ES2378822T3 - Carne de ingeniería tisular para el consumo y método para producir carne de ingeniería tisular para el consumo - Google Patents

Carne de ingeniería tisular para el consumo y método para producir carne de ingeniería tisular para el consumo Download PDF

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Abstract

Un método para producir un producto cárnico no humano para el consumo que comprende las etapas: cultivar conjuntamente células musculares no humanas y adipocitos no humanos ex vivo; después sembrar las células musculares no humanas y los adipocitos no humanos en una estructura de soporte; y hacer crecer las células musculares no humanas y adipocitos no humanos para producir un producto cárnico no humano.

Description

Carne de ingenieria tisular para el consumo y metodo para producir carne de ingenieria tisular para el consumo.
CAMPO DE LA INVENCION
El campo de la presente invenci6n se refiere a la producci6n y cultivo de productos carnicos para el consumo. En 5 particular, se refiere a carne de ingenieria tisular para el consumo
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los productos carnicos como carne de vacuno, cerdo, cordero, aves o pescado son productos deseables para el consumo alimenticio. Los productos carnicos se producen actualmente a partir de animales enteros, que es un metodo de producci6n muy ineficaz porque una porci6n significativa de todo el cereal producido agricolamente se
10 utiliza para los animales en lugar de para consumo humano. En los Estados Unidos, por ejemplo, la alimentaci6n del ganado representa aproximadamente el 70% de todo el trigo, el maiz y otros cereales producidos. Ademas, para producir una libra de carne de vacuno, se requieren miles de libras de agua para que el animal beba y para cultivar el alimento para el ganado. Mientras tanto, en todo el mundo, segun algunos calculos, mas de 800 millones de personas estan desnutridas y 50.000 personas, mueren de hambre cada dia.
15 Los actuales metodos de producci6n de carne tambien son perjudiciales para el medio ambiente. Las selvas tropicales se agotan a un ritmo de aproximadamente 500 pies cuadrados de bosque tropical por cada libra de carne de vacuno producida. Del mismo modo, las tecnicas modernas de pesca marina se han vuelto tan eficaces que los oceanos y los lagos estan sobreexplotados. Las especies que alguna vez fueron comunes estan ahora en peligro de extinci6n o se han extinguido.
20 Los actuales esfuerzos cientificos para hacer frente a estos problemas se han centrado en aumentar la eficacia de la cria o producci6n de ganado. Por ejemplo, se han utilizado hormonas de crecimiento para hacer crecer el ganado mas rapido y de este modo, consumir menos cereales y agua. Las hormonas de crecimiento tipicamente se inyectan en el ganado, pero tambien se han desarrollado nuevos metodos de introducci6n de la hormona de crecimiento utilizando tecnologias de ingenieria genetica, tales como transgenicos o la clonaci6n de animales completos. Los
25 actuales metodos de producci6n de carne, sin embargo, requieren agua, cereal, y tierra para criar el ganado.
Otro problema de los actuales metodos de producci6n de carne implica la contaminaci6n de los alimentos. Todos los anos, en promedio, cada americano enferma y 9.000 personas mueren a causa de algo que han ingerido. Para controlar la contaminaci6n de los alimentos, la estrategia actual del Gobierno es inspeccionar la carne durante el procesado. El USDA (Departamento de Agricultura de EE.UU) y la FDA (Administraci6n de drogas y alimentaci6n),
30 sin embargo, rara vez regulan las granjas donde se originan los pat6genos porque carecen de potestad reglamentaria sobre las granjas. Sin embargo, a excepci6n de E. coli 0156: H7, las bacterias peligrosas se consideran legalmente "inherentes" a la carne cruda. Sin embargo, dos de las "bacterias inherentes", - Campylobacter y Salmonella - representan el 80% de todas las enfermedades y el 75% de las muertes por consumo de carne y aves de corral.
35 En la industria avicola segun se informa, por ejemplo, se permite que hasta un 25% del pollo para asar y un 45% de la carne picada de pollo, den un resultado positivo para salmonela. El Centro para el Control de Enfermedades estima que Campylobacter infecta entre 70% y 90% de todos los pollos. Las infecciones por Campylobacter causan retortijones, diarrea con sangre y fiebre. Cada ano en los Estados Unidos, las infecciones por Campylobacter tienen como resultado aproximadamente 800 muertes. Las infecciones por Campylobacter tambien pueden conducir al
40 sindrome de Guillian-Barre, una enfermedad que requiere de cuidados intensivos durante varias semanas. La incidencia de enfermedades graves y muertes a causa de estas bacterias puede aumentar a medida que se desarrollan mas cepas resistentes a antibi6ticos. Esto ha hecho que algunos cientificos se cuestionen el uso continuo de antibi6ticos como suplemento alimenticio para el ganado.
Por lo tanto, existe una necesidad de producir productos carnicos para el consumo que sean mas eficaces, mas 45 seguros y mas sanos que los metodos actuales de producci6n.
COMPENDIO DE LA INVENCION
La presente invenci6n esta dirigida a productos carnicos no humanos de ingenieria tisular y metodos para producir tales productos carnicos no humanos. La invenci6n proporciona un metodo para producir un producto carnico no humano para el consumo como se establece en las reivindicaciones de la 1 a 14. En una realizaci6n preferida de la
50 invenci6n, el producto carnico esta sustancialmente libre de cualquier contaminaci6n microbiana o parasitaria perjudicial. Otra realizaci6n de la invenci6n esta dirigida a un producto carnico no humano como se establece en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22.
DESCRIPCION GENERAL DE LA REALIZACION PREFERIDA
En general, los productos carnicos proceden de los musculos de los animales.Los carniceros realizan los cortes correspondientes de carne de vacuno, aves, cordero, pescado o carne de cerdo para su venta como filetes, pechugas de pollo, chuletas de cordero, filetes de pescado, chuletas de cerdo, etc Tambien se incluyen derivados de productos carnicos, tales como la carne picada que puede ser procesada en alb6ndigas, filetes rusos, alb6ndigas de pescado, salchichas, salami, mortadela, jam6n, etc. Los productos carnicos tambien pueden incluir tejidos musculares o carne que ha sido sazonada o secada, tales como la cecina.
Una realizaci6n de la presenteinvenci6n implica un metodo como se ha definido anteriormente para producir carne no humano para el consumo. El metodo puede incluir cultivar celulas madre de musculo in vitro y permitir que estas celulas se diferencien en tipos especificos de celulas musculares, tales como celulas del musculo esqueletico o celulas de musculo liso ex vivo. Las celulas musculares pueden derivar de cualquiera de los animales no humanos que consumen los seres humanos, como mamiferos (p. ej. bovinos, bufalos, cerdos, ovejas, ciervos, etc), aves (p. ej. pollo, patos, avestruces, pavos, faisanes, etc), peces (p. ej. pez espada, salm6n, atun, lubina, trucha, bagre, etc), invertebrados (p. ej., langosta, cangrejo, camar6n, almejas, ostras, mejillones, erizos de mar, etc), reptiles (p. ej. serpiente, cocodrilo, tortuga, etc), y anfibios (p. ej., ancas de rana). Preferiblemente, las celulas musculares derivan de celulas madre mesenquimales embrionarias pluriotentes que dan origen a celulas musculares, celulas de grasa, celulas de hueso y celulas del cartilago. Las celulas musculares tambien pueden derivar de celulas madre embrionarias totipotentes como las celulas de blastocisto, de huevos fecundados, de placenta o del cord6n umbilical de estos animales.
Las celulas musculares pueden crecer en un cultivo dentro de los tejidos musculares que estan unidos a una estructura de soporte tal como un armaz6n de dos o tres dimensiones o una estructura de soporte. Las celulas musculares pueden crecer en la estructura de soporte bidimensional, tal como una placa petri formando varias capas de celulas que pueden ser separadas y procesadas para el consumo. Otros ejemplos de estructuras de soporte bidimensionales pueden incluir membranas porosas que permitan la difusi6n de nutrientes de los medios de cultivo desde un lado de la membrana hacia el otro lado donde las celulas estan sujetas. En este tipo de condiciones de cultivo, se pueden lograr capas adicionales de celulas mediante la exposici6n de las celulas al medio de cultivo a ambos lados de la membrana, es decir, las celulas reciben nutrientes por difusi6n desde un lado de la membrana y tambien del medio de cultivo que rodean a las celulas que crecen en la membrana.
Las celulas musculares tambien pueden ser cultivadas sobre, alrededor, o dentro de una estructura de soporte tridimensional. La estructura de soporte se puede modelar en diferentes tamanos, configuraciones y formas, segun se desee, para proporcionar la configuraci6n y forma para que las celulas musculares crezcan y se asemejen a los diferentes tipos de tejidos musculares, tales como filete, lomo, pierna, pechuga de pollo, muslo, chuletas de cordero, filete de pescado, cola de langosta, etc. La estructura de soporte se puede hacer con biomateriales naturales o sinteticos, que sean preferiblemente no t6xicos por lo que no seran daninos si se ingieren. Los biomateriales naturales pueden incluir, por ejemplo, colageno, fibronectina, laminina, u otras matrices extracelulares. Los biomateriales sinteticos pueden incluir, por ejemplo, hidroxiapatita, alginato, acido poliglic6lico, acido polilactico, o sus copolimeros. La estructura de soporte puede estar formada como un soporte s6lido o semis6lido.
Para proporcionar el crecimiento celular y del tejido 6ptimo, la estructura de soporte, preferiblemente, tiene alta porosidad para proporcionar un area superficial maxima para la fijaci6n celular. Tambien se puede modelar una estructura de soporte tridimensional para incluir una red vascular ramificada en el interior de la masa del producto carnico que proporcione el suministro de nutrientes al interior y que traslade los metabolitos fuera de las celulas. En esta realizaci6n particular, la red vascular ramificada puede ser comestible utilizando biomateriales naturales o sinteticos no t6xicos como se ha mencionado anteriormente. Ademas, la estructura de soporte puede incluir tambien peptidos de adhesi6n, moleculas de adhesi6n celular, u otros factores de crecimiento asociados covalentemente o no covalentemente con la estructura de soporte. Ejemplos de los peptidos incluyen secuencias tales como Arg-Gly-Asp o Arg-Glu-Asp-Val. Niklason, L., et. al., Advances in Tissue Engineering of Blood Vessels and Other Tissues, Transplant Immunology, 5(4):303-306 (1997)
Por otro lado, las condiciones de cultivo para estas celulas musculares pueden incluir condiciones de flujo estatico, de agitaci6n, o dinamico. Para la producci6n a gran escala, el metodo preferido es en utilizar un biorreactor, que produzca un mayor volumen de las celulas y permita un mayor control sobre el flujo de nutrientes, gases, metabolitos y moleculas reguladoras. Ademas, los biorreactores pueden proporcionar senales fisicas y mecanicas tales como la compresi6n para estimular a que las celulas produzcan biomoleculas especificas. Vacanti, J., et. al., Tissue Enginneering: the Design and Fabrication of Living Replacement Devices for Surgical Reconstruction and Transplantation, Lancet. 354 Supl. 1, pSI32-34 (1999).
En otra realizaci6n de la invenci6n, tal y como se ha definido anteriormente los productos carnicos no humanos, derivados de las celulas musculares cultivadas ex vivo incluyen celulas grasas derivadas tambien de cualesquiera animales no humanos. La carne mas grasa suele ser mas sabrosa, pero con un mayor contenido de grasa aparece un mayor riesgo de efectos adversos para la salud tales como enfermedades cardiacas. Asi, la relaci6n de celulas musculares a celulas grasas se puede regular in vitro para producir los productos carnicos con un sabor 6ptimo y efectos saludables. La regulaci6n se puede lograr mediante el control de la proporci6n de celulas musculares y
grasas, que se siembra inicialmente en cultivo y / o variando, segun se desee, las concentraciones y la relaci6n de los factores de crecimiento o factores de diferenciaci6n que actuan sobre las celulas musculares o celulas grasas.
En otra realizaci6n de la invenci6n, el cartilago derivado de condrocitos puede formar primero una capa o estructura de soporte subyacente junto con la estructura de soporte. Despues, las celulas musculares y celulas de grasa, se siembran sobre la capa de condrocitos. La interacci6n de las celulas musculares y condrocitos puede ademas proporcionar las senales reguladoras necesarias requeridas para la formaci6n de tejido. Ejemplos de productos carnicos no humanos que tienen celulas musculares y celulas del cartilago incluyen pechuga de pollo o costillas de cerdo.
En una realizaci6n preferida de la invenci6n, se pueden utilizar tecnicas asepticas para cultivar las celulas musculares que dan como resultado productos carnicos no humanos que estan sustancialmente libres de microbios daninos, tales como bacterias, hongos, virus, priones, protozoos, o cualquier combinaci6n de los anteriores. Entre los microbios daninos se pueden incluir microorganismos pat6genos, tales como salmonella, campylobacter, E. coli 0156: H7, etc. Ademas, las celulas musculares que han crecido en el cultivo puede estar substancialmente libres de parasitos tales como las tenias que infectan los musculos de animales enteros y que se transmiten a los seres humanos a traves del consumo de carne insuficientemente cocida. Tambien se pueden emplear tecnicas asepticas en el empaquetado de los productos carnicos cuando salen de la linea de producci6n biol6gica.Tal garantia de calidad puede ser controlada por ensayos estandar para microorganismos o sustancias quimicas que son conocidos en la tecnica."Sustancialmente libre" significa que la concentraci6n de microbios o parasitos esta por debajo de un nivel clinicamente significativo de contaminaci6n, es decir, por debajo de un nivel en el que la ingesti6n daria lugar a enfermedades o estados adversos para la salud.
En otra realizaci6n preferida de la invenci6n, el producto carnico no humano derivado de celulas musculares que han crecido ex vivo puede estar expuesto a una corriente electrica u oscilante. A diferencia de los tejidos musculares derivados de animales enteros, puede que los tejidos musculares que han crecido ex vivo o in vitro nunca hayan sido ejercitados (p. ej. nunca se hayan utilizado para mover una pierna). De este modo, la exposici6n de las celulas del musculo, del tejido muscular, o de los productos carnicos no humanos in vitro a una corriente electrica u oscilante puede imitar el ejercicio y aumentar la similitud entre la textura de la carne que ha crecido ex vivo y la carne procedente de animales enteros. La corriente electrica u oscilante tambien puede aumentar la tasa de crecimiento de las celulas musculares ex vivo. La corriente electrica u oscilante se puede aplicar a las celulas madre de musculo o a las celulas musculares despues de que se han diferenciado de las celulas madre.
En otra realizaci6n de la invenci6n, otros nutrientes tales como vitaminas de las que normalmente carecen los productos carnicos de animales enteros se pueden anadir para aumentar el valor nutritivo de la carne. Esto se puede conseguir ya sea mediante la adici6n directa de los nutrientes al medio de crecimiento o mediante tecnicas de ingenieria genetica. Por ejemplo, el gen o genes responsables de las enzimas de la biosintesis de una vitamina particular, tal como vitamina D, A, o los diferentes complejos de vitamina B, pueden ser transfectados en las celulas musculares cultivadas para producir la vitamina particular.
En otra realizaci6n de la invenci6n, tambien se pueden introducir geneticamente factores de regulaci6n, factores de crecimiento, u otros productos genicos en las celulas musculares. Estos factores, conocidos como factores de regulaci6n miogenica ("MRF"), pueden estimular y regular el crecimiento de los musculos in vivo, pero normalmente no pueden ser producidos por las celulas musculares in vivo o in vitro. Asi, la expresi6n de factores reguladores miogenicos en las celulas musculares cultivadas puede aumentar la producci6n de celulas musculares in vitro.
En otra realizaci6n de la invenci6n, los productos carnicos no humanos derivados de celulas musculares in vitro pueden incluir diferentes derivados de productos carnicos no humanos. Estos derivados se pueden preparar, por ejemplo, moliendo o triturando los tejidos musculares que han crecido in vitro y mezclandolos con el aderezo apropiado para hacer alb6ndigas, alb6ndigas de pescado, filetes rusos, etc. Los derivados tambien se pueden preparar a partir de capas de celulas musculares cortadas y condimentadas, por ejemplo, cecina, jam6n, mortadela, salami, etc. Por lo tanto, los productos carnicos no humanos de la presente invenci6n se puede ser utilizar para generar cualquier tipo de producto alimenticio procedente de la carne de un animal.
Los siguientes ejemplos ilustran c6mo los expertos en la tecnica pueden hacer uso de la invenci6n actual para producir productos carnicos in vitro. Los metodos de biologia celular, cultivos celulares, e inmunohistoquimica que no se describen explicitamente en esta descripci6n ya han sido ampliamente descritos en la bibliografia cientifica.
EJEMPLOS
EJEMPLO�I
Este ejemplo ilustra el aislamiento de celulas madre mesenquimales pluripotentes para su uso en la producci6n de productos carnicos no humanos in vitro. Las celulas madre mesenquimales dan lugar a celulas musculares (miocitos), celulas grasas (adipocitos), celulas 6seas (osteocitos) y celulas de cartilago (condrocitos). Las celulas madre mesenquimales pueden ser diseccionadas y aisladas de los tejidos embrionarios de cualesquiera embriones
de animales no humanos. En el ganado vacuno, por ejemplo, los tejidos mesenquimales embrionarios que son ricos en celulas madre musculares pluripotentes se aislan preferentemente de los embriones entre los dias 30 y 40 o antes. Una vez diseccionados, los tejidos embrionarios pueden ser picados en trozos pequenos de aproximadamente un milimetro por un milimetro de tamano en una soluci6n salina amortiguada con fosfato ("PBS"), pH 7,45. Se pueden incubar de cinco a diez trozos del tejido picado en 300 1l de tripsina al 0,25% y EDTA al 0,1% en PBS durante treinta minutos a 37°C con agitaci6n suave. Posteriormente, los tejidos se pueden dejar sedimentar en el fondo del tubo por gravedad o centrifugaci6n suave. Entonces el sobrenadante que contiene la disoluci6n de tripsina/EDTA puede ser aspirado y reemplazado con 300 1l de colagenasa al 0,1% en PBS durante diez a treinta minutos a 37° C. La digesti6n con colagenasa se puede repetir durante varios ciclos, segun se desee. Dependiendo de la viscosidad de la disoluci6n debido al ADN liberado de las celulas danadas, se puede anadir a la soluci6n de colagenasa 40 1l de DNasa I en una proporci6n de 1 mg/ ml en PBS, entre los ciclos.
La reacci6n se puede detener anadiendo un medio como DMEM o Ham F-12, o ambos en una relaci6n 1:1, (Life Technologies, Rockville, Maryland) que se complementa con Hepes 10mM, L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich), 1020% de suero fetal de ternera inactivado por calor o suero bovino (Hyclone Laboratories, Logan, Utah), 100 unidades / ml de penicilina y 100 1g / ml de estreptomicina ("medio completo"). Las celulas se pueden disociar completamente pipeteando suavemente los tejidos hacia arriba y hacia abajo seguido por el lavado de las celulas en el medio completo una o dos veces utilizando una centrifuga. Despues las celulas se pueden depositar en una placa Petri de tamano apropiado que puede estar recubierta con biomateriales naturales (p. ej., colageno, fibronectina, laminina, u otras matrices extracelulares) o biomateriales sinteticos (p. ej., hidroxiapatita, alginato, acido poliglic6lico, acido polilactico, o sus copolimeros), o ambos, y se pueden hacer crecer a 37° C y equilibrarse con CO2 al 5%.
EJEMPLO�II
Despues de que las celulas madre mesenquimales han sido aisladas, se pueden enriquecer en el cultivo en mioblastos o celulas madre musculares. Inicialmente, las celulas se pueden depositar diferencialmente en placas Petri diferentes despues de la disociaci6n y lavado como se ha descrito en el Ejemplo I. Utilizando una placa Petri de 60 mm, las celulas pueden ser incubadas primero en un medio completo de dos a cuatro horas. Durante este tiempo, las celulas epiteliales tenderan a unirse rapidamente a la placa de Petri, mientras que los mioblastos permanecen en el sobrenadante. Entonces el sobrenadante puede ser recogido y los mioblastos pueden depositarse en una placa Petri diferente recubierta con biomateriales naturales o sinteticos tales como los mencionados en el Ejemplo I. Los mioblastos se pueden enriquecer complementando los medios de cultivo con factores de crecimiento como el factor de crecimiento del musculo esqueletico, prostaglandina F2a ("PGF2a), y el factor de crecimiento insulinico tipo 1 ("IGF-1").
Ademas, los mioblastos se pueden diferenciar en miocitos especificos o en celulas musculares mediante el cultivo de los mioblastos en un medio completo o en un medio minimo (p. ej., medio completo menos suero fetal de ternera) complementado con factores de crecimiento o diferenciaci6n especificos del musculo tales como PGF2a a concentraciones que van de 24 pg/ml a 28 pg/ml, e insulina desde 10-6 M a 10-5 M. Para imitar lo mejor posible a las celulas musculares in vivo, que normalmente estan inervadas por celulas neuronales, el medio de cultivo tambien se puede complementar con los neurotransmisores apropiados tales como acetilcolina.
EJEMPLO III
Alternativamente, los mioblastos pueden ser enriquecidos a partir de celulas madre embrionarias totipotentes. Las celulas totipotentes se pueden derivar de huevos de un animal fecundados in vitro, utilizando tecnicas de fecundaci6n in vitro, a partir de celulas madre presentes en cordones umbilicales o la placenta, o de celulas madre embrionarias (ES) aisladas a partir de celulas en fase de blastocisto. Las celulas ES, por ejemplo, pueden ser recogidas, disociadas suavemente con tripsina, y cultivadas in vitro con factor inhibidor de leucemia recombinante (Chemicon, San Diego, CA) y celulas alimentadoras tales como celulas embrionarias de fibroblastos con crecimiento detenido. Estas celulas totipotentes se pueden tratar con factores de crecimiento tales como PGF2a o IGF-1 para inducir a las celulas a diferenciarse en mioblastos.
EJEMPLO�IV
Utilizando la inmunohistoquimica estandar o las tecnicas de hibridaci6n in situ, se pueden identificar mioblastos o miocitos (celulas musculares diferenciadas). Brevemente, los mioblastos o miocitos que se han hecho crecer en cultivo pueden ser transferidos a portaobjetos de vidrio recubiertos con una matriz extracelular apropiada como se ha descrito anteriormente. Estas celulas se pueden hacer crecer hasta el numero y diferenciaci6n deseadas usando las condiciones descritas anteriormente. Despues de un crecimiento y periodo de diferenciaci6n suficiente, las celulas se pueden fijar con formaldehido al 4%. Si se van a usar marcadores intracelulares de anticuerpos o sondas nucle6tidicas, las membranas de las celulas se pueden permeabilizar con NP-40 o Triton-X al 1%. Se pueden utilizar anticuerpos contra marcadores especificos para mioblastos o miocitos, tales como miosina, titina, alfa-actinina disponibles en Sigma® para identificar las celulas utilizando tecnicas de inmunohistoquimica fluorescente estandar. Alternativamente, se puede utilizar para la hibridaci6n in situ ARN monocatenario o sondas de ADN para estos
marcadores.
Ademas, cuando las celulas musculares se han unido a una estructura de soporte tridimensional, como se describe a continuaci6n, pueden ser crio-congeladas, seccionadas e identificadas utilizando marcadores de anticuerpos tales como anticuerpos contra miosina, titina, 12101, troponina T, alfa actinina disponibles de Sigma®
EJEMPLOV
Se pueden modelar armazones o soportes de dos o tres dimensiones a partir de biomateriales naturales (p. ej. colageno, fibronectina, laminina, u otra matriz extracelular) o de biomateriales sinteticos (p. ej. hidroxiapatita, alginato, acido poliglic6lico, acido polilactico y sus copolimeros), o de ambos. Preferiblemente, los armazones tridimensionales se modelan con vias ramificadas para que los nutrientes y medios de cultivo lleguen a la masa interna de los tejidos musculares que se forman. Ejemplos de los materiales y metodos de construcci6n de estos armazones se describen en las patentes de EE.UU. N° 5.686.091, titulada "Biodegradable Foams For Cell Transplantation�� N° 5.863.984, titulada "Biostable Porous Material Comprising Composite Biopolymers"� N° 5.770.417, titulada "Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cells for Producing Vascularized Tissue in vivo"� y N° 5.916.265, titulada "Method of Producing a Biological Extracellular Matrix for Use as a Cell Seeding Scaffold and Implant�.
La estructura de soporte se modela preferentemente en diferentes tamanos, configuraciones y formas que permitan el crecimiento de tejidos musculares que se asemejen a los diferentes tipos de productos carnicos, tales como filetes, lomo, codillo, pechuga de pollo, pierna, chuletas de cordero, filetes de pescado, cola de langosta, etc .
EJEMPLO�VI
Los adipocitos, condrocitos, y osteoblastos pueden diferenciarse a partir de celulas madre mesenquimales pluripotentes o de celulas madre embrionarias totipotentes. Las celulas madre se pueden aislar tal y como se ha descrito en el Ejemplo I o III. Las celulas madre pueden cultivarse en DMEM, o en Ham-F12, o en ambos, en una relaci6n 1:1. El medio puede ser complementado con hormonas tiroideas, transferrina, insulina, asi como con otros factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento insulinico (IGF), el factor de crecimiento de fibroblastos basico, y la hormona del crecimiento.
En el caso de los adipocitos, la diferenciaci6n puede lograrse mediante el tratamiento de las celulas madre con proteinas morfogeneticas 6seas ("BMP") tales como BMP-4 y BMP-2, que son conocidas por que inducen la diferenciaci6n al linaje de adipocitos. Ahrens et. al. "Expresion of human bone morphogenetic proteins -2 o -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesechymal cell lineages,� DNA Cell Biol., 12:871-880 (1993)� �ang et al., "Bone Morphogenetic protein 2 causes commitment and differentiation in C3H10T1/2 and 3T3 cells� Gro�th Factors 9:57 (1993).
Ademas de con BMP, la diferenciaci6n de los adipocitos puede ser mejorada con el agonista del receptor gamma activado por los proliferadores de peroxisomas ("PPAR gamma"), tal como BRL 49653 (rosiglitazona). Sottile y Seu�en, "Bone morphogenetic protein-2 stimulates adipogenic differentiation of mesenchymal precursor cells in synergy �ith BRL 496539 (rosiglitzaone)�, FEBS Lett, 475 (3):201-204 (2000).
En ciertas situaciones, se puede incluso inducir la transdiferenciaci6n de los mioblastos en adipoblastos (precursores de los adipocitos) mediante tratamiento de las celulas de mioblastos o de las celulas musculares satelite con acidos grasos de cadena larga ("LCFA") o tiazolidinedionas, o con ambos. Grimaldi et al., "Transdifferentiation of myoblasts to adipoblasts: triggering effects of fatty acids and thiazolidinediones� Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 57 (l):71-75 (1997)� Teboul et.. al., "Thiazolidinediones and fatty acids convert myogenic cells into adipose-like cells�, J. Biol.. Chem.270 (47):28183 a 28187 (1995).
Por lo tanto, se pueden producir productos carnicos no humanos con la cantidad deseada de contenido en grasa, por siembra y cultivo conjunto de celulas musculares y adipocitos en una determinada proporci6n. Alternativamente, se puede dejar que las celulas madre se diferencien inicialmente en mioblastos y luego en otro momento, se puede anadir AGCL o tiadolidinedionas a diferentes concentraciones y con tiempos de exposici6n diferentes para transdiferenciar los mioblastos en adipocitos como se desea. Ademas, el crecimiento de las celulas musculares y celulas grasas se puede regular controlando la concentraci6n de los factores de crecimiento y de diferenciaci6n. Por ejemplo, si se desean menos celulas grasas en el producto carnico final, se pueden anadir concentraciones menores de los factores BMP al cultivo mientras que se puede anadir una concentraci6n mayor de PGF2a y/o insulina para promover el crecimiento de las celulas musculares.
EJEMPLO�VII
Los condrocitos o celulas de cartilago tambien se pueden aislar de la rodilla o costillas de una animal. Utilizando tecnicas similares a las descritas en el Ejemplo I, el tejido diseccionado de la rodilla o costillas se puede picar, digerir con colagenasa, y lavar con medio completo. Las celulas pueden entonces depositarse diferencialmente en placas
para aumentar la pureza de las celulas condrociticas.
Se sabe que los condrocitos se diferencian en respuesta al esfuerzo mecanico. Asi, preferiblemente, las celulas pueden ser sometidas a esfuerzo de flujo por cizalla como se describe en la Patente de EE.UU. N� 5.928.945, titulada "Application of Shear Flo� Stress to Chondrocytes or Chondrocyte Stem Cells to Produce Cartilage.
5 Inicialmente los condrocitos pueden formar una primera capa de celulas de soporte en un armaz6n tridimensional. Las celulas de mioblastos o de adipocitos, o de ambos, pueden entonces sembrarse sobre la capa de condrocitos y crecer hasta el tamano deseado. Como tal, la capa de condrocitos puede proporcionar una adherencia adicional o factores de crecimiento a las celulas musculares.
EJEMPLO�VIII
10 Las celulas musculares que han crecido in vitro difieren de las celulas musculares que han crecido in vivo en que las celulas in vivo se utilizan durante el ejercicio o los movimientos del cuerpo. Como los musculos se utilizan in vivo, las celulas musculares, de las extremidades, por ejemplo, se contraen y se relajan de acuerdo con el movimiento de las extremidades. Por lo tanto, para imitar lo mejor posible el crecimiento de las celulas musculares in vivo, las celulas que han crecido in vitro se pueden exponer a una corriente electrica u oscilante, o a impulsos de corriente electrica u
15 oscilante para contraer las celulas musculares. Se pueden sumergir sondas electricas en los medios de cultivo para distribuir una corriente suave. Alternativamente, la estructura de soporte puede estar recubierta con materiales conductores de electricidad. Ejemplos de materiales conductores de electricidad y un metodo para recubrir con ellos la estructura de soporte se describen en la Patente de EE.UU. N° 5.843.741, titulada "Method for Altering the Differentiation of Anchorage Dependent Cells on an Electrically Conducting Polymer,"
20 Los ejemplos anteriores ilustran los procedimientos para la producci6n de productos carnicos no humanos ex vivo. Se trata solamente de ejemplos y no se pretende limitar la invenci6n a estos ejemplos.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir un producto carnico no humano para el consumo que comprende las etapas: cultivar conjuntamente celulas musculares no humanas y adipocitos no humanos ex vivo� despues sembrar las celulas musculares no humanas y los adipocitos no humanos en una estructura de soporte� y
    5 hacer crecer las celulas musculares no humanas y adipocitos no humanos para producir un producto carnico no humano.
  2. 2.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, donde las celulas musculares no humanas derivan de celulas madre mesenquimales embrionarias pluripotentes no humanas o de celulas madre embrionarias totipotentes no humanas.
  3. 3.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, donde la etapa de crecimiento de las celulas musculares no humanas
    10 comprende hacer crecer celulas madre musculares no humanas y diferenciar las celulas madre musculares no humanas en diferentes tipos de celulas musculares no humanas.
  4. 4. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende ademas la etapa de exponer las celulas musculares no humanas y los adipocitos no humanos a una corriente electrica u oscilante, donde la exposici6n a la corriente electrica u oscilante produce en el producto carnico no humano una textura es mas similar a la carne
    15 natural.
  5. 5.
    Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende ademas la etapa de anadir nutrientes que se incorporan a los productos carnicos no humanos.
  6. 6.
    Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las celulas musculares no humanas se
    derivan de animales seleccionados del grupo que consiste en mamiferos, pajaros, peces, invertebrados, reptiles y 20 anfibios.
  7. 7. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el producto carnico no humano esta libre substancialmente de contaminaci6n microbiana danina.
  8. 8. Un metodo para producir carne no humana para el consumo que comprende las etapas de: cultivar celulas madre musculares no humanas ex vivo� 25 sembrar las celulas madre musculares no humanas en una estructura de soporte�
    tratar las celulas madre musculares no humanas con acidos grasos para trans diferenciar las celulas madre no humanas en adipocitos� y hacer crecer las celulas para producir un producto carnico no humano
  9. 9. Un metodo para producir productos carnicos no humanos para el consumo que comprende las etapas de: 30 cultivar celulas de cartilago no humanas ex vivo�
    sembrar las celulas de cartilago no humanas en una estructura de soporte�
    cultivar a) celulas musculares no humanas o b) ambas celulas musculares no humanas y adipocitos junto
    con celulas de cartilago no humanas sobre o alrededor de la estructura de soporte� y hacer crecer las celulas musculares no humanas o celulas musculares no humanas y adipocitos para 35 producir un producto carnico no humano.
  10. 10.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 9, donde las celulas de cartilago no humanas se exponen a un esfuerzo mecanico, preferiblemente a un esfuerzo de flujo por cizalla.
  11. 11.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, donde la estructura de soporte es
    (a) una estructura de soporte bidimensional� o 40 (b) una estructura de soporte tridimensional.
  12. 12.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, donde la estructura de soporte esta hecha de biomaterial natural o sintetico apto para el consumo.
  13. 13.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, donde la estructura de soporte tiene una capa de soporte cartilaginosa
    derivada de condrocitos.
  14. 14. Un producto carnico no humano para el consumo que comprende celulas musculares no humanas y una o mas celulas no humanas seleccionadas del grupo que consiste en adipocitos y celulas cartilaginosas que se han hecho crecer ex vivo.
    5 15. Un producto carnico no humano segun la reivindicaci6n 14 que comprende ademas una estructura de soporte, donde las celulas musculares no humanas y una o mas celulas no humanas se seleccionan del grupo que consiste en adipocitos y celulas de cartilago se adhieren a la estructura de soporte.
  15. 16. Un producto carnico no humano segun la reivindicaci6n 14 o la reivindicaci6n 15, donde las celulas musculares
    no humanas son celulas del musculo esqueletico, y/o donde las celulas musculares no humanas derivan de 10 animales seleccionados del grupo que consiste en mamiferos, aves, peces, invertebrados, reptiles y anfibios.
  16. 17.
    Un producto carnico no humano segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde el producto carnico no humano esta substancialmente libre de contaminaci6n con microbios daninos.
  17. 18.
    Un producto carnico no humano segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde las celulas musculares no humanas derivan de celulas pluripotentes o totipotentes.
    15 19. Un producto carnico no humano segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, donde las celulas musculares no humanas han sido expuestas a una corriente electrica, donde la exposici6n a dicha corriente da al producto carnico no humano una textura que le asemeja mas a la carne natural.
  18. 20. Un producto carnico no humano segun la reivindicaci6n 14 que comprende
    (i) adipocitos no humanos que se han hecho crecer ex vivo� donde opcionalmente los adipocitos no
    20 humanos estan (a) transdiferenciados a partir de mioblastos no humanos� o (b) derivadas de celulas madres no humanas pluripotentes o totipotentes.
  19. 21. Un producto carnico no humano segun la reivindicaci6n 14, que comprende celulas de cartilago no humanas que se han hecho crecer ex vivo� donde las celulas de cartilago no humanas (a) se colocan entre una estructura de soporte y las celulas musculares no humanas� y/o (b) han sido expuestas a un esfuerzo mecanico preferiblemente
    25 esfuerzo de flujo por cizalla.
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