JP2008513006A - 組織操作された食肉および組織操作された食肉の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組織操作された肉製品およびかかる肉製品の製造方法に関する。本発明の一の実施態様において、肉製品は生体外で増殖された筋細胞を含む。これらの筋細胞は、培養されて、次いで、支持構造に付着されてもよく、ならびに任意の非ヒト細胞に由来してもよい。本発明の好ましい一の実施態様において、肉製品は、任意の有害な微生物または寄生虫による汚染を実質的に含まない。本発明の別の実施態様は、筋細胞および筋細胞と一緒に生体外で増殖された他の細胞、例えば、脂肪細胞もしくは軟骨細胞またはその両方を含む肉製品に関する。本発明の別の実施態様において、肉製品は、電流または振動電流に曝された筋細胞を含む。
概して、肉製品は動物の筋肉から得られる。肉屋は、ステーキ、鶏胸肉、ラムチョップ、魚切り身、ポークチョップ等として販売するために牛肉、鶏肉、子羊肉、魚肉または豚肉の対応する部分を切り出す。肉製品は、ミートボール、ハンバーガー用パテ、フィッシュボール、ソーセージ、サラミ、ボローニャソーセージ、ハム等に加工され得るひき肉のごとき肉製品派生物も含む。肉製品は、ジャーキーのように風味付けられるかまたは乾燥された筋肉組織または肉を含んでもよい。
本実施例は、インビトロでの肉製品の生産において用いるための多能性間葉性幹細胞の単離を説明する。間葉性幹細胞は、筋細胞、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞を生じる。間葉性幹細胞は、ヒト以外の任意の動物の胚の胚組織から解離および単離されてもよい。例えば、ウシにおいて、好ましくは、多能性筋肉幹細胞に富む胚性間葉性組織は30〜40日齢以下で胚から単離される。一旦単離されると、胚組織は、リン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)pH7.45中、約1ミリメーター×1ミリメーターの大きさの小片に細分化されてもよい。5〜10片の細分化された組織を、300μlの、PBS中の0.25%のトリプシンおよび0.1%のEDTA中、穏やかに攪拌しながら、30分間37℃でインキュベーションする。その後、組織を、重力または穏やかな遠心分離によりチューブの底に沈殿させておいてもよい。次いで、トリプシン/EDTA溶液を含有する上清を吸引し、次いで、10〜30分間37℃で、300μlのPBS中の0.1%のコラゲナーゼと置換してもよい。所望により、コラゲナーゼ消化を数サイクル繰り返してもよい。損傷した細胞から放出されるDNAのために、溶液の粘度に応じて、各サイクルの間に40μlのDNase IをPBS中1mg/mlでコラゲナーゼ溶液に加えてもよい。
間葉性幹細胞を単離した後、それらを培養下で筋芽細胞または筋肉幹細胞について富化させてもよい。実施例Iに記載のように解離および洗浄した後、初めに、細胞を異なるペトリディッシュ上に別々にセットする。60mmのペトリディッシュを用いて、初めに、細胞を完全培地中で2〜4時間インキュベーションしてもよい。この時間内で、上皮細胞は直ぐにペトリディッシュに付着する傾向があるが、筋芽細胞は上清中にとどまったままである。次いで、上清を集め、次いで、筋芽細胞を、実施例Iに記載したような天然または合成生体材料でコーティングした異なるペトリディッシュ上にセットしてもよい。成長培地へ骨格筋肉成長因子、プロスタグランジンF2α(「PGF2α」)およびインスリン様成長因子I(「IGF−1」)のごとき成長因子を加えることにより筋芽細胞を富化させてもよい。
或いは、筋芽細胞は全能性胚幹細胞から富化されてもよい。全能性細胞は、体外受精技法を用いる動物の体外受精卵、臍帯または胎盤に存在する幹細胞、または胞胚期の細胞から単離された胚性幹(ES)細胞に由来してもよい。例えば、ES細胞を収集し、トリプシンを用いて穏やかに解離させ、次いで、組換え白血病抑制因子(Chemicon,San Diego,CA)および増殖が止まった胚線維芽細胞のごとき支持細胞と共にインビトロで培養してもよい。これらの全能性細胞をPGF2αまたはIGF−1のごとき成長因子で処理し、細胞を誘導させて、筋芽細胞に分化させてもよい。
標準的な免疫組織化学またはin−situハイブリダイゼーション技法を用いて、筋芽細胞または筋細胞(分化した筋細胞)を同定してもよい。簡潔に記載すると、培養下で増殖させた筋芽細胞または筋細胞を、上記した適切な細胞外マトリックスでコーティングしたガラススライドに移してもよい。上記の条件を用いて、これらの細胞を所望の数および分化に増殖させてもよい。十分な増殖および分化期間の後、細胞を4%のホルムアミドで固定する。細胞内抗体マーカーまたはヌクレオチドプローブを用いる場合は、1%のNP−40またはトリトン−Xを用いて細胞膜を透過性としてもよい。筋芽細胞または筋細胞に特異的なマーカーに対する抗体、例えば、Sigma(登録商標)から入手可能なミオシン、タイチン、アルファ−アクチニンを用いて、標準的な蛍光免疫組織化学技法を利用して、細胞を同定してもよい。或いは、これらのマーカー用の一本鎖RNAまたはDNAプローブをin−situハイブリダイゼーションに用いてもよい。
2または3次元の足場または支持体は、天然生体材料(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンもしくは他の細胞外マトリックス)または合成生体材料(例えば、ヒドロキシアパタイト、アルギナート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびそれらのコポリマー)またはその両方から変形されてもよい。好ましくは、3次元の足場は、形成された筋肉組織の内部に栄養素および培地を到達させるための分岐状経路を含むように変形される。材料およびこれらの足場の構築方法の例は、米国特許第5,686,091号(題名“Biodegradable Foams For Cell Transplantation”);第5,863,984号(題名“Biostable Porous Material Comprising Composite Biopolymers”);第5,770,417号(題名“Three−Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cell for Producing Vascularized Tissue in vivo”);および第5,916,265号(題名“Method of Producing a Biological Extracellular Matrix for Use as a Cell Seeding Scaffold and Implant”)により提供される。これらの特許は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞は全て多能性間葉性幹細胞または全能性胚性幹細胞から分化できる。幹細胞は実施例IまたはIIIに記載のように単離されてもよい。幹細胞をDMEMもしくはHam’s F−12またはそれらの1:1の比の混合物中で培養してもよい。培地に甲状腺ホルモン、トランスフェリン、インスリンおよび他の成長因子、例えば、インスリン様成長因子(IGF)、塩基性線維芽細胞成長因子および成長ホルモンを加えてもよい。
軟骨細胞を動物の膝または胸郭から単離してもよい。実施例Iに記載のものと同様の技法を用いて、膝または胸郭から単離した組織を細かく刻み、コラゲナーゼで消化し、次いで、完全培地で洗浄する。次いで、細胞を別々にプレートにセットし、軟骨細胞の純度を増大させる。
インビトロで増殖された筋細胞とインビボで増殖された筋細胞とは、インビボ細胞が運動または身体動作において使用されるという点で異なる。筋肉はインビボで使用されるので、例えば四肢の筋細胞は、四肢の動作に従って収縮および弛緩する。故に、インビボでの筋細胞の増殖をより厳密に模倣するために、インビトロで増殖された細胞を、電流もしくは振動電流または電流もしくは振動電流のパルスに曝して筋細胞を収縮させてもよい。電気プローブを培地に埋め込み、中程度の電流を送達してもよい。或いは、支持構造を電気伝導性材料でコーティングしてもよい。電気伝導性材料およびそれらで支持構造をコーティングする方法の例は、米国特許第5,843,741号(題名“Method for Altering the Differentiation of Anchorage Dependent Cells on an Electrically Conducting Polymer”)に記載されている。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
Claims (23)
- 生体外で増殖された非ヒト筋細胞を含む、非ヒト食肉製品。
- 支持構造をさらに含み、および非ヒト筋細胞が該支持構造に付着されている、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト筋細胞が骨格筋細胞である、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト筋細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類および両生類からなる群より選択される動物に由来するものである、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト肉製品が有害な微生物汚染を実質的に含まない、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト筋細胞が多能性または全能性細胞に由来するものである、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト筋細胞が電流に曝されたものである、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 生体外で増殖された非ヒト脂肪細胞をさらに含む、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト脂肪細胞が非ヒト筋芽細胞から分化形質転換される、請求項8記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト脂肪細胞が多能性または全能性非ヒト幹細胞に由来するものである、請求項8記載の非ヒト肉製品。
- 生体外で増殖された非ヒト軟骨細胞をさらに含む、請求項1記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト軟骨細胞が支持構造および非ヒト筋細胞の間に位置付けられる、請求項10記載の非ヒト肉製品。
- 非ヒト軟骨細胞が機械的ストレスに曝されたものである、請求項10記載の非ヒト肉製品。
- 下記工程:
生体外で非ヒト筋肉幹細胞を培養し;
非ヒト筋肉幹細胞を支持構造上に播種し;次いで
非ヒト筋肉幹細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する:
を含む、非ヒト食肉製品の製造方法。 - 非ヒト筋肉幹細胞の増殖工程が、非ヒト筋肉幹細胞を異なる型の非ヒト筋細胞へ分化させることを含む、請求項13記載の方法。
- 非ヒト筋細胞を電流または振動電流に曝す工程をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 非ヒト肉製品に組み込まれるべき栄養素を添加する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
- 非ヒト筋細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類および両生類からなる群より選択される動物に由来するものである、請求項13記載の方法。
- 非ヒト肉製品が有害な微生物汚染を実質的に含まない、請求項13記載の方法。
- 下記工程:
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を生体外で共培養し;
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を支持構造に播種し;次いで
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する:
を含む、非ヒト食肉の製造方法。 - 下記工程:
生体外で非ヒト筋肉幹細胞を培養し;
非ヒト筋肉幹細胞を支持構造に播種し;
非ヒト筋肉幹細胞を脂肪酸で処理して、非ヒト筋肉幹細胞を脂肪細胞に分化形質転換させ;次いで
脂肪細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する:
を含む、非ヒト食肉の製造方法。 - 下記工程:
生体外で非ヒト軟骨細胞を培養し;
非ヒト軟骨細胞を支持構造に播種し;
非ヒト筋細胞を非ヒト軟骨細胞と共に支持構造上またはその付近で培養し;次いで
非ヒト筋細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する:
を含む、非ヒト食肉製品の製造方法。 - 非ヒト軟骨細胞が機械的ストレスに曝されたものである、請求項20記載の方法。
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