RU2646122C1 - Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс - Google Patents
Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646122C1 RU2646122C1 RU2017111230A RU2017111230A RU2646122C1 RU 2646122 C1 RU2646122 C1 RU 2646122C1 RU 2017111230 A RU2017111230 A RU 2017111230A RU 2017111230 A RU2017111230 A RU 2017111230A RU 2646122 C1 RU2646122 C1 RU 2646122C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- adipocytes
- cells
- vessel
- monolayer
- cultivation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 113
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 89
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims abstract description 34
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims abstract 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 abstract description 17
- 230000004807 localization Effects 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 21
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 1
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010913 Type 1 Angiotensin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010062481 Type 1 Angiotensin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000678 effect on lipid Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс. Способ включает выделение зрелых адипоцитов из жировой ткани крыс, получение в монокультуре монослоя прикрепленных к вкладышу адипоцитов, формирование слоя клеток крыс на дне сосуда, заполнение питательной средой всего объема данного сосуда и размещение вкладыша с монослоем адипоцитов поверх его. Изобретение обеспечивает однотипную локализацию адипоцитов в объеме культурального сосуда, а также возможность микроскопического наблюдения за состоянием всех клеточных популяций. 6 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам совместного культивирования зрелых адипоцитов с другими типами клеток крыс.
Известен способ совместного культивирования (сокультивирования) адипоцитов с другими клетками млекопитающих в виде гетерогенной монослойной культуры (Santander A.M., Lopez-Ocejo О., Casas О et. al. Paracrine Interactions between Adipocytes and Tumor Cells Recruit and Modify Macrophages to the Mammary Tumor Microenvironment: The Role of Obesity and Inflammation in Breast Adipose Tissue // Cancers (Basel). 2015. V. 15, N. 7(1). P. 143-178). Способ предусматривает смешивание двух клеточных суспензий и последующее формирование из гетерогенной популяции общего монослоя. К недостаткам этого способа следует отнести невозможность дифференцированного подхода к оценке биохимических и морфологических изменений в клетках определенного типа.
Известен также способ сокультивирования, сочетающий суспензионную культуру зрелых адипоцитов и монослойную культуру клеток второго типа (Vu V., Kim W., Fang X. et al. Coculture with primary visceral rat adipocytes from control but not streptozotocin-induced diabetic animals increases glucose uptake in rat skeletal muscle cells: Role of adiponectin // Endocrinology. 2007. N. 148. P. 4411-4419). Способ состоит в предварительном выращивании монослоя клеток второго типа; наслаивании суспензии зрелых адипоцитов; совместном культивировании двух клеточных популяций. К недостаткам этого способа сокультивирования следует отнести загрязнение монослоя адгезированных клеток оседающими адипоцитами; низкую жизнеспособность и изменение метаболизма адипоцитов во взвешенном состоянии.
Также известен способ сокультивирования с использованием полупроницаемых мембранных вкладышей (Janke J., Engeli S., Gorzelniak К. et al. Mature adipocytes inhibit in vitro differentiation of human preadipocytes via angiotensin type 1 receptors // Diabetes. 2002. V. 51, N. 6. P. 1699-1707). При этом монослой адгезированных клеток второго типа культивируют на дне сосуда, а суспензия адипоцитов, отделенная мембранным вкладышем, локализуется в верхней части культуральной ячейки.
Недостатками являются неоднородность популяции адипоцитов по локализации (адгезированные на поверхности мембранной вставки, взвешенные, плавающие на поверхности культуральной среды) и низкая жизнеспособность неприкрепленных жировых клеток. Кроме того способ ограничивает возможность применения микроскопии для контроля за состоянием адипоцитов.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят способ сокультивирования с использованием полупроницаемых мембранных вкладышей с альтернативным размещением клеточных популяций (Dirat В., Bochet L., Dabek М. et. al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion // Cancer Res. 2011. V. 71, N 7. P. 2455-2465). Способ включает формирование монослоя адгезированных адипоцитов в нижней части культуральной ячейки; выращивание в монокультуре второго типа клеток на поверхности мембранной вкладки; совместное культивирование двух популяций адгезированных клеток. К недостаткам прототипа следует отнести самопроизвольный отрыв адипоцитов от поверхности культурального пластика, приводящий к всплыванию части жировых клеток. Это ведет к неоднородности популяции адипоцитов по локализации в объеме культуры (адсорбированные на дне ячейки или на нижней поверхности вкладки, взвешенные) и свойствам, что в свою очередь отражается на результатах биохимических анализов, делая их маловоспроизводимыми, затрудняет манипуляции с жировыми клетками. Неоднотипная локализация адипоцитов в комплексе с оптическими свойствами полупроницаемой мембраны затрудняет микроскопический контроль за состоянием клеточных популяций в ходе сокультивирования.
Задачей изобретения является разработка способа совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс, способных к адгезии к культуральному пластику, обеспечивающего однотипную локализацию адипоцитов в объеме культурального сосуда и расширяющего возможности микроскопического наблюдения за состоянием обеих клеточных популяций.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс с использованием полупроницаемых мембран вкладышей, включающем выделение зрелых адипоцитов из жировой ткани крыс, раздельное формирование клеточных монослоев на дне культуральной ячейки и на поверхности вкладыша, совместное культивирование двух клеточных популяций в общем культуральном сосуде, предусмотрены следующие отличия: 1) вкладыш, выполненный в виде пластины из непроницаемого для воды оптически прозрачного материала, размещают поверх культурального сосуда; 2) монослой прикрепленных адипоцитов формируют из всплывающих клеток с пространственной ориентацией на нижней стороне вкладыша; 3) гомогенный монослой прикрепленных адипоцитов отделяют от седиментировавших и взвешенных клеток путем переноса вкладыша из сосуда с монокультурой в сосуд для совместного культивирования.
Сущность предложенного способа заключается в следующем. Выделение зрелых адипоцитов из жировой ткани крыс может быть проведено специалистом в данной области любым известным методом.
Монослой всплывающих адипоцитов получают следующим способом. Культуральные сосуды подходящего объема, предпочтительно лунки многолуночного планшета, заполняют более чем наполовину объема питательной средой, рекомендованной для культивирования адипоцитов, в частности DMEM (среда Игла в модификации Дульбеко). Среду предварительно выдерживают в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в течение 1-2 часов для установления равновесия газов. Поверх среды аккуратно наслаивают клеточную суспензию с расчетным количеством адипоцитов. Культуральные сосуды доверху заполняют питательной средой и, избегая образования пузырьков воздуха, накрывают покровными пластинами. Пластины выполнены из материала (стекла, обработанного пластика), отвечающего двум требованиям: 1) оптическая прозрачность, позволяющая использовать микроскоп для визуального контроля за состоянием клеточной популяции; 2) способность обеспечить клеточную адгезию. Адипоциты инкубируют при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 1-2 суток. В дальнейшем без изменения ориентации пластину с монослоем адипоцитов переносят в сосуд для сокультивирования.
В качестве второго типа клеток для совместного культивирования могут быть выбраны любые клетки, способные к адгезии к культуральному пластику, в том числе гепатоциты, миоциты, тиреоциты, мультипотентые мезинхимальные стромальные клетки (МСК) и другие. Эти клетки могут представлять собой первичные культуры или постоянные клеточные линии. Получение монослоя адгезированных клеток может быть проведено специалистом в данной области с использованием специальных методов.
Совместное культивирование адипоцитов с клетками второго типа ведут в культуральном сосуде (фиг. 1), конструкция которого повторяет конструкцию сосуда, использованного для получения монослоя адипоцитов. Поверх сосуда фиг. 1 (1) размещена пластина с монослоем всплывших адипоцитов фиг. 1 (2), на дне сосуда находится монослой из клеток второго типа фиг. 1 (3). Питательная среда фиг. 1 (4), заполняя весь объем культурального сосуда, обеспечивает свободную диффузию веществ между двумя клеточными популяциями. Состав питательной среды, наличие в ней дополнительных фармакологических препаратов, так же как продолжительность и условия инкубации, подбираются специалистом в данной области исходя из конкретных задач.
Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь. Благодаря изменению положения вкладыша в культуральном сосуде, а именно перемещению его из глубины сосуда к верхнему краю, в качестве субстрата для клеточной адгезии может использоваться только нижняя сторона вкладыша (покровной пластины). При такой конструкции культурального сосуда адипоциты формируют монослой преимущественно не на дне сосуда, а на поверхности покровной пластины, т.к. лишь в этом случае выталкивающая сила Архимеда из фактора, противодействующего адгезии клеток, превращается в фактор способствующий ей. В дальнейшем перенос покровной пластины в отдельный сосуд для сокультивирования позволяет отделить прикрепившиеся адипоциты от седиментировавших и взвешенных клеток, что обеспечивает однотипную локализацию адипоцитов при сокультивировании. Использование для изготовления покровной пластины вместо полупроницаемой мембраны водонепроницаемого оптически прозрачного материала (стекла, обработанного пластика), резко снижая светорассеяние на нем, существенно расширяет возможности микроскопического наблюдения за состоянием клеток, контроля полноты прикрепления и спонтанного открепления адипоцитов как на этапе монокультуры, так и на стадии сокультивирования.
Изобретение позволяет осуществлять сокультивирование любых адгезированных клеток крыс с прикрепившимися адипоцитами, сохраняя раздельность монослоев. Популяция адипоцитов характеризуется высокой гомогенностью благодаря однотипной локализации жировых клеток на поверхности покровной пластины, прочность адгезии адипоцитов достаточна для сохранения целостности монослоя в ходе сокультивирования. Жизнеспособность прикрепившихся адипоцитов сохраняется не менее 5 дней.
Конструкция сосуда для сокультивирования поддерживает свободный обмен молекулами любого размера между клеточными популяциями. Но благодаря разборности конструкции сохраняется возможность использования дополнительных полупроницаемых вкладышей, позволяющих избирательно ограничивать диффузию метаболитов в ходе одного эксперимента. Предлагаемый способ может быть использован для изучения долгосрочных эффектов паракринных взаимодействий, в том числе при тестировании фармакологических препаратов.
Отсутствие пор в материале покровной пластины улучшает его оптические свойства и снижает загрязнение препарата красителем, расширяя возможности применения и повышая качество микроскопии прижизненных и окрашенных препаратов обеих клеточных популяций.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Схема культурального сосуда для сокультивирования зрелых адипоцитов с другими адгезированными клетками: 1 - культуральный сосуд; 2 - монослой всплывающих адипоцитов на покровной пластине; 3 - монослой адгезированных клеток второго типа; 4 - питательная среда.
Фиг. 2. Прижизненное фото адипоцитов в монокультуре: А - монослой седиментировавших адипоцитов; Б - монослой всплывших адипоцитов.
Фиг. 3. Распределение зрелых адипоцитов на дне ячейки и на поверхности покровной пластины в зависимости от технологии внесения клеточной суспензии (в процентах). Вариант 1 - клетки вносят на дно ячейки. Вариант 2 - клеточную суспензию наслаивают поверх питательной среды. Светлые прямоугольники - осевшие адипоциты, темные прямоугольники - всплывшие адипоциты.
Фиг. 4. Фото клеточных монослоев при совместном культивировании адипоцитов и фибробластов в течение 5 дней: А - монослой адгезированных фибробластов (окраска по Романовскому-Гимза); Б - монослой всплывших адипоцитов (окраска красителем Oil Red О).
Фиг. 5. Количество липидов на дне культурального сосуда после 5 дней сокультивирования адипоцитов и МСК. Светлые прямоугольники - питательная среда DMEM; темные прямоугольники - питательная среда DMEM + инсулин; пунктирная линия - количество липидов в 1 день сокультивирования, среда DMEM; сплошная линия - количество липидов в 1 день сокультивирования, среда DMEM + инсулин. Данные представлены в относительных единицах; за единицу принимали содержание липидов в монокультуре неиндуцированных МСК (среда DMEM).
Фиг. 6. Количество липидов на покровной пластине после 5 дней сокультивирования адипоцитов и МСК. Светлые прямоугольники - питательная среда DMEM; темные прямоугольники - питательная среда DMEM + инсулин; пунктирная линия - количество липидов в 1 день сокультивирования, среда DMEM. Данные представлены в относительных единицах; за единицу принимали содержание липидов в монокультуре адипоцитов, поддерживаемых в среде DMEM.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:
Пример 1. Получение монослоя всплывающих адипоцитов и его характеристика
Жировую ткань крыс получали от белых беспородных крыс весом 150-200 г с соблюдением норм биоэтики. В работе использовали подкожный жир из бедренной области.
Выделение зрелых адипоцитов осуществляли по методике, описанной Hazen S.A. с соавторами (Hazen S.A., Rowe W.A., Lynch C.J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. // Journal of Lipid Research. 1995. V. 36. P. 868-875) с некоторыми модификациями. Образцы ткани измельчали ножницами и инкубировали с раствором коллагеназы I типа (200 ед/мл) в DMEM со стептомицином и пенициллином (100 ед/мл) при 37°С в течение 60 минут при постоянном встряхивании. Адипоциты суспендировали в растворе. Непереваренные фрагменты ткани отделяли путем фильтрования через сито с размером ячеек 250 мкм. Клеточную взвесь центрифугировали 10 мин со скоростью 1000 об/мин. Осадок стромально-васкулярной фракции и маточный раствор удаляли. Флотировавшие адипоциты ресуспендировали в растворе Хенкса и центрифугировали в тех же условиях. Процедуру отмывки повторяли трехкратно.
Для получения монослоя всплывающих адипоцитов в ячейки 24-луночного планшета клетки вносили в количестве 104. Ячейки доверху заполняли питательной средой DMEM с антибиотиком и 10% фетальной телячьей сывороткой. Для установления равновесия газов среду предварительно в течение 1,5-2 ч выдерживали при температуре 37°С. Поверх каждой ячейки размещали покровное стекло размером 17×17 мм, избегая образования пузырей воздуха. Планшет накрывали крышкой и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Спустя сутки, когда всплывшие адипоциты прикреплялись к поверхности покровных стекол, их использовали для исследований.
Микроскопический контроль за прикреплением седиментирующих и всплывающих адипоцитов указывает на существенное преобладание в популяции клеток, локализованных на поверхности покровной пластины (фиг. 2). При этом характер распределения адипоцитов зависит от технологии внесения клеточной суспензии (фиг. 3). При внесении клеточной суспензии на дно ячейки фиг. 3 (вариант 1) соотношение осевших и всплывших адипоцитов примерно равно 1:2. При наслаивании клеточной суспензии поверх питательной среды, заполняющей не менее половины объема ячейки фиг. 3 (вариант 2), всплывает около 90% зрелых адипоцитов.
Для оценки прочности прикрепления клеток стеклянную пластину с монослоем адипоцитов переносили в новую ячейку, доверху заполненную свежей питательной средой. Спустя сутки на дне ячейки фиксировались одиночные жировые клетки, их число не превышало 50 на лунку. При повторных процедурах переноса число открепившихся клеток не увеличивалось. Таким образом монослой всплывающих адипоцитов обладает достаточной адгезией, чтобы выдержать манипуляции в ходе сокультивирования. Связанное с откреплением адипоцитов загрязнение дна ячейки не может служить источником серьезной погрешности.
Зрелые адипоциты были идентифицированы при окрашивании красителем Oil Red О. Популяция всплывающих адипоцитов по существу являлась однородной, т.к. загрязнение другими типами клеток не превышало 5%. В ходе культивирования изменений типичной морфологии зрелых адипоцитов отмечено не было.
Жизнеспособность свежеизолированных адипоцитов, определенная с помощью трипанового синего, составляла 90-95% и на протяжении 5 дней культивирования превышала 85%.
Пример 2. Сокультивирование зрелых адипоцитов с фибробластами кожи
Выделение адипоцитов из жировой ткани крыс и формирование монослоя адипоцитов проводили способом, описанным в примере 1.
Выделение фибробластов проводили из полнослойных кожных лоскутов крыс по методу, описанному Pajoum Shariati S.R. с коллегами (Pajoum Shariati S.R., Shokrgozar M.A., Vossoughi M., Eslamifar A. In vitro coculture of human skin keratinocytes and fibroblasts on a biocompatible and biodegradable scaffold // Iran Biomed J. 2009. V. 13, N. 3. P. 169-177) с некоторыми модификациями. Образцы ткани, очищенные от шерсти и гиподермы,измельчали ножницами и инкубировали с раствором коллагеназы I типа (200 ед./мл) в DMEM со стептомицином и пенициллином (100 ед./мл) при 37°С в течение 2 часов при постоянном встряхивании. Непереваренные фрагменты ткани отделяли фильтрованием через сито, клетки осаждали центрифугированием (10 мин. со скоростью 1000 об/мин), осадок ресуспендировали в питательной среде. Фибробласты культивировали в чашках Петри в среде DMEM с антибиотиком и 10% фетальной телячьей сывороткой при 37°С в атмосфере 5% CO2. На следующий день для удаления неприкрепившихся клеток питательную среду заменяли свежей. В дальнейшем среду меняли каждые 2-3 суток. При достижении субконфлюэнтного состояния клетки снимали трипсином-ЭДТА и пересевали в новые чашки.
Для сокультивирования использовали фибробласты второго пассажа. Клетки выращивали в 24-луночном планшете до достижения конфлюэнтности. Ячейки доверху заполняли питательной средой DMEM, поверх, сохраняя ориентацию клеточного монослоя, размещали покровные стекла с прикрепленными адипоцитами. Совместные культуры инкубировали в стандартных условиях в течение 5 дней. Одновременно в аналогичных условиях выращивали монокультуры адипоцитов и фибробластов.
Прижизненную оценку состояния клеточных популяций проводили визуально с использованием микроскопов с прямой и инвертированной оптическими схемами. Морфологию фибробластов оценивали после окраски по Романовскому-Гимза, наличие жировых капель в адипоцитах подтверждали в ходе окраски красителем Oil Red О.
Клетки обеих клеточных популяций сохраняли типичное строение (фиг. 4). На дне ячейки были обнаружены одиночные клетки открепившихся адипоцитов, общая численность которых не превышала 50 штук на ячейку. Признаков загрязнения популяции адипоцитов открепившимися фибробластами отмечено не было. Жизнеспособность фибробластов и адипоцитов, определенная с помощью трипанового синего, составляла более 90%.
Таким образом предлагаемый способ позволяет достичь однотипной локализации прикрепленных адипоцитов в ходе сокультивирования с минимальным загрязнением жировыми клетками популяции, находящейся на дне ячейки.
Пример 3. Сокультивирование зрелых адипоцитов с мультипотентными мезинхимальными стромальными клетками (МСК)
Целью эксперимента было оценить влияние зрелых жировых клеток на накопление липидов в МСК на поздних этапах адипогенной дифференцировки.
Выделение адипоцитов из жировой ткани крыс и формирование монослоя адипоцитов проводили способом, описанным в примере 1.
Выделение МСК производили из жировой ткани крыс по методу Zuk et. al. (Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et all. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Molecular Biology of the Cell. 2002. V. 13. P. 4279-4295). Образцы ткани измельчали ножницами и инкубировали с раствором коллагеназы I типа (200 ед./мл) в DMEM со стрептомицином и пенициллином (100 ед./мл) при 37°С в течение 60 минут при постоянном встряхивании. После инактивации фермента эквивалентным объемом среды DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, клетки осаждали центрифугированием. Осадок отбирали, ресуспендировали в 0,5 мл среды и подвергали гемолизу в течение 2 минут в дистиллированной воде. Изотоничность восстанавливали добавлением 10-кратного фосфатно-солевого буфера. Клетки повторно осаждали центрифугированием, пропускали через нейлоновое сито 100 мкм и высевали в чашки Петри. Клетки культивировали в среде DMEM с антибиотиком и 10% фетальной телячьей сывороткой при 37°С в атмосфере 5% СО2. На следующий день для удаления неприкрепившихся клеток питательную среду заменяли свежей. В дальнейшем среду меняли каждые 2-3 суток. При достижении субконфлюэнтного состояния клетки снимали трипсином-ЭДТ А и пересевали в новые чашки.
Индукцию адипогенной дифференцировки проводили по методу, описанному Hauner Н. с соавторами (Hauner Н., Wabitsch M., Pfeiffer E.F. Differentiation of adipocyte precursor cells from obese and nonobese adult women and from different adipose tissue sites // Horm Metab Res Suppl. 1988. V. 19. P. 35-39). МСК третьего пассажа выращивали в 24-луночном планшете до достижения 80% конфлюэнтности. В ячейки вносили 1000-кратный индуцирующий коктейль (1 мкл на мл среды), создающий конечные концентрации инсулина (5 мкг/мл), дексаметазона (1 мкмоль/л), изобутилметилксантина (500 мкмоль/л). Через двое суток индуцирующую среду заменяли питательной средой, содержащей инсулин (5 мкг/мл). Спустя семь дней, когда в индуцированных клетках стали обозначаться первые липидные капли, МСК использовали для сокультивирования со зрелыми адипоцитами.
Сокультивирование зрелых адипоцитов и индуцированных МСК. Покровные стекла с прикрепившимися адипоцитами с сохранением ориентации клеточного монослоя размещали поверх ячеек с индуцированными или неиндуцированными МСК. Замену питательной среды на аналогичную (DMEM + инсулин или DMEM соответственно) осуществляли каждые 2-3 дня, добиваясь чтобы она заполняла весь объем ячейки без воздушных пузырей. Совместные культуры инкубировали в стандартных условиях в течение 5 дней. Одновременно выращивали монокультуры адипоцитов и МСК.
Прижизненную оценку состояния клеточных популяций проводили визуально с использованием микроскопов с прямой и инвертированной оптическими схемами. Морфологию клеток изучали после окраски по Романовскому-Гимза, наличие жировых капель доказывали в ходе окраски красителем Oil Red О. Для количественного определения липидов краситель Oil Red О экстрагировали с влажных препаратов растворами изопропанола возрастающей концентрации (от 60% до 100%). Экстракты колориметрировали при длине волны 540 нм в кюветах 3 мм. Результаты представляли в относительных единицах. Для популяции клеток, выращенных на дне сосуда, за единицу принимали содержание липидов в монокультуре неиндуцированных МСК. Для популяции клеток, выращенных на покровной пластине, за единицу принимали содержание липидов в монокультуре адипоцитов, поддерживаемых в среде DMEM. Исследование проведено в 6 повторах. Для каждой группы рассчитывали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего.
В ходе совместного культивирования количество запасенных липидо, как в индуцированных, так и в неиндуцированных МСК увеличивалось более чем в 10 раз по сравнению с исходным уровнем (на фиг. 5 сплошная линия и пунктирные линии соответственно). Влияние зрелых адипоцитов на процесс накопления липидов неиндуцироваными МСК было сопоставимо с действием индуцирующего коктейля в монокультуре мезинхимальных стромальных клеток. Однако морфологически две популяции существенно отличались. В монокультуре клетки содержали по несколько крупных жировых включений. Для совместной культуры, напротив, характерны множественные мелкие липидные капли.
Запас липидов в монослое зрелых адипоцитов определялся, прежде всего, наличием в питательной среде инсулина (фиг. 6). Под действием этого гормона количество липидов возрастало и одновременно сокращалось число адипоцитов малого диаметра. Присутствие МСК в совместной культуре не оказывало значимого влияния на накопление липидов зрелыми алипоцитами.
Проведенный эксперимент демонстрирует, что при совместном культивировании зрелые адипоциты стимулируют липогенез в клетках дифференцирующихся МСК, в то время как обратное влияние не обнаруживается.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет поддерживать однотипную локализацию прикрепленных адипоцитов в ходе сокультивирования, расширяя возможности использования микроскопии для контроля за состоянием обеих клеточных популяций. Способ может быть использован для изучения долгосрочных эффектов паракринных взаимодействий, в том числе при тестировании фармакологических препаратов.
Claims (1)
- Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс, способных к адгезии к культуральному пластику, характеризующийся тем, что выделяют зрелые адипоциты из жировой ткани крыс, получают монослой прикрепленных к вкладышу адипоцитов в монокультуре, где для получения монослоя адипоциты размещают в сосуде с монокультурой, который доверху заполняют питательной средой, накрывают указанный сосуд вкладышем и формируют за счет всплывающих клеток монослой прикрепленных к нижней стороне вкладыша адипоцитов, далее на дне сосуда для совместного культивирования формируют слой клеток крыс, способных к адгезии, путем выращивания их в сосуде для совместного культивирования до достижения конфлюэнтности, после чего весь объем сосуда заполняют питательной средой, вкладыш с прикрепленным монослоем адипоцитов и с сохранением ориентации переносят из сосуда с монокультурой в сосуд для совместного культивирования и размещают его поверх сосуда для совместного культивирования, причем вкладыш выполнен в виде пластины из непроницаемого для воды оптически прозрачного материала.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017111230A RU2646122C1 (ru) | 2017-04-04 | 2017-04-04 | Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017111230A RU2646122C1 (ru) | 2017-04-04 | 2017-04-04 | Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646122C1 true RU2646122C1 (ru) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017111230A RU2646122C1 (ru) | 2017-04-04 | 2017-04-04 | Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646122C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200700660A1 (ru) * | 2004-09-17 | 2007-10-26 | Джон Вейн | Мясные продукты и способ их получения |
| RU2573922C2 (ru) * | 2010-10-08 | 2016-01-27 | Натурин Вискофан Гмбх | Устройство для культивирования клеточных культур |
-
2017
- 2017-04-04 RU RU2017111230A patent/RU2646122C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200700660A1 (ru) * | 2004-09-17 | 2007-10-26 | Джон Вейн | Мясные продукты и способ их получения |
| RU2573922C2 (ru) * | 2010-10-08 | 2016-01-27 | Натурин Вискофан Гмбх | Устройство для культивирования клеточных культур |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DIRAT В., BOCHET L. et al., Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion // Cancer Res., 71, (7), 2011, стр. 2455-2465. * |
| DIRAT В., BOCHET L. et al., Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion // Cancer Res., 71, (7), 2011, стр. 2455-2465. JANKE J., ENGELI S. and et al., Mature adipocytes inhibit in vitro differentiation of human preadipocytes via angiotensin type 1 receptors // Diabetes, Vol. 51, 2002, стр. 1699-1707. * |
| JANKE J., ENGELI S. and et al., Mature adipocytes inhibit in vitro differentiation of human preadipocytes via angiotensin type 1 receptors // Diabetes, Vol. 51, 2002, стр. 1699-1707. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ghazanfari et al. | Effects of cyclic stretch on proliferation of mesenchymal stem cells and their differentiation to smooth muscle cells | |
| Varone et al. | A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it | |
| Shamir et al. | Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease | |
| Yen et al. | High-throughput reconstitution of epithelial–mesenchymal interaction in folliculoid microtissues by biomaterial-facilitated self-assembly of dissociated heterotypic adult cells | |
| US6875605B1 (en) | Modular cell culture bioreactor and associated methods | |
| CA2612269C (en) | Method of producing organotypic cell cultures | |
| US20110207175A1 (en) | Multi-culture bioreactor system | |
| Cullen et al. | Microfluidic engineered high cell density three-dimensional neural cultures | |
| US11633523B2 (en) | Method for producing cell tissue, and porous film | |
| JP2011172533A (ja) | マイクロ空間構造体を用いた高密度三次元細胞培養法 | |
| EP2539437B1 (en) | SMOOTH MUSCLE-LIKE CELLS (SMLCs) DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS | |
| CN102858955A (zh) | 由人多潜能干细胞制备人黑色素细胞的方法 | |
| Kukumberg et al. | Microlens topography combined with vascular endothelial growth factor induces endothelial differentiation of human mesenchymal stem cells into vasculogenic progenitors | |
| CN107164315B (zh) | 一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法 | |
| TW202128977A (zh) | 細胞層片製造裝置及細胞層片 | |
| CN106661552A (zh) | 心脏细胞培养材料 | |
| LaNasa et al. | Influence of ECM proteins and their analogs on cells cultured on 2-D hydrogels for cardiac muscle tissue engineering | |
| CA2568475C (en) | A method for creating cell clusters | |
| CN116981764A (zh) | 使用微孔板孔单元进行类器官传代的方法 | |
| CN114276903A (zh) | 一种肝脏类器官的培养芯片、肝脏类器官模型及其制备方法与应用 | |
| Eigenhuis et al. | A simplified protocol for the generation of cortical brain organoids | |
| Attiogbe et al. | An in vitro autologous, vascularized, and immunocompetent Tissue Engineered Skin model obtained by the self-assembled approach | |
| WO2009080794A1 (en) | Method for preparing cell-specific extracellular matrices | |
| RU2646122C1 (ru) | Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс | |
| CN111909888A (zh) | 用于构建屏障加强体外重组表皮模型的ta培养液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200405 |