CN117795058A - 生产用于人类消费的基于细胞的产品 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种制备用于人类消费的基于细胞的产品的方法，特别是从诸如肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞等细胞类型的群体制备基于细胞的产品的方法。
Description
优先权
本申请要求2021年4月28日提交的美国临时申请第63/180,828号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于用于人类消费的基于细胞的产品领域，特别是从肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞等细胞类型群体制备的产品。本公开涉及新型的可消费产品以及制备这种可消费产品的方法。
背景技术
随着世界人口的持续增长，对于消费产品的需求比以往任何时候都大。面对不断扩张的人口压力，传统消费产品市场在满足人们需求方面难以为继。体外生产用于消费的基于细胞的产品已成为补充传统产品需求的一种有吸引力的选择。此外，体外生产的基于细胞的产品有助于减轻传统产品的一些缺陷。例如，传统的肉类产品与有争议的动物屠宰过程、增加的微生物污染以及诸如热量输入转换不良、温室气体排放和污染等环境问题有关。
因此，本发明的一个目的是提供体外生产用于消费的基于细胞的产品的制备方法。具体来说，这种基于细胞的产品由肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞的群体制备。由肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞的群体制备的基于细胞的消费产品可得到许多益处，例如阻止动物屠宰和虐待，减少与饲养动物有关的环境影响，以及消除与屠宰相关的污染风险。此外，利用这些细胞群体制备基于细胞的消费产品，使得生产商改变产品的脂肪含量，从而能够调控消费者所希望的重要特征，如风味、适口性、健康、嫩度和多针性等。
发明内容
本发明一般涉及利用肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞等细胞类型的群体制备用于消费的体外生产的基于细胞的产品的方法。举例来说，所述基于细胞的产品可以是肉制品，如鹅肝。
在第一个实施例中，用于消费的基于细胞的产品可由肝细胞的群体制备。在优选的实施例中，制备的产品可以是鹅肝，并且用于生成鹅肝的肝细胞群可以表现出脂肪变性，特别是细胞质中脂滴的积累。
在第二个实施例中，用于消费的基于细胞的产品可以由脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞的群体制备。在优选的实施例中，制备的产品可以是肉制品，并且用于生产肉制品的细胞群体可表现出脂肪变性，特别是细胞质中脂滴的积累。
附图说明
本专利或申请文件至少包含一幅彩色图。应申请和支付必要的费用后，专利局将提供本专利或专利申请出版物的彩色图纸副本。
图1描述了一个示范性流程图，显示鸡成纤维细胞如何被分化形成肝细胞或脂肪细胞，以形成基于细胞的鹅肝或基于细胞的肉制品或调味产品。
图2A和2B显示了成纤维细胞在不含油酸(2A)或含油酸(2B)的成纤维细胞培养基中无法转分化为脂肪细胞。成纤维细胞培养基由10％FBS、2％鸡血清和100μg/mL FGF2组成。图2C和2D显示了成纤维细胞在脂肪细胞分化培养基中向脂肪细胞的转分化过程，两者分别是当不存在油酸(2C)和存在已知的脂质积累诱导剂油酸时(2D)。脂肪细胞分化培养基由DMEM-高葡萄糖、补充的10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1μM地塞米松、1μM吲哚美辛、500μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和10μg/mL胰岛素组成。图2A-D中均表现出PPARγ过表达。
图3描述了从鸡胚成纤维细胞转分化六天后的收获的脂肪细胞中C/EBPα、FABP4、PPARγ和SREBP1的mRNA表达水平的定量分析。使用qPCR对鸡胚成纤维细胞进行以下分析：(1)施用PPARγ载体并在成纤维细胞培养基中生长(灰色，条纹状)；(2)施用PPARγ载体并在脂肪细胞分化培养基中生长(方格状)；(3)施用PPARγ载体并在含有油酸的成纤维细胞培养基中生长(反斜线)；(4)施用PPARγ载体并在含有油酸的脂肪细胞分化培养基中生长(灰色，实线)；(5)转染空的对照载体(黑色)。基因表达表示为log2的倍数变化。
图4A-D描述了过表达PPARγ的鸡胚成纤维细胞的油红O染色情况。用10％福尔马林固定成纤维细胞，然后用油红O在60％异丙醇和苏木精中染色，以评估脂滴的存在。用油红O将脂滴染成红色，用苏木精将细胞核染成紫色。图4A和4B描述了成纤维细胞在不含油酸(4A)或含油酸(4B)的成纤维细胞培养基中无法形成脂滴。图4C和4D描述了在脂肪细胞分化培养基中生长的成纤维细胞转分化为脂肪细胞的情况。被转分化的脂肪细胞产生脂滴。
图5A描述了用空载体转染的鸡胚胎成纤维细胞，该空载体保持成纤维细胞多极形态且没有脂滴出现。图5B描述了过度表达C/EBPα并表现出脂肪细胞的脂滴表型的鸡胚胎成纤维细胞。细胞在含有10％FBS、2％鸡血清和100μg/mL FGF2的DMEM-F12培养基中生长。
图6A和6B描述了过表达C/EBPα的鸡胚成纤维细胞中油红O的染色情况，显示了脂滴的存在。图6C和6D描述了在对照鸡胚成纤维细胞中油红O的染色情况。用10％福尔马林固定成纤维细胞，然后用油红O在60％异丙醇和苏木精中染色，以评估脂滴的存在。油红O将脂滴染成红色，苏木精将细胞核染成紫色。
图7A和7B描述了用油红O染色的鸡胚成纤维细胞中细胞核的DAPI染色，这些成纤维细胞过量表达C/EBPα并且有脂滴出现。图7C和7D描述了对照鸡胚成纤维细胞的DAPI和油红O染色情况。细胞核以1:800的比例用DAPI染色。
图8A描述了含有空载体的对照成纤维细胞。对照成纤维细胞没有出现脂滴，并保留了成纤维细胞的多极形态。图8B描述了过表达C/EBPα的永生化鸡胚成纤维细胞中存在脂滴，其表明成纤维细胞转分化为脂肪细胞。尽管脂滴不断积累，但被转分化的脂肪细胞仍在继续扩增。用于转分化的生长培养基包括DMEM-F12、10％FBS、2％鸡血清和100μg/ml FGF2。
图9A显示了在成肌细胞生长培养基中，尽管含有500μM的油酸，MyoD过表达的鸡胚胎成肌细胞不能转分化为脂肪细胞。图9B显示了MyoD过表达的鸡胚成肌细胞在脂肪细胞分化培养基中转分化成脂肪细胞的过程，该培养基中存在500μM的已知脂质蓄积剂油酸。成肌细胞生长培养基由包括20％FBS、2％鸡血清和100μg/ml FGF2的DMEM-F12。
图10A和10D显示了在MyoD过表达(10D)和MyoD未过表达(10A)的成肌细胞生长培养基中永生化的鸡胚胎成肌细胞。在图10A和10D中，细胞保留了成肌细胞形态，没有向脂肪细胞转化分化。图10B和10E显示了永生化鸡胚胎成肌细胞在成肌细胞生长培养基中，在含有500μM的已知脂质蓄积剂油酸的情况下，以及MyoD过表达(10E)和无MyoD过表达(10B)的情况。在图10B和10E中，细胞保留了成肌细胞形态，没有向脂肪细胞转分化。图10C和10F显示了在脂肪细胞分化培养基中永生化的鸡胚胎成肌细胞，在含有500μM的已知脂质蓄积剂油酸的情况下，有(10F)和没有(10C)MyoD过度表达。在图10C和10F两者中，细胞向脂肪细胞转分化，其中过表达MyoD的细胞(10F)的转分化更强。
图11A描述了用表达C/EBPα和GFP两者的载体转染的鸡胚成纤维细胞。细胞在1μg/mL嘌呤霉素条件下进行筛选。图11B描述了转染C/EBPα载体的鸡胚成纤维细胞的明场视图，显示脂质形成。图11C和11D描述了转染空载体对照的鸡胚成纤维细胞的GFP和明场视图。
图12描述了从鸡胚成纤维细胞转分化六天后收获的脂肪细胞中C/EBPα、FABP4、PPARγ和SREBP1的mRNA表达水平的定量分析。使用qPCR对以下鸡胚成纤维细胞进行分析：(1)施用C/EBPα载体(反斜线)，(2)转染空对照载体(灰色)或(3)未转染(黑色)。基因表达表示为log2的倍数变化。
图13A描述了含有空载体的对照鸡胚成纤维细胞。对照细胞保留了成纤维细胞的多极形态。图13B描述了转染载体十天后过表达HNF4α的永生化鸡胚成纤维细胞转分化为表现出肝细胞形态的细胞。
图14描述了从鸡胚成纤维细胞转分化六天后收获的肝细胞中HNF4α、C/EBPα和CYP3A4mRNA表达水平的定量分析。使用qPCR对以下鸡胚成纤维细胞进行分析：(1)转染P8HNF4α载体(灰色)；(2)转染P14 HNF4α载体(反斜线)；(3)转染P18 HNF4α载体(方格)；(4)转染空对照载体(黑色)进行分析。基因表达表示为log2的倍数变化。P＝通道数。
图15描述了在BR7生物反应器中生长的过表达C/EBPα的鸡成纤维细胞在4倍放大镜下(A)和10倍放大镜下(B)的脂质积累情况。被转分化的成纤维细胞显示出60-80％的融合度，重要的是，它们保留了脂质积累的脂肪细胞表型，并具有持续的增殖能力，即使将其从本文示出的孔板扩大到BR7生物反应器中也是如此。
图16描述了在BR7生物反应器中生长的过表达HNF4α并已转分化为肝细胞的肝脏鸡成纤维细胞在4倍放大镜下(A)和10倍放大镜下(B)的脂质积累情况。这验证了根据本方法转分化为肝细胞的成纤维细胞即使从孔板放大到BR7滚瓶中也能保持增殖能力和表型的稳定性。
图17描述了细胞培养分析中有关代谢物(A)和pH(B)的数据，这些数据来自大规模生产运行过程中生长的对照和未转染的鸡成纤维细胞。
图18描述了细胞培养分析中的代谢物(A)和pH(B)数据，这些数据来自大规模生产运行过程中生长的HNF4α过表达的鸡肝细胞。
图19描述了肝细胞样细胞组织(灰色，斜线)与对照组、非转染成纤维细胞组织(黑色)中脂肪酸组成的百分比。
图20描述了用HNF4α组织研制的鸡肉酱原型。
图21描述了幼年北京鸭的原代鸭肝细胞中细胞内脂质积累的情况。
图22描述了从鸭胚胎中提取的肝细胞中细胞内脂质积累情况。
图23A-D以图表说明了未转染样本和HNF4α转染样本中成纤维细胞与肝组织的蛋白质水平(A-B)、水分含量(C)和pH(D)。
图24和图25以图表说明了随着时间的推移，ggCEBPa过表达细胞生长和增殖时细胞培养基成分变化的定量分析。
图26以图表说明了52代ggCEBPa细胞的mRNA表达数据。
图27显示了两种不同的细胞传代技术以及每种技术得到的细胞存活率百分比。
具体实施方式
本文提供了涉及体外生产用于消费的基于细胞的产品的方法和组合物，所述产品包括肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞。为了解更多详情，请参考美国申请第17/033,635号，其全部内容并入本文。
在详细描述特定实施例之前，应当理解的是，本公开并不局限于本文所描述的特定实施例，这些实施例可能各不相同。还应当理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定的说明性实施例，除非另有定义，否则不具有限制性。本说明书中使用的术语在本领域、本公开的上下文以及使用每个术语的具体上下文中一般具有其普通含义。某些术语在下文或说明书的其它地方进行了讨论，以便在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用这些组合物和方法时为从业人员提供额外的指导。任何术语的使用范围和含义都将从使用该术语的具体上下文中显现出来。因此，本文所阐述的定义旨在为确定本发明的特定实施例提供说明性指导，而不限于特定的组合物或生物系统。
如本公开和所附权利要求中使用的单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非该内容另有明确规定。
在本公开及所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则“包括”一词或其变体诸如“包含(comprises)”或“包括(comprising)”等应理解为包括所述的某一要素或某一组要素，但不排除任何其他要素或任何一组要素。
除非提供具体定义，否则本文所述的与分子生物学、细胞生物学、分析化学和合成有机化学相关的术语以及实验室程序和技术所使用是本领域中众所周知和常用的术语。标准技术可用于重组技术、分子、生物、微生物、化学合成和化学分析。
生产用于人类消费的基于细胞的产品
本文提供了体外生产用于人类消费的基于细胞的产品的方法。
细胞
本公开的用于消费的基于细胞的产品是通过体外培养天然存在的、转基因的或改良的动物细胞而产生的组合物。
本公开的所述方法中使用的细胞可以是原代细胞，也可以是细胞系。本文提供的所述方法适用于培养中的任何后生动物细胞。通常，所述细胞来自于其组织适于饮食消费并表现出骨骼肌组织规格化能力的任何后生动物物种。
在一些实施例中，所述细胞来源于任何旨在用于人类或非人类饮食消费的非人类动物物种(例如来源于禽类、绵羊、山羊、猪、牛、鱼类的细胞)(例如家畜、家禽、禽类、野味或水生物种的细胞)。
在一些实施例中，所述细胞来自于家畜，例如驯养的牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、兔子等。在一些实施例中，所述细胞来自家禽，例如训养的鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽子等。在一些实施例中，所述细胞来自猎物种类，例如野鹿、陆禽、水禽、野兔等。在一些实施例中，所述细胞来自从野生渔业或水产养殖操作中商业捕捞的水生物种或半水生物种，或供娱乐的，包括某些鱼类、甲壳类、软体动物、头足类、鲸类、鳄鱼、龟、蛙等。
在一些实施例中，所述细胞来自于外来的、受保护的或灭绝的动物物种。在一些实施例中，所述细胞来自于原鸡(Gallus gallus)、家鸡(Gallus domesticus)、牛(Bostaurus)、猪(Sous scrofa)、火鸡(Meleagris gallopavo)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、大西洋鲑(Salmo salar)、蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)、绵羊(Ovis aries)、鹌鹑(Coturnix)、山羊(Capra aegagrus hircus)或者美洲螯龙虾(Homarus americanus)。
在一些实施例中，所述细胞是原代干细胞、自我更新的干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞或转分化的多能干细胞。
在一些实施例中，所述细胞可通过遗传开关修饰以诱导所述细胞向骨骼肌的快速和有效转化，以用于培养生产。
在一些实施例中，所述细胞是生肌细胞，注定成为肌肉或肌样细胞。在一些实施例中，生肌细胞是天然生肌的，例如成肌细胞。天然生肌细胞包括但不限于成肌细胞、肌细胞、卫星细胞、侧群细胞、肌源性干细胞、间充质干细胞、肌性周细胞(myogenic pericytes)或系膜细胞(mesangioblasts)。
在一些实施例中，细胞是骨骼肌谱系的细胞。骨骼肌谱系的细胞包括成肌细胞、肌细胞和骨骼肌祖细胞，也称为成肌祖细胞，包括卫星细胞、侧群细胞、肌源性干细胞、间充质干细胞、成肌周细胞和中成血管细胞。
在一些实施例中，所述细胞是非成肌细胞，这种非成肌细胞可编程为成肌细胞，例如，所述细胞可包括经修饰以表达一种或多种成肌转录因子的成纤维细胞。在示例性实施例中，成肌转录因子包括MYOD1、MYOG、MYF5、MYF6、PAX3、PAX7、旁系同源物、直系同源物及其遗传变体。在一些实施例中，所述细胞是天然肝细胞或干细胞。在一些实施例中，所述细胞经修饰以表达一种或多种生肌转录因子，如PCT出版物WO/2015/066377所述，其全部内容通过引用结合于此。
在一些实施例中，所述细胞包含本文所述的细胞群的混合物，例如共培养物中的成纤维细胞和成肌细胞的混合物，例如共培养物中的成纤维细胞和成肌细胞的混合物。在一些实施例中，用于体外生产基于细胞的消费产品的所述细胞是悬浮共培养物中的成纤维细胞和成肌细胞的混合物。在一些实施例中，用于体外生产基于细胞的消费产品的细胞是贴壁共培养物中的成纤维细胞和成肌细胞的混合物。在一些实施例中，共培养物可以进一步包含脂肪细胞。
在一些实施例中，所述细胞处于悬浮培养物或贴壁共培养物中，并且包含成纤维细胞和成肌细胞的混合物，其中成纤维细胞与成肌细胞(指定为F和M)的比例范围约为5F:95M至约95F:5M。在示例性实施例中，成纤维细胞与成肌细胞的比例约为5F:95M、10F:90M、15F:85M、20F:80M、25F:75M、30F:70M、35F:65M、40F:60M、45F:55M、50F:50M、55F:45M、60F:40M、65F:35M、70F:30M、75F:25M、80F:20M、85F:15M、90F:10M，或甚至约95F:5M。
在一些实施例中，所述细胞经遗传修饰以抑制通路，如HIPPO信号通路。抑制HIPPO信号通路的示例性方法参见PCT申请PCT/US2018/031276中所述，其全部内容通过引用结合于此。
在一些实施例中，所述细胞经修饰以表达端粒酶逆转录酶(TERT)和/或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)。在一些实施例中，所述细胞经修饰以表达TERT和/或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如PCT公开WO2017/124100中所述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，所述细胞经修饰以表达谷氨酰胺合成酶(GS)、胰岛素样生长因子(IGF)和/或白蛋白。修饰细胞以表达GS、IGF和/或白蛋白的示例性方法参见PCT申请PCT/US2018/042187中所述，该申请通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，所述细胞可包括本文所述修饰的任何组合。
培养基础设施
如本文所述，培养基础设施是指培养细胞或培养细胞以提供二维或三维消费产品的环境。
培养基础设施可以是滚瓶、试管、圆筒、烧瓶、培养皿、多孔板、碟、大桶、培养箱、生物反应器、工业发酵罐等。
虽然培养基础设施本身可以具有三维结构或形状，但在培养基础设施中培养的细胞可以形成单层细胞或多层细胞。本公开的组合物和方法可促进培养基质中后生动物细胞的三维生长，以提供三维细胞生物质的无支架自组装。
三维培养基础设施可根据需要雕刻成不同的尺寸、形状和形态，以提供肌肉细胞生长的形状和形态，并使其类似于不同类型的肌肉组织，如牛排、里脊肉、小腿肉、鸡胸肉、鸡小腿、羊排、鱼片、龙虾尾等。三维培养基础设施可由无毒的天然或合成生物材料制成，因此摄入后不会对人体造成伤害。天然生物材料可包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其他细胞外基质。合成生物材料可包括羟基磷灰石、藻酸盐、聚乙醇酸、聚乳酸或它们的共聚物等。三维培养基础设施可形成固体或半固体支撑物。
培养基础设施可以是任何规模，支持任何体积的细胞生物质和培养试剂。在一些实施例中，培养基础设施的范围从约10μL到约100000L。在示例性实施例中，培养基础设施是约10μL、约100μL、约1mL、约10mL、约100mL、约1L、约10L、约100L、约1000L、约10000L或甚至约100000L。
在一些实施例中，培养基础设施包括基质。培养基础设施包括可渗透的基质(例如，生理溶液可渗透)或不可渗透的基质(例如，生理溶液不可渗透)。可对基质进行纹理处理，以促进细胞生长和细胞膜附着。
在一些实施例中，在培养基础设施中培养细胞可诱导细胞外基质(ECM)的产生，所述细胞外基质可充当自体支架以指导三维细胞生长，例如，在垂直于基质的平面上指导细胞的附着、增殖和肥大。
在一些实施例中，培养基础设施可不包括外源添加的支架以促进三维细胞生物质的自组装。在一些实施例中，培养基础设施可不包含外源性支架，例如水凝胶或软琼脂。
培养条件
产生基于细胞的消费产品的培养条件通常是洁净无菌的。
细胞可以以贴壁培养形式生长从而形成细胞片，或可以以悬浮培养形式生长从而形成细胞沉淀。表1提供了可在体外生产的各种产品的示例性培养方法。
表1：用于生产体外生产的基于细胞的肉的细胞培养方法
在一些实施例中，培养基基本上不含来自动物的血清或其它组分。
因此，生产体外生产的基于细胞的肉的示例性方法包括：(a)提供来自非人类生物体的成纤维细胞和/或成肌细胞；(b)在成纤维细胞和/或成肌细胞在悬浮培养物或贴壁培养物中生长的条件下，在培养基中培养成纤维细胞和/或成肌细胞，其中所述培养基基本上不含来自动物的血清和其它组分。
在一些实施例中，所述细胞在悬浮培养中生长，例如在摇瓶中，并且培养物的产物经离心产生细胞沉淀。在其它实施例中，所述细胞在贴壁培养中生长，培养产物是细胞片。
形成
本公开的用于消费的基于细胞的产品可加工成任何种类的产品，包括但不限于基于细胞的肉制品、鹅肝、保健品和维生素。本公开的示例性基于细胞的产品包括基于细胞的肉制品，例如禽肉制品、鸡肉制品、鸭肉制品和牛肉制品。
基于细胞的消费产品的特征
本文提供了用于消费的体外生产的基于细胞的产品，所述产品包括许多独特的特征，所述特征允许这些产品区别于传统产品(传统产品可能涉及活体动物的屠宰或死亡)。体外方法也可进行定制，以实现所需的特性，如健康和感官益处。
激素
与传统产品相比，本公开的体外生产的基于细胞的产品包含的类固醇激素含量明显更低。例如，使用所述体外培养方法，不需要向培养物中加入任何外源激素，从而在所得基于细胞的肉制品中实现较低的或不存在激素水平。因此，在一些实施例中，基于细胞的产品基本上不含类固醇激素(即，不含或含有少量类固醇激素)。这与为传统肉类生产而饲养的动物形成鲜明对比，传统肉类生产通常通过喂食或以其他方式给予外源激素。
因此，在一些实施例中，本公开的基于细胞的产品包含不超过约1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg或甚至约0.001μg类固醇激素/kg基于细胞的产品的干质量(drymass)。在一些实施例中，基于细胞的产品包含不超过约1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg、或甚至约0.001μg孕酮/kg基于细胞的产品的干质量(dry mass)。在一些实施例中，基于细胞的产品包含不超过约1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg、或甚至约0.001μg睾酮/kg基于细胞的产品的干质量(dry mass)。在一些实施例中，基于细胞的产品包含不超过约0.05μg、0.01μg、0.005μg或甚至约0.001μg雌二醇/kg基于细胞的产品的干质量(dry mass)。在示例性实施例中，基于细胞的产品包含不超过约35ng雌二醇/kg基于细胞的产品的干质量(dry mass)。
微生物污染
使用所述无菌、基于实验室的体外培养方法，基于细胞的产品基本上不含微生物污染物。“基本上不含”是指微生物或寄生虫的浓度低于临床上显著的污染水平，即低于摄入会导致疾病或不利健康状况的水平。如此低的污染水平可延长保质期。这与为传统肉类生产而饲养的动物形成对比。本文所指微生物污染包括但不限于细菌、真菌、病毒、朊病毒、原生动物及其组合。有害微生物可包括大肠菌群(粪便细菌)、大肠杆菌、酵母、霉菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、李斯特菌和葡萄球菌。
此外，培养的细胞可能基本上不含会通过食用未充分煮熟的肉类传染给人类寄生虫，如感染整个动物细胞的绦虫。
抗生素
相对于传统产品，本公开的体外生产的基于细胞的产品包含的抗生素含量明显更低，或基本不含抗生素，或完全不含抗生素。例如，使用本文所述的体外培养方法，可控制或消除培养物中抗生素的使用，从而使所得基于细胞的产品中抗生素水平较低或不存在。因此，在一些实施例中，基于细胞的产品基本上不含抗生素(即，不含或含有少量抗生素)。这与为传统肉类生产而饲养的动物形成对比，而传统肉类生产通常饲喂或以其他方式施用外源抗生素。
因此，在一些实施例中，本公开的基于细胞的产品中，基于细胞的产品包含不超过约100μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约90μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约80μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约70μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约60μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约50μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约40μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约30μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约20μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约10μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约5μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约1μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约0.5μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约0.1μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；基于细胞的产品包含不超过约0.05μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量；或甚至基于细胞的产品包含不超过约0.01μg抗生素/kg基于细胞的产品干质量。
脂质
与传统产品相比，本公开的体外生产的基于细胞的产品包含较低水平的平均总脂质(脂肪)含量。例如，基于细胞的肉通常含有约0.5％至约5.0％之间的平均总脂肪含量，而常规肉中的脂肪酸含量变化很大，约在3％至约18％的范围内，这取决于肉的切割方式。
因此，在一些实施例中，当以基于细胞的产品的总湿质量的百分量(％)测量时，本公开的基于细胞的产品包含约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3.0％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4.0％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％或约5.0％的平均总脂肪含量。与传统产品相比，较低的脂肪含量可提供较低的卡路里含量以及其他相关的健康益处。
本公开提供的方法可以改变特定的脂肪酸谱以获得所需的风味特征或脂肪酸谱。本公开的基于细胞的产品中较低水平的脂肪酸还能延长保质期，例如通过降低产品中的脂肪氧化水平。
氨基酸
本发明的基于细胞的肉制品一般包含包含约50g至约95g氨基酸每100g干重(按重量计)。
维生素E含量
与传统产品相比，本公开的体外生产的基于细胞的产品包含更高含量的维生素E(α生育酚)。在一些实施例中，本公开的基于细胞的产品中，每100g湿质量的基于细胞的产品中包含至少约0.5mg、至少约0.6mg、至少约0.7mg、至少约0.8mg、至少约0.9mg或至少约1.0mg维生素E。
水分含量
本公开的基于细胞的产品通常具有约65％至约95％的含水量。
基于细胞的肉的结构
举例来说，基于细胞的肉除非经过其他处理，否则不含有血管组织，如静脉和动脉，而传统肉类则包含这些血管，并含有血管中的血液。因此，在某些实施例中，基于细胞的肉不包括任何血管组织。
同样，基于细胞的肉虽然由肌肉或类似肌肉的组织组成，但除非另行处理，否则不包括功能性肌肉组织。因此，在某些实施例中，基于细胞的肉不包括功能性肌肉组织。
需要指出的是，如果需要，可以在基于细胞的肉中进一步设计血管和功能性肌肉组织等特征。
补充
在其它实施例中，可以加入其它营养物，例如维生素，以增加基于细胞的产品的营养价值。例如，可以通过在生长培养基中外源性添加营养物质或通过基因工程技术来实现。
保质期
每年都有相当一部分肉类和肉制品变质。据估计，大约有35亿公斤的家禽和肉类在消费者、零售商和餐饮服务环节遭到浪费，对经济和环境造成了巨大影响(Kantor等人(1997年))，其中很大一部分损失是由于微生物腐败造成的。
传统肉类易腐烂，货架期稳定性相对较短(在此可相对简称为“保质期(shelflife)”)。保质期是指食品适合人类食用的时间。传统肉类的成分以及屠宰和收获肉类的条件为包括粪便细菌(如大肠菌群)在内的各种微生物创造了有利的生长条件。肉类也很容易因化学、氧化和酶活性而腐败。一般认为，微生物生长、氧化和酶自溶是导致肉类变质的三种机制。肉类中的脂肪、蛋白质和碳水化合物分解后会产生异味和臭味，这些异味和臭味使肉类不适合人类食用。根据物种和收获方法的不同，传统肉制品在相对较短的储存时间后就不能安全食用。例如，鸡肉应在购买后几天内煮熟。煮熟的家禽在冰箱中只能安全存放4天，在冰柜中最多可存放4个月。因此，有必要控制肉类的腐败变质，以延长其保质期并保持其营养价值、质地和风味。
体外生产的基于细胞的肉，通过其生产方法和组合物，生产出与常规肉制品相比保质期更长且不需要添加防腐剂以获得保质期稳定性的肉制品。的组成使得检测到的异味和异味更少。此外，用于体外生产基于细胞的肉的生产方法要求清洁和无菌条件，从而确保收获的产品和后续食品加工中的微生物细胞计数均较低。这些多重因素有助于延长体外生产的基于细胞的肉的保质期稳定性。
与传统肉类相比，本公开基于细胞的肉类因腐败而导致的保质期得到了延长，在室温(约25℃)和较低温度(如约4℃)下均如此。保质期的延长与基于细胞的肉类的污染减少、基于细胞的肉类的成分、基于细胞的肉类的降解减少以及基于细胞的肉类的颜色、腐败、气味和风味的变化速度减慢有关。
在不拘泥于理论或机制的情况下，与传统肉类相比，基于细胞的肉类中的总脂肪酸含量减少，导致脂肪酸氧化水平降低，从而使肉类的颜色、气味或风味的变化速度减慢。
在不拘泥于理论或机制的情况下，与传统肉类相比，基于细胞的肉类中脂肪酶的数量得以减少，从而使脂肪酸分解水平降低，减慢了肉类的颜色、气味或味道的变化速度。
在不拘泥于理论或机制的情况下，与传统肉类相比，由于基于细胞的肉类中没有血管，存在的氧气较少，脂肪酸氧化和需氧细菌生长的水平较低，从而降低了微生物污染水平，并减慢了肉的颜色、气味或风味的变化速度。
在不拘泥于理论或机制的情况下，与传统肉类相比，由于基于细胞的肉类中没有功能性肌肉组织(如肌红蛋白)，因此存在的氧气较少，导致脂肪酸氧化和需氧细菌生长水平较低，从而降低了微生物污染水平，并减慢了肉类颜色、气味或风味的变化速度。
在不拘泥于理论或机制的前提下，由于基于细胞的肉类中的维生素E含量高于传统肉类，因此抗氧化活性更高，可防止脂肪酸氧化，从而减缓肉类颜色、气味或风味的变化速度。
因此，在一些实施例中，与传统肉类相比，基于细胞的肉类的保质期增加了至少约1.5倍(x)、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或甚至至少约10倍。在约4℃和约25℃的温度下，以及在这两个温度之间的所有温度(包括终点温度)下，都能观察到保质期的延长。
由肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞等细胞群体制备的供消费的基于细胞的肉类产品
在本发明的优选实施例中，用于消费的基于细胞的产品可以从诸如肝细胞、脂肪细胞、成肌细胞和/或成纤维细胞等细胞群体制备得到。在一个特定的实施例中，用于消费的基于细胞的产品可以是基于细胞的肉或基于细胞的鹅肝。举例来说，基于细胞的肉制品可以是由动物皮和脂肪组成的基于细胞的油炸猪皮(例如炸猪皮)。基于细胞的鹅肝可以包括酱和肝酱产品，例如鸡肝酱、肝酱汁、肝抹酱和肝香肠。或者，供消费的基于细胞的产品可以是肝脏补充剂或狗粮。在某些实施例中，脂肪细胞可用作基于细胞的肉制品、基于植物的肉制品和/或杂交产品，例如包含植物和基于细胞的肉的产品的调味剂或产品(例如，脱水的脂肪细胞)。此外，此类产品的“脂肪含量”可通过量化脂滴、提交量化数据以进行脂肪酸分析以及通过脂质组学(包括涉及质谱分析的测量)测定总脂质组成来进行评估。
图1描述了将成纤维细胞转化为具有脂质积累表型的细胞的示例性流程图。例如，鸡或鸭胚胎成纤维细胞可通过过表达HNF4a转分化为肝细胞。在这些肝细胞中诱导脂肪变性可刺激脂质积累，从而使产生的细胞可用于制作鹅肝酱或肉酱食品。作为替代方案，鸡或鸭胚胎成纤维细胞可通过CEBPa、PPARg或其某些组合的过表达转分化为脂肪细胞。这些脂肪细胞可用于生产细胞培养的肉制品或用于调味此类产品。
在优选的第一个实施例中，基于细胞的鹅肝可以从肝细胞群体产生。在某些实施例中，基于细胞的鹅肝可以包含肝细胞和成纤维细胞的混合物。或者，基于细胞的肉可以包含单个肝细胞群体。
例如，可以从鸭、鹅或鸡等动物身上获取原代肝细胞。然后，可对获得的原代肝细胞进行扩增并使其永生化。在替代实施例中，肝细胞样细胞可以从成纤维细胞中转分化而来。例如，成纤维细胞向肝细胞样细胞的转分化可通过对ATF5、PROX1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、ONECUT1、NR1H4、MLXIPL、NR5A2和XBP1等成纤维细胞基因进行重编程来实现。在本公开的上下文中，“转分化”是指一种成熟的、特化的细胞类型改变成单独的细胞类型而不进入多能状态的过程。
转分化涉及转录因子和/或其他刺激的异位表达。转分化可与“谱系重编程”或“转化”等术语互换使用。例如，经工程改造以表达脂肪细胞表型(例如脂质累积)的成纤维细胞可表征为已转分化为脂肪细胞，肝细胞也是如此。转分化细胞需要经过选择过程，以确保成纤维细胞完全转化为肝细胞。在优选的实施例中，成纤维细胞可以是鸡或鸭成纤维细胞。在某些实施例中，鸡或鸭成纤维细胞可以是原代的和永生化的。在其他实施例中，多能干细胞可作为肝细胞的来源。
在某些实施例中，可以转染肝细胞以诱导脂肪变性。举例来说，肝细胞的脂肪变性可由转染基因的过表达诱导。在优选的实施例中，过表达的基因可以是PPARγ、C/EBPα、SREBP1或SREBP2。或者，肝细胞脂肪变性可通过下调特定基因或添加油酸诱导。在优选的实施例中，下调基因可以是OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2或INSIG2。肝细胞的转染可以通过任何合适的机制完成，包括但不限于将待过表达的基因克隆到载体中。在特定实施例中，载体可以是PhiC31载体或诱导型载体(例如，四环素载体和cumate载体)。基因的下调可以通过例如转染siRNA或CRISPR指导RNA来实现。
成功转染后，可诱导肝细胞脂肪变性。肝细胞脂肪变性的程度可通过脂质积累的程度来确定，包括但不限于形成的脂滴的数量。表现出广泛脂肪变性的肝细胞随后可被筛选和扩增以生成鹅肝。
在优选的第二个实施例中，基于细胞的肉可以由脂肪细胞、成纤维细胞和/或成肌细胞的群体产生。在某些实施例中，基于细胞的肉可以包含脂肪细胞、成纤维细胞和/或成肌细胞的混合物。或者，基于细胞的肉可以包含单个脂肪细胞群体。
在某些实施例中，原代成纤维细胞可以从诸如鸡、鸭、鹅或其它鸟类物种获得。或者，可从这些动物身上获取原代成肌细胞或原代脂肪细胞，获得的原代成纤维细胞、成肌细胞或脂肪细胞可以进行扩增和永生化。然后可对永生化的成纤维细胞或成肌细胞进行转染，诱导其向脂肪细胞或类脂肪细胞转分化。此外，转染还可诱导所得脂肪细胞或脂肪细胞样细胞发生脂肪变性。在优选的实施例中，所公开的永生化细胞类型即使在培养60个群体倍增水平(PDL)或更长时间后仍能保持分化能力。经过如此多的群体倍增的细胞通常被称为“晚期传代”细胞。晚期传代可由至少60个PDL、至少70、80、90、100、110、120或130个传代来定义。应该注意的是，每个单个传代数，例如“传代”，指的是2或更多的种群倍增。
例如，转染基因的过度表达可诱导脂肪细胞或类脂肪细胞的转分化和脂肪变性。如图2C、图2D和图3所示，过表达PPARγ的成纤维细胞在脂肪细胞分化培养基中生长时，无论是在含有油酸的情况下，还是在不含有油酸的情况下，都能转分化为脂肪细胞。可对转分化细胞进行筛选，以确保其完全转化为脂肪细胞。在其他实施例中，原生脂肪细胞可从脂肪生成组织或间充质组织中分离出来。在优选的实施例中，过表达基因可以是PPARγ、C/EBPα、C/EBPγ、MyoD1、SREBP1或SREPB2。另外，脂肪细胞或脂肪细胞样细胞的脂肪变性可通过特定基因的下调来诱导。在优选的实施例中，下调的基因可以是MyoD1、OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2或INSIG2。在另一个优选的实施例中，MyoD的上调可诱导成肌细胞向脂肪细胞转分化。成纤维细胞的转染可通过任何合适的机制完成，包括但不限于将待过表达的基因克隆到载体中。在特定的例子中，载体可以是PhiC31载体。基因下调可通过转染siRNA或CRISPR引导RNA来实现。在一个特定的例子中，可通过siRNA或CRISPR引导RNA下调成肌细胞中的MyoD1，以启动成肌细胞向脂肪细胞样细胞的转分化。在其他实施例中，多能干细胞可作为脂肪细胞的来源。
转染成功后，可诱导转分化为脂肪细胞或脂肪细胞样细胞以及这些细胞中的脂肪变性。脂肪变性的程度可以通过脂质累积的程度来确定，包括但不限于形成的脂滴的数量。然后，可以选择表现出广泛脂肪变性的脂肪细胞或脂肪细胞样细胞，并将其扩增以生成肉。如图4C和4D所示，过表达PPARγ的成纤维细胞在脂肪细胞分化培养基中生长时，无论是在含有油酸还是不含有油酸的情况下，都能转分化为脂肪细胞。随后，转分化的脂肪细胞产生脂滴。在特定的实施例中，在永生化成纤维细胞或成肌细胞中过表达诸如C/EBPα、C/EBPγ和MyoD的基因可能令人惊讶地促进它们增殖和转分化为脂肪细胞，以及转分化脂肪细胞的脂肪变性，参见图5B、图6A-B、图7A-B、图8B、图9B和图10F。这一结果令人惊讶，因为与本公开平行的研究已经发现在原代细胞中过表达这些基因导致增殖抑制。此外，前期文献显示敲除MyoD有助于成肌细胞转分化为脂肪细胞(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352396417300191)。原代细胞有群体倍增水平(PDL)限制和有限的寿命(之后会衰老)，而本发明的永生细胞则没有。一种可能的解释是，永生细胞停留在细胞周期的特定部分，或者TERT基因导致永生细胞对这种过表达的反应不同于原代细胞。另一种可能的解释是，随着转分化成肌细胞老化并经历许多PDL，它们产生更高表达的脂肪生成相关基因，因此即使MyoD过表达也无法抑制脂滴的形成。
此外，成肌细胞向脂肪细胞的转分化以前与MyoD的下调有关。(Chen等，《分子生物学方法》，1889:25-41(2019))。发明人惊奇地发现了相反的结果：MyoD的上调促进了成肌细胞向脂肪细胞的转分化。参见图9B和10F。
成纤维细胞向脂肪细胞的转分化通常与培养中的培养基成分有关，如激素和小分子。这些激素和小分子非常容易使用，例如，只需将其添加到细胞培养基中即可。然而，这种方法并不适用于消费品，因为常用的激素和小分子物质并不允许食用。另一方面，基因工程方法往往会导致细胞最终失去增殖能力和表型特征。本发明人惊奇地发现了一种基因工程方法，该方法产生的细胞既保留了转分化表型又保留了增殖能力，例如，一种导致C/EPBα过表达的基因编辑，而不使用通常认为可食用的小分子和激素。这种新的转分化方法将促进消费品的开发。
本发明特别优选的实施例包括体外培养的肉制品，该肉制品初步包括由成纤维细胞、成肌细胞或它们的某种组合组成的细胞群，其中所述细胞群体被转分化后表达脂肪细胞表型，并通过CEPBα、CEPBγ、PPARγ、SREBP1、SREBP2或它们的某些组合的过表达转染诱导脂肪变性。在某些实施例中，可转染细胞群从而下调OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2和INSIG2中的至少一种。在某些实施例中，转分化可以在没有内源性激素或小分子的情况下发生，这些激素或小分子被认为可将细胞转分化为脂肪细胞表型。在进一步的实施例中，转分化的细胞群可以保持增殖能力并在后期传代时显示出稳定的表型。在某些实施例中，可转染细胞群以过表达HNF4α和/或表达肝细胞表型。在一些实施例中，细胞群体可以包括具有野生型MyoD的成肌细胞，尤其是野生型MyoD可能过表达。在优选的实施例中，转分化的细胞群体可以在细胞质中表现出脂滴形成。
在优选的替代实施例中，体外培养的肉制品可以包含50-95重量％的体外培养的肉和5-19重量％的黄油、奶油或它们的某种组合。特别地，体外培养的肉可包括被转分化表达脂肪细胞表型的细胞群体、被转分化表达肝细胞表型、脂肪细胞谱系细胞、肝细胞谱系细胞中至少一种的细胞群体或它们的某种组合。在一些实施例中，黄油和/或奶油可以与基于植物的脂质替代物组合(如天然油、菜籽油、植物油、红花油、人造黄油或其一些组合)或由基于植物的脂质替代物代替。在某些实施例中，体外培养的肉制品可以包含一种或多种重量为0.1％至1％的萝卜和胡萝卜；0.5重量％至6重量％的葱、大蒜和百里香；和1-12重量％的波特酒。在某些实施例中，所述波特酒可减少。在一些实施例中，细胞群体可经转染以过表达HNF4α、肝谱系细胞或其一些组合中的至少一种。在其他实施例中，体外培养的肉可包括转染细胞群，通过过表达CEPBα、CEPBγ或它们的某些组合诱导脂肪变性。
本发明的其它优选实施例包括烹饪体外培养的肉制品的方法，包括在烹饪装置中熔化脂质；将体外培养的肉添加到所述烹饪装置中，其中所述体外培养的肉包含转分化以表达脂肪细胞表型的细胞群体；和烹饪所述体外培养的肉制品的至少一面，直到观察到合适的颜色变化或稠度变化，例如变褐或变脆。在进一步的实施例中，体外培养的肉可以包含通过CEPBα、CEPBγ或其一些组合的过表达而被转染以诱导脂肪变性的细胞群体。在某些实施例中，所述方法可以进一步包括将葱、大蒜、百里香、波特酒、盐和胡椒中的一种或多种添加到体外培养的肉制品中；将体外培养的肉制品与脂质混合直至光滑；和将体外培养的肉制品冷却至冷冻。在一些实施例中，脂质可包括植物性替代品，如天然油、菜籽油、植物油、红花油、人造奶油或它们的某种组合。
具体来说，展望以下实施例：
1.一种体外培养的肉制品，包括：由成纤维细胞、成肌细胞或其组合组成的细胞群体，该细胞群体被转分化以表达脂肪细胞表型；其中转分化涉及转染，以通过CEPBα、CEPBγ、PPARγ、SREBP1、SREBP2或其组合的过表达来诱导脂肪变性。
2.根据实施例1所述的体外培养的肉制品，其中细胞群体被转染从而下调OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2和INSIG2中的至少一种。
3.根据实施例2所述的体外培养的肉制品，其中转分化的发生不需要内源激素或公认的可将细胞转分化为脂肪细胞表型的小分子。
4.根据实施例3所述的体外培养的肉制品，其中转分化的细胞群体在后期传代时保持增殖能力。
5.根据实施例3所述的体外培养的肉制品，其中所述转分化的细胞群体在后期传代时显示出稳定的表型。
6.根据实施例1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群体经转染从而过表达HNF4α。
7.根据实施例1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞被转分化从而表达肝细胞表型。
8.根据实施例1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群体包括具有野生型MyoD的成肌细胞。
9.根据实施例8所述的体外培养的肉制品，其中野生型MyoD过表达。
10.根据实施例1所述的体外培养的肉制品，其中所述转分化的细胞群体在细胞质中表现出脂滴形成。
11.一种体外培养的肉制品，包括：
a.50-95重量％的体外培养的肉制品，其中体外培养的肉制品包括被转分化表达脂肪细胞表型的细胞群体、被转分化表达肝细胞表型、脂肪细胞系细胞、肝细胞系细胞中至少一种的细胞群体或它们的组合；和
b.5-19重量％按的黄油、奶油或它们的混合物。
12.根据实施例11所述的体外培养的肉制品，其中黄油和/或奶油由基于植物的脂质替代物替代。
13.根据实施例12所述的体外培养的肉制品，其中所述基于植物的脂质替代物是天然油、菜籽油、植物油、红花油、人造黄油或其一些组合。
14.根据实施例11所述的体外培养的肉制品，包括萝卜和胡萝卜中的一种或多种，重量百分比为0.1％至1％。
15.根据实施例11所述的体外培养的肉制品，包含葱、大蒜和百里香中的一种或多种，重量百分比为0.5％至6％。
16.根据实施例11所述的体外培养的肉制品，包含1-12重量％的波特酒。
17.根据实施例16所述的体外培养的肉制品，其中减少波特酒。
18.根据实施例11所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群经转染以过表达HNF4α、肝谱系细胞或其某些组合中的至少一种。
19.根据实施例11所述的体外培养的肉制品，其中所述体外培养的肉制品包含通过过表达CEPBα、CEPBγ或其一些组合而转染以诱导脂肪变性的细胞群体。
20.一种烹饪体外培养的肉制品的方法，其包括：
a.在烹饪设备中熔化脂质；
b.将体外培养的肉添加到烹饪装置中，其中所述体外培养的肉包含转分化以表达脂肪细胞表型的细胞群体；和
c.烹饪所述体外培养的肉制品的至少一侧，直到发生颜色变化或质地变化。
21.根据实施例20所述的方法，其中所述体外培养的肉包含通过过表达CEPBα、CEPBγ或其组合而转染以诱导脂肪变性的细胞群体。
22.根据实施例20所述的方法，还包括：
a.向体外培养的肉制品中加入葱、大蒜、百里香、波特酒、盐、胡椒中的一种或多种；和
b.将体外培养的肉制品与脂质混合直至光滑；
23.根据实施例22所述的方法，进一步包括冷却所述体外培养的肉制品直至冷冻。
24.根据实施例20所述的方法，其中所述脂质由基于植物的替代物代替。
25.根据实施例24所述的方法，其中所述基于植物的脂质替代物包括天然油、菜籽油、植物油、红花油、人造黄油或其一些组合。
本发明通过以下附加实施例进一步说明，但这些示例不应被理解为对本发明的限制。根据本公开内容，本领域技术人员应该明白，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的特定实施例进行许多改变，仍然获得类似或类似的结果，所做更改仍属于本发明的精神和保护范围。
权利要求书中的所有权利要求在此作为附加实施例以引用的方式全部并入本说明书中。
实施例
实施例1：通过C/EPBα的过表达将鸡胚胎成纤维细胞转分化为脂肪细胞
如图11A、图11B、图5B、图6A和图6B所示，2.5×105鸡胚胎成纤维细胞用mPGK-ggCEPBa-hEF1a-copGFP-IRES-PuroR载体和PhiC31整合酶表达质粒转染，从而将基因C/EPBα转染成纤维细胞，继而诱导转分化为脂肪细胞。如图11C、图11D、图5A、图6C和图6D所示，对照组成纤维细胞转染了空载体mPGK-MCS-hEF1a-copGFP-IRES-PuroR。对照群体提供了一个基准，可据此评估和量化相关载体及其基因的功效。转染细胞筛选自含有10％FBS、2％鸡血清和100μg/mLFGF2的DMEM-F12培养基的培养物。在替代实施例中，细胞在无血清培养基或无动物成分(ACF)培养基中生长。将细胞保存在含嘌呤霉素的培养基中，直至未转染的对照细胞失去活力(转染后约72小时)。所有剩余的活细胞均过表达C/EPBα基因，并显示GFP荧光。然后，在含有DMEM-F12(含10％胎牛血清、2％鸡血清和100μg/mL FGF2)的培养物中生长用C/EPBα转染的选定细胞，以诱导转分化为脂肪细胞。在替代实施例中，细胞在无血清培养基或无动物成分(ACF)培养基中生长。在某些情况下，细胞培养基包含额外的脂肪酸补充剂。培养基中脂肪酸的补充可能导致细胞中脂肪酸浓度增加。补充的脂肪酸可以由细胞摄取和代谢，可以结合到脂肪球中，或者可以简单地粘附或以其他方式粘在细胞上。用于细胞培养基的脂肪酸补充剂可包括基于植物的脂质。
转染后72-96小时，过度表达C/EPBα基因的细胞开始在细胞质中形成脂滴。液滴开始时为小球，是定向脂肪细胞的特征。随着细胞继续分化，分化的脂肪细胞逐渐成熟，脂滴大小增加。细胞形态也从成纤维细胞的双极或多极形态转变为肥大和增生的脂肪细胞的混合物。成纤维细胞用10％福尔马林固定，并在60％异丙醇和苏木精中用油红O染色，以评估是否存在脂滴。脂滴用油红O染色呈红色，细胞核用苏木精染色呈紫色。当细胞核用DAPI以1:800的比例染色时，油红O染色的脂滴在德克萨斯红通道(Texas Red channel)下也显示出荧光。
如通过比较图11A和11C所示，相对于用对照载体(图11C-D)转染的对照细胞，转染过表达C/EPBα的细胞显示出绿色荧光蛋白(GFP)(11A-B)明显增加。该结果证实了含有C/EPBα的载体的成功转染，即它穿过细胞膜，进入细胞质，并开始转录。其中，图11A和图11C验证了转染载体对GFP的转录，图11B和图11D验证了C/EPBα的转录。C/EPBα过表达的特征是脂质积聚，是脂肪细胞的标志表型。图11B的明场图像显示，脂滴形成明显增加，可见白点数量增加。这一系列图提供了转染成功、C/EPBα过表达和向脂肪细胞表型转化的证据。
图5A-B、图6A-D和图7A-D提供了一系列显微图像，可用来比较未改变的成纤维细胞形态与被转分化过量表达C/EBPα的成纤维细胞形态。如图5A、图6C-D和图7C-D所示，转染了对照载体的细胞在失去活力之前保持了成纤维细胞的多极形态，显示出细长的瘦纤维，并且没有出现脂滴。特别值得注意的是，图5A未显示任何脂质堆积，而脂质堆积的特征是成群的白点。图6C和6D所示的进一步对照说明了在细胞样本中添加油红O的情况，油红O可使脂质染成高可见度的红色。不过，图6C和6D均未显示任何油红O染料的积累，表明这些对照组中缺乏脂质积累。此外，图7A-D同时用油红O和DAPI对样本进行染色，其中DAPI用高可见度的蓝色荧光对细胞核染色。虽然图7C和7D清晰地显示出大量细胞核发出蓝色荧光的情况，但这些细胞都没有发出任何油红O荧光，表明这些对照组细胞缺乏脂质积累。相反，如图5B、6A-B和7A-B所示，过表达C/EBPα的细胞表现出向脂肪细胞特征的新形态转分化，细胞质脂滴明显增多。具体而言，图5B以白点分组的形式说明了广泛的脂滴形成，明显超过对照，并且相对于对照，细长的成纤维细胞多极形态结构减少。图6A和6B显示了油红O的广泛染色，其对脂质进行了染色，明显超过了对照值。最后，图7A和7C显示了油红O和DAPI的广泛荧光，表明存在明显超过对照的脂质累积的细胞。特别值得注意的是，高表达C/EPBα的细胞在转染后7天才出现脂滴染色。
如图12所示，与未转染的细胞或用对照空载体转染的细胞相比，过度表达C/EPBα的细胞表现出其他成脂标记物如FABP4、PPARγ和SREBP1表达的增加，为证明转染成纤维细胞以过表达C/EPBα会导致成纤维细胞转分化为脂肪细胞提供了进一步的证据。
转分化细胞不仅表达转染的基因C/EPBα，而且还表达脂肪细胞和脂质生成途径中的其他基因(即脂肪生成因子)，其表达量高于对照组，表达水平也具有脂肪细胞的特征。转染旨在过表达这些其他额外脂肪生成因子的载体可提供进一步增加脂质累积的手段，从而可能有利于提高鹅肝和酱类食品配方。在分化后6天收获的细胞中，通过qPCR分析基因表达。
实施例2：鸡胚胎成纤维细胞或成肌细胞向脂肪细胞的转分化
鸡胚胎成纤维细胞可来源于第12天和第14天的鸡胚，并在含有10％FBS、2％鸡血清和100μg/mL FGF2的DMEM-F12培养基中生长。在替代实施例中，细胞在无血清培养基或无动物成分(ACF)培养基中生长。原代成肌细胞可从鸡获得并永生化。
可将过表达研究的目的基因(如PPARγ、SREBP1和MyoD)克隆到PhiC31载体中。下调研究的目标基因，如MyoD1、OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2和INSIG2，可由siRNA和CRISPR指导RNA下调。AmaxaTM 4D-核因子TM(AmaxaTM 4D-NucleofactorTM)可用于以5×105个细胞/反应的密度将质粒DNA递送至细胞中。
表型变化可通过荧光显微镜进行评估，并且可以通过油红O或BODIPY 493/503染色来观察脂滴的形成。基因表达分析可通过qPCR进行。
图2A-D提供了在各种培养基条件下转染过表达PPARg的成纤维细胞的显微镜图像。图2A和2B均说明了当过表达PPARg的细胞在缺乏油酸(2A)和含有油酸(2B)的成纤维细胞培养基中生长时，脂质累积有限。图2C和2D都说明了当过表达PPARg的细胞在缺乏油酸(2C)和含有油酸(2D)的脂肪细胞分化培养基中生长时，脂质累积增加。具体来说，图2C和2D清楚地显示出脂质积聚和细长多极形态减少，这是成纤维细胞的特征。相比之下，图2A和2B清楚地显示缺乏脂质积聚，并保持了多极拉长的形态。因此，图2A-D说明在某些培养基条件下，利用PPARg过表达将成纤维细胞转分化为脂肪细胞的效果会增强。图4A-D描述了图2A-D中探讨的相同变量，并添加了红色染色剂(即油红O)和深紫色染色剂(即苏木精)，分别用于染色脂质和细胞核。图4A和4B说明了在缺乏油酸(4A)和含有油酸(4B)的成纤维细胞培养基中，过表达PPARg的细胞的脂质积累非常有限，图4A和4B中缺乏红色染色支持了这一结论。相反，图4C和4D均说明了在脂肪细胞分化培养基中过表达PPARg的细胞的稳健脂质积累，如两图中可见的红色染色所示。
图3为在分化后6天收获的细胞中通过qPCR分析的成脂标记PPARg、CEBPa、FABP和SREBP1 mRNA表达定量图。分析的细胞包括空载体细胞和在成纤维细胞培养基(FM)、脂肪细胞分化培养基(ADM)、成纤维细胞和油酸培养基以及脂肪细胞分化和油酸培养基中转染过表达PPARg的细胞。这些结果表明，单独过表达PPARg不足以上调所有检测的成脂标记物。相反，这些成脂标记物的上调需要PPARg的过表达和适当的培养基条件相结合。本实验表明，ADM培养基为过表达PPARg的转染细胞中的成脂标记物上调提供了最佳条件，而油酸的加入进一步增加了这些成脂标记物的上调。
图8A和8B过渡到用空载体(10A)转染的成纤维细胞与过表达CEBPa的TERT-永生化鸡胚成纤维细胞(10B)的比较，如图5A-B、图6A-D、图7A-D、图11A-D和图12所示。图8A显示，转染空载体的成纤维细胞不会出现脂滴或脂质积累。与此相反，图8B表明，过表达CEBPa的经TERT永生化的鸡胚成纤维细胞的细胞质中会积累脂质，并从成纤维细胞形态转变而来，表明其转分化为脂肪细胞。令人惊讶的是，这些被转分化的细胞还能保持其增殖能力，体现在它们即使在同时积累脂滴的情况下也能继续扩张和增殖。通常情况下，细胞在分化后会失去增殖能力。
图9A和图9B过渡到过表达MyoD的鸡胚成肌细胞在成肌细胞培养基(图9A)或脂肪细胞分化培养基(图9B)中的比较。如图9A所示，即使加入500uM的油酸，表达MyoD的细胞也不会在成肌细胞培养基中分化。相反，如图9B所示，将培养基转换为脂肪细胞分化培养基并添加500uM的油酸会导致脂滴的形成。
图10A-F比较了永生化鸡胚胎成肌细胞中脂质积累的六种不同条件。成肌细胞要么缺乏MyoD过表达(10A-C)，要么存在MyoD过表达(10D-F)。这两种细胞类型变体的脂质积累在三种不同的培养基条件下进行测试：成肌细胞培养基(10A和10D)、补充油酸的成肌细胞培养基(10B和10E)以及补充油酸的脂肪细胞分化培养基(10C和10F)。图10A和10D说明，在成肌细胞生长培养基中培养的成肌细胞，在有(10D)和没有(10A)MyoD过表达的情况下，保留了成肌细胞形态，并且未能转分化为脂肪细胞。类似地，图10B和10E说明了在500μM油酸存在的成肌细胞生长培养基中培养的成肌细胞，存在(10E)和不存在(10B)MyoD过表达，保留了成肌细胞形态并且不能转分化为脂肪细胞。相反，图10C和10F表明，在500μM油酸存在下，在脂肪细胞分化培养基中培养的成肌细胞(存在(10C)和不存在(10F)MyoD过表达)成功转分化为脂肪细胞，从而证明了脂肪细胞分化培养基对成肌细胞转分化的关键作用。然而，转分化在过表达MyoD(10F)的细胞中更为稳健，表明MyoD过表达也在转分化程度中起作用。
实施例3：产生表现出脂肪变性的肝细胞
原代肝细胞可从鸭、鹅或鸡获得，并进行扩增和永生化。
用于过表达研究的相关基因，如PPARγ、C/EBPα、SREBP1和SREBP2，可克隆到PhiC31载体中。用于下调研究的相关基因，如OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2和INSIG2，可通过siRNA和CRISPR引导RNA进行下调。AmaxaTM 4D-核因子TM可用于以5×105个细胞/反应的密度将质粒DNA递送至细胞中。
表型变化可以通过荧光显微镜进行评估，并且可以通过用油红O或BODIPY 493/503染色来观察脂滴的形成。基因表达分析可通过qPCR进行。
实施例4：成纤维细胞向肝细胞的转分化
原代成纤维细胞可从鸭和鸡中获得并永生化。细胞可在含10％FBS、2％鸡血清和100μg/mL FGF2的DMEM-F12培养基中生长。在替代实施例中，细胞在无血清培养基或无动物成分(ACF)培养基中生长。
用于过表达研究的相关基因，如ATF5、PROX1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、ONECUT1、NR1H4、MLXIPL、NR5A2和XBP1，可克隆到PhiC31载体中。AmaxaTM 4D-核因子TM可用于以5×105个细胞/反应的密度将质粒DNA递送至细胞中。
表型变化可以通过荧光显微镜进行评估，可以通过用油红O或BODIPY 493/503染色来观察脂滴的形成。基因表达分析可通过qPCR进行。
图13A和13B说明了转染空载体(13A)和转染过表达HNF4a的载体(13B)的鸡胚成纤维细胞。图13A显示，当用空载体转染时，鸡胚胎成纤维细胞保留了成纤维细胞形态。相反，图13B显示转染过量表达HNF4a的鸡胚胎成纤维细胞在转染后10天转分化为肝细胞形态。
图14提供了在分化后6天收获的永生化鸡胚胎成纤维细胞中通过qPCR分析的肝细胞标志物HNF4a、CEBPa和CYP3A4 mRNA表达的定量图。分析的细胞包括具有空载体的细胞和被转染以在8、14或18的传代水平(即群体倍增数)过表达HNF4a的细胞。这些结果表明，即使在增殖时，转染过量表达HNF4a的永生化鸡胚胎成纤维细胞也表现出表型稳定性。与图8B的结果非常相似，图14所示的转分化细胞令人惊讶地在广泛的群体倍增中保持了它们的增殖能力以及稳定的转分化表型。
如图15A-B和图16A-B所示，在较大规模生产运行期间，细胞中也会发生脂质累积，因为在单独实验中，过度表达C/EPBα或HNF4α的鸡成纤维细胞在BR7生物反应器中生长时会表现出这种累积。当目标是大规模生产用于消费的基于细胞的肉类时，验证台式结果是否转化为更大规模的生长方法至关重要。随着细胞生长技术从台式扩大到大型应用，通常会看到细胞表型随时间变化或消失。同样，天然成肌细胞通常在年轻时就具有分化能力，但随着年龄的增长，往往会丧失这种能力。细胞失去增殖能力和分化能力的原因尚不清楚，但怀疑与衰老过程和/或表观遗传有关。因此，很难预测细胞培养的台式技术是否能成功推广。特别值得注意的是，图15A-B表明，转染过表达CEBPa并在BR7滚瓶生物反应器中生长的成纤维细胞在60-80％汇合度时表现出较高的脂质积累。类似地，图16A-B说明HNF4α过表达的成纤维细胞表现出肝细胞的立方形形态特征，因此说明转分化的成功。因此，图15A-B和图16A-B均显示，转染过表达CEBPa和HNF4a的TERT永生化鸡胚胎成纤维细胞分别表现出脂肪细胞和肝细胞的表型稳定性，并保持增殖能力，即使细胞在生物反应器中大规模生长也是如此，因此证明了所公开的大规模生产细胞肉的方法的有效性。
图17A、图17B、图18A和图18B显示了在14天的大规模生产过程中培养的基于细胞的肉的代谢物、废物和pH的变化。图17A和图17B显示了鸡成纤维细胞(本例中用作对照)在大规模生产过程中14天的生长情况。乳酸盐和氨的积累以及培养基的酸化表明细胞新陈代谢活跃，增殖活跃，可以作为生长速度的代用指标。图18A和18B显示了通过过表达HNF4a转分化为肝细胞的成纤维细胞在大规模生产中生长14天的情况。同样，乳酸盐和氨的积累以及培养基的酸化都表明细胞新陈代谢活跃，增殖活跃，可以作为生长速度的代用指标。不过，特别值得注意的是，与图17A相比，图18A中氨的积累程度较低。这在细胞生长的早期阶段可能是有利的，因为过多的氨积聚可能会影响组织质量，并可能导致组织过早脱离生长基质。另一方面，在预期收获时允许氨积累可以更容易地收集细胞，因为氨积累可以促进细胞从生长基质上脱离。除代谢产物分析外，还可分析基于细胞的肉，以确定形成的组织的质量。在一些实施例中，基于细胞的肉在贴壁培养物中生长，并且一旦生长达到汇合度就形成细胞薄片。组织片生长并收集后，组织质量可根据5分制进行评估。得分为1的产品在操作时不能保持片状结构，即使轻轻触摸也会撕裂和破碎。一个在组织质量量表上得分为1的常见例子是一片磨碎的帕尔马干酪，处理时会立即散开。另一方面，形成完整细胞片的产品可得5分，该细胞片即使握在手中并拉动也不会裂开。在某些情况下，一个常见的得分为5的例子是一个成形良好的比萨饼面团。至于本公开的结果中，图17A和17B的未转染的对照细胞获得5/5的组织质量评分，而图18A和18B的过量表达HNF4α的鸡成纤维细胞获得4.5/5的组织质量评分。同样，在大规模生产过程中，C/EPBα过表达的鸡成纤维细胞也保持了正常的功能和特性，组织质量评分为5/5。
图19量化了通过过表达HFN4a转分化为肝细胞的胚胎鸡成纤维细胞与对照成纤维细胞组织的脂肪酸谱。鹅肝等肝脏产品不仅脂肪酸含量高，而且特定种类的脂肪酸含量也很高。图19显示的结果表明，通过过表达HFN4a将胚胎鸡成纤维细胞转分化为肝细胞后，其脂肪酸谱与鹅肝相似。传统鹅肝中存在大量的ω-3脂肪酸，如油酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。如图19所示，通过HFN4a过表达转分化为肝细胞的胚胎鸡成纤维细胞的表达高度类似。特别值得注意的是，对照组没有达到同样高的ω-3脂肪酸水平。
表2提供了过量表达CEBPs的细胞的脂肪酸概况的定量分析。样本F1-F3包含未转染的对照，而样本F4-F7包含经转染以过表达CEBPa的细胞。在这些实施例中，CEBPa的过表达导致棕榈酸和棕榈油酸的相对浓度增加。两者都是饱和脂肪，能够形成良好的脂肪球。此外，这些脂肪酸是脂肪细胞中存在的主要脂肪酸。因此，这一定量分析支持了CEBPa转染促进成纤维细胞向脂肪细胞转分化的结论。
表2
下方表3提供了过量表达HNF4a的细胞的脂肪酸谱的定量分析。样本F1-F4包含未转染的对照，而样本F5-F8包含经转染以过表达HNF4a的细胞。在这些实施例中，HNF4a的过表达导致棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和下文所述的许多其他物质的浓度增加，以μg/g表示。特别值得注意的是，亚油酸是鹅肝中脂肪百分比最高的。因此，这个定量分析支持这样的结论，即HNF4a转染支持成纤维细胞向具有有利于形成鹅肝食品的脂肪酸谱的肝细胞的转分化。
表3
下方表4提供了过量表达HNF4a的细胞的脂肪酸谱的定量分析。样本F1-F4包含未转染的对照，而样本F5-F8包含经转染以过表达HNF4a的细胞。在这些实施例中，HNF4a的过表达导致棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和下文所述的许多其他物质的浓度增加，以相对组成百分比表示。
表4
图20显示了由胚胎鸡成纤维细胞通过HFN4a过表达转分化为肝细胞而形成的鸡肉酱原型。鸡肉酱原型含有约37.5％的肝组织，符合酱类至少含30％肝组织的行业标准。参见《标签政策手册》第123页。此外，鸡肉酱原型呈现出棕色，其奶油质地与传统的鸡肉酱相似。
下方的表5和表6描述了生产鸡肉酱的过程和所用的成分。本示例为孤立示例，绝非限制性示例。如下图所示，由非转染对照肝细胞组成的组织初步与少量红萝卜和棕色胡萝卜混合以显色。将原料称重并混合。用叉子确保颜色均匀地添加到组织中。然后对经过颜色处理的组织进行进一步加工，制成鹅肝酱。
表5
表6
在一个特别的非限制性例子中，制作鹅肝酱的方法是先用平底锅中火融化黄油，直到起泡。然后加入经着色处理的组织，直至变成褐色；组织褐变需要每面烹饪约3分钟；然后加入葱、大蒜和百里香，混合后再煮一分钟；然后向混合物中加入波特酒，煮约30秒后酒减半；将混合物在食品加工机中与黄油、多脂奶油和熟悬浮液混合，直至光滑；混合的混合物用盐和胡椒调味；然后将所得混合物用保鲜膜覆盖，并冷却至少2小时或过夜，以生成最终的鹅肝产品。鹅肝在室温下放置三十分钟后即可食用。
在某些情况下，使用本公开的细胞生产鹅肝或鹅肝酱产品可能还包括在生长的细胞中添加额外的脂肪酸。额外的脂肪酸可以简单地增加最终产品中脂肪的总体浓度，也可以用来增强最终产品的风味，或两者的某种组合。在一个例子中，将细胞制备成食品时，将植物性脂质混合或以其它方式添加到细胞中，以增加脂肪酸浓度，增强风味，或两者兼而有之。
图21和22探索了生产鹅肝的另一条途径。这种方法不是将成纤维细胞转分化为肝细胞或脂肪细胞，而是从直接从例如鸭中收集肝细胞开始。肝细胞采集自幼鸭或鸭胚胎。对细胞进行分离、传代和筛选，以实现高生长率。然后对增殖能力强、悬浮适应能力强、有形成组织倾向的细胞进行培养，培养和收集后加工成鹅肝或鹅肝酱产品。
图21提供了从幼年北京鸭采集的原代鸭肝细胞的明场显微镜图。这些细胞表现出细胞内脂质积聚，是肝细胞的标志特征。
图22为鸭胚胎肝细胞的明场显微镜图。这些细胞也表现出了肝细胞的标志特征——细胞内脂质积聚。
图23A-D分别比较了未转染样本和HNF4α转染中成纤维细胞与肝组织的蛋白质水平、含水量和pH数据。这些数据表明，湿成纤维细胞表现出与湿肝组织相似的蛋白水平(23A)；干成纤维细胞表现出与干肝组织相似的蛋白质水平(23B)；并且成纤维细胞和肝组织之间的水分水平(23C)和pH(23D)相似。
图24和25以图表说明了随着时间的推移，ggCEBPa过表达细胞生长和增殖时细胞培养基成分变化的定量分析。在一些实施例中，细胞培养基不含血清或不含动物组分(ACF)。为了收集这些数据，首先使用生长培养基接种ggCEBPa细胞，然后用浓缩的代谢产物淹没细胞，目的是减少废物并防止早期组织释放。当以低于谷氨酰胺和谷氨酸盐的浓度向细胞培养物中添加葡萄糖时，与葡萄糖相比，ggCEBPa细胞将消耗更高水平的谷氨酰胺和谷氨酸盐，从而保持乳酸盐和氨的量稳定且低于值4，如图所示。乳酸盐和铵的稳定水平低于4，使培养物的pH保持在6.9-7.7的正常范围内。以这种方式改变葡萄糖、谷氨酰胺和谷氨酸盐的浓度，废物保持在较低水平，ggCEBPa组织在培养板中保持附着达16天以上。然而，当以比谷氨酰胺和谷氨酸盐更高的浓度向细胞培养物中添加葡萄糖时，ggCEBPa细胞将消耗更高水平的葡萄糖，并因此产生越来越多的乳酸盐和铵作为废物。乳酸盐和铵水平的升高会导致培养物的pH从6.9-7.7的正常/健康范围降至6.2。pH的下降和废物的增加导致ggCEBPa组织在第13天释放。
图26以图表说明高通量ggCEBPa细胞的mRNA表达数据。具体来讲，这些细胞已经过52次传代，属于晚期细胞。这种晚期细胞的分化和增殖能力通常会下降。然而，正如本文所详述的，本公开的细胞不仅保留了转染的C/EBPα基因的表达，而且还保留了脂肪细胞和脂质生成途径中其他基因(即脂肪生成因子)的表达。这样的表达表明脂肪细胞表型具有很强的稳定性，对于这种晚期细胞来说，这是非常了不起的。此外，这种稳定性对于大规模生产以细胞为基础的肉类尤其有利，因为这种稳定性确保了从该细胞系衍生的细胞所开发的所有产品的连续性和一致性。为了生成这些数据，ggCEBPa细胞每隔3天传代一次，达到52代，这通常是细胞达到约80-90％融合度的时候。y轴log2倍数变化是用RT-qPCT测定的mRNA表达单位。“传代”是指使用胰蛋白酶从培养板分离细胞，然后用培养基中和胰蛋白酶，计数细胞，并将一定百分量(％)的活细胞从原始细胞培养板移至新培养板。向含有细胞的培养物中加入新鲜培养基。该过程表示1次通过。当细胞达到约80-90％的汇合度时，将其传代至新的培养板上。PDL指的是“群体倍增水平”。这个数字表示在一段时间内细胞数量增加一倍的次数。例如，如果在24小时内，细胞自冷冻保存后解冻以来增加了两倍，则细胞的PDL值为2。
图27显示了两种不同的细胞传代技术以及每种技术得到的细胞存活率百分比。使用两种不同的方法，将过量表达ggCEBPa的细胞传代7次，即从第46代至第53代。在第一种方法中，当细胞达到约80-90％汇合度时，细胞传代。第二种方法是在细胞达到完全融合(即100％融合)两天后对细胞进行传代。如图27所示，当细胞达到约80-90％汇合度时，与已经达到汇合度后传代的ggCEBPa细胞相比，传代的ggCEBPa细胞获得一致更高的细胞存活率。具体来讲，当细胞留在培养物中达到100％汇合度时，存活率降低约8-25％。因此，在细胞培养达到约80-90％汇合度时进行细胞传代，可提高细胞传代的效率。
参考
上述所有参考文献的全部内容均并入本文。
Claims (25)
1.一种体外培养的肉制品，其包括：包括成纤维细胞、成肌细胞或其组合的细胞群体，所述细胞群体转分化以表达脂肪细胞表型；其中，所述转分化涉及转染，以通过CEPBα、CEPBγ、PPARγ、SREBP1、SREBP2或其组合的过表达诱导脂肪变性。
2.根据权利要求1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群体被转染从而下调OSR1、PRRX1、LHX9、TWIST2和INSIG2中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的体外培养的肉制品，其中转分化在没有内源激素或公认为将细胞转分化为脂肪细胞表型的小分子的情况下发生。
4.根据权利要求3所述的体外培养的肉制品，其中所述转分化的细胞群体在后期传代时保持增殖能力。
5.根据权利要求3所述的体外培养的肉制品，其中所述转分化的细胞群体在后期传代时显示出稳定的表型。
6.根据权利要求1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群体被转染以过表达HNF4α。
7.根据权利要求1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞转分化以表达肝细胞表型。
8.根据权利要求1所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群体包括具有野生型MyoD的成肌细胞。
9.根据权利要求8所述的体外培养的肉制品，其中所述野生型MyoD过表达。
10.根据权利要求1所述的体外培养的肉制品，其中所述转分化的细胞群体在细胞质中表现出脂滴形成。
11.一种体外培养的肉制品，包括：
a.50-95重量％的体外培养的肉制品，其中体外培养的肉制品包括被转分化表达脂肪细胞表型的细胞群体、被转分化表达肝细胞表型、脂肪细胞谱系细胞、肝细胞谱系细胞中至少一种的细胞群体或其组合；和
b.5-19重量％的黄油、奶油或其混合物。
12.根据权利要求11所述的体外培养的肉制品，其中所述黄油和/或奶油由基于植物的脂质替代物替代。
13.根据权利要求12所述的体外培养的肉制品，其中所述基于植物的脂质替代物是天然油、菜籽油、植物油、红花油、人造黄油或其一些组合。
14.根据权利要求11所述的体外培养的肉制品，包含0.1重量％至1重量％的一种或多种萝卜和胡萝卜。
15.根据权利要求11所述的体外培养的肉制品，包含0.5重量％至6重量％的葱、大蒜和百里香中的一种或多种。
16.根据权利要求11所述的体外培养的肉制品，包含1-12重量％的波特酒。
17.根据权利要求16所述的体外培养的肉制品，其中减少所述波特酒。
18.根据权利要求11所述的体外培养的肉制品，其中所述细胞群体被转染以过表达HNF4α、肝谱系细胞或其某些组合中的至少一种。
19.根据权利要求11所述的体外培养的肉制品，其中所述体外培养的肉制品包括通过过表达CEPBα、CEPBγ或其一些组合而转染以诱导脂肪变性的细胞群体。
20.一种烹饪体外培养的肉制品的方法，包括：
a.在烹饪设备中熔化脂质；
b.将体外培养的肉添加到所述烹饪装置中，其中所述体外培养的肉制品包括转分化以表达脂肪细胞表型的细胞群体；
c.烹饪所述体外培养的肉制品的至少一侧，直到发生颜色变化或质地变化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述体外培养的肉制品包括通过过表达CEPBα、CEPBγ或其组合而转染以诱导脂肪变性的细胞群体。
22.根据权利要求20所述的方法，还包括：
a.向体外培养的肉制品中加入葱、大蒜、百里香、波特酒、盐和胡椒中的一种或多种；和
b.将体外培养的肉制品与脂质混合直至光滑；
23.根据权利要求22所述的方法，还包括冷却所述体外培养的肉制品直至冷冻。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述脂质由基于植物的替代物替代。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述基于植物的脂质替代物包括天然油、菜籽油、植物油、红花油、人造黄油或其一些组合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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