CN102858955A - 由人多潜能干细胞制备人黑色素细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，所述方法包括在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的终末分化的试剂存在下共培养人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞的步骤。本发明还涉及可通过所述方法获得的人黑色素细胞以及其在细胞治疗和筛选试验中的用途。

Description

由人多潜能干细胞制备人黑色素细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法。
背景技术
黑色素细胞是色素产生细胞，其负责皮肤、眼睛和毛发的着色。在脊椎动物的发育中，黑色素细胞源于神经嵴，并且经历命运特化、增殖、迁移、存活(survival)和分化的复杂过程后最终存在于表皮中。色素沉着(pigmentation)由在被称为黑色素体的特定细胞器中高度受控的黑色素生产而获得。通过被称为黑素生成这一过程，黑色素体沿着所述树突进行运输并被转移至生长的毛发，或被转移至周围的角质形成细胞以在保护人组织抵抗导致DNA损伤和组织癌症的阳光紫外线(UV)辐射的有害影响中发挥重要作用。在过去10年中，几种基因已被关联于涉及黑色素细胞的色素性疾病。这些疾病可分为三种类型。第一种，影响黑色素细胞从神经嵴中发育的疾病(斑驳病、瓦尔登布尔氏(Waardenburg)综合征和遗传性对称性色素异常症)，第二种，具有黑色素合成缺陷的疾病(白化病)以及第三种，黑色素体成熟或转移疾病(赫曼斯基-普德拉克(Hermansky-Pudlak)综合征、契-东(Chediak-Higashi)综合征和格里塞利(Griscelli)综合征)(Rose PT等)。有趣的是，尽管为更好地了解成熟黑色素细胞的功能和调控已经进行了大量的努力，但是对人体内涉及黑色素细胞从胚胎前体的发育和分化的分子和细胞机理仍然所知甚乏。
用一组胚胎转化因子转化体细胞产生了具有胚胎干细胞(hESC)的多潜能特性的细胞。这些诱导的多潜能干细胞(hiPSC)具有分化成为任意细胞类型的潜能，这使其成为潜在来源，从其中产生细胞以作为治疗平台用于广泛疾病的治疗。作为这些细胞治疗效益的概念验证(proof of concept)，据表明源于hiPSC的骨髓细胞可在适当的人源化小鼠模型中逆转镰刀型细胞贫血症表型。
黑色素细胞的体外诱导最初由Yamane等(1999)所报道，他们在21天期间在包含干细胞因子(SCF)、内皮素3(EDN3)、12-O-十四烷酰-佛波醇13-乙酸酯(TPA)和地塞米松的培养基中将小鼠胚胎干细胞共培养于单层基质细胞系ST2之上。更近期间，Herlyn实验室(Fang等，2006)已经表明通过使用人拟胚体，在不存在滋养细胞的情况下使用蛋白质诱导物的组合，即Wnt3a、内皮素-3和SCF，可从hESC产生黑色素细胞。
但是，在先前领域中并无使用2D方案从人多潜能干细胞中产生人黑色素细胞的方法的报道。
因此，该领域中仍然存在从人多潜能干细胞中产生人黑色素细胞的新方法的需求。
发明简述
本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，所述方法包括步骤a)在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的终末分化的试剂存在下共培养人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞。
本发明还涉及可通过上述方法获得的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群。
本发明还涉及药物组合物，其包含上文所述的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
在进一步方面，本发明还涉及用于治疗方法的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群或上文所述的药物组合物。
本发明还涉及制备人皮肤替代品的方法，其包括提供本发明的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群的步骤和提供人角质形成细胞群的步骤。
此外，本发明涉及可通过上文所述的方法获得的人皮肤替代品并且涉及其在治疗方法中的应用。
在另一个方面，本发明涉及用于筛选对人黑色素细胞具有给定生物效应的化合物的方法，其包括以下步骤：
i)在测试化合物存在或不存在的情况下培养根据上文所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群；
ii)比较在所述测试化合物存在或不存在的情况下黑色素细胞群中的所述给定生物效应。
本发明还涉及根据上文定义的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群或人皮肤替代品用于筛选化合物的应用。
发明详述
本发明涉及用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，所述方法包括步骤a)在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的终末分化的试剂存在的情况下将人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞共培养。
所述术语“黑色素细胞”具有其在本领域中的通常含义。它是指上皮和毛发中有色的黑色素分泌细胞，其负责所述皮肤和毛发的着色。
有利地，本发明的离体方法是一种2D方法，其实现了对所述人多潜能干细胞分化成人黑色素细胞的不同阶段的监控。因此，本发明方法可用于筛选干预(正性或负性)该分化过程的化合物。
“细胞培养表面”或“细胞培养基质”的表述是指适用于细胞培养的各种类型的表面或基质。所述术语“细胞培养表面”包括但不限于组织培养平板、碟、孔或瓶。在一个特定的实施方案中，所述培养表面是所述培养平板、碟、孔或瓶的塑料表面。所述细胞培养表面与真皮成纤维细胞的包被相容。
本文所使用的表述“支持外胚层分化的细胞”是指提供适当的底物并且分泌适当的因子以支持人多潜能干细胞的生长和分化的细胞。在一个特定的实施方案中，支持外胚层分化的细胞选自成纤维细胞，更特别地选自人和小鼠成纤维细胞，并且更特别地选自真皮成纤维细胞。在一个特定的实施方案中，支持外胚层分化的细胞是丝裂霉素灭活的或放射灭活的人真皮成纤维细胞。
在本发明的一个实施方案中，支持外胚层分化的所述细胞是滋养成纤维细胞。
本文所使用的表述“滋养成纤维细胞”是指作为多潜能干细胞的基底层使用并且为将干细胞维持在未分化状态而不丢失多潜能性而提供分泌因子、细胞外基质和细胞接触的细胞。滋养细胞可通过γ射线照射或丝裂霉素进行灭活。根据本发明的一个实施方案，所述滋养成纤维细胞可来自成纤维细胞，更特别地来自人和小鼠成纤维细胞，并且更特别地来自真皮成纤维细胞，其包括真皮成纤维细胞系。真皮成纤维细胞系的实例包括但不限于CCD-1112SK(Hovatta O等，2003)和3T3-J2(Rheinwald JG等，1975)。在一个具体的实施方案中，在被包被于所述培养表面之前，预先处理真皮成纤维细胞以终止其增殖。因此，可使用放射线照射或使用细胞周期阻断剂如丝裂霉素处理真皮成纤维细胞。
本文所使用的术语“真皮成纤维细胞”是指合成和维持真皮细胞外基质的细胞群。真皮成纤维细胞的特异性标记物包括波形蛋白和FAP(成纤维细胞活化蛋白)。
根据本发明的一个实施方案，以真皮成纤维细胞可天然粘附其上的方式选择所述细胞培养表面。可选择各种材料的细胞培养表面。这些材料的实例包括但不限于塑料组织培养皿或以明胶包被的培养皿。
本文所使用的表述“刺激表皮诱导的试剂”是指能够诱导表皮标记物如角蛋白8和角蛋白18表达的试剂。刺激表皮诱导的试剂一般抑制滋养层和中胚层诱导。
在一个特定的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂选自骨形态发生蛋白(如BMP-2、BMP-4和BMP-7)、受体调控的Smad蛋白(如Smad 1、Smad 5和Smad 9)和TGF-β家族配体(如生长和分化因子6：GFD-6)(Moreau等，2004)。在一个优选的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂选自BMP-2、BMP-4、BMP-7、Smad1、Smad5、Smad7和GFD-6。在一个优选的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂是BMP-4。
所述术语“BMP-4”是指骨形态发生蛋白4。BMP-4是属于TGF-β超家族蛋白质的多肽。示例性的天然BMP-4氨基酸序列在GenPept数据库中以登录号AAC72278提供。
在一个实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂选自BMP-2、BMP-4、BMP-7、Smad1、Smad5、Smad7和GFD-6。
在一个优选的实施方案中，所述刺激表皮诱导的试剂是BMP-4。BMP-4的浓度可介于0.02nM至77nM或介于0.3ng/mL至1000ng/mL。在一个特定的实施方案中，BMP-4的浓度是0.5nM。
本文所使用的表述“刺激角质形成细胞的终末分化的试剂”是指刺激角蛋白5和角蛋白14表达的试剂。实际上，角蛋白5和角蛋白14是能够在3D培养物中终末分化的基底角质形成细胞的标记物。在一个特定的实施方案中，所述刺激角质形成细胞的终末分化的试剂选自抗坏血酸和视黄酸。
在一个优选的实施方案中，所述刺激角质形成细胞的终末分化的试剂是抗坏血酸。
所述术语“抗坏血酸”是指(R)-3，4-二羟基-5-((S)-1，2-二羟乙基)呋喃-2(5H)-酮，其具有以下结构式：
Figure BPA00001595553300051
根据本发明的一个实施方案，抗坏血酸的浓度可介于0.01mM至1mM。在一个特定的实施方案中，抗坏血酸的浓度是0.3mM。
本文所使用的术语“人多潜能干细胞”是指具有形成任何成体细胞能力的任何人前体细胞。
在一个特定的实施方案中，人多潜能干细胞包括但不限于人胚胎干细胞(hES细胞)或人诱导多潜能干细胞(hiPS细胞)。
在一个优选的实施方案中，所述人多潜能干细胞在不破坏人胚胎的情况下获得。
本文所使用的术语“人胚胎干细胞”或“hES细胞”或“hESC”是指具有形成任何成体细胞能力的人前体细胞。hES细胞获自小于一周的受精胚胎。
根据本发明的一个实施方案，hES细胞可选自任何hES细胞系。hES细胞系的实例包括但不限于，SA01、VUB-01、WA01(H1)(ThomsonJA等，1998)和WA09(H9)(Amit M等，2000)。根据本发明，如Fang等(2006)所描述hES细胞此前并未在拟胚体中分化。
本文所使用的术语“人诱导多潜能干细胞”或“人iPS细胞”或“人iPSC”或“hiPSC”是指由人非潜能细胞(如成体体细胞)人工衍生的一类人多潜能干细胞。人诱导多潜能干细胞在形成任何成体细胞的能力上等同于人胚胎干细胞，但是并非源自于胚胎。一般情况下，可通过Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因在任何成体体细胞(如，成纤维细胞)中的诱导表达而获得人诱导多潜能干细胞。例如，人诱导多潜能干细胞可根据Takahashi K等(2007)、Yu等(2007)所述的方案获得，或通过任何如下所述其它方案获得：其中将在这些原始方案内用于重编程细胞的一种或其它试剂替换为作用于或转移至iPS细胞系起源的体细胞的任意基因或蛋白质。基本上，成体体细胞用包含Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的病毒载体如逆转录病毒转染。
根据本发明的一个实施方案，人iPS细胞可选自任何人iPS细胞系。人iPS细胞系的实例包括但不限于克隆201B(Takahashi等，2007)和hiPS(Foreskin)或IMR90(Yu等，2007)。
或者，hES细胞或人iPS细胞可选自可为治疗目的构成的主细胞库。在优选的方式中，可以选择hES细胞或hiPS细胞以避免或限制大部分人群中的免疫排斥。hES细胞或hiPS细胞对于编码主要组织相容性抗原A、B和DR的基因一般是HLA纯合型的，这意味着它们在所述HLA库(HLA repertory)中具有简单的基因特征(Nakatsuji N等，2008和Taylor C等，2003)。所述细胞可用于创建干细胞库以作为适用于制备用于与黑色素细胞缺陷相关的病症的细胞治疗的黑色素细胞的可再生的细胞源。
在另一个特定的实施方案中，人多潜能干细胞可携带导致人遗传疾病的一个或多个突变，并且特别是导致人皮肤遗传疾病的突变。
本文所使用的表述“与黑色素细胞缺陷相关的病症”或“色素性疾病”是指功能性黑色素细胞缺乏的任何病症或疾病。这可由黑色素合成所必需的酶的缺陷、由黑色素细胞的发育和/或增殖和/或存活的缺陷所导致。
与黑色素细胞缺陷或涉及黑色素细胞的色素性疾病相关的病症包括但不限于影响黑色素细胞从神经嵴中发育的疾病(斑驳病、瓦尔登布尔氏症和遗传性对称性色素异常症)、具有黑色素合成缺陷的疾病(白化病)、黑色素体成熟或转移疾病(赫曼斯基-普德拉克综合征、契-东综合征和格里塞利综合征)以及白癫风。
一般情况下，步骤a)在补充有刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞终末分化的试剂的基础培养基(base culture medium)中进行。适当的基础培养基可以是，例如FAD培养基(达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)(DMEM)与汉氏F12(Ham′s F12)培养基的3∶1混合物)和10％的胎牛血清，补充以5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、10-10mol/L霍乱毒素、1.37ng/mL重组表皮生长因子。
在一个实施方案中，所述基础培养基不含源自动物的物质。在一个优选的实施方案中，所述基础培养基基本上由合成化合物、人源化合物和水组成。有利地，所述培养基可根据良好生产规范(在“GMP”条件下)用于培养细胞。一般情况下，所述血清可由N2B27培养基替代，如Ying等，2003、Lowell等，2006和Liu Y等，2006中的描述。N2B27包含1/1比率的DMEM/F12和神经元基础培养基(Neurobasal media)、N2补充物(1/100)、B27补充物(1/50)和β-巯基乙醇(1/1000)。例如，其可从Stem Cell Sciences UK Ltd.以货号SCS-SF-NB-02获得。
在另一个实施方案中，可在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞终末分化的试剂存在下并且在刺激黑色素细胞分化的试剂存在下在基础培养基中进行步骤a)。一般情况下，刺激黑色素细胞分化的所述试剂可选自WNT家族蛋白(诸如wnt3a)、干细胞因子(SCF)和内皮素3(EDN3)(Fang等，2006)。这些蛋白质参与从神经嵴向色素细胞的分化。所述Wnt蛋白质家族在小鼠中诱导神经细胞和色素细胞的形成。在缺失EDN3或其受体的动物体内黑色素细胞的缺乏提示该通路在源自神经嵴的黑色素细胞群的发育中是关键的。
体外研究中表明EDN3促进黑色素细胞前体的增殖、存活和分化。KIT(编码SCF受体)中的突变不影响黑色素细胞系的特化，而是阻碍成黑色素细胞(melanoblast)在后期发育阶段的存活。特别地，SCF/KIT信号对于所述前体成黑色素细胞的迁移、增殖、存活和分化是关键性的。
Wnt3a信号决定了神经嵴细胞的黑色素细胞命运，EDN3对细胞命运有所贡献，并且SCF促进了定向祖细胞(committed progenitor)的增殖/存活。
根据本发明，人多潜能干细胞(如，hES细胞或人iPS细胞)在步骤a)期间培养足以使色素细胞群克隆出现的一段时间。色素细胞群的所述克隆可由技术人员以肉眼容易地鉴别而无需使用显微镜。
根据一个特定的实施方案，步骤a)进行至少35天、优选地至少40天，甚至更为优选地至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天或至少75天。
一般情况下，将步骤a)进行最多120天，优选地最多100天。
本发明的进一步目的涉及可由上述方法获得的源自人多潜能干细胞的分离的人黑色素细胞群。
本文所使用的术语“分离的”是指与其天然环境的至少一些组分相分开的细胞或细胞群。
本发明的进一步目的涉及可由上述方法获得的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群。
本文所使用的术语“基本上纯的同质群”是指其中细胞总数的大部分(如，至少约80％，优选地至少约90％，更优选地至少约95％)具有目标黑色素细胞的特定特征的细胞群。
在一个实施方案中，通过Taqman阵列(Taqman array)评估本发明的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群具有少量与成体黑色素细胞相比不同地调控的黑素生成发生。
在一个实施方案中，当使用人iPS细胞时，本发明的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群包含转基因(其在步骤a之前进行的重编程步骤期间引入所述细胞)。
根据进一步的实施方案，步骤a)后可进行下列步骤：
b)从步骤a)获得的细胞群中分离色素细胞；
c)在适当的培养基中培养所述分离的细胞。
当涉及培养物中的细胞时，本文所使用的“分离”是指所述细胞的克隆，即将所述细胞与培养物中的其它细胞分开以建立新克隆的事实。一般情况下可使用细胞培养领域的技术人员已知的标准技术进行步骤b)。
在一个实施方案中，所述分离步骤b)可包括使用机械和/或酶学处理进行的细胞解离。一般情况下，所述分离步骤b)可包括用胰蛋白酶处理。
一般情况下，所述分离步骤b)可进一步包括将分离的色素细胞接种在适当的细胞培养表面上。
本文所使用的术语“适当的培养基”是指包含用于支持特定细胞群生长、增殖和存活所必需的营养物的培养基。
特别地，亦称为“黑色素细胞培养基”的用于人黑色素细胞的适当的培养基是包含用于支持人黑色素细胞的生长、增殖和存活所必需的营养物的培养基。一般情况下，本发明的黑色素细胞培养基可由，例如，补充以生长因子的254CF培养基(Invitrogen)构成。
一般情况下，适用于本发明的步骤c)的适当的培养基不含BMP-4和抗坏血酸。
本发明的人黑色素细胞(或基本上纯的同质人黑色素细胞群)可用于数种类型的应用，其包括但不限于：
1)色素性疾病或皮肤损害的细胞治疗；
2)通过重构人皮肤替代品而进行的组织工程；
3)用于药理学和毒理学研究的细胞模型；
4)研究黑色素细胞发育机制和鉴定治疗黑素瘤的新型治疗靶。
1)色素性疾病或皮肤损害的细胞治疗
根据本发明方法获得的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群随后可适用于治疗。
在过去10年中，几种基因已被关联于涉及黑色素细胞的色素性疾病。这些疾病可分为三种类型。第一种，影响黑色素细胞从神经嵴中的发育的疾病(斑驳病、瓦尔登布尔氏综合征和遗传性对称性色素异常症)，第二种，具有黑色素合成缺陷的疾病(白化病)以及第三种，黑色素体成熟或转移疾病(赫曼斯基-普德拉克综合征、契-东综合征和格里塞利综合征)。有趣的是，尽管为更好地了解成熟黑色素细胞的功能和调控已经进行了大量的努力，但是对人体内涉及黑色素细胞从胚胎前体的发育和分化的分子和细胞机理仍然所知甚乏。
此外，白癫风是皮肤上的脱色斑块。其在免疫系统已经破坏黑色素细胞片块的情况下发生，所述黑色素细胞是产生黑颜色的黑色素的细胞。
去色素的皮肤在所述皮肤的裸露区域变得对光敏感，这导致在阳光曝露下变红和晒伤。根据白癫风的类型、程度和病程，常规药物疗法如局部或全身的皮质类固醇、局部免疫调节剂和光疗并非总是成功的，并且色素再沉着(repigmentation)通常不完全。
在药物疗法无法引起色素再沉着的情况下或对于手术反应良好的节段型白癜风的情况，手术方法变得至关重要。手术治疗的基本原理是活体黑色素细胞从色素供体皮肤向受体白癜风部位的自体移植。已经描述了包括组织移植和细胞移植在内的多种移植方法。所述疾病的稳定性是获得成功结果的最重要标准。
因此，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物可进一步包含至少一种具有生物活性物质或生物活性因子。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指不干扰所述祖细胞的生物学活性效力的载体介质，并且其在所施用的浓度下不对所述宿主产生过度的毒性。适当的药学上可接受的载体或赋形剂的实例包括但不限于，水、盐溶液(如，林格氏液)、油、明胶、碳水化合物(如，乳糖、淀粉酶或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯六茜素(pyroline)。药物组合物可被配制成液体、半液体(如，凝胶)或固体(如基质(matrix)、网格(lattice)、骨架(scaffolds)等)。
本文所使用的术语“生物活性物质或生物活性因子”是指其在本发明药物组合物中的存在有益于受试者接受所述组合物的任何分子或化合物。如本领域的技术人员所公认，适用于实施本发明的生物活性物质或生物活性因子可在广泛的多个生物活性分子和化合物家族中找到。例如，可用于本发明上下文中的生物活性物质或生物活性因子可选自抗炎剂、抗细胞凋亡剂、免疫抑制剂或免疫调节剂、抗氧化剂、生长因子和药物。
本发明的一个相关方面涉及用于治疗患有与黑色素缺陷有关的病症的受试者的方法，所述方法包括将有效量的本发明的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群(或其药物组合物)施用于受试者的步骤。
本文所使用的术语“受试者”是指哺乳动物，优选人类，其可患有与皮肤损伤有关的病症，但是可能或可能不具有所述病症。
在本发明上下文中，本文所使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指目的在于延迟或预防病症发作，或目的在于逆转、减轻、抑制、减缓或终止所述病症症状的发展、加剧或恶化，或目的在于带来所述病症症状的改善，并且/或者目的在于治愈所述病症的方法。
本文所使用的术语“有效量”是指足以获得预期目的的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群(或其药物组合物)的任何量。
可使用任何适当方法将本发明的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群(或其药物组合物)施用于受试者。
在特定的实施方案中，本发明的治疗进一步包括在开始基于细胞的治疗之前对所述受试者进行药物免疫抑制。用于受试者的全身或局部免疫抑制的方法是本领域中所熟知的。
有效剂量和给药方案可以容易地通过基于所述受试者的病症性质的良好医疗规范(good medical practice)来确定，并且其应取决于许多因素，包括但不限于，所述病症症状程度和目的组织或器官的损伤或退化程度，以及该受试者的特征(如，年龄、体重、性别、基本健康等)。
一般情况下，可将本发明的人黑色素细胞用于治疗色素性疾病和色素遗传性皮肤病的方法。
一般情况下，可通过建立仿人皮肤生理的黑化表皮(melanisedepidermis)而将本发明的人黑色素细胞用于治疗皮肤损害的方法(严重烧伤患者、下肢溃疡(leg ulcer)如糖尿病性皮肤溃疡和镰刀细胞贫血……)。
本发明的人黑色素细胞还可用于提供对涉及包括遗传疾病在内的皮肤色素性疾病和光敏感性的机制的深入了解。
2)组织工程—重构人皮肤替代品
可通过上述方法获得的源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞能够再现(recapitulate)原代人黑色素细胞的全部形态学和功能属性。实际上，本发明人证实所述细胞能够通过黑色素体产生和分泌黑色素。当并入具有人角质形成细胞的3D器官型(organotypic)系统时，它们能够参与黑化多分层表皮(pluristratified epidermis)的形成。
本发明的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群还可适用于制备人皮肤替代品。有利地，本发明的人皮肤替代品是黑化的皮肤替代品。
可将本发明的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群单独或与其它细胞组合而移植，和/或与其它生物活性因子或试剂和/或药物组合而移植。本领域的技术人员应当了解，可将这些其它细胞、生物活性因子、试剂和药物与本发明的细胞同时或顺次施用。
一般情况下，可将本发明的基本上纯的同质人黑色素细胞群与人角质形成细胞组合移植以重构人表皮。本领域的技术人员了解以何种比率组合所述细胞。
一般情况下，根据所需的结果，所述黑色素细胞与角质形成细胞的比率可介于1∶1至1∶100。在优选的实施方案中，以介于1∶3至1∶20的比率将本发明的人黑色素细胞与角质形成细胞组合使用。
用于进行这种方法的角质形成细胞可以是能够重构人表皮的任何人源角质形成细胞。其可以是分离自人皮肤样品的原代角质形成细胞。或者，其可以是源自人多潜能干细胞的角质形成细胞。
一般情况下，所述角质形成细胞可根据Guenou等，2009中描述的方法由人多潜能干细胞衍生。
角质形成细胞的完全层化和组织分化可通过使用三维器官型培养方法(Doucet O等，1998；Poumay y.等，2004；Gache Y.等，2004)来实现。例如，当体外培养物在气-液界面生长时，形成了高度有序的角质层。
本文所使用的术语“器官型培养”是指三维组织培养，其中所培养的细胞用于在体外重构组织或器官。
在一个特定的实施方案中，本发明的人皮肤替代品可根据PoumayY等，2004所描述产生。角质形成细胞的培养可在聚碳酸酯培养插入物(polycarbonate culture insert)上进行。这些细胞可以在补充以1.5mMCaCl2和50μg/ml抗坏血酸的Epilife培养基上维持11天。通过除去培养基而将这些细胞暴露于所述气-液界面10天。
在一个特定的实施方案中，将角质形成细胞接种于移植有人真皮成纤维细胞的细胞培养基质之上，然后提供如上所述的其器官型培养物。该特定技术实现了获得包含真皮和表皮的人皮肤替代品。这种方法可通过Del Rio M.等，(2002)或Larcher F.等，(2007)所描述的方案来进行。例如，可将角质形成细胞接种于移植有活的真皮成纤维细胞的纤维蛋白基质之上。随后使器官型培养物覆盖生长以达到角质形成细胞汇合，并且最终在所述气-液界面维持7天以增强所述上皮的层化和分化。
一般情况下，本发明的人皮肤替代品包含多分层表皮，其产生自如上所述的源自人多潜能干细胞的基本上纯的同质人黑色素细胞群的源自体外的培养物和人角质形成细胞，其分层成为黑化的鳞状上皮。在一个特定的实施方案中，本发明的人皮肤替代品可包含如上所述的黑化多分层表皮和真皮。
因此，本发明的进一步方面涉及制备人皮肤替代品的方法，其包括提供上文所述的源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群和提供人角质形成细胞群的步骤。
本发明的进一步目的涉及可根据上文所述的方法而获得的人皮肤替代品。
本发明的进一步目的涉及使用上文所述的人皮肤替代品对动物移植，优选哺乳动物，更优选小鼠的方法。在一个特定的实施方案中，所述动物是免疫缺陷型动物(如，NOD/SCID小鼠)。所述方法可用于为人皮肤提供动物模型。
在一个特定的实施方案中，用本发明人皮肤替代品移植的动物可根据Del Rio M.等(2002)所述产生。简而言之，将动物剃净并且在无菌条件下净化。随后在小鼠背部产生全层伤口(Full-thickness wound)，并且最终在无菌条件下用本发明的人皮肤替代品进行移植。随后的10-12周可足以在所述动物上获得人皮肤。
本发明的进一步目的涉及可根据上文所述的方法而获得的人皮肤的动物模型。
本发明的人皮肤替代品和动物模型可具有多种用途。这些用途包括但不限于，用于筛选化合物、培养肿瘤的底物和病理学试剂(如，人乳头瘤病毒)，以及用于模拟人身损伤或与皮肤损伤有关的病症以及用于药理毒理分析。
特别地，本发明的皮肤替代品和动物模型可用于研究由UV暴露所诱导的DNA损害和多种药物对由UV暴露所诱导的DNA损害的潜在效果。
例如，本发明的人皮肤替代品和动物模型可用于多种体外和体内测试。在特定的但非限制性的情况下，本发明的人皮肤替代品和动物模型在护肤产品、药物代谢、对测试化合物的细胞反应、伤口愈合、光毒害、皮肤刺激、皮肤炎症、皮肤侵蚀和细胞损伤的评价中具有用途。一般情况下，对于本发明的动物模型，所述产品可局部施用于所述人皮肤上或可通过口、舌下、皮下、肌内、静脉内和经皮途径施用。
本发明包括多种筛选试验。在一些实施方案中，所述筛选方法包含提供本发明的人皮肤替代品或动物模型和至少一种测试化合物或产品(如，护肤产品，诸如保湿剂、化妆品、染料或香水；所述产品可以为包括但不限于霜剂、洗液、液体和喷剂的任意形式)，将所述产品或测试化合物施用于所述人皮肤替代品或动物模型，以及分析所述产品或测试化合物在所述人皮肤替代品或动物模型上的效果。一般情况下，对于本发明的动物模型，所述测试化合物或产品可局部施用于所述人皮肤上或可通过口、舌下、皮下、肌内、静脉内和经皮途径施用。可使用各种试验以测定所述产品或测试化合物在所述人皮肤替代品或动物模型上的效果。所述试验可涉及所述化合物或产品的毒性、效力或功效。此外，可测试所述化合物或产品对生长、屏障功能或组织强度的效果。
在其它优选的实施方案中，本发明的人皮肤替代品或动物模型用于筛选药物透皮引入的功效。
在一个特定的实施方案中，本发明的人皮肤替代品和动物模型还可用于培养和研究天然形成于皮肤中的肿瘤，以及用于培养和研究影响皮肤的病原体。因此，在一些实施方案中，可以预期使用恶性细胞接种本发明的人皮肤替代品或动物模型。随后可将这些重构的人皮肤替代品或动物模型用于筛选化合物或其它治疗策略(如，放射或螺旋断层放疗)对抗处于天然环境下的肿瘤的功效。本发明的一些实施方案提供包括提供受目的病原体感染的重构人皮肤替代品或动物模型和至少一种测试化合物或疗法，以及使用所述测试化合物和疗法处理所述皮肤替代品或动物模型的方法。
在另一个特定的实施方案中，本发明的人皮肤替代品或动物模型还可用于模拟人身损伤或与皮肤损伤有关的病症。例如，本发明的人皮肤替代品和动物模型可提供用于模拟伤口、烧伤(如，火烧伤、晒伤……)或由辐射、病原体……引起的损伤、由化学产品或环境条件引起的刺激、退行性疾病和遗传性疾病的体外和体内模型。在某些实施方案中，目的病症是遗传性皮肤病，诸如表皮分解性水泡症(Epidemolysis bullosa)、着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum)、鱼鳞病(ichthyosis)、外胚层发育不良症、金德勒综合征(kindler syndrome)以及其它疾病。一般情况下，本发明的人皮肤替代品或动物模型可由多潜能干细胞产生，所述多潜能干细胞可携带导致人皮肤遗传疾病的一个或多个突变。上文所述的体外和体内模型可能对于医学研究具有特别的意义，或者可用于筛选治疗或预防所述伤损和病症的化合物。特别地，本发明预期使用例如高通量或高内涵(high content)技术将本发明的人皮肤替代品和动物模型用于从文库、特别是组合文库中筛选化合物。一般情况下，对于本发明的动物模型，所述测试化合物或产品可局部施用于所述人皮肤上或可通过口、舌下、皮下、肌内、静脉内和经皮途径施用。
在本发明的进一步方面，本发明的人皮肤替代品可用于治疗与皮肤损伤有关的病症。
因此，本发明涉及用于治疗与皮肤损伤有关的病症的方法，其包括由用本发明的人皮肤替代品移植需要的患者所组成的步骤。
例如，本发明的人皮肤替代品在伤口愈合和烧伤治疗应用中具有用途。移植物用于治疗烧伤和伤口愈合的用途在美国专利第5,693,332号、第5,658,331号和第6,039,760号中描述。因此，本发明提供用于伤口(包括由烧伤引起的伤口)愈合的方法，所述方法包括提供本发明的人皮肤替代品和带有伤口的患者以及在使所述伤口愈合的条件下用所述人皮肤替代品移植所述患者。
3)用于药理学和毒理学研究的细胞模型
本发明分离的基本上纯的人黑色素细胞群可为多种筛选测试提供重要的材料来源。因此它们可用于高内涵筛选(HCS)和高通量(HTS)筛选试验。例如，这些试验可用作为与黑色素细胞相关的疾病鉴别治疗靶。可进行其它试验以鉴别美容活性物质或调节皮肤色素沉着的化合物。
本发明分离的基本上纯的人黑色素细胞群可以是动物实验的有用的替代，用以在进行临床试验前获得人体中的预测性数据。
有利地，本发明分离的基本上纯的人黑色素细胞群可通过源自多个人受试者的多个不同人多潜能干细胞而获得，所述受试者可以是健康或患病的。特别地，它们可包含反映不同的种族来源的不同基因型、不同遗传性疾病或反映对UV照射的皮肤敏感性的不同表现型。因此可获得不同光类型(phototype)的分离的基本上纯的人黑色素细胞群。皮肤光类型(SPT)是基于人对阳光敏感性的分类系统。具有I和II型皮肤的人对包括皱纹和皮肤癌在内的光老化效应具有最高风险。但是，包括皱纹和皮肤癌在内的日照效应可在任何皮肤类型中发生。
SPT I-总是晒伤，从不晒黑
SPT II-易于晒伤，最低程度地晒黑
SPT III-中度晒伤，逐渐晒至浅褐色
SPT IV-最低程度地晒伤，总是良好地晒至中度褐色
SPT V-很少晒伤，完全晒至深色
SPT VI-从不晒伤，深度着色。
本发明的人黑色素细胞可用于研究皮肤刺激和侵蚀，体外光毒性以及对于UV照射的反应。
在一个方面，因此，本发明涉及用于筛选对人黑色素细胞具有给定生物效应的化合物的方法，包括以下步骤：
i)在测试化合物存在或不存在的情况下培养根据上文所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群；
ii)比较在所述测试化合物存在或不存在的情况下黑色素细胞群中的所述生物效应。
一般情况下，本文所使用的表述“生物效应”可是指为皮肤病学和/或美容目的而进行筛选的化合物的所需效应(例如，刺激黑色素合成)或不良效应(诸如毒性)。根据所述筛选方法的具体目标，本领域的技术人员将了解待试验的生物效应的类型。
在另一个方面，本发明涉及本发明的人黑色素细胞特别是在美容学或晒伤的临床研究中作为体外细胞模型用于筛选化合物的用途。
4)研究黑色素细胞发育机制和鉴定治疗黑色素瘤的新型治疗靶
本发明的人黑色素细胞还可用于阐明参与黑色素细胞的生理和病理发育的机制和信号通路。
本发明的人黑色素细胞还可用于鉴别治疗黑色素瘤的新型治疗靶。
因此，本发明还涉及如上所定义的人黑色素细胞作为研究黑色素细胞发育的细胞模型的用途。
所述黑色素细胞的胚胎发育始于神经嵴中的细胞命运特化，其随后继之以细胞迁移和微环境定位(niche localization)。黑色素细胞发育中所涉及的很多基因还参与了黑色素瘤的发展，其为源于所述黑色素细胞的恶性并且致死形式的皮肤癌。尽管可将尚未扩散至淋巴结的早期黑色素瘤切除而几乎无复发风险，经诊断患有转移性黑色素瘤的患者由于大多数肿瘤对放疗和化疗的抗性而具有高死亡率。发展成为黑色素瘤的转化黑色素细胞进行异常增殖并且通常开始在皮肤中放射性地生长。垂直生长可随着该放射性生长后发生，这导致透过基底膜向下层真皮的侵入和随后的转移。但是，仍然不清楚正常的黑色素细胞是如何成为黑色素瘤细胞以及黑色素瘤在其发展中是如何利用正常黑色素细胞及其祖细胞的特性的。
黑色素瘤还利用了个体发生和再生期间所需的许多调控信号和通路。
如上文所述Uong等在其研究中(2010)表明，黑色素瘤的形成与黑色素细胞的发育和再生共有许多特征，尽管仍有大量问题以待回答。此外，黑色素细胞和黑色素细胞干细胞的正常调控和行为的了解将实现对癌症治疗的更优策略的开发。
本发明将通过以下实施例进行进一步说明。但是，这些实施例不应以任何方式解释成限制本发明的范围。
具体实施方式
由人多潜能干细胞制备黑色素细胞群和人皮肤替代品的方法
在本报告中，本发明人阐明了iPS重编程细胞(hiPSC)和hESC能够产生纯的和功能性的黑色素细胞群。这些细胞通过遵循对补充以BMP4和抗坏血酸的FAD培养基中的滋养细胞进行表皮诱导的定向2D方案而获得。源自多潜能干细胞的这些黑色素细胞表达黑色素细胞的全部主要标记物，发育出黑色素体并且合成出能够迁入角质形成细胞的黑色素。
材料与方法
hESC培养和黑色素细胞分化
将来自两种细胞系SA01(Cellartis，
Figure BPA00001595553300191
Sweden)和WA09(Wicell，Madison WI)的hESC和使用逆转录病毒山中因子(Yamanakafactors)(Takahashi等)与慢病毒汤姆逊因子(Thomsom factor)(Thomson等)而产生的hiPSC在经10mg/mL丝裂霉素C灭活的STO小鼠成纤维细胞之上生长，其以30000/cm2进行接种并且根据上文所述进行生长(Guenou等，2009)。
为进行分化，将hESC和hiPSC细胞簇在FAD培养基中接种于经丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞上，所述FAD培养基由2/3DMEM、1/3HAM:F12和10％胎牛血清(FCII，Hyclone，Logan，UT，USA)组成，补充以5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、10-10M霍乱毒素、1.37ng/mL三碘甲状腺原氨酸(triodothyronin)、24μg/mL腺嘌呤和10ng/mL重组人EGF。使用各多潜能细胞系进行三次独立实验。通过使用0.5nM人重组BMP-4(R&D，UK)和0.3mM抗坏血酸(Sigma-Aldrich)实现外胚层分化的诱导。将细胞在同样的培养基中生长直至观察到并分离出着色群克隆。分离之后使用0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)解离色素细胞并将其以单细胞接种于补充以生长因子(Invitrogen)的黑色素细胞特异培养基254CF中。在这些条件下培养1周之后，根据其形态对呈现出与黑色素细胞类似形态的细胞进行机械分离并且将其在至少12代期间独立地在相同的培养基中扩增。
角质形成细胞和黑色素细胞培养
作为对照，将原代人角质形成细胞(HK)在FAD培养基中培养于经丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞上并将原代人表皮黑色素细胞(HEM)培养于补充以生长因子(Invitrogen)的254CF培养基中。
定量RT-PCR(Q-PCR)
根据制造商的方案使用RNeasy微型提取试剂盒(Qiagen，Courtaboeuf，France)从hESC、HEM和源自hiPSC的黑色素细胞(mel-hiPSC)与源自hESC的黑色素细胞(mel-hESC)中分离总RNA。进行柱上DNase I消化以避免基因组DNA扩增。使用Nanodrop技术检验RNA水平和质量。使用Superscript III逆转录试剂盒(Invitrogen)将总计500ng的RNA用于逆转录。根据制造商的指导，使用LightCycler480系统(Roche，Basel Switzerland)和SYBR Green PCR Master Mix(Roche)进行Q-PCR分析。基因表达的定量根据DeltaCt法进行并且以18S的表达标准化。进行熔解曲线和电泳分析以控制PCR产物特异性并排除非特异扩增。通过将引物混合物(1μM)一式两份地加载于96孔平板内而制备Q-PCR阵列。在加入SYBR Green PCR Master Mix和12.5ng cDNA后如上述进行Q-PCR。
免疫细胞化学
将细胞固定于4％的多聚甲醛之中(15分钟，室温)，然后在补充以0.4％的Triton X-100和5％BSA(Sigma-Aldrich)PBS中渗透和封闭。初级抗体在4℃下在封闭缓冲液中培养过夜。抗体包括小鼠抗-MITF(DAKO)、小鼠抗-TRP1(Abcam)、兔抗-酪氨酸酶(Abcam)、小鼠抗-Rab27(BD pharmingen)、小鼠抗-SSEA3/4(R&D)、小鼠抗-TRA1-81(eBioscience)、小鼠抗-RPE 65(Abcam)、兔抗-K14(Novacastra)、兔抗-PAX6(Covance)和小鼠抗-PAX3(Santa Cruz)。使用种属特异性荧光团偶联的二级抗体(Invitrogen)染色细胞(1小时，室温)；使用DAPI显现细胞核。使用各hESC细胞系进行三次独立实验。使用配有落射荧光照明(epifluorescence illumination)的Zeiss显微镜拍摄图像。
FACS分析
使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)使细胞从培养平板上脱离并且将其固定于2％多聚甲醛中(15分钟，室温)。经PBS洗涤后，使用0.1％皂甙(Sigma-Aldrich)渗透细胞，或不进行渗透。将以1∶100稀释的初级抗体在包含0.1％FCS的PBS中培养(1小时，室温)。使用同型特异性抗体或不使用初级抗体制备对照品。加入种属特异性二级抗体(1小时，室温)并且在FACScalibur上使用CellQuest软件(BD Biosciences)分析细胞。对于各实验分析的事件数为10,000。各细胞系进行三次独立实验。
黑色素体转移定量
在补充以生长因子的epilife培养基中将人角质形成细胞(HK)和来自原代培养物或源自多潜能干细胞的黑色素细胞以1∶3的比率培养3天。3天后，使用抗-TRP1抗体进行免疫染色以显现黑色素体并且使用对角质形成细胞特异性的抗角蛋白-14抗体进行免疫染色。随后使用Zeiss荧光显微镜观察荧光。使用ArrayScan(Cellomics)通过检测在其细胞质中表达所述角蛋白14和呈递TRP1阳性囊泡的角质形成细胞而对黑化的角质形成细胞的数量进行定量。
结果
色素细胞系的建立
此前我们开发了考虑人个体发育期间表皮形成的时间生物学的来自于hESC的方案，用以产生表现出基底角质形成细胞的全部表型特征的同质细胞群(Guenou等)。该过程中，在40天的分化中仅仅60％的所述细胞是角质形成细胞(Guenou等)，这实现了其它源于外胚层的细胞类型的建立。根据超过40天的表皮诱导方案，将使用汤姆逊和山中因子(IMR90和PolyF)的iPS重编程细胞和未分化的hESC(SA01和WA09(H9))在补充以BMP4(0.5nM)和抗坏血酸(0.3nM)的FAD培养基中接种于经丝裂霉素处理的3T3-J2滋养细胞上。
有趣的是，数周之后在围绕源自hiPSC和hESC的角质形成细胞的区域中可检测到逐步的色素沉着。为证实这些源自多潜能干细胞的着色群包含固定于所述黑色素细胞系的细胞，我们通过定量PCR(qPCR)随着全部分化过程进行了分子表征。为此，在不同的时间点如未分化状态、着色前和着色后在hiPSC和hESC样品中以及在纯化的色素细胞中分析了表达特征。首先，时间过程qPCR分析表明多潜能基因标记物OCT4、NANOG和SOX2的转录降低，所述转录迅速达到不可检测的水平，其与人成体黑色素细胞(HEM)的转录是相当的。此外，编码黑色素合成的调节剂的基因如TRP1、酪氨酸酶和MITF在色素细胞在培养物中富集期间逐渐增加。有趣的是，与源于神经嵴的细胞标记物如SOX10和PAX3的水平增加相平行，并且我们还观察到了源于神经管的细胞标记物PAX6的增加。
这些数据表明源于所述外胚层的多种着色表型的形成，其包括源于神经嵴的色素细胞和源于神经管的色素细胞。
源自多潜能干细胞的同质和纯的黑色素细胞群的表征
所述着色群在分离和两次传代后表现出与人成体黑色素细胞(HEM)相类似的形态。这些细胞被命名为对应于源自iPSC的黑色素细胞的mel-iPSC和对应于源自hESC的黑色素细胞的mel-hESC。mel-iPSC和mel-hESC的qPCR分析显示黑色素细胞生物学所涉及的关键基因如SOX10、PAX3、MITF-M同种型、TRP1和TYR的表达指向了类似于HEM的表达模式。实际上，我们观察到具有多潜能性和自我更新特点的全部基因(OCT4、NANOG、SOX2)表达的降低或PAX6和OTX2表达的降低，这证实了该色素细胞群并非视网膜色素上皮。免疫印迹分析证实了所述mel-iPSC和mel-hESC细胞核中OCT4、TRA1-81和PAX6表达的缺乏，以及PAX3和MITF的正确细胞核定位与TRP1、酪氨酸酶(TYR)和Rab27的细胞质表达。
此外，4次传代之后的FACS分析揭示了与对照组未分化mel-iPSC和mel-hESC相比mel-iPSC和mel-hESC中SSEA4和TRAl-81表达的缺乏。该分析还显示超过80％的mel-iPSC和mel-hESC是TRP1和MITF阳性，正如成体黑色素细胞的对照培养物。
在这些培养条件下，细胞活跃增殖多达12代并且可任意冻融而维持其形态和表型。
源自多潜能干细胞的黑色素细胞是功能性的。
为证实黑色素体产生和分泌黑色素的能力，通过将mel-iPSC或HEM与人成体角质形成细胞(HK)进行共培养而评估黑色素体的转移。在共培养3天后，通过蛋白质TRP1(表达于所述黑色素体膜)和角蛋白14(特异性表达于角质形成细胞中)的共免疫染色来检测黑色素体向角质形成细胞中的转移。阵列扫描(Arrayscan)分析显示，在与mel-iPSC培养的20％的角质形成细胞和与HEM培养的45％的角质形成细胞中可检测到黑色素体，而在未以黑色素细胞培养的HK中没有可检测到的TRP1染色。
有趣的是，在黑色素体转移后，它的定位是处于角质形成细胞的核周区室，预计其保护了它们的DNA免受紫外线照射。使用mel-hESC获得了类似的结果，其中在共培养三天后可检测到20％的黑化角质形成细胞。
通过使用实现黑化多分层表皮生成的3D器官型系统，我们在体外类生理环境中估测了源于iPSC或源于hESC的黑色素细胞的功能性。因此，我们显示90％角质形成细胞(HK)和10％黑色素细胞(mel-iPSC、mel-hESC和HEM)的共培养导致了功能性和黑色素化表皮的形成，其具有黑色素细胞在基底层中的正确复位(homing)以及由分化角质形成细胞组成的表皮上层的黑化。
使用多分层表皮的体外三维重构尝试对源自多潜能干细胞的黑色素细胞进行的进一步功能性评估，其通过在培养基-空气界面将黑色素细胞与以单层接种于基质上的成体基底角质形成细胞混合而进行。在完全多分层化的表皮发育之后，肉眼观察显示在包含源自hESC或iPSC的黑色素细胞的重构组织中的轻度色素沉着。Fontana Masson染色证实了表皮基底层中包含黑色素的细胞的存在。TRP1免疫染色证实了源自多潜能干细胞的黑色素细胞在所述基底层中的正确复位。在所述表皮上层中，黑色素包含过程为角质形成细胞所包围。用控制皮肤色素沉着的生理学试剂α-促黑激素(αMSH)处理黑化表皮激活了该组织中黑色素的生成。
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Claims (15)

1.一种用于获得源自人多潜能干细胞的人黑色素细胞群的离体方法，其包括步骤a)在刺激表皮诱导的试剂和刺激角质形成细胞的终末分化的试剂存在下共培养人多潜能干细胞与支持外胚层分化的细胞。
2.根据权利要求1所述的离体方法，其中所述支持外胚层分化的细胞是滋养成纤维细胞。
3.根据权利要求1或2所述的离体方法，其中所述刺激表皮诱导的试剂选自BMP-2、BMP-4、BMP-7、Smad1、Smad5、Smad7和GFD-6。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的离体方法，其中所述刺激角质形成细胞的终末分化的试剂选自抗坏血酸和视黄酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的离体方法，其中所述人多潜能干细胞是人胚胎干细胞(hES细胞)或人诱导多潜能干细胞(hiPS细胞)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的离体方法，其中所述步骤a)进行至少35天，优选地至少40天，甚至更为优选地至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天或至少75天。
7.根据前述权利要求中任一项所述的离体方法，其在步骤a)后进一步包括下列步骤：
b)从步骤a)获得的细胞群中分离色素细胞；
c)在适当的培养基中培养所述分离的细胞。
8.一种源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群，其可通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法获得。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求8所述的源自人多潜能干细胞的基本上纯同质黑色素细胞群以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
10.用于治疗方法中的根据权利要求8所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群或根据权利要求9所述的药物组合物。
11.一种制备人皮肤替代品的方法，其包括提供根据权利要求8所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群的步骤以及提供人角质形成细胞群的步骤。
12.一种人皮肤替代品，其可通过根据权利要求11所述的方法获得。
13.用于治疗方法中的根据权利要求12所述的人皮肤替代品。
14.一种用于筛选对人黑色素细胞具有给定生物效应的化合物的方法，包括以下步骤：
i)在测试化合物存在或不存在的情况下培养根据权利要求8所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群；
ii)比较在所述测试化合物存在或不存在的情况下黑色素细胞群中的所述生物效应。
15.根据权利要求8所述的源自人多潜能干细胞的分离的基本上纯的同质人黑色素细胞群或根据权利要求12所述的人皮肤替代品用于筛选化合物的用途。
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