroporige Verbindungen: Kanäle zwischen lamellären Gruppen von Porenwänden oder zwischen polymeren Streben. Sie tragen meist zur Vernetzung der Makroporen bei und weisen eine Größe im Bereich zwischen 200 μm und 2 mm auf.
Nanoporen: Leerräume in der Polymermasse. Querschnitte von Polymermasse, entweder aus Porenwandstreben oder Porenwand-Lamellenstrukturen, weisen abgerundete Konkavitäten auf, die die gesamte Polymermasse entweder durchdringen können oder nicht. Diese Nanoporen können aus eingeschlossenem Nichtlösemittel in der Polymermasse oder aus einem autokatalytischen Abbau der Polymermasse resultieren. Nanoporen verteilen sich in den Wänden des Stützgerüsts. Sie tragen nur zu Gesamtvernetzung der Makroporen bei, wenn sie durch das gesamte Material hindurch verlaufen.
Verbindungen: Die Strömungskanäle, die die Makroporen miteinander verbinden. Zu den Verbindungen gehören die makroporigen Verbindungen (Kanäle), die mikroporigen Verbindungen (Kanäle) und die Nanoporen, die die gesamte oben definierte Masse durchdringen.
Die vorliegende Erfindung sieht ein makroporiges polymeres Stützgerüst vor, das Makroporen und Verbindungen beinhaltet. Makroporen haben einen Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 3,5 mm und Verbindungen wie in strangförmigen Knochen. Die Morphologie der hier beschriebenen polymeren Stützgerüsten (auch Schaumstrukturen genannt) basiert auf derjenigen von strangförmigen Knochen.
Strangförmige Knochen sind, wie nachgewiesen wurde, der metabolisch aktivste Bereich in Knochen (beschrieben von Rodan GA in Bone 13, S3–S6 1992). Die spezielle Geometrie der offenen Poren von strangförmigen Knochen wirkt sich günstig auf die Knochenbildung und -resorption aus und ist daher von beträchtlichem Interesse im Kontext des Tissue Engineerings bei Knochen: üüüTatsächlich sollte ein ideal angelegtes Knochen-Tissue-Engineering auch eine schnelle Knochenbildung und -resorption gestatten. Die Morphologie von Knochensträngen diente deshalb bislang als Modell zur Herstellung der hier beschriebenen neuen polymeren Stützgerüststrukturen.
Die Architektur der Knochenstränge ist abhängig vom anatomischen Ort, an dem sich der Knochen befindet, und – in geringerem Ausmaß – vom Alter des Patienten.
Martin RB (in CRC Critical Reviews in Biomedical Engineering, 10(3), 179–222, 1984) beschrieb die Knochenstränge als "ein komplexes System von unterbrochenen Wänden und Streben". Die Leerräume, die sich zwischen den Strängen befinden, werden als "Mark-Zwischenräume" bezeichnet. Die Richtungen der Stränge sind unregelmäßig; allerdings ist manchmal eine globale Organisation der Stranggeometrie sichtbar, die den auf den Knochen einwirkenden Kräften folgt. Bereiche, in denen die Stränge einer vorgegebenen Richtung folgen, sind anisotrop, während Bereiche, in denen die Stränge zufällig angeordnet sind, isotrop sind (vgl. 2).
Whitehouse und Dyson (supra) sowie Martin (supra) haben die Porigkeit von strangförmigem Knochen in den Femora sehr ausführlich beschrieben. Tabelle 1.1 gibt verschiedene Porigkeiten und Strangbreiten wieder, die von Whitehouse und Dyson für alle Femora-Bereiche ermittelt wurden.
Tabelle 1.1: Porigkeit und Strangbreite von femoralen Strangknochen
Die Struktur von strangförmigem Knochen wurde auf die Strangbreite, Porigkeit und Anisotropie sowie auf allgemeine Muster wie Konnektivität und Star-Volumen untersucht. Licht- und Rasterelektronenmikroskopaufnahmen, die zu strangförmigem Knochen veröffentlicht wurden, lassen erkennen, daß die durch Stränge (d. h. Poren) festgelegten Mark-Zwischenräume eine Größe zwischen einem Millimeter und mehreren Millimetern haben und mit Löchern verbunden sind, deren Größen zwischen etwa 0,3 mm und einem mm liegen.
Wenn die aus Polymer gebildeten Stränge, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, für physiologische Anwendungen eingesetzt werden, wird das polymere Stützgerüst vorzugsweise aus einem beliebigen bioverträglichen Material hergestellt. Der Begriff "bioverträglich", wie er in diesem Dokument verwendet wird, bezieht sich auf Polymere, die gegenüber Zellen nicht toxisch wirken und auf denen Zellen kultiviert werden können. Einige Beispiele für geeignete Polymere sind Poly(Lactid), Poly(Lactid-Coglycolid) (PLGA) in unterschiedlichen Verhältnissen, Polystyrol, Poly(Glycolid), Poly(akrylat)e, Poly(Methylmethacrylat), Poly(Hydroxyethylmethacrylat), Poly(Vilylalkohol), Poly(Carbonat), Poly(Ethylen-Covinylacetat), Poly(Anhydrid), Poly(Ethylen), Poly(Propylen), Poly(Hydroxybutyrat), Poly(Hydroxyvalerat), Poly(Urethan)e, Poly(Ätherurethan), Poly(esterurethan), Poly(acrylat), Poly(imid), Poly(Anhydrid-Coimid), Poly(Aminosäuren) und Poly(Phosphazen). Biodegradierbare, aliphatische Polyester wie etwa Polymilchsäure und daraus abgeleitete Polymere, stellen eine besonders gut geeignete Kategorie von Polymeren in Anwendungen für die vorliegenden Stützgerüste dar, die sich aus die Zelltransplantation beziehen, und zwar deshalb, weil sie bereits für die klinische Anwendung am Menschen zugelassen sind. In dieser Hinsicht ist PLGA ein für Stützgerüste bevorzugtes Polymer, insbesondere in Mischungen mit mehr als 50% Poly(DL-Lactid) wie z. B. PLGA 85 : 15 und PLGA 75 : 25.
Welche Anwendungen sich für die vorliegenden Stützgerüste eignen, ist je nach Zusammensetzung und Struktur des Polymers unterschiedlich. So eignen sich beispielsweise biodegradierbare polymere Stützgerüste entweder für In-vitro-Anwendungen und/oder für die In-vivo-Zelltransplantation. Die Matrizen können dann als Träger oder Stützgerüste dienen, damit ein Zellwachstum in vitro möglich ist, bevor eine Implantation in vivo erfolgt. Die Stützgerüste können auch direkt in vivo verwendet werden, ohne zuvor mit Zellen geimpft worden zu sein. In beiden Anwendungen (mit einer vorherigen Impfung oder ohne eine vorherige Impfung) sind biodegradierbare polymere Matrizen gemäß der vorliegenden Erfindung für das Wachsen von dreidimensionalem Gewebe besonders geeignet und können zum Wachsen von Bindegeweben wie Knochen, Knochen und Parodontalgewebe aber auch von Dentalgeweben und Geweben anderer Organe wie z. B. Leber- oder Brustgewebe verwendet werden.
Eine bedeutende Eigenschaft des vorliegenden polymeren Stützgerüsts ist das Vorhandensein von Makroporen, von denen mindesten 50% einen Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 3,5 mm haben, ein Bereich, der sich als repräsentativ für denjenigen von menschlichen strangförmigen Knochen erwiesen hat. Die Makroporen haben vorzugsweise einen Durchmesser von mindestens 1,0 mm und am zweckmäßigsten einen Durchmesser zwischen etwa 1,0 mm und etwa 3,5 mm.
Das Stützgerüst ist nicht nur durch seine makroporige Struktur gekennzeichnet, sondern auch durch einen hohen Vernetzungsgrad, was sowohl die Durchdringung des Stützgerüsts als auch den Zustrom von Nährstoffen zu den Zellen verbessert. Makroporige Verbindungen von mindestens 0,35 mm bilden eine "offene Zellumgebung" im polymeren Stützgerüst, was für die Anregung eines Gewebewachstums im gesamten Stützgerüst – d. h. eines dreidimensionalen Gewebewachstums – von Wichtigkeit ist.
Die Makroporen sind durch porige Polymerwände festgelegt, die eine lamellare Struktur haben können oder auch nicht. Die Gesamtdicke der Porenwände ist nicht größer als etwa 0,4 mm und vorzugsweise nicht größer als 0,3 mm. Der Vernetzungsgrad in den Porenwänden ist neben anderen Faktoren von den Verarbeitungstemperaturen abhängig.
Ein überraschendes und unerwartetes Ergebnis ist, daß jede Makropore in Strömungsaustausch mit einer erheblichen Zahl von benachbarten Makroporen steht, und zwar sowohl über makroporige als auch mikroporige Verbindungen.
Stützgerüste mit unterschiedlichen Porenwandstrukturen, die sich unter Anwendung dieses neuartigen Phasenumkehr- und Particulate-Leaching-Prozesses bei unterschiedlichen Verarbeitungstemperaturen ergeben, werden im vorliegenden Dokument beschrieben.
Die Porigkeit des polymeren Stützgerüsts liegt für alle hergestellten Stützgerüste bei einem Wert von mindestens 50%, was sich aus einer Abschätzung mit Hilfe der Bildanalysesoftware Northern Eclipse ergibt, und beträgt vorzugsweise mehr als 50%. Der Porigkeitsgrad des vorliegenden polymeren Stützgerüsts trägt außerdem zu dessen "Offenzelligkeit" bei, was zu einer beträchtlichen Überlappung zwischen Makroporen (die die Ursache für die makroporigen Kanäle sind) führt, was die hochgradig vernetzte Struktur des vorliegenden Stützgerüsts definiert und dessen Nutzbarkeit als Stützgerüst zum Wachsen von Zellen weiter erhöht. In dieser Hinsicht ist der Porigkeitsgrad vorzugsweise größer als etwa 75%, während der optimale Porigkeitsgrad über 85% liegt.
Mit seinen Eigenschaften ist das vorliegende Stützgerüst besonders geeignet für Anwendungen im Tissue Engineering und vor allem in der Zelltransplantation, weil es ein bioverträgliches Stützgerüst darstellt, das über das makroporige Netzwerk des Stützgerüsts dreidimensional von Zellen besiedelt werden kann. Dies ist von Bedeutung, wenn man die Transplantation von Zellen von Zellen anstrebt, die Gewebe bilden, besonders von solchen, die eine Neoangiogenese erfordern, wie dies z. B. bei Knochengewebe der Fall ist. Außerdem ist das Stützgerüst biodegradierbar, wenn es für Zelltransplantationen verwendet wird, wobei die Biodegradation so gesteuert werden kann, daß das Zellwachstum simultan mit der Degradation des Stützgerüsts erfolgt.
Für den Fachmann wird erkennbar sein, daß das vorliegende polymere Stützgerüst modifiziert werden kann, um seine Eigenschaften zur Verwendung als Stützgerüst für ein Zellwachstum weiter zu verbessern. Modifikationen, die typisch die als Träger für ein Zellwachstum verwendeten Strukturen beeinflussen, wären ebenfalls zum Modifizieren des polymeren Stützgerüsts geeignet. Solche Modifikationen dienen zur Verbesserung der biologischen Reaktion und beinhalten beispielsweise Modifikationen der Oberfläche mit Kollagen, Kalziumphosphat, Proteoglykanen, Proteinen, Peptiden, Kohlehydraten und Polysacchariden oder durch Säure-Basen-Behandlung. Zusätzlich kann das polymere Stützgerüst als Reservoir für die Zuführung von aktiven Molekülen wie z. B. Proteinen, Wachstumsfaktoren usw. dienen, die die Zellfunktion verbessern.
Das vorliegende polymere Stützgerüst läßt sich durch einen Prozeß herstellen, bei dem "Particulate-Leaching"-Verfahren und das Verfahren der Phasenumkehr kombiniert angewandt werden. In einem ersten Schritt wird das ausgewählte polymere Stützgerüst zu einem flüssigen Polymer aufbereitet. Im vorliegenden Dokument ist mit dem Begriff "flüssiges Polymer" ein Polymer in flüssiger Form gemeint, das entweder in reiner Form vorliegt oder einer anderen Flüssigkeit beigemischt ist. Dies läßt sich durch Mischen des Polymers in ein Lösemittel bewerkstelligen, so daß eine Polymerlösung entsteht. Hierfür kann jedes beliebige Lösemittel verwendet werden, das allgemein zum Herstellen einer Polymerlösung geeignet ist, beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Methylenchlorid, Ethylazetat, Chloroform, Azeton, Benzol, Butanon-2, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, n-Heptan, n-Hexan und n-Pentan. Wie jeder Fachmann bestätigen wird, werden vorzugsweise nichtzytotoxische Lösemittel wie DMSO zum Herstellen der Lösung verwendet, damit das Zellwachstum nicht beeinträchtigt wird. Die Konzentration des Polymers in der Polymerlösung wird in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Polymers variieren, das zum Herstellen des Stützgerüsts verwendet wird.
Alternativ dazu kann das Polymer in ein flüssiges Polymer umgewanden werden, indem es auf seinen Schmelzpunkt erhitzt wird.
Das flüssige Polymer wird anschließend im Zuge der Particulate-Leaching-Phase des Prozesses mit Partikeln geeigneter Größe gemischt. Geeignet sind Partikel mit einem Durchmesser, der dem gewünschten Durchmesser der Makroporen im polymeren Stützgerüst entspricht, insbesondere solche mit einem Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 3,5 mm. Besser sind Partikel mit einem Durchmesser von mehr als 1,0 mm, und optimal geeignet sind solche mit einem Durchmesser zwischen 1,0 mm und 2,0 mm. Beispiele für Partikel, die sich zum Mischen mit dem Polymer eignen, sind Polysaccharide (wie b. B. Glucose), organische und anorganische Salze, Proteine und Lipide geeigneter Größenordnung, die in einem anderen als dem für das Polymer verwendete Lösemittel gelöst werden können (d. h. einem Polymer-Nichtlösemittel). Die Menge der Partikel, die der Polymerlösung beigemischt werden, wird wiederum mit den Eigenschaften des Polymers variieren, das zum Herstellen des Stützgerüsts verwendet wird.
Nachdem die Partikel gründlich mit dem flüssigen Polymer durchmischt wurden, so daß sich ein Partikel-Polymer-Gemisch ergibt, wird das Polymer einer Phasenumkehr unterzogen, bei der es vom flüssigen in den festen Zustand umgewandelt wird. Dieser Schritt wird bewerkstelligt, indem das Partikel-Polymer-Gemisch in ein Polymer-Nichtlösemittel eingetaucht wird, also in ein Lösemittel, in welchem das Polymer nicht löslich ist. Solche Polymer-Nichtlösemittel sind beispielsweise Wasser, Alkohol, 1-4-Dioxan und Anilin.
Damit ein festes polymeres Stützgerüst mit einer bestimmten Form entsteht, kann das Polymergemisch während des Phasenumkehrvorgangs in eine Form gefüllt werden. Vorzugsweise kann das flüssige Polymer um die Partikel herum stabilisiert werden, indem beispielsweise die fest-flüssige Dispersion aus Partikeln und Polymer gefroren wird. Dabei wird keine Form verwendet, und der Prozeß der Phasenumkehr setzt von allen Außenoberflächen her ein. Wenn das Polymer-Lösemittel zum Beispiel DMSO ist, wird das Polymergemisch auf eine Temperatur von 12°C, also die Gefrierpunkttemperatur von DMSO, oder darunter abgekühlt. Diese Abkühlung kann auch bis auf niedrigere Temperaturen wie z. B. Temperaturen von weniger als 0°C erfolgen. Eine Konsequenz der Anwendung niedrigerer Temperaturen (beispielsweise –20°C oder –80°C) während dieses Prozeßstadiums ist die anschließende Bildung eines polymeren Stützgerüsts mit unterschiedlicher Morphologie (vgl. Beispiel 4), so etwa mit einer dickeren Hautstruktur, welche vor der Verwendung als Stützgerüst für ein dreidimensionales Zellwachstum entfernt werden kann, wie in Beispiel 1 beschrieben. Neben dem Abkühlen können auch andere Verfahren zum Stabilisieren des Pertikel-Polymer-Gemischs angewandt werden, beispielsweise das Gelieren (Erhöhen der Viskosität).
Im Anschluß an die Umwandlung des Polymergemischs von der flüssigen in die feste Phase wird das Polymer dem Particulate Leaching unterzogen. In diesem Prozeßschritt wird das Polymer in eine Partikellösung eingetaucht, d. h. in eine Lösung, die dazu dient, die im Polymer dispergierten Partikel, nicht jedoch das Polymer selbst zu lösen. Welche Lösemittel geeignet sind, wird freilich von der Art der Partikel und des Polymers abhängen. Beispiele für geeignete Partikel-Lösemittel sind Wasser, Alkohol, 1-4-Dioxan und Anilin. Die Temperatur des Partikel-Lösemittels kann bei geringfügigen Auswirkungen auf das resultierende polymere Stützgerüst variiert werden. Die Temperatur wird jedoch im allgemeinen zwischen dem Gefrierpunkt des Partikel-Lösemittels und der Glasübergangstemperatur des Polymers liegen, so daß das polymere Stützgerüst unter dem Einfluß der Temperatur des Nichtlösemittels weder schmilzt noch viskos wird. In einem Beispiel wird eine Temperatur des Partikel-Lösemittels zwischen 0°C und 45°C angewandt, wenn als Lösemittel Wasser verwendet wird und das Polymer PLGA 75 : 25 ist.
Das Polymer wird für eine Zeitspanne in das Partikel-Lösemittel eingetaucht, die so bemessen ist, daß eine vollständige Auflösung der im polymeren Stützgerüst dispergierten Partikel erfolgen kann. Im allgemeinen dauert es mindestens 24 Stunden, bis die Partikel im polymeren Stützgerüst vollständig aufgelöst sind; es wird jedoch eine Zeitspanne von mindestens 48 Stunden bevorzugt. Zur Beschleunigung der effizienten Auflösung der Partikel ist es wünschenswert, das Polymer für die Dauer des Auflösungsvorgangs häufiger in frisches Lösemittel einzutauchen, beispielsweise in Intervallen von rund 8 bis 9 Stunden oder durch Einsatz eines Bades mit Lösemittelumwälzung.
Die Prozesse der Phasenumkehr und des Particulate Leaching können in einem Arbeitsgang mit einem Lösemittel bewerkstelligt werden, das gleichzeitig ein Polymer-Nichtlösemittel und ein Partikel-Lösemittel ist. In einem Beispiel wurde doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) verwendet.
Das plymere Stützgerüst wird im Anschluß an eine angemessene Zeitspanne für die Partikelauflösung aus dem Partikel-Lösemittel entnommen und kann entweder vor der Verwendung vakuumgetrocknet oder in Alkohol (beispielsweise 70% Ethanol) desinfiziert, gespült und in einem Kulturmedium zur anschließenden Verwendung vorbehandelt werden. Wenn das polymere Stützgerüst nicht sofort benötigt wird, ist es wünschenswert, es in einem Exsikkator zu lagern, damit keine Feuchtigkeit zurückbleibt, um eine mögliche Zersetzung des Polymers zu vermeiden.
Das vorliegende Verfahren führt vorteilhafterweise zu einem einem Stützgerüst mit einzigartigen Eigenschaften und insbesondere zu einem polymeren Stützgerüst mit einem makroporigen Netzwerk. Ein weiterer wesentlicher Vorteil des vorliegenden zweistufigen Prozesses besteht darin, daß er verstärkte Möglichkeiten zum Beeinflusse der Morphologie des resultierenden polymeren Stützgerüsts bietet. Anders formuliert, bietet das Verfahren zwei Stufen, nämlich das Particulate Leaching und die Phasenumkehr, auf denen die Morphologie des polymeren Stützgerüsts beeinflußt werden kann. So können beispielsweise die Größe und Verteilung der Makroporen sowohl während der Particulate-Leaching-Stufe als auch während der Phasenumkehrstufe des Prozesses insofern verändert werden, als sie durch die Größe und Verteilung der Partikel und – in geringerem Ausmaß – durch die bei der Verarbeitung des Stützgerüsts herrschenden Temperaturen bestimmt werden. Außerdem lassen sich die Größe und die Verteilung der Verbindungen durch Variieren der Phasenumkehrrate beeinflussen. Die Phasenumkehrrate kann durch eine Reihe von Variablen verändert werden, zu denen unter anderem die Temperatur, die Art des Polymer-Nichtlösemittels und die Polymerkonzentration gehören. Somit läßt sich die endgültige Morphologie des Stützgerüsts steuern. Die resultierende Morphologie ähnelt vorzugsweise derjenigen eines menschlichen strangförmigen Knochens.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen für ein dreidimensionales Wachstum unter Verwendung des hier beschriebenen polymeren Stützgerüsts vorgesehen. Die neuartige vernetzte makroporige Struktur des vorliegenden polymeren Stützgerüsts eignet sich besonders für das Tissue Engineering und insbesondere das Tissue Engineering von Knochen, das eine interessante Alternative zu den gegenwärtig verfügbaren Therapien zur Wiederherstellung von Knochen darstellt. In dieser Hinsicht erfolgt ein Impfen des polymeren Stützgerüsts mit Zellen, die aus Knochenmark gewonnen wurden, nach herkömmlichen Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind (und von Maniatopoulos et al in Cell Tissue Res 254, 317–330, 1988 beschrieben werden). Dabei werden Zellen auf dem polymeren Stützgerüst angesiedelt und unter geeigneten Wachstumsbedingungen kultiviert. Den Kulturen werden Nährstoffe zugeführt, die ihr Wachstum bewirken.
Wie oben erläutert, können im vorliegenden polymeren Stützgerüst Zellen unterschiedlichen Typs gezüchtet werden. Das polymere Stützgerüst der vorliegenden Erfindung eignet sich jedoch hauptsächlich zum Wachsen von osteogenen Zellen, insbesondere solchen, die Knochenmatrix bilden. Für das Tissue Engineering können die Zellen beliebigen Ursprungs sein. Die Zellen sind vorteilhafterweise menschlichen Ursprungs. Das vorliegende Verfahren zum Züchten von Zellen in einem erfindungsgemäßen dreidimensionalen Stützgerüst ermöglicht es, daß beispielsweise osteogene Zellen das Stützgerüst durchdringen, um so während der In-vitro-Phase Knochenmatrix zu bilden, wobei sich eine durchdringende Verteilung in der Struktur des polymeren Stützgerüsts und insbesondere bis zu einer Tiefe von mindestens dem Zweieinhalbfachen der Tiefe der durchschnittlichen Makroporengröße einstellt. Die Durchdringung mit osteogenen Zellen und folglich der Knochenmatrixaufbau können durch mechanische Vorrichtungen, Ultraschall, elektrische Felder oder elektronische Vorrichtungen noch verbessert werden.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden konkreten Beispielen beschrieben, die jedoch lediglich als Beispiele und nicht als Einschränkung der Allgemeingültigkeit der Erfindung zu verstehen sind.
Beispiel 1 – Präparation eines polymeren PLGA-75 : 25-Stützgerüsts
Ein polymeres PLGA-75 : 25-Stützgerüst gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von PLGA 75 : 25 (Hersteller: Birmingham Polymer Inc.) präpariert, das eine Eigenviskosität von 0,87 dL/g hat. Ein ml von 0,1 g/ml PLGA 75 : 25 in DMSO wurde mit 2 g Glucosekristallen (mit einer Partikelgröße im Bereich von 0,8 mm bis 2 mm) in einer Aluminiumform gemischt. Das PLGA 75 : 25-DMSO-Gemisch wurde auf –20°C abgekühlt. Diese Temperatur des PLGA 75 : 25-DMSO-Gemischs wird als T_mix bezeichnet. Die gefrorenen PLGA 75 : 25-Blöcke wurden anschließend in ein Eis-Wasser-Gemisch aus ddH₂O bei 0°C getaucht, das für das Polymer ein Nichtlösemittel ist. Diese Wassertemperatur wird als T_nonsolvent bezeichnet. Die Blöcke blieben für die Dauer von 48 Stunden in ddH₂O, wobei das ddH₂O etwa alle 8 Stunden ausgetauscht wurde. Die dabei entstandenen Stützgerüste wurden aus dem Wasser genommen, für 72 Stunden bei 0,01 mmHg vakuumgetrocknet und bis zur Verwendung in einem Exsikkator unter Vakuum bei 4°C gelagert. Anschließend wurden die Stützgerüste, die unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestellt worden waren, eingehend analysiert.
Die makroporige Struktur von 2 mm dicken polymeren Stützgerüstabschnitten wurde bei geringer (16-facher) Vergrößerung, wie in 3A gezeigt, unter einem Dissektionsmikroskop beobachtet. Dabei wurde im gesamten polymeren Stützgerüst eine einheitliche Verteilung von untereinander verbundenen Makroporen mit Größen im Bereich von etwa 0,8 bis 1,5 mm beobachtet. Die Makroporen zeigten elliptische Morphologien und dicke Porenwände (Dicke etwa 300 μm), die Mikroporen enthielten.
Das polymere Stützgerüst wurde dann in ein Tissue-Tek-Einbettungsmedium (Miles #4583) eingebettet und in einem Kryostaten bei –20°C seziert. Eine aufeinanderfolgende Serie von 20 μm dicken Schnitten (50 Schnitte) wurde auf Glas-Objektträger (VWR Canlab) übertragen. Die Schnitte wurden unter einem Dissektionsmikroskop bei niedriger (16-facher) Vergrößerung fotografiert und abgetastet. 3B zeigt einen abgetasteten Schnitt des Stützgerüsts, in dem die porigen Komponenten des Stützgerüsts, die Makroporen, die makroporigen Verbindungen (Kanäle) und die mikroporigen Verbindungen (Kanäle) zu sehen sind. Ein polymerer Dünnfilm (d. h. eine Hautschicht) wurde auf der äußeren Oberfläche des polymeren Stützgerüsts beobachtet. Die Bilder wurden zu TIFF-Dateien konvertiert und auf einem Personalcomputer (PC) mit Hilfe der Bildanalysesoftware Northern Eclipse analysiert.
Dabei wurde das Menü "Einzelmessung" zum Messen der Porenwandmaße (Fläche, Umfang, Durchmesser usw.) für jeden abgetasteten Schnitt verwendet. In der Routine "Datenmessung" wurden die Fläche und die Zahl der Porenwandstreben für jeden abgetasteten Objektträger berechnet.
Diese Messungen wurden von Pixeleinheiten in Millimeter umgerechnet, indem das System bei der oben erwähnten Vergrößerung der abgetasteten Bilder kalibriert wurde, um so das Verhältnis Pixel/mm zu bestimmen. Die Makroporengröße wurde bestimmt, indem auf dem digitalisierten Bild des Schnittes des polymeren Stützgerüsts mit einem Software-Tool von Hand eine Linie von einer Porenwand zur benachbarten Porenwand gezeichnet wurde. Die mit Hilfe der Bildanalysesoftware Northern Eclipse ermittelten Eigenschaften des resultierenden polymeren Stützgerüsts lauteten wie folgt:

Makroporengröße 1,79 ± 0,42 mm

Makroporige Verbindungen 0,37 ± 0,15 mm

Porenwanddicke 0,29 ± 0,13 mm

Mikroporen 0,10 ± 0,05 mm

Porigkeit 86,7 ± 2,43 mm
Außerdem wurde die Porigkeit der Polymermatrizen anhand von Quecksilber- Porositätsmessungen (mit Quantachrome Autoscan 60) abgeschätzt. Ein Festkörper-Penetrometer mit 5 cm³ Zellen-Stammvolumen wurde für Proben im Bereich von 0,015 bis 0,020 g verwendet. Die Werte für das Leerraumvolumen wurden aus dem Quecksilber-Eindringvolumen berechnet. Die Porigkeit wurde aus dem Quecksilber-Eindringvolumen berechnet und ergab einen Wert von 89,6%. Die mit Hilfe der Bildanalysesoftware Northern Eclipse abgeschätzte Porigkeit (≈ 87%) ist im wesentlichen äquivalent zu dem durch die Quecksilber-Porositätsmessungen ermittelten Wert von X90%, wenn man berücksichtigt, daß das Verfahren der Quecksilber-Porositätsmessung bei der Analyse von polymeren Stützgerüsten mit Porenduchmessern über ≈ 75 μm keine genauen Ergebnisse liefert.
Das polymere Stützgerüst wurde außerdem für die Analyse mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) präpariert. Dazu wurde das Stützgerüst in Querschnitte mit einer Dicke von ungefähr 2 mm unterteilt und unter einer Argonatmosphäre durch Sputtern mit Gold beschichtet (Polaron Instrument Inc., Doylestown, PA). Die Rasterelektronenmikroskopaufnahmen wurden mit einem REM vom Typ Hitachi 2500 bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV aufgenommen. Der Durchmesser der Makroporen betrug, wie die REM-Aufnahmen bestätigten, etwa 1 bis 1,5 mm, wenngleich auch nicht immer eine klare Abgrenzung zwischen den einzelnen Makroporen beobachtet wurde, was die sehr offene, vernetzte Struktur dieser polymeren Stützgerüste deutlich macht.
Die mikroporige Beschaffenheit der Porenwände, wie sie unter dem optischen Mikroskop beobachtet wurde, bestätigte sich in der in 3C gezeigten REM-Aufnahme.
Das polymere Stützgerüst wurde mechanisch wie folgt getestet: Ein polymeres Stützgerüst in Form eines Zylinders mit einem Durchmesser und einer Höhe von 1,5 cm wurde unter Verwendung eines Instron Mechanical Testers präpariert und getestet. Die mechanischen Experimente wurden auf einer uniaxialen servohydraulischen Testmaschine (Instron, Modell 1331 mit Steuergerät Series 2150) durchgeführt. Eine 1-kg-Kraftmeßdose (Sensotec, Modell 31/4680) wurde für alle Kompressionstests verwendet. Die Auslenkung des Aktors wurde mit einem linear DC-verstellbaren Differentialtransformator (LVDT, Intertechnology, Modell SE 374) gemessen. Die Signale von der Kraftmeßdose und vom LVDT wurden während der Tests auf einem digitalen Speicheroszilloskop (Gould, Modell 1425) angezeigt. Die Signale wurden außerdem einem Analog-Digital-Wandler (A/D-Wandler) mit 16 Kanälen und 12 Bit Auflösung in einem beschleunigten Computer vom Typ Apple IIe zugeführt. Die Datenerfassungsrate für diese Experimente lag bei 430 Datenpunktpaaren pro Sekunde. Die Kompression des polymeren Stützgerüsts erfolgte mit einer Rate von 0,1 mm/s. Wie in 4A gezeigt, ergab eine grafische Darstellung der Druckfestigkeit in Abhängigkeit von der prozentualen Verformung des polymeren Stützgerüsts zwei Module. Der Young-Modul für den ersten elastischen Bereich (der Wert Y₁) betrug 0,76 ± 0,12 MPa, während der Young-Modul für den zweiten elastischen Bereich (der Wert Y₂) bei 0,18 ± 0,016 MPa lag.
Beispiel 2 – Auswirkung der Polymerkonzentration auf die Struktur des polymeren Stützgerüsts
Die Auswirkung der Konzentration von PLGA 75 : 25 in DMSO auf die Struktur des resultierenden polymeren Stützgerüsts wurde nach dem in Beispiel 1 ausführlich beschriebenen Protokoll ermittelt. Drei verschiedene Konzentrationen von PLGA 75 : 25 in DMSO (0,05 g/ml, 0,1 g/ml und 0,2 g/ml) wurden zur Herstellung von Polymermatrizen verwendet, während alle anderen in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen konstant gehalten wurden.
Jedes einzelne Präparat des polymeren Stützgerüsts wurde mit einer Rasierklinge in zwei Hälften zerteilt. Auf jedem von ihnen wurde unabhängig von der Anfangskonzentration von PLGA 75 : 25 in DMSO eine Hautstruktur festgestellt. Die mechanischen Eigenschaften der drei verschiedenen polymeren Stützgerüste wurden untersucht und sind in 4B wiedergegeben. Eine signifikante Abnahme des Young-Moduls wurde in dem polymeren Stützgerüst beobachtet, das unter Verwendung von PLGA 75 : 25 in DMSO mit der Konzentration 0,05 g/ml präpariert worden war, während sich mit der PLGA-75 : 25-Konzentration von 2 mg/ml das starrste Stützgerüst ergab.
Diese Stützgerüste wurden ebenfalls unter einem Lichtmikroskop und einem REM beobachtet. Unter dem Lichtmikroskop konnten keine Unterschiede in der Struktur der drei polymeren Stützgerüste festgestellt werden. Bei der REM-Untersuchung dagegen wiesen die mit 0,05 g/ml PLGA in DMSO präparierten Stützgerüste eine stärker lamellenartige Struktur mit mehr mikroporigen Verbindungen auf (siehe 5) als diejenigen, die mit 0,2 g/ml PLGA in DMSO präpariert worden waren, wo weniger mikroporige Verbindungen zu sehen waren (siehe 6).
Beispiel 3 – Auswirkung der Partikel auf die Struktur des polymeren Stützgerüsts
Die Auswirkung auf die Struktur des resultierenden polymeren Stützgerüsts durch Variieren der Menge und Größe der dem PLGA-Polymer beigemischten Glucosepartikel wurde wie folgt ermittelt: Unterschiedliche Mengen von Glucosepartikeln (0,5 g, 1 g und 2 g) wurden separat einer 1-ml-Polymerlösung beigemischt, während alle anderen in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen konstant gehalten wurden. Die Auswirkung der Partikelgröße auf die endgültige Stützgerüstmorphologie wurde ebenfalls untersucht, wobei folgende (mit Standard-Testsieben von VWR, West Chester, PA) durchsiebte Partikel verwendet wurden: 1) NaCl-Kristalle (< 0,35 mm), 2) Saccharosekristalle (0,54 mm < Kristallgröße < 0,8 mm), 3) Glucosekristalle (0,8 mm < Kristallgröße < 2,0 mm). Die resultierenden polymeren Stützgerüste wurden durch Lichtmikroskopie beobachtet. Beim Vermischen der Polymerlösung mit den Partikel war zu erkennen, daß die Polymerlösung bei geringen Partikelmengen (d. h. < 0,5 g/ml) nicht voll in das Partikelbett eingetaucht war. Diese Schicht der Polymerlösung resultierte nach der Phasenumkehr in einer membranartigen Struktur ähnlich derjenigen, die zu beobachten ist, wenn keine Partikel verwendet werden. Größere Partikeldichten in der Lösung (d. h. 2,0 g/ml) infiltrierten die Polymerlösung vollständig, so daß das resultierende Stützgerüst eine Verteilung von Makroporen ohne diese membranartige Struktur enthielt.
Die Größe der Makroporen war direkt proportional zur Größe der verwendeten Partikel; beispielsweise betrug die Makroporengröße ≈ 0,33 mm, wenn Partikel < 0,35 mm verwendet wurden (vgl. 7A), und ≈ 0,75 mm bei Verwendung von Partikeln im Bereich von 0,54 bis 0,8 mm (vgl. 7B). Bei Partikeln schließlich, die größer waren als 0,8 mm, hatten die beobachteten Makroporen Abmessungen von ≈ 1,4 mm (vgl. 7C). Wenn der Polymer-DMSO-Lösung keine Partikel beigemischt wurden, ergab sich als resultierende Polymerstruktur ein Hohlzylinder aus einer dicken Haut, die Mikroporen enthielt, wie
8 zeigt. Diese Haut ähnelte stark der Membranstruktur, die aus einem normalen Phasenumkehrprozeß resultiert.
Beispiel 4 – Auswirkung der Verarbeitungstemperaturen auf die Struktur des polymeren Stützgerüsts
Die Auswirkungen dreier verschiedener Werte für T_mix (11°C, –20°C und –80°C) bei konstantem T_nonsolvent (0°C) wurden untersucht. Es ergaben sich zwei verschiedene Hauptstrukturen des Stützgerüsts, nämlich 1) mit T_mix = 11 °C und 2) mit T_mix = –20°C und T_mix = –80°C. Stützgerüste, die mit mit T_mix = 11 °C und T_nonsolvent = 0°C hergestellt wurden, wiesen keine Haut auf und hatten eine sehr offene Struktur. Wie 9A zeigt, schienen die Makroporengrößen erweitert zu sein und wurden durch REM auf ≈ 2,72 mm geschätzt. Die Porenwände wiesen weniger Mikroporen, aber mehr makroporige Verbindungen auf, was den Stützgerüsten allgemein eine offenere Struktur verleiht. Die mit T_mix = –20°C und –80°C hergestellten Stützgerüste wiesen beide eine Hautstruktur auf. Für T_mix = –20°C erschienen die Makroporen kleiner als bei Stützgerüsten, die höheren T_mix-Werten hergestellt worden waren; ihre Größe wurde durch REM zu ≈ 1,8 mm abgeschätzt. Die Porenwände waren lamellär und hatten weniger makroporige Verbindungen, jedoch mehr mikroporige Verbindungen (vgl. 9B). Es wurde beobachtet, dass die Makroporengröße mit niedrigeren T_mix-Werten zurückging. Die Unterschiede bei den Makroporengrößen waren besonders groß zwischen Stützgerüsten, die mit T_mix = 11 °C und –20°C hergestellt worden waren, während zwischen Stützgerüsten, die mit T_mix = –20°C und –80°C hergestellt worden waren, geringere Unterschiede bei den Mikroporengrößen beobachtet wurden. Während die Makroporengrößen mit T_mix zurückgingen, änderte sich auch die Struktur der Porenwand in der oben beschriebenen Weise. Unterschiedliche T_mix Werte können die Polymer-Ausfällungsrate und somit die Komplexität der Porenwandstruktur beeinflußt haben.
Unterschiedliche Werte für T_nonsolvent (40°C, 20°C und 0°C) wurden ebenfalls untersucht, und zwar bei einer konstanten Temperatur T_mix von –20°C. In diesem Fall lag der Hauptunterschied zwischen allen Stützgerüsten in ihrer Porenwanddicke. Niedrigere Werte für T_nonsolvent verursachten dickere und komplexere Porenwände, während höhere Werte für T_nonsolvent zu dünnen und kompakten Porenwänden führten, vergleichbar mit den polymeren Streben, durch die die einzelnen Makroporen festgelegt sind. Die 9B und 9C zeigen die verschiedenen Morphologien der Stützgerüststrukturen bei T_nonsolvent = 0°C beziehungsweise 40°C. Die meisten strukturellen Unterschiede ergaben sich zwischen Stützgerüsten, die bei T_nonsolvent = 0°C und T_nonsolvent = 20°C hergestellt worden waren. Geringere Unterschiede waren zwischen Stützgerüsten zu erkennen die bei T_nonsolvent = 20°C oder 40°C hergestellt worden waren. Während niedrigere Werte für T_nonsolvent (0°C) zu lamellären Porenwänden führten (vgl. 9B), führten höhere Werte für T_nonsolvent (40°C) zu strebenartigen Porenwand-Morphologien (vgl. 9C).
Die Dicke der Porenwände von Stützgerüsten, die bei unterschiedlichen Werten für T_nonsolvent hergestellt worden waren, wurde durch REM abgeschätzt. Bei T_nonsolvent = 0°C ergab sich für die Porenwände ein geschätzter Wert von 0,29 mm, während bei T_nonsolvent = 20°C die Größe der Porenwände ≈ 0,10 mm betrug; zwischen T_nonsolvent = 20°C und 40°C konnten keine signifikanten Unterschiede gemessen werden. Alle bei den verschiedenen obengenannten Temperaturen hergestellten Stützgerüste wurden seziert, und die Porengröße sowie die Porenwanddicke wurden gemessen. Ihre Porigkeit wurde außerdem mit Hilfe der Bildanalysesoftware Northern Eclipse abgeschätzt. Dabei ergaben sich folgende Ergebnisse:
Beispiel 5 – Modifikation der Oberfläche des polymeren Stützgerüsts
Die hergestellten Stützgerüste, die in Beispiel 1 beschrieben werden, wurden weiterhin durch eine Säure-Basen-Behandlung, Aufbringen von Kollagen und Aufbringen von Kalziumphosphat oberflächenmodifiziert. Die Verfahren und Ergebnisse werden nachstehend beschrieben.
Es wurde eine Säure-Basen-Behandlung zum Erhöhen der Oberflächenladung und zum Verändern der Oberflächentopographie entwickelt. Die Stützgerüste wurden für 24 Stunden in Essigsäure unterschiedlicher Konzentrationen (0,1 M, 1 M, 5M) aufbewahrt. Stützgerüste wuren außerdem für 24 Stunden in NaOH unterschiedlicher Konzentrationen aufbewahrt, um die Oberflächen-Polymerverkettungshydrolyse zu beobachten. Unter dem REM zeigten die für 24 Stunden mit 5M-Essigsäure oder NaOH behandelten Stützgerüst Veränderungen der Oberflächentopographie unter Auftreten von Nanoporen.
Es wurde ein Experiment zum Aufbringen von Kollagen entwickelt, um die Zelladhäsion auf den Polymeroberflächen zu erhöhen. Die Stützgerüste wurden für eine Stunde sowie von zwei, fünf, acht und 24 Stunden in 0,1% Kollagen aufbewahrt.
Es wurde ein Experiment zum Aufbringen von Kalziumphosphat erprobt, um die Zelladhäsion auf den Oberflächen der Stützgerüste zu erhöhen. Diese wurden für eine Woche bei 37°C in dem (in Beispiel 6 beschriebenen) voll supplementierten Medium aufbewahrt. Die Kalziumphosphatkristalle an der Oberfläche der Stützgerüste wurden durch Von Kossa-Färbung sichtbar gemacht.
Es wurden weitere Experimente zum Aufgingen von Kalziumphosphat durchgeführt, bei denen die Stützgerüste für zwei Stunden bei Zimmertemperatur in 1,5 mM Na₂HPO₄ eingetaucht und anschließend über Nacht in einer gesättigten Ca²⁺-Lösung in den Gleichgewichtszustand gebracht wurden. Im Anschluß daran wurden die Stützgerüste unter dem REM beobachtet, wobei auf der Stützgerüststruktur Kristalle mit blattförmigen Morphologien zu erkennen waren (vgl. 10).
Beispiel 6 – Aus Knochenmark gewonnene Zellkultur auf polymeren Stützgerüsten
Es wurden polymere PLGA-75 : 25-Stützgerüste wie bereits beschrieben präpariert: 2 g/ml Glucosekristalle wurden in einer PLGA-75 : 25-Lösung von 0,1 g/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO, BDH, Toronto, ON) dispergiert. Die fest-flüssige Polymerdispersion wurde auf 11 °C abgekühlt. Anschließend wurde das Polymer ausgefällt, und die Glucosekristalle wurden aus dem ausgefällten Polymer in ddH₂O bei 40°C extrahiert. Die Stützgerüste wurden auf eine konstante Masse (10 μg Hg, 72 Std.) getrocknet, für eine halbe Stunde in 70% EtOH desinfiziert, dreimal mit α-MEM gespült und für sechs Tage bei 37°C in sterilem α-MEM in den Gleichgewichtszustand gebracht.
Erstdurchlauf-Primärzellen aus Knochenmark wurden zum Impfen von 0,25-cm³-Stützgerüsten verwendet, wobei Protokolle und Medien verwendet wurden, die anderweitig ausführlich beschrieben werden (von Maniatopoulos et al., supra, und Davies et al. in Cells and Materials, 1 : 3–15, 1991). Kurz beschrieben, wurden aus Knochenmark gewonnene Zellen sowohl aus den Femora von jungen erwachsenen Wistar-Ratten entnommen (ungefähr 150 g) und in ein voll supplementiertes Medium (FSM) gegeben: α-MEM, supplementiert mit 15% fetalem bovinem Serum, 50 mg/mL Ascorbinsäure, 10 mM β-Glycerophosphat und Antibiotika (0,1 mg/mL Penicillin G, 0,05 mg/mL Gentamicin und 0,3 mg/mL Fungizone); 10^–8 M Dexamethason (Dex) wurde dem FSM aus reinen Dex+-Kulturen hinzugefügt.
Die Zellen wurden für sechs Tage kultiviert und an den Tagen 2 und 5 erneut mit FSM-Nährstoffen versorgt. Die Dex(-)-Zellen wurden mit 0,01% Trypsin in BPS trypsinisiert, während die Dex+-Kulturen, in denen Anzeichen einer Kalzifikation sichtbar waren, mit 0,01% Trypsin und 10 μM Ethylendiamintetraessigsäure (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA) in BPS trypsinisiert wurden. Anschließend wurden separate vorbenetzte Stützgerüste mit Dex+- und Dex(-)-Zellen bei einer Konzentration von 7,5 × 10⁵ Zellen/Stützgerüst geimpft. Die Kulturen wurden für 42 Tage bei 37°C und 5% CO₂ aufbawahrt und zwei bis drei Tage erneut mit FSM versorgt. Bei jeder erneuten Versorgung mit FSM wurde Dex dem FSM der Dex+-Kulturen mit einer Konzentration von 10^–8 M hinzugefügt.
Tetracyclin-HCl-Pulver (Sigma, St. Louis, MO) wurde in einem α-MEM gelöst, um eine Lagerungslösung von 90 mg/mL herzustellen. Ein neues tetracyclinhaltiges voll supplementiertes Medium (TFSM) wurde aus α-MEM präpariert, das 15% fetales bovines Serum, 50 mg/mL Ascorbinsäure, 10 mM β-Glycerophosphat und 9 mg/ml Tetracyclin enthielt. Das TFSM wurde für den letzten Nachversorgungstag (Tag 40) verwendet. Am Tag 42 wurden die Kulturen in α-MEM gewaschen (dreimal, jeweils für ca. drei Minuten) und über Ncht in Karnovsky-Fixativ (2,0% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaldehyd und 0,1 M Natrium-Kakodylatpuffer, pH 7,2 bis 7,4) fixiert. Einige Kulturen wurden zu REM-Untersuchungen zurückbehalten, in einer Serie von abgestuften Alkohollösungen (70%, 100%) dehydriert und für zwei Tage bei 0,01 mmHg gefriergetrocknet. Alle anderen Kulturen wurden zu histologischen oder Konfokaluntersuchungen in 0,1 M Kakodylatpuffer aufbewahrt.
Konfokaluntersuchungen wurden wie folgt durchgeführt: Es wurden Proben in 0,1 M Kakodylatpuffer (Hersteller: BDH) in kundenspezifisch hergestellte Kammern eingebracht. Die Kammern wurden mit einem Glasüberzug hermetisch dicht verschlossen. Fluoreszenzsignale wurden durch optische Sektion in einem Konfokal-Lasermikroskop vom Typ Bio-Rad MRC-600 unter Verwendung des BHS-Filters detektiert. Stützgerüste, die mit Dex+-Zellen geimpft waren, zeigten eine Fluoreszenzmarke bis zu einer Tiefe von ungefähr 1 mm, wie in 11 gezeigt. In größerer Tiefe der Stützgerüste konnten Fluoreszenzeffekte nicht beobachtet werden, weil die Feldtiefe des Konfokalmikroskops nicht groß genug war. Die Stützgerüste wurden deshalb auf eine Dicke von ungefähr 2 mm seziert und von beiden Seiten durch Konfokalmikroskopie analysiert. Dabei wurde Fluoreszenz im gesamten Stützgerüst beobachtet. Die Fluoreszenzmarke wurde auch bei Sektionen von Stützgerüsten beobachtet, die mit Dex(+)-Zellen geimpft worden waren (siehe 12). Querschnitte von polymeren Stützgerüsten, die mit Dex(+)- und Dex(-)-Zellen geimpft worden waren, wurden unter ultraviolettem Licht beobachtet. Ein helles Fluoreszenzsignal war nur bei den Dex(+)-Sektionen im gesamten Stützgerüst zu sehen. Speziell wurde die mit dem Fluoreszenzsignal beobachtete gebildete Knochenmatrix durch die gesamte Tiefe eines in der Kultur verwendeten polymeren 0,5-cm-Stützgerüsts sichtbar gemacht. Der begrenzende Faktor in dieser Analyse war die Tiefe des polymeren Stützgerüsts; somit würde die Vergößerung der Tiefe des polymeren Stützgerüsts die Tiefe vergrößern, bis zu welcher eine Zelldurchdringung und damit die Knochenmatrixbildung in diesem polymeren Stützgerüst zu erreichen wäre.
Es wurden außerdem Stützgerüste mit Antikörper-Markierungen für Osteocalcm versehen. Die Osteocalcinexpression sowohl in Dex(+)- als auch Dex(-)-Kulturen wurde unter Anwendung immunohistochemischer Verfahren untersucht, wobei ein Goat-Anti-Rat Osteocalcin-Antiserum (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) in einer endgültigen Verdünnung von 1 : 6000 verwendet wurde. Die Analyse wurde durch ein zweites Antikörper-Labeling abgeschlossen, das mit Donkey-Anti-Goat-IgG, konjugiert zu Meerrettich-Peroxidase-Antiserum, bei einer Konzentration von 1: 250 durchgeführt wurde. Ein 3,3-Diaminobenzidin-(DAB-) Substratsatz für Peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, CA) wurde unter Einbeziehung von Nickelchlorid zur Entwicklung der Färbung verwendet. 13 zeigt ein mit Antikörper-Markierungen für Osteocalcin versehenes Stützgerüst, das mit Dex(+)-Zellen geimpft wurde und für sechs Wochen kultiviert wurde. Histologische Schnitte der Stützgerüste wurden wie folgt hergestellt: Es wurden Proben in Tissue Tek eingebettet und vertikal auf eine Dicke von 6 mm seziert. Das Zellwachstum innerhalb der Stützgerüste wurde ebenfalls an den histologischen Schnitten beobachtet. Bei geringer Vergrößerung konnte der gesamte Schnitt des Stützgerüsts durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Sowohl in Dex(+)- als auch Dex(-)-Kulturen wurde durch die gesamte Stützgerüststruktur hindurch eine Bedeckung mit Zellen festgestellt. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung war an allen Makroporen entlang, auf den Außenflächen und in der Mitte der Stützgerüste sichtbar. Die 14 und 15 zeigen mit Dex(+)- und Dex(-)-Kulturen besetzte Schaumstrukturen bei geringer Vergrößerung. Die Menge der auf Dex(-)-Kulturen gebildeten Matrix war gegenüber derjenigen auf Dex(+)-Kulturen weitaus größer, wie bei hoher Vergrößerung zu sehen ist. In Dex(+)-Kulturen wurden nur wenige Zellschichten gefunden, die an den Porenwänden angelagert sind und in enger Apposition mit den Porenwänden Matrix bilden, während in Dex(-)-Kulturen die gesamten Makroporen-Volumina mit Matrix gefüllt sind.
Beispiel 7 – Impfen von polymeren Stützgerüsten mit menschlichen Knochenmarkzellen
Es wurden PLGA-7525-Matrizen der in Beispiel 1 beschrieben An präpariert. Diese Stützgerüste wurden 30 Minuten vor dem Impfen mit menschlichen Knochenmarkzellen, die von jungen Spendern stammten in 70% Ethanol desinfiziert, wobei die Protokolle und dexamethasonhaltige (dex-haltige) Medien verwendet wurden, die von Parker et al. (J. of Bone Min. Res., 12(1), S300 : F298, 1997) ausführlich beschrieben werden.
Beispiel 8 – Auswirkung der Makroporengröße und Vernetzung die Zellinvasion
Es wurden drei verschiedene Stützgerüst-Morphologien erzeugt: 1) Stützgerüste, die ausschließlich durch Particulate Leaching hergestellt wurden, die als membranartige Stützgerüste bezeichnet werden, Bestandteil des bisherigen Standes der Technik sind und in den nachstehend kurz diskutierten 16A, 16B und 16C dargestellt sind, 2) Stützgerüste, die durch Particulate Leaching und Phasenumkehr bei niedrigen Verarbeitungstemperaturen gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt wurden und als intermediäre Stützgerüste bezeichnet werden und 3) Stützgerüste, die durch Particulate Leaching und Phasenumkehr bei höheren Verarbeitungstemperaturen gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 hergestellt wurden und als knochenartige Stützgerüste bezeichnet werden. Auf jedem dieser drei grundlegenden Verarbeitungswegen wurden die drei Stützgerüststrukturen mit unterschiedlichen Makroporengrößen erzeugt, so daß sich insgesamt neun verschiedene Stützgerüststrukturen ergaben. Diese neun Stützgerüststrukturen sind in den 16A bis 16I dargestellt.
Membranartige Stützgerüste wurden ausschließlich durch Anwendung einer Particulate-Leaching-Technologie hergestellt (beschrieben von Mikos et al in Biomaterials 14, 323–330, 1993; siehe hierzu den bisherigen Stand der Technik in den 16A, 16B und 16C). Kurz angesprochen werden soll eine PLGA-75 : 25-Lösung (Birmingham Polymers) in Chloroform, die über gesiebte Partikel verteilt wurde, und zwar entweder 1) NaCl (Größe < 0,35 mm), 2) Sucrosekristalle (mit einer Größe im Bereich von 0,54 bis 0,8 mm) oder 3) Glucosekristalle (mit einer Größe im Bereich von 0,8 bis 2,0 mm). Die Polymerstrukturen wurden auf Zimmertemperatur gehalten, um das Verdampfen des Chloroforms zu ermöglichen, und anschließend wurden die Partikel in ddH₂O aufgelöst.
Intermediäre und knochenartige Stützgerüste wurden gemäß den Beschreibungen in den Beispielen 1 und 4 indem dieselben verschiedenen Partikel, die weiter oben beschrieben werden, aus dem ausgefällten Polymer extrahiert wurden. Intermediäre Stützgerüste wurden bei einer Polymerlösungstemperatur von –20°C und mit einer auf Zimmertemperatur befindlichen Nichtlösung hergestellt, während knochenartige Stützgerüste bei einer Polymerlösungstemperatur von 11°C und mit einer auf Zimmertemperatur befindlichen Nichtlösung hergestellt wurden. Die so entstandenen Stützgerüste wurden 30 Minuten vor dem Impfen mit Zellen in 70% Ethanol desinfiziert.
Die Zellkolonisation der Stützgerüste wurde durch Konfokalmikroskopie bestätigt, ind die Zelldifferenzierung über die Stützgerüststruktur hinweg wurde durch die in Beispiel 6 beschriebene Analyse mit der Antikörper-Markierung für bestätigt. Es wurden folgende Ergebnisse beobachtet:
Tabelle 2: Stützgerüstgrößen und Zellkolonisationsmuster
Die in der Tabelle angegebene Zellkolonisation der Stützgerüste erforderte eine minimale Verbindungsgröße von 0,35 mm und Makroporengröße von 0,7 mm.
In diesem Beispiel wurden membranartige Stützgerüste mit einer Makroporengröße von 1,1 mm nicht von Zellen kolonisiert, während knochenartige Stützgerüste mit Makroporengrößen von 0,7 mm vollständig von Zellen kolonisiert wurden. Daraus ist zu schließen, daß dieses Beispiel zeigt, daß Stützgerüste, die nach der Particulate-Leaching- und Phasenumkehrtechnik hergestellt wurden, eine Zellkolonisation durch die gesamte Stützgerüst-Morphologie ermöglichten, während zuvor veröffentlichte Stützgerüste nur innerhalb ihrer oberflächlichen Porenschicht von Zellen kolonisiert wurden.
Die vorangegangene Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sollte zur Veranschaulichung der Prinzipien der Erfindung dienen und ist nicht als Einschränkung der Erfindung auf die hier dargestellte Ausführungsform zu verstehen. Es sei darauf hingewiesen, daß der Geltungsbereich der Erfindung durch alle in den nachstehenden Patentansprüchen eingeschlossenen Ausführungsformen definiert ist.

Claims

Makroporiges polymeres Stützgerüst, umfassend polymere Streben, die Makroporen definieren, welche durch makroporige Kanäle miteinander verbunden sind, die mikroporige Kanäle enthalten, die sich durch die polymeren Streben erstrecken, so daß die Makroporen auf jeder Seite einer vorgegebenen Strebe durch die vorgegebene polymere Strebe in Verbindung sind, wobei die Makroporen einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 0,5 mm bis ungefähr 3,5 mm aufweisen, wobei die makroporigen Kanäle, die die Makroporen verbinden, einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 200 μm bis ungefähr 2 mm aufweisen, und wobei die mikroporigen Kanäle einen durchschnittlichen Durchmesser kleiner als ungefähr 200 μm aufweisen, und wobei das makroporige polymere Stützgerüst eine Porigkeit von mindestens 50% aufweist.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 1, wobei die polymeren Streben, die die Makroporen trennen, eine Dicke kleiner als 0,4 mm aufweisen.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 1 oder 2, welches bioverträglich ist.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches biodegradierbar ist.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 3, wobei das Polymer Poly(Lactid-Coglycolid) ist.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 5, wobei das Polymer Poly(Lactid-Coglycolid) in einem Verhältnis von 75% Lactid und 25% Glycolid umfaßt.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, das eine Porigkeit von mindestens 85% aufweist.
Polymeres Stützgerüst nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei die polymeren Streben, die die Makroporen trennen, eine Dicke kleiner als 0,4 mm aufweisen, und wobei das Polymer bioverträglich und biodegradierbar ist, und eine Porigkeit von mindestens 85% aufweist.
Verfahren zum Synthetisieren eines makroporigen polymeren Stützgerüsts, umfassend die Schritte: Mischen des flüssigen Polymers mit Partikeln, um ein Gemisch des flüssigen Polymers und der Partikel zu bilden; Stabilisieren des Gemisches; Eintauchen des Gemisches in ein Nichtlösemittel für das flüssige Polymer, um das flüssige Polymer auszufällen, indem ein verfestigtes Gemisch hergestellt wird; und Eintauchen des verfestigten Gemisches in ein Lösemittel, das die Partikel für eine Zeit löst, die ausreichend ist, um die Partikel zu lösen, um das makroporige polymere Stützgerüst zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das flüssige Polymer durch Lösen eines Polymers in einem polymeren Lösemittel gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das polymere Lösemittel Dimethylsulfoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei die Partikel einen Durchmesser in dem Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 mm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser in dem Bereich von ungefähr 1,0 bis ungefähr 2,0 mm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11, 12 oder 13, wobei die Partikel aus der Gruppe ausgewählt werden, die Polysaccharide, organische Salze, anorganische Salze, Proteine, Lipide und deren Kombinationen enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Polysaccharid Glucose ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Partikel Zuckerpartikel sind.
Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16, zusätzlich den Schritt des Modifizierens der Oberfläche des polymeren Stützgerüsts umfassend.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Oberfläche des polymeren Stützgerüsts unter Verwendung einer Behandlung modifiziert wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die die Säurebehandlung, die Basenbehandlung, die Kollagenabscheidung und die Calciumphosphatabscheidung enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das flüssige Polymer durch Erwärmen eines Polymers bis auf seinen Schmelzpunkt gebildet wird, um das Polymer zu verflüssigen.
Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18, wobei das Nichtlösemittel für das Polymer aus der Gruppe ausgewählt wird, die Wasser, Alkohol, 1-4-Dioxan und Anilin enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das flüssige Polymer aus Poly(Lactid-Coglycolid) gewonnen wird.
Makroporiges polymeres Stützgerüst mit mikroporigen polymeren Streben, die Makroporen definieren, die miteinander durch makroporige Kanäle verbunden sind, die durch Mischen des flüssigen Polymers mit Partikeln gebildet werden, um ein Gemisch des flüssigen Polymers und der Partikel zu bilden, indem das Gemisch in ein Nichtlösemittel für das flüssige Polymer eingetaucht wird, um das flüssige Polymer auszufällen, um ein verfestigtes Gemisch herzustellen, und indem das verfestigte Gemisch in ein Lösemittel eingetaucht wird, das die Partikel für eine Zeit löst, die ausreichend ist, um die Partikel zu lösen, um das makroporige polymere Stützgerüst mit mikroporigen polymeren Streben zu erhalten, die die Makroporen definieren, die miteinander durch die makroporigen Kanäle verbunden sind, wobei die Makroporen einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 mm aufweisen, wobei die makroporigen Kanäle, die die Makroporen miteinander verbinden, einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 200 μm bis ungefähr 2 mm aufweisen, wobei die mikroporigen polymeren Streben mikroporige Kanäle enthalten, die sich durch die Streben erstrecken, die einen durchschnittlichen Durchmesser größer als ungefähr 50 μm und kleiner als ungefähr 200 μm aufweisen, und wobei das makroporige polymere Stützgerüst eine Porigkeit von mindestens 50% aufweist.
Verfahren zum Wachsen von Gewebe mit durchdringender Verteilung in einem dreidimensionalen makroporigen polymeren Stützgerüst mit einer strangförmigen Morphologie bis in eine Tiefe von mindestens dem 2,5-fachen der mittleren Makroporengröße in dem Stützgerüst, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines makroporigen polymeren Stützgerüsts, umfassend polymere Streben, die Makroporen definieren, welche miteinander durch makroporige Kanäle verbunden sind, die mikroporige Kanäle enthalten, die sich durch die polymeren Streben erstrecken, so daß die Makroporen auf jeder Seite einer vorgegebenen polymeren Strebe durch die vorgegebene polymere Strebe in Verbindung sind, wobei die Makroporen einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 mm aufweisen, wobei die makroporigen Kanäle, die die Makroporen verbinden, einen durchschnittlichen Durchmesser in einem Bereich von ungefähr 200 μm bis ungefähr 2 mm aufweisen, und wobei die mikroporigen Kanäle einen durchschnittlichen Durchmesser kleiner als ungefähr 200 μm aufweisen, und wobei das makroporige polymere Stützgerüst eine Porigkeit von mindestens 50% aufweist; Impfen des polymeren Stützgerüsts mit Gewebezellen; und Kultivieren der Gewebezellen.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das makroporige polymere Stützgerüst bioverträglich ist und eine Porigkeit von mindestens 85% aufweist.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, zusätzlich den Schritt des Modifizierens der Oberfläche des polymeren Stützgerüsts vor dem Impfen des polymeren Stützgerüsts umfassend.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Oberfläche des polymeren Stützgerüsts unter Verwendung einer Behandlung modifiziert wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die die Säurebehandlung, die Basenbehandlung, die Kollagenabscheidung und die Calciumphosphatabscheidung enthält.
Verfahren nach Anspruch 23, 24, 25 oder 26, wobei die Gewebezellen knochenähnliche Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Gewebezellen die Knochenmatrix entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Gewebezellen menschlichen Ursprungs sind.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Gewebezellen aus der Gruppe ausgewählt werden, die Paradontalgewebezellen, Knorpelgewebezellen, Dentalgewebezellen, Lebergewebezellen und Brustgewebezellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, wobei die Zellen für "im Leben"-Anwendungen ("in vitro") oder "im Glas"-Anwendungen ("in vivo") aufrechterhalten werden.