CN107530378A - 通过直接重编程生成黑色素细胞的组合物和方法 - Google Patents

通过直接重编程生成黑色素细胞的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于通过直接重编程生成黑色素细胞的组合物和方法。还公开了使用这样的组合物来治疗白癜风和其他色素沉积不足的病症的方法。根据本发明，提供了一种用于产生适用于人类患者的黑色素细胞的方法。一个实例性的放包括：提供能够转分化成黑色素细胞的细胞；在化学限定的培养基中培养所述细胞；将与小眼畸形有关的转录因子(MITF)、SRY相关的HMG盒(SOX10)转录因子和配对盒‑3(PAX‑3)转录因子中的至少两种，或将编码所述转录因子的核酸，引入到所述细胞中，其中所述转录因子的表达诱导细胞转分化成表达黑色素细胞标记物TYR、DCT、S‑100和Melan‑A的黑色素细胞。

Description

通过直接重编程生成黑色素细胞的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年11月18日提交的美国的临时申请62/081,228的优先权，全部内容通过引用合并于此，如同全面阐述一样。
联邦政府赞助研究下的发明的权利声明
根据35 U.S.C.§202(c)，承认美国政府对于所述发明的权利，该发明是由国立卫生研究院R01-AR054593和P30-AR057217资助的。
技术领域
本发明涉及人类黑色素细胞的分子生物学和生产领域。更具体地，本发明提供了用于直接将人类成纤维细胞转分化(trans-differentiate)为黑色素细胞的组合物和方法。
背景技术
在说明书中引用了大量的出版物和专利文件，包括公开的申请和已经授权的专利，从而描述该发明所属领域的状态。各引文通过引用合并于此，如同全面阐述一样。
黑色素细胞在保护人类皮肤免受紫外线(UV)侵害中起重要作用。黑色素细胞缺陷可导致大量色素沉积病症以及皮肤癌，如斑驳症、白化病、白癜风、头发灰白和黑色素瘤。白癜风是由于皮肤黑色素细胞丧失而导致的皮肤病况。因此，皮肤的白色斑块出现在身体的不同部位。身体的任何部位都可能受到影响。在美国，有二至五百万人患有这种病症，并且约有1-2％的世界人口受这种疾病的影响。它同时影响男女两性，并影响所有种族。它可以在任何年龄开始，但有50％的白癜风患者在二十五岁之前就发病。由于外观异常，白癜风可能对患者造成极大的痛苦。
存在很多治疗选择。许多治疗方法可能会产生有害的副作用。治疗可能需要很长时间，且有时不起作用。目前治疗白癜风的方法包括药物的、手术的、和其他治疗方法。大多数治疗旨在恢复皮肤白色斑块的颜色。药物治疗包括有或没有紫外线A(UVA)灯(PUVA)的类固醇膏。手术治疗包括人自身组织的皮肤移植或自体黑色素细胞转移。医生从患者身体的一个区域取得皮肤并将其粘附至另一区域，或者从皮肤分离黑色素细胞并转移至受影响的区域。然而，由于成人黑色素细胞具有十分有限的增值能力，生成足够数量的自体黑色素细胞存在困难，由此限制了治疗功效。
尽管经过多年的研究努力，还没有对于白癜风的有效治疗。显然，十分需要开发这样的治疗。
发明概述
根据本发明，提供了一种用于产生适合用于人类患者的黑色素细胞的方法。一种示例性的方法包括：提供能够转分化成黑色素细胞的细胞，在化学上限定的培养基中培养所述细胞，将与小眼畸形有关的转录因子(MITF)、SRY相关的HMG盒(SOX10)转录因子和配对盒-3(PAX-3)转录因子中的至少两种，或将编码所述转录因子的核酸，引入到所述细胞中，其中所述因子的表达诱导所述细胞转分化成表达黑色素细胞标记TYR、DCT、S-100和Melan-A的黑色素细胞。该方法任选地需要分离黑色素细胞。在一种方法中，引入了两种转录因子MITF和SOX10。在优选的实施方案中，引入了所有三种转录因子。细胞优选来源于哺乳动物。特别优选的是成纤维细胞。
转录因子可以由一个或多个表达载体编码，或由此编码的蛋白质直接引入细胞。可选地，可以使用合成的mRNA以将转录因子引入受体细胞。如此产生的分离的黑色素细胞也构成本发明的一个方面。
在另一方面，本发明提供了一种将黑色素细胞输送到有需要的患者以用于各种医学病况的方法。一个示例性的方法包括由所述患者提供自体细胞，所述细胞能够转分化为黑色素细胞，由以上所述这些细胞来制备黑色素细胞，收获黑色素细胞，以及将黑色素细胞引入所述患者，所述黑色素细胞表达黑色素细胞特异性标记并产生色素。在一种方法中，所述引入步骤包括从受影响区域除去表皮，由此形成治疗位点，以及将包含分离的黑色素细胞和可选地角质细胞的组合物直接施用至所述治疗位点。生物相容性膜也可用于促进所述细胞的移植。上述方法可以有利地用于治疗包括但不限于斑驳症、白化病、白癜风和头发灰白的病症。
最终的，本发明也提供了一种鉴别调节黑色素细胞存活力或功能的试剂的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供如上所述制备的黑色素细胞，在存在和不存在测试试剂的情况下孵育细胞，并分析所述试剂是否改变与黑色素细胞活力或功能相关的细胞参数，从而鉴别改变所述参数的试剂。在另一方面，所述试剂抑制细胞暴露于UV辐射后的恶性转化。
附图说明
图1A-H：筛选黑色素细胞直接重编程因子。图1A.黑色素细胞直接重编程转录因子(TF)筛选方案。使用来自酪氨酸酶-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的成纤维细胞进行筛选。当酪氨酸酶(TYR)被激活时，在4-HT存在下，Cre激活导致番茄盒的切除和GFP的表达。图1B.用10个候选因子(右图)或仅载体(左图)包装的病毒感染细胞后GFP+细胞的流式细胞检测分析。图1C：流式细胞检测分析在被对照载体(NI)、Sox10和MITF(SM)或Sox10、MITF和Pax3(SMP3)感染后的GFP和TYRP1表达。代表性数据来自三项独立实验。图1D：分选后的GFP+细胞形态学。小鼠成纤维细胞用SMP3感染，并在第14天基于GFP表达进行分选。图1E-1G：使用对TYR(图1E)、DCT(图1F)和S100(图1G)特异的抗体来免疫染色分析诱导的小鼠黑色素细胞(miMel)。用Alexa Fluro 594标记第二抗体。DAPI用于染色细胞核。使用Melan-a小鼠黑色素细胞作为阳性对照。比例尺表示30μm。图1H：电子显微镜分析显示，miMels在细胞质中含有许多成熟的黑素体。箭头指向黑素体的不同阶段，包括II期、III期和IV期。比例尺表示400nm。
图2：qRT-PCR分析候选因子表达。感染后，SOX2、MITF、PAX3、DLX5、FOXD3、LEF1、MSX1、PAX6、SOX2和SOX9在成纤维细胞中的表达。mSOX2、mMITF、mPAX3、mDLX5、mFOXD3、mLEF1、mMSX1、mPAX6、mSOX2和mSOX9表示这些基因是小鼠来源。OE代表受候选因子感染的成纤维细胞；载体代表受空载体感染的成纤维细胞。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。
图3A-3C：流式细胞检测分析感染后GFP阳性(GFP+)细胞的百分比。用含有不同组合的候选因子的病毒感染来自酪氨酸酶-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的TTF。感染后5天进行流式细胞检测分析。当TTF感染携带2种不同的候选因子(图3A)、3种不同候选因子(图3B)、或4种不同候选因子(图3C)的病毒时，流式细胞检测分析GFP+细胞百分比。NI：仅载体；S：SOX10；D：DLX5；F：FOXD3；L：LEF1；M：MITF；Mx：MSX1；P3：PAX3；P6：PAX6；S2：SOX2；S9：SOX9。
图4A-4C。流式细胞检测分析感染后TYRP1阳性(TYRP1+)细胞的百分比。用携带不同组合的候选因子的病毒感染来自酪氨酸-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的TTF。感染后5天进行流式细胞检测分析。当TTF感染携带2种不同的候选因子(图4A)、3种不同候选因子(图4B)、或4种不同候选因子(图4C)的病毒时，流式细胞检测分析TYRP1+细胞百分比。
图5：通过如图4和5所示的流式细胞检测分析对GFP+和TYRP1+细胞进行定量。显示的数据是来自三个独立实验的平均值±SD。
图6A-6B：通过SMP3直接重编程后GFP+细胞的形态学。来自酪氨酸酶-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的TTF被SMP3感染14天的代表性图像。在SMP3感染细胞中检测到GFP+细胞，并在第14天拍照(图6A)。在FAGS分选后，GFP+细胞被富集，并且这些细胞显示出典型的黑色素细胞形态(图6B)。比例尺，50μm。
图7：流式细胞检测分析GFP+细胞中TYR+细胞的百分比。用SMP3感染来自酪氨酸酶-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的TTF14天。从GFP+细胞圈门TYR+细胞。代表性的结果来自3项独立实验。
图8A-8C：直接重编程的小鼠iMel的表征。图8A.iMel的免疫细胞化学染色。用SMP3来重编程来自酪氨酸酶-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的TTF。直接重编程后，用针对SILV或Melan-A特异性的抗体染色iMel。使用Melan-a小鼠黑色素细胞作为阳性对照。比例尺，30μm。图8B.qRT-PCR分析由仅载体(NI)、SM和SMP3包装的病毒感染的TTF中的黑色素细胞特异性标记物，如TYR、TYRP1、OCT和SILV，以及SOX10、MITF和PAX3的内源性表达。Melan-a小鼠黑色素细胞用作阳性对照。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。图8C.qRT-PCR分析SMP3感染的TTF中的SOX10、MITF和PAX3的转基因的和内源性的表达。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。
图9A-9B：在小鼠SMP3诱导的MEF中黑色素细胞标记物表达和DOPA活性。图9A，RT-PCR分析在使用SMP3重编程的MEF中的黑色素细胞标记物。在感染后第5天收集由SMP3感染的MEF用于RT-PCR分析。MEF和melan-a小鼠黑色素细胞分别用作阴性和阳性对照。所述标记物包括TYR、TYRP1、OCT、MITF(endo)、SOX10和PAX3。GAPDH在此用作内对照。图9B，亲本MEF和SMP3诱导的MEF(SMP3-MEF)的形态学。用含有SMP3的病毒感染MEF(左图)，培养19天然后置于G418下进行选择并拍照(中图)。然后用多巴胺染色细胞，并显示多巴活性(右图)。比例尺，50μm。
图10A-10B：由MEF直接重编程的小鼠iMel的表征。将MEF通过SMP3重编程至iMel中。图10A，使用对TYR、S100和Melan-A特异性的抗体免疫细胞化学染色来自MEF的iMel(MEF-iMel)。比例尺，25μm。图10B，qRT-PCR分析MEF-iMel和MEF中的黑色素细胞标记物，包括MITF(endo)、TYR、TYRP1、OCT、P、SOX10(endo)和PAX3(endo)。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。
图11A-11D：RT-PCR分析用不同组合的转录因子感染后TTF中的黑色素细胞标记物。图11A，用不同组合的SOX10(S)、MITFGFP(MGFP)和PAX3(P3)感染来自C57B6小鼠的成年TTF。感染后第5天收集TTF来用于RT-PCR分析。图11A，TTF和SMGFPP3感染的TTF的形态。用携带SOX10/MITFGFP/PAX3(SMGFPP3)的病毒感染TTF，培养21天并拍照(图11B)。TTF培养物作为阴性对照(图11B)。比例尺，50μm。分选出GFP+细胞并再培养14天。这些细胞表现出典型的黑色素细胞形态和色素(图11C)。箭头指向色素。上图中的比例尺，50μm；下图中的比例尺，25μm。图11D，qRT-PCR分析TTF和来自TTF的iMel(TTF-iMel)中的黑色素细胞标记物。分析TTF和源自TTF的iMel中的MITF(endo)、TYR、TYRP1、DCT、P、SOX10(endo)和PAX3(endo)。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。
图12A-12I：直接重编程人成纤维细胞至黑色素细胞。图12A，在指定时间点用SMGFPP3重编程后的TYR+和TYRP1+细胞的百分比。用SMGFPP3感染人胎儿成纤维细胞(胎儿hF)，在含有G418的培养基中进行分选和筛选。在第0、25、40和80天通过流式细胞检测分析细胞。代表性数据来自三个独立实验。图12B，胎儿hF和来自胎儿hF的诱导的黑色素细胞的细胞形态。在第40天，胎儿hF和来自胎儿hF的诱导的黑色素细胞(胎儿hF-SMGFPP3)的代表性图像。比例尺表示50μm。图12C-12F，使用对TYR(图12C)、TYRP1(图12D)、DCT(图12E)和SILV(图12F)特异的抗体对来自胎儿hF的人诱导黑色素细胞(hiMel)和正常人皮肤黑色素细胞(hMel)进行免疫染色分析。用Alexa Fluro594标记二级抗体。用DAPI染色核DNA。比例尺表示20μm。qRT-PCR分析由仅载体病毒(NI)、SMGFP和SMGFPP3感染的胎儿hF中的以及hMel中的黑色素细胞特异性标记物，如TYR、TYRP1、DCT和SILV，以及SOX10、MITF和PAX3的内源性表达。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。图12H，Fontana-Masson染色显示hiMel中的黑色素。左图的比例尺为25μm，右图的比例尺为10μm。箭头指向黑色素。图12I，在细胞质中具有许多成熟黑素体的hiMel的电子显微镜图像。II：II期黑素体；III：III期黑素体；IV：IV期黑素体。左图比例尺表示1μm，右图比例尺表示400nm。箭头指向黑素体。
图13A-13D：由胎儿成纤维细胞直接重编程的人iMel的表征。由携带SMGFPP3的病毒感染2代人胎儿成纤维细胞(胎儿hF)。图13A，在指定时间点分析用SMGFPP3重编程后，TYR+和TYRP+细胞的代表性流式细胞测试图。用SMGFPP3感染胎儿hF，在含有G418的培养基中进行分选和筛选。在第0、40和80天收集细胞并进行流式细胞测试分析。图13B，用SMGFPP3重编程后的TYR+细胞分析的代表性流式细胞测试图。图13C，在正常皮肤黑色素细胞(hMel)和来自胎儿hF的iMel(hiMel)中的S100和Melan-A的免疫细胞化学分析。比例尺，25μm。图13D，qRT-PCR分析hiMel中的人PAX3(hPAX3)、人SOX10(hSXO10)和人MITF(hMITF)的转基因和内源性(Endo)表达。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。
图14A-14C：使用诱导系统生成hiMel。将人MITF-M、SOX10和PAX3亚克隆到诱导型病毒载体中。用携带这些转基因的病毒感染胎儿hF。图14A，在多西环素(DOX)存在或不存在的情况下，SOX10、MITF和PAX3的转基因表达的qRT-PCR分析。图14B，诱导后14天撤除DOX的hiMel中(DOX撤除)以及DOX持续存在的具有DOX的hMel中(DOX)黑色素细胞标记物的qRT-PCR分析。hMel和胎儿hF(hF)分别用作阳性和阴性对照。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。图14C，诱导后14天撤除DOX的hiMel中黑色素细胞标记物，包括TYR、OCT、TYRP1和S100的免疫染色分析。比例尺，30μm。
图15A-15G：诱导的人黑色素细胞的分子表征。图15A，在对人胎儿成纤维细胞(胎儿hF)、来自人胎儿称纤维细胞的诱导的黑色素细胞(hiMel)和正常皮肤黑色素细胞(hMel)进行的RNA-微阵列分析中差异性表达的基因热图。图15B，散点图显示黑色素细胞标记物在hiMel中表达，但不在胎儿hF中表达。图15C，基因集富集分析hMel和hiMel之间的重叠基因。许多基因集包括KEGG_LYSOSOME、DACOSTA_UV_RESPONSE_VIA_ERCC3、PARENT_MTOR_SIGNALING_UP、MILI_PSEUDOPODIA_HAPTOTAXIS_DN和MILI_PSEUDOPODIA_CHEMOTAXIS_DN都富集在hiMel和hMel中。图15D和图15E，胎儿hF，hiMel和hMel中TYR(图15D)和TYRP1(图15E)的启动子的DNA甲基化分析。空心圆圈表示未甲基化的CpG二核苷酸，而闭合圆圈表示甲基化的CpG。图15F和15G，胎儿hF、hiMel和hMel中TYR和TYRP1启动子的组蛋白修饰分析。使用针对二甲基化的组蛋白H3K4(H3K4me2)和H3乙酰化(acH3)的抗体进行染色质免疫沉淀。TYR和TYRP1启动子在hiMel中显示出与hMel类似的活性状态(H3K4me2和acH3)的富集。在胎儿hF中，TYR和TYRP1启动子表现出无活性状态。代表性数据来自三个独立实验。
图16A-16B：人胎儿原代和PDGFRA+I c-Kir成纤维细胞的球体形成能力。图16A，从胎儿皮肤分离的0代(PO)，1代(P1)和2代(P2)人胎儿原代成纤维细胞(胎儿hF)的球体形成能力。图16B，来自原代胎儿成纤维细胞的PDGFRA+/c-Kit成纤维细胞的球体形成能力。PO成纤维细胞是使用针对PDGFRA(阳性选择)和c-Kit(阴性选择)的抗体进行MACS微珠纯化。在球体形成测定中使用PDGFRA+/c-Kit-成纤维细胞。PO表示0代，P1表示通道1，P2表示通道2。代表性数据来自三个独立实验。
图17A-18B：在人胎儿成纤维细胞中黑色素细胞标记物的表达。在诱导培养基中培养P2人胎儿成纤维细胞(胎儿hF)40天。图17A，胎儿hF中TYR、OCT和Melan-A的免疫细胞化学染色分析。胎儿hF对这些标记物是阴性的。比例尺，25μm。图17B，流式细胞检测分析成纤维细胞中TYR+和TYRP1+细胞的百分比。代表性结果来自三个独立实验。
图18A-18C：由人胎儿纯化的成纤维细胞诱导的hiMel的表征。使用SMGFPP3重编程人胎儿PDGFRA+/c-Kit成纤维细胞。图18A，流式细胞检测分析在原代人胎儿成纤维细胞中PDGFRA+和c-Kit+细胞的百分比。代表性数据来自3项独立实验。图18B，hMel中、来自人胎儿PDGFRA+/c-Kit-成纤维细胞的hiMel(hiMel)中和人胎儿PDGFRA+/c-Kit-成纤维细胞(hF)中的黑色素细胞标记物的qRT-PCR分析。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。图18C，免疫染色分析hiMel中的黑色素细胞标记物。比例尺，30μm。
图19：在30个皮肤等效物中的来自人类胎儿成纤维细胞的hiMel。使用包皮角化细胞(keratinocyte)和hiMel构建30个皮肤等效物。Fontana-Mason染色30个皮肤等效物显示黑色素在角化细胞中，表明色素从黑色素细胞转移到角化细胞。箭头指向角化细胞中的色素。Melan-A和S100染色突出了真皮表皮连接处散布的黑色素细胞。比例尺，30μm。
图20：响应于MSH刺激的来自人类胎儿成纤维细胞的hiMel的色素产生。使用包皮角化细胞和hiMel构建30个皮肤等效物。a-MSH施用于表皮上。在MS-MSH刺激后3周收获重建的皮肤。Fontana-Mason染色a-MSH处理的(左图)和对照的(右图)30个皮肤重建物。箭头指向色素。比例尺，30μm。
图21A-21F：诱导的人黑色素细胞的体内功能分析。图21A，使用hiMel的皮肤重建测定显示着色的毛囊。hiMel、hMel或胎儿hF与新生小鼠真皮成纤维细胞和源自BALB/c(白化)小鼠皮肤的上皮细胞相结合。将细胞注入至免疫缺陷小鼠的背部皮肤中。3周后，在皮肤的下侧拍摄移植物。在使用hiMel或hMel的重建测定中观察到着色的毛囊；而使用胎儿hF未观察到着色毛囊。比例尺，5mm。代表性图像来自5只小鼠。图21B，人特异性Alu染色(绿核)证实人源iMel(左上图)，以及连续切片的H&E染色显示具有毛囊形成的囊肿(右上图)；比例尺，200μm。位于毛囊的空泡区域(左下图)和表皮基底层(右下图)的人类细胞，比例尺，50μm。图21C和21D，使用针对人DCT的抗体(图21C)和TYRP1的抗体(图21D)免疫染色来自贴片测定法(patch assay)的异种移植物。DCT+细胞存在于毛囊的滤泡间真皮和空泡区域。在毛囊和表皮中均观察到TYRP1+细胞。比例尺，20μm。图21E，使用针对人S100的抗体对异种移植物的免疫组织化学染色。S100+阳性细胞位于表皮、毛囊和真皮。比例尺，20μm。图21F，异种移植物的Fontana-Masson染色显示在由胎儿hF和小鼠细胞形成的异种移植物中没有色素(左)；而当测定中包含hiMel时，表皮和滤泡上皮中显示出丰富的黑色素(右图)。比例尺，20μm。
图22A-22B：使用MITF诱导的成纤维细胞的皮肤重建测定。用MITF感染P2人胎儿成纤维细胞并培养50天。这些MITF诱导的细胞用于皮肤重建测定。图22A，在注射部位观察到白色毛囊和毛干，并从皮肤下面拍摄。箭头指向毛干。比例尺，2mm。图22B，重建皮肤的Fantana-Mason染色在毛囊或表皮中未显示任何色素。比例尺，50μm。
图23：qRT-PCR分析成人成纤维细胞(成人hF)和SMGFPP3感染的成人hF(成人hf-SMGFPP3细胞)中的黑色素细胞标记物。成人hF-SMGFPP3细胞在G418选择下培养15天，并分选以进行qRT-PCR分析。所述黑色素细胞标记物包括MITF(endo)、TYR、TYRP1、OCT、P、SOX10(endo)和PAX3(endo)。显示的数据是来自三个独立实验的表达的平均值±SD。
图24A-24B：免疫染色分析SMGFPP3感染的成人成纤维细胞(成人hF)中的TYR、DCT、S100和Melan-A。图21A，成人hF使用SMGFPP3重编程并染色用于TYR、OCT、S100和Melan-A表达。比例尺，30μm。图21B，通过如a所述的免疫染色分析来定量TYR+和OCT+细胞。代表性数据来自3个独立实验。
图25：流式细胞检测分析SMGFPP3重编程的成人hF中TYR+和TYRP1+细胞的百分比。代表性数据来自3个独立实验。
具体实施方式
谱系特异性转录因子通过将体细胞直接重编程为另一种分化命运而不需要通过诱导的多能干细胞(iPSC)状态的过渡，来诱导体细胞的细胞命运变化(1-8)。直接重编程为患者特异性细胞的生成提供了一种根本地新途径。此处，通过筛选候选的转录因子池，我们确定了三种因子MITF、SOX10和PAX3的组合，其可以将小鼠和人类成纤维细胞直接转化为功能性黑色素细胞。诱导的黑色素细胞(iMel)激活黑色素细胞特异性网络，表达色素生成和递送的成分，并产生黑素体。将人iMel适当地整合到真皮-表皮连接处，并在3D器官型皮肤重建中产生并递送黑色素至周围的角化细胞。人iMel在体内皮肤重建测定中产生着色的表皮和毛囊。iMel的产生对黑色素细胞谱系定型、色素沉积病症和细胞替代疗法的研究具有重要意义。
定义
关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。当该术语应用于DNA时，指的是从其所在的生物体的天然存在的基因组中直接连续(在5'和3'方向)的序列分离的DNA分子。例如，“分离的核酸”可以包括插入至载体(如质粒或病毒载体)的、或整合至原核生物或真核生物DNA的DNA或cDNA分子。
术语“启动子区域或表达控制序列”指基因的转录调节区域，其可以在编码区域的5'或3'端、或在编码区域内、或者内含子中。这样的序列调节由其功能上(“可操作地”)连接的多核苷酸编码的多肽的表达。表达可以在mRNA或多肽水平上调节。因此，术语表达控制序列包括mRNA相关的元件和蛋白质相关的元件。这样的元件包括启动子、启动子内的启动子结构域、上游元件、增强子、赋予组织或细胞特异性的元件、响应元件、核糖结合序列、转录终止子等。
本领域技术人员将认识到核酸载体可以包含启动子元件以外的核酸元件及目的核酸分子。这些其他核酸元件包括但不限于：复制起点、核糖体结合位点、编码药物耐受性酶或氨基酸代谢酶的核酸序列、以及编码分泌信号、定位信号或可用于多肽纯化的信号的核酸序列。
在一些实施方案中，表达控制序列包括组织或器官特异性启动子。很多这样的表达控制序列对技术人员来说是显而易见的。
术语“载体”指可以将DNA序列插入其中以引入至宿主细胞中并在那里复制的小载体DNA分子。“表达载体”是包含具有在宿主细胞中表达所需要的必要的调节区域的基因或核酸序列的专门的载体。
对于本领域技术人员来说，许多技术可用于促进表达构建体的转化、转染或转导至原核或真核生物。术语“转化”、“转染”和“转导”指将核酸和/或表达构建体插入至细胞或宿主生物中的方法。这些方法涉及多种技术，如用高浓度盐、电场或清洁剂处理细胞，从而使宿主细胞外层膜或壁对目的核酸分子、显微注射、PEG融合物、病毒载体、裸质粒等类似物有渗透性。
如本文所用，术语“报告子”、“报告系统”、“报告基因”或“报告基因产物”应指运行的基因系统，其中核酸包括编码产物的基因，其在表达时产生例如通过生物测定、免疫测定、放射免疫测定或通过比色、荧光、化学发光或其它方法易于测量的报告信号。所述核酸可以是线性或环状的、单链或双链的、反义或正义极性的RNA或DNA，并且可操作地与对于表达报告基因产物必要的控制元件连接。所需的控制元件将根据报告系统的性质以及报告基因是否为DNA或RNA的形式而变化，但是可以包括但不限于，如启动子、增强子、转录控制序列、poly A添加信号、转录终止信号及其类似物。
所引入的核酸可以整合或可以不整合(共价连接)至受体细胞或生物体的核酸中。例如，在哺乳动物细胞中，所引入的核酸可以保持为附加元件或独立的复制子，如质粒。可选地，所引入的核酸可以整合到受体细胞或生物体的核酸中，并且稳定地保持在该细胞或生物体中，并进一步传递或遗传至受体细胞或生物体的后代细胞或生物体。最终地，所引入的核酸可以仅瞬时存在于受体细胞或宿主生物体中。
术语“选择性标记基因”指当表达时赋予转化细胞以可选择的表型如抗生素耐性的基因。
术语“可操作地连接”指将表达编码序列所必须的调节序列以相对于编码序列的适当位置置于DNA分子中，以实现编码序列的表达。这一相同的定义有时也用于编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)在表达载体中的布置。该定义有时也用于产生杂交核酸分子的第一和第二核酸分子的核酸序列的布置。
当指当特定的核苷酸序列或氨基酸序列时，短语“基本上由…组成”指具有给定的SEQ ID NO:的性质的序列。例如，当用于氨基酸序列时，该短语包括该序列本身和不影响序列的基本特征和新特征的分子修饰。
聚合酶链反应(PCR)已经在美国专利4,683,195,4,800,195和4,965,188中进行了描述，其全部公开内容通过引用并入本文。术语“载体”涉及可被感染、转染或转化进细胞并独立地或在宿主细胞基因组内复制的单链或双链环状核酸分子。环状双链核酸分子可以被切割并由此在用限制性内切酶处理时线性化。载体、限制性内切酶和限制性内切酶靶向的核酸序列的知识的分类对本领域技术人员而言是容易获得的，并且包括可以连接另一遗传序列或元件(DNA或RNA)的任意复制子，例如质粒或病毒，从而引起所连接的序列或元件的复制。本发明的核酸分子可以通过用限制性内切酶切割载体并将两个部分连接起来而插入至载体。
本文所用的术语“引物”是指衍生自生物系统的(通过限制酶消化产生的)或合成产生的、单链或双链的、RNA或DNA的寡核苷酸，当放置在适当的环境中时，其能够在功能上充当模板依赖性核酸合成的引发剂。当与适当的核酸模板，合适的核酸的核苷三磷酸前体、聚合酶、合适的辅因子和条件，如合适的温度和pH一起存在时，引物可以通过聚合酶活性或类似活性以在其3’端添加核苷酸而延伸，从而得到引物延伸产物。根据应用的具体条件和要求，所述引物的长度可以变化。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常为15-25个或更多个核苷酸。所述引物必须与所需模板具有充分的互补性，以引发所需延伸产物的合成，也就是说，以足以在合适的毗邻位置提供引物的3’羟基部分的方式，能够与所需模板链一起退火，用于开始由聚合酶或类似酶介导的合成。引物序列不需要与所需模板精确互补。例如，非互补核苷酸序列可以附于另外的互补引物的5’端。可选地，非互补碱基可以散布于寡核苷酸引物序列内，条件是所述引物序列与所需模板链具有充分的互补性，以功能性地提供一种用于合成延伸产物的模板-引物复合物。
“克隆细胞群”是指从同一细胞衍生的一组相同的细胞。
“成纤维细胞”可以从很多来源获得，所述来源包括但不限于成人成纤维细胞、人胎儿成纤维细胞(可以从获得角化细胞的相同或不同组织来源获得)、人胎儿皮肤成纤维细胞和成纤维干细胞。在本发明优选的实施方案中，所述成纤维细胞和角化细胞可以从相同的组织来源获得。术语“激活的成纤维细胞”用于指在肿瘤入侵期间诱导的成纤维细胞。
“专能(multipotent)”表示细胞通过其后代能够产生存在于成年动物中的几种不同的细胞类型。
“多能(pluripotent)”表示细胞能够通过其后代产生所有细胞类型，包括生殖细胞在内的成年动物。胚胎干细胞和胚胎生殖细胞在该定义下都是多能细胞。
本文所用的术语“细胞系”可以指可以传代至少一次而不终止的培养细胞。本发明涉及的细胞系可以传代至少1、2、5、10、15、20、30、40、50、60、80、100和200次。细胞传代在下文中定义。
本文所用术语“悬浮”可以指其中细胞不附着于固体支持物的细胞培养条件。在悬浮中增殖的细胞，在细胞增殖时可以使用本领域技术人员熟知的装置进行搅拌。
本文所用术语“单层”可以指在适当培养条件下增殖时附着于固体支持物上的细胞。在合适的生长条件下在单层中增殖的一小部分细胞可以附着到单层中的细胞而非固体支持物。优选地，小于15％的这些细胞不附着于固体支持物上，更优选小于10％的这些细胞不附着于固体支持物上，最优选小于5％的这些细胞不附着于固体支持物上。
本文中关于细胞使用的术语“铺板的”或“铺板”可以指在体外建立细胞培养物。例如，细胞可以在细胞培养基中稀释，然后加入细胞培养板、培养皿或烧瓶中。细胞培养铺板是本领域普通技术人员通常所知的。细胞可以以各种浓度和/或细胞密度进行铺板。
术语“细胞铺板”也可以延伸到术语“细胞传代”。本发明的细胞可以使用本领域技术人员熟知的细胞培养技术进行传代。术语“细胞传代”可以指包括以下步骤的技术：(1)从固体支持物或基底释放细胞并解离这些细胞，和(2)在适于进一步细胞增殖的培养基中稀释细胞。细胞传代还可以指去除含有培养细胞的液体培养基的一部分，并将液体培养基加入到原始培养容器中以稀释细胞并允许进一步的细胞增殖。此外，还可以将细胞加入到已经补充有适于进一步细胞增殖的培养基的新培养容器中。
涉及细胞时，本文所用术语“增殖”指可以在一段时间内呈数量上的增加的细胞组。
本文所用术语“重编程”或“重编程的”可以指将一种细胞转变成具有至少一种不同特性的另一种细胞的材料和方法。而且，这样的材料和方法可以将细胞重编程或转变成另一种细胞类型，该细胞类型通常不在前一细胞的生命周期中表达。例如，(1)可以将非全能细胞重编程为全能细胞，或(2)可将前体细胞重编程为全能细胞。
本文所用的术语“分化的细胞”可以指已从非专门化的表型发展至专门化表型的前体细胞。例如，胚胎细胞可以分化成肠上皮细胞。本发明的材料和方法可以将分化的细胞重编程为全能细胞。例如，分化细胞可以从胎儿或出生的活的动物中分离。
本文所用术语“未分化细胞”可以指具有非专门化表型并且能够分化的前体细胞。未分化细胞的实例是干细胞。
为便于实施本发明，提供以下材料和方法。
细胞培养
从酪氨酸酶-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato，-EGFP)Luo/J转基因的和C57BL/6小鼠中分离TTF。尾部去皮，切成1cm片段，置于培养皿中，并在MEF培养基(含有10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、非必需氨基酸(Invitrogen)、丙酮酸钠和青霉素/链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Invitrogen))中培养5天。从第14.5天小鼠胚胎中分离MEF。细胞在所有实验中分裂不超过三次。从20周龄的胎儿皮肤(Advanced BioscienceResources，Inc；Alameda，CA)分离人胎儿成纤维细胞。根据宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准的方案，从手术后弃去的正常皮肤获得人成年成纤维细胞。机械离解人皮肤样本，置于明胶涂覆的培养皿中并在MEF培养基中培养。XB2是小鼠角化细胞的永生细胞系，将其在MEF培养基中培养。将HEK 293T细胞和人成纤维细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(均来自Invitrogen)的DMEM中培养。
病毒感染
对于小鼠细胞感染，通过将逆转录病毒和pECO转染到293T细胞中来包装病毒。对于人细胞感染，通过将逆转录病毒载体pUMVC和pCMV-VSVG转染到293T细胞中来包装泛嗜病毒(pantropic virus)。为了改善泛嗜逆转录病毒的感染效率，我们使用Retro-XTM浓缩器(Clontech)根据制造商的说明浓缩病毒。48小时后，用含有RPMI 1640(Invitrogen)、10％FBS、10ng/ml bFGF(Invitrogen)、100ng/ml SCF(R&D)、100nM ET-3(American PeptideCompany)、20pM霍乱毒素(CT)(Sigma-Aldrich)和200nM 12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)(Sigma-Aldrich)的小鼠黑色素细胞诱导培养基替换生长培养基。人黑色素细胞诱导培养基含有培养基254、10ng/ml bFGF、100ng/ml SCF、100nM ET-3。对于G418选择，在黑色素细胞诱导培养基中加入60μg/mL G418。
流式细胞术和细胞分选
用抗TYR(Abcam)、TYRP1(Sigma)、c-Kit(eBioscience)和PDGFRA(BioLegend)的抗体染色细胞(2.5×106个细胞/ml)。为了检测细胞内蛋白质，对用PBS中的4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)固定的细胞进行染色。在有2％FBS的PBS中进行染色。使用LSRII流式细胞仪(BD)分析染色的细胞和GFP+细胞。对于FACS分选，使用FACSAriaTMII(BD)细胞分选仪(Upenn Flow Cytometry Facility)在PBS/2％FBS中以106个细胞/ml的浓度分选细胞。将PDGFRA+/c-Kit-成纤维细胞从P1胎儿hF分选，并作为P0培养。对于磁珠分选，根据制造商的指导使用了Miltenyi MACS磁珠分选系统。使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。
免疫荧光和免疫化学
用4％多聚甲醛固定单层细胞，用特异于TYR、TYRP1、DCT(多克隆；V.J.Hearing，Bethesda，MD的礼物)、Melan-A、SILV和S100(多克隆；Dako)的一级抗体进行染色。洗涤后，将细胞与合适的594标记的二级抗体(Invitrogen)一起孵育。将石蜡包埋的载玻片脱蜡，然后如上所述进行抗原修复和染色。如上所述进行DCT的免疫荧光。使用标准免疫过氧化物酶技术在石蜡包埋的载玻片上进行对S100、melan-A和Fontana-Masson的免疫组织化学染色。
qRT-PCR
根据制造商的说明书，使用RNA微型试剂盒(Qiagen)从单一培养物中提取RNA。我们使用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis试剂盒(Invitrogen)进行逆转录反应。使用SYBR Green Supermix(Bio-Rad)进行qPCR，并使用Bio-Rad qPCR检测系统分析反应物。所用的引物列于表1。
表1引物序列
全基因谱分析和阵列分析
将从Illumina芯片生成的微阵列原始数据进行归一化，背景校正，并使用R包“lumi”(9)进行了总结。为减少假阳性，从分析中移除未表达探针，本文所述所有实验共检测了21,758个探针。用R包“limma”(10,11)评价差异基因表达分析，然后通过Benjamini和Hochberg程序进行多次检验校正(12，13)。将经调整的p值<0.05和倍数变化>4的基因进行双向聚类分析以产生热图。如前所述进行GSEA分析(14)。
亚硫酸氢盐基因组测序
根据制造商的建议，使用CpGenome修饰试剂盒(Millipore)进行亚硫酸氢盐处理。所用的PCR引物列于表1中。将扩增的产物克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。用每个基因的M13正向和M13反向引物对10个随机选择的克隆进行测序。测序在宾夕法尼亚大学测序设施上进行。通过BiQ Analyzer软件分析序列的CpG甲基化。
染色质免疫沉淀
在室温下，将107个hFF、hiMel或人黑色素细胞用1％甲醛固定10分钟，然后在置于冰上的1ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0,10mM EDTA，1％SDS和蛋白酶抑制剂)中裂解20分钟。将裂解物分装三个管并进行超声处理。离心10分钟后，通过用在IP缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0，NaCl，2mM EDTA，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂)中的BSA(1mg BSA，10ml珠)预先封闭的琼脂糖珠在4℃下孵育4小时以预清洗上清液。根据制造商的方案，每个免疫沉淀反应使用共100μL的预清洗染色质，每个反应物在20μg抗体存在下在1mL IP缓冲液中稀释。用于该研究的抗体是：抗-acH3(Millipore)、抗H3的二甲基K4(H3K4me2，Millipore)和正常的兔IgG(Sigma)。将沉淀物纯化并通过qPCR分析。PCR引物列于表2。
球体形成测定
如前所述(15)进行球体形成测定。简言之，将解离的细胞接种在含有终浓度为10ng/ml bFGF和100ng/ml SCF的外源生长因子的低细胞密度培养物中的无血清培养基中。产生球形菌落并在显微镜下计数。
人3D皮肤重建
如前所述进行人3D皮肤重建(16)。简言之，将组织培养盘(Organogenesis，Canton，MA)的插入物用1ml牛胶原I(器官发生)包被，并用含有7.5×104个成纤维细胞的3ml胶原蛋白I进行分层。在37℃下4至7天后，将hiMel与角化细胞混合，并以1:5(hiMel与角化细胞)的比例接种在真皮重建物之上。4天后，加入人角化细胞，将所述细胞在皮肤重建培养基中培养：角化细胞无血清培养基(Invitrogen)，其中有60μg/ml牛垂体提取物、2％经透析的胎牛血清(FBS，Invitrogen)、4.5ng/ml bFGF(Invitrogen)、100nM ET-3(Sigma)和10ng/ml SCF(R&D系统)。将培养物浸于含有1ng/ml表皮生长因子(EGF)(Invitrogen)的培养基中2天，含有0.2ng/ml EGF的培养基中另外2天，然后保持在空气-液体界面，并在高钙(2.4mM)培养基中孵育。两周后收获皮肤重建物，并在10％的中性缓冲福尔马林中固定3小时，并通过常规组织学方法进行处理。对于α-MSH处理测定，在培养物中加入50nMα-MSH以在重建的皮肤中诱导黑色素生成。
使用黑色素细胞的毛发贴片测定
如前所述(17，18)进行贴片测定。简言之，从出生后一天的BALB/c小鼠(一种具有无色素的白色毛发衣的小鼠品系)剥离躯干皮肤并在游离PBS中冲洗。皮肤在含有分散酶的PBS(2.5mg/ml，Invitrogen)中在4℃下平放放置过夜。分离表皮和真皮，如前所述分离诱导性真皮细胞和表皮细胞(19,20)。在雄性裸鼠(nu/nu)小鼠(Charles River)7-9周时测定了致毛细胞。对于每次皮内注射，使用1×106个BALB/c新生的真皮细胞和10,000个表皮聚集体。为了测试hiMel在重建测定中参与毛囊形成和产生着色发干的能力，在每次注射时将0.5×106个hiMel加入新生的BALB/c真皮和表皮细胞混合物中。作为阳性对照，将0.5×106个培养的人黑色素细胞以与小鼠细胞分开注射的方式加入。将细胞混合物重悬在50-70μl的DMEM-F12培养基(Invitrogen)中，并注射(25号针头)到小鼠皮肤的皮下组织，形成疱(bleb)。注射部位用黑色纹身刺痕(242Permanent Black Pigment，Aims，纽约州霍恩内尔)标记。在注射后两周收获皮肤，并在解剖显微镜下检查新形成的毛囊。进行两次独立实验，分别用不同批次的hiMel进行，每次设两个重复。
原位杂交
简言之，将石蜡载玻片脱水，抗原修复，并与Alu DNA探针(BioGenex PR-1001-01，即用型)杂交：将载玻片加热至85℃10分钟，然后37℃过夜。然后将载玻片与特异于荧光素，生物素标记(BioGenex AS2505-16，即用型)的抗体孵育，最后与用链霉亲和素-AlexaFluo488标记的二级抗体一起孵育。DAPI用于标记核DNA。
数据分析
学生t检验或ANOVA用于分析基因表达和流式细胞检测数据。对β-肌动蛋白加载对照进行归一化后分析qPCR数据。双侧p<0.05确定统计学意义。
以下提供的实施例用于说明本发明的具体实施方案。并非以任何形式限制本发明。
实施例1
前述研究已证明小眼畸形相关的转录因子(MITF)在来自神经嵴细胞的黑色素细胞谱系测定中的重要作用，并且MITF在NIH3T3成纤维细胞中的强制表达将其转化成黑色素细胞样细胞(21)。然而，这种诱导的细胞仅表达一些黑色素细胞特异性标记，并且缺乏黑色素细胞的功能特征(21)。推测可能需要多个转录因子将成纤维细胞重编程成功能性黑色素细胞，我们选择了与神经嵴谱系测定和黑色素细胞分化相关的10个候选转录因子(表2)(22-29)。
表2候选转录因子
为了通过流式细胞分析有效地监测黑色素细胞分化，我们开发了使用尾成纤维细胞(TTF)的转录因子筛选测定，所述尾成纤维细胞来自酪氨酸酶-CreER Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J报告小鼠(30)。用4-羟基他莫昔芬(4-HT)处理时，酪氨酸酶(TYR)驱动的CreER在黑色素细胞中的表达将这些小鼠细胞从表达红色荧光蛋白(RFP)转化为表达绿色荧光蛋白(GFP)。这使得可以通过检测GFP表达来监测TYR阳性(TYR+)黑色素细胞的出现(图1a)。制备携带10种候选小鼠转录因子的逆转录病毒，并使用所有这些因子的混合物感染TTF。通过qRT-PCR证实转基因的表达(图2)，仅用载体包装的病毒用作阴性对照。在用所有因子感染后12天，在4-HT存在下观察到GFP阳性(GFP+)细胞(图1b)，表明细胞中TYR启动子的激活。在对照(仅载体的细胞)中，检测到明显减少的GFP+细胞(图1b)。
我们接下来试图确定由成纤维细胞诱导黑色素细胞所需的最小基因集。鉴于SOX10在神经嵴谱系分化过程中已知的主要作用，将SOX10与所有其他单一因子组合引入TTF。当SOX10与MITF组合时，产生最大数量的GFP+细胞(图3a)。然而，SOX10/MITF组合引起包含所有细胞的6.44％的GFP+细胞的适度重编程效率。因此，我们添加了第三个转录因子(来自剩余的8个)，并使用每个组合分析了GFP+细胞的百分比。与其他组合相比，SOX10/MITF/PAX3和SOX10/MITF/SOX9组合提高了GFP+细胞的产生(图3b)。与SOX10/MITF/PAX3或SOX10/MITF/SOX9组合相比，向SOX10/MITF/PAX3组合添加SOX9不能进一步增加GFP+细胞的百分比(图3c)。而且，向SOX10/MITF/PAX3或SOX10/MITF/SOX9组合添加第四个因子不能进一步增加GFP+细胞的百分比(数据未显示)。为了确认黑色素细胞重编程，我们在用不同转录因子组合重新编程后，使用流式细胞术分析检查了TYRP1阳性(TYRP1+)细胞的百分比。结果表明，SOX10/MITF/PAX3组合诱导了百分比最高的TYRP1+细胞(图4)。统计学分析显示，与其他组合相比，SOX10/MITF/PAX3组合激活较高的GFP和TYRP1表达(图1c和图5)。因此，由SOX10/MITF/PAX3(SMP3)诱导的黑色素细胞的特征在另外的研究中表征。
在用携带SMP3组合的病毒感染来自酪氨酸酶(TYR)-CreER/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB -tdTomato-EGFP)Luo/J小鼠的TTF后，我们每天在荧光显微镜下监测GFP+细胞群体。诱导后14天出现具有黑色素细胞形态的GFP+细胞(图1d，图6a和6b)。使用FACS分选出GFP+细胞并将其重新接种以进行进一步表征。这些细胞表达了色素生产和递送机构的蛋白质组分，包括TYR、DCT、Melan-A和SILV(图1e和1f，图7和8a)。我们还观察到S100(一种钙结合蛋白)在诱导的黑色素细胞中高度表达(图1g)。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的转录分析揭示了多种黑色素细胞特异性基因的表达，包括TYR、TYRP1、DCT、SILV，P以及内源MITF、SOX10和PAX3(图8b)。同时，转基因SOX10，MITF和PAX3仍然在GFP+细胞中表达(图8c)。电子显微镜(EM)显示，GFP+iMel在不同发育阶段产生黑素体(图1h)，包括含成熟黑色素(III型和IV型)的黑素体。
然后，我们测试小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和源自成年C57BL/6小鼠的TTF中的SMP3组合。我们发现黑色素细胞特异性标记物，包括TYR，TYRP1和DCT早在MEF细胞用SMP3组合感染后5天即表达(图9a)。由于黑色素细胞比成纤维细胞更耐G418(31)，我们用G418将SMP3感染的MEF在XB2角化细胞饲养细胞层上培养14天。具有典型黑色素细胞形态的G418耐性细胞显示出强的多巴活性(图9b)。大部分G418耐性细胞表达TYR、Melan-A和S100(图10a)，显示出黑色素细胞特异性基因表达模式(图10b)。当用SOX10，MITF-GFP和PAX3(SMGFPP3)组合感染成年TTF时，获得了类似的结果，并且这些成人TTF在用SMGFPP3感染后表达黑色素细胞标记物(图11a)。使用FACS分选出GFP+细胞(图11b)，并将其在黑色素细胞诱导培养基中培养。如预期的，与仅用载体感染的成年TTF相比，显示典型的黑色素细胞形态的重编程GFP+细胞(图11c)表现出更高的黑色素细胞标记物的表达水平(图11d)。
为了测试人成纤维细胞是否可以直接重编程成黑色素细胞，我们用人的SMGFPP3组合感染传代的原代人胎儿真皮成纤维细胞(胎儿hF)。在G418选择下培养SMGFPP3感染的细胞，直到具有典型的黑色素细胞形态的细胞群体压倒(overwhelm)其他细胞群体。在此过程中，我们使用流式细胞仪分析分析培养物中TYR+和TYRP1+细胞的百分比。到第40天观察到约40％具有典型黑色素细胞形态的细胞(图12a和12b，图13a)，并且到第80天大部分细胞显示典型的黑色素细胞免疫表型(图12a和图13a)。我们继续培养这些黑色素细胞，发现在第100天，99.3％的富集细胞是TYR+细胞(图13b)。hiMel表达TYR、TYRP1、DCT和SILV(图12c-12f)，以及S100和Melan-A(图13c)。qRT-PCR分析进一步证实黑色素细胞特异性基因网络被激活(图12g)。此外，还诱导了PAX3、SOX10和MITF的内源性表达(图12g)。然而，我们发现转基因PAX3、SOX10和MITF仍然在hiMel中表达(图13d)。关注黑色素细胞表型和功能取决于持续的转基因表达，我们将表达多西环素诱导型PAX3、SOX10和MITF的病毒引入胎儿hF。诱导PAX3、SOX10和MITF的转基因表达2周，然后通过从培养基中撤除多西环素进行沉默(图14a)。将沉默的细胞再培养80天并用qRT-PCR和免疫染色测定进行分析。黑色素细胞标记物在没有外源PAX3、SOX10和MITF表达的情况下继续表达(图14b和14c)。这些数据表明诱导的黑色素细胞表型是稳定的，不依赖于转基因表达。
如Fontana-Mason染色所揭示，hiMel能够产生黑色素(图12h)。为了进一步证实黑色素细胞的身份，我们发现hiMel含有真正的黑素体，从早期阶段(II型)到含成熟黑色素(III型和IV型)的黑素体(图12i)。
总体表达分析表明，hiMel与成人黑色素细胞而非亲本成纤维细胞聚集，如无监督层次聚类所示(图15a)。值得注意的是，编码用于着色的黑素生成的限速酶的许多代表性基因(如TYR、TYRP1和DCT)在hiMel中上调(图15b)。此外，Melan-A在hiMel中高度表达(图15b)。此外，我们分析了MSigDB基因集合在hiMel和hMel中的富集。如图15c所示，源自人成纤维细胞的hiMel获得黑色素细胞的特征(KEGG_LYSOSOME基因集和DACOSTA_UV_RESPONSE_VIA_ERCC3途径)，并失去成纤维细胞特异性基因网络的表达(MILI_PSEUDOPODIA_HAPTOTAXIS_DN和MILI_PSEUDOPODIA_CHEMOTAXIS_DN途径)(32)。
我们接下来分析了TYR和TYRP1启动子的DNA甲基化状态，作为基因激活的指示。如预期的那样，TYR和TYRP1启动子在hiMel(去甲基化比例：TYR，69.64％；TYRP1，60.94％)和人黑色素细胞(去甲基化百分比：TYR，85.71％；TYRP1，87.5％)中高度去甲基，而这些相同的区域在亲本成纤维细胞中高度甲基化(去甲基化百分比：TYR，35.67％；TYRP1，34.38％)(图15d和15e)。然后，我们进行了染色质免疫沉淀(ChIP)测定，以分析TYR和TYRP1启动子区域中的组蛋白修饰。与亲本成纤维细胞相比，我们发现hiMel和hMel显示较高水平的H3K4me2甲基化和acH3乙酰化(图15f和15g)。
接下来，我们进行球体形成测定以测试当前黑色素细胞培养条件下原代胎儿成纤维细胞中成体干细胞的存在。我们发现0代(P0)原代胎儿真皮成纤维细胞可以形成一些球体；然而，这些形成球体的细胞在传代时明显减少，且到第2代(P2)胎儿成纤维细胞(其用于黑色素细胞诱导实验)形成很少的球体(图16a)。为了进一步排除胎儿成纤维细胞培养物被黑色素细胞或黑色素细胞干细胞污染的可能性，我们在诱导培养基中培养P2胎儿成纤维细胞40天。在这个孵育期后，我们没有检测到表达TYR、TYRP1、DCT或Melan-A的任何细胞(图17a)。类似地，流式细胞分析显示培养物中几乎没有TYR+或TYRP1+细胞群体(图17b)。
为了进一步阐明初始成纤维细胞群体的纯度和身份，我们使用成纤维细胞标记物PDGFRA(33)纯化成纤维细胞和黑色素细胞标记c-Kit，以使用MACS MicroBead技术圈出黑色素细胞(图18a)。首先，我们发现PDGFRA+/c-KIT-成纤维细胞形成很少的球体(图16b)。然后将P2PDGFRA+/c-KIT-纯化的成纤维细胞通过人SMGFPP因子组重编程。通过qRT-PCR和免疫染色证实黑色素细胞标记物的表达(图18b和18c)。这些结果进一步表明，iMel不是由培养物污染物引起，而是由人成纤维细胞的直接重编程。
为了研究hiMel的生物学功能，我们使用hiMel、亲本胎儿成纤维细胞和包皮角化细胞形成3D器官型皮肤等效物，如前所述(16)。Melan-A和S100阳性黑色素细胞位于真皮-表皮连接处附近(图19)。Fontana-Masson染色显示基底层和超基底层角化细胞中的黑色素，表明iMel不仅产生色素，而且还将色素转移到周围的角化细胞中(图19)。此外，我们发现，在α-MSH刺激下，hiMel构成的3D皮肤重建中的黑色素生成增加(图20)。
为了研究hiMel的体内功能，我们开发了一种新的测定方法，使用改良的毛发贴片测定来评估皮肤和毛发色素沉着(34)。该测定中，将hiMel与来自新生的BALB/c白化小鼠皮肤的上皮细胞和真皮成纤维细胞混合，然后移植到裸鼠背部皮肤。人正常皮肤黑色素细胞被用作阳性对照。当将人正常皮肤黑色素细胞或hiMel与由BALB/c白化小鼠皮肤制备的细胞混合时，色素毛囊形成(图21a，中图和右图)。为了避免污染亲本成纤维细胞中的黑色素细胞或黑色素细胞干细胞的可能性，我们将亲本成纤维细胞与BALB/c衍生的上皮细胞和真皮成纤维细胞混合，然后将细胞混合物移植到裸鼠背部皮肤。在这些条件下仅产生白发(图21a，左图)。收集移植物，组织学检查发现具有许多毛囊的表皮内衬囊肿(图21b)。我们发现FITC标记的人特异性Alu探针特异性识别的hiMel，位于着色移植物中的毛囊内(图21b)和真皮中(数据未显示)的真皮-表皮连接处附近。可以在毛囊的滤泡间真皮和空泡区域看到DCT+细胞(图21c)。同时，在毛囊和表皮中观察到TYRP1+细胞(图21d)。类似地，在表皮和毛囊中的真皮-表皮连接处附近看到S100+细胞(图21e)。一些黑色素细胞也位于真皮中。然后，我们进行了Fontana-Masson染色，以研究黑色素在表皮和毛囊中的分布。在表皮，毛囊上皮和毛干中检测到黑色素(图21f)，表明hiMel能够在体内将色素转移到周围的角化细胞中(图21f)。使用hiMel的毛发贴片测定中的色素沉着模式与正常皮肤黑色素细胞中的相同。在使用亲本成纤维细胞和BALB/c衍生细胞的毛发贴片测定中，我们没有发现任何黑色素(图21f)。这些数据表明hiMel在功能上与正常皮肤黑色素细胞相同。
为了测试单独的MITF是否足以在体内产生功能性黑色素细胞，我们在黑色素细胞诱导培养基中培养MITF感染的成纤维细胞50天。然后我们将MITF感染的成纤维细胞与BALB/c衍生的上皮细胞和真皮成纤维细胞混合物移植到小鼠背部皮肤中。我们没有发现皮肤重建体的毛囊和表皮中有任何色素(图22a和22b)，表明单独的MITF不足以由成纤维细胞诱导黑色素细胞。
然后我们使用相同的程序对待成人成纤维细胞(成人hF)并用SMGFPP3病毒组合感染它们。将SMGFPP3感染的细胞培养15天，分选GFP+细胞并在黑色素细胞诱导培养基中培养GFP+细胞40天。GFP+细胞的qRT-PCR分析显示用于黑色素生成和转移的黑色素细胞网络确实被激活(图23)。我们还检测到关键黑色素细胞标记物的表达，发现具有典型黑色素细胞形态的细胞表达TYR、DCT、S100和Melan-A(图24a)。显然地，只有6％的成年hF表达黑色素细胞标记物，表明成年成纤维细胞重编程效率远低于胎儿成纤维细胞(图24b)。我们进行流式细胞术分析以测量成年重编程的细胞中TYR+和TYRP1+细胞的百分比，发现其分别仅为3.27％和2.16％(图25)。
讨论
我们开发了一种从成纤维细胞直接产生黑色素细胞的新方法。该方法是调用直接重编程或转分化。它与产生诱导的多能干细胞(iPSC)然后将iPSC分化为黑色素细胞有明显差异。iPSCs需要很长时间才能产生，并且未分化的iPSC是致瘤性的，可能污染分化的细胞，并且分化效率低。我们开发的方法更有效率且截然不同。用包含Pax3、Sox10和Mitf的质粒感染/转染正常成纤维细胞。然后将细胞在黑色素细胞培养基中培养。几周后，黑色素细胞出现在培养物中。诱导的黑色素细胞具有典型的包皮衍生的黑色素细胞形态，通过基因表达分析或免疫组织化学法检测其表达作为黑色素细胞的所有标记物，并通过Fontana-Mason染色呈阳性。当诱导的黑色素细胞被包含在3D皮肤等效培养物中时，黑色素细胞作为正常黑色素细胞迁移到真皮表皮连接处，并将黑色素转移到角化细胞。因此，这些细胞具有正常的黑色素细胞的表型并起正常黑色素细胞的作用。
在转化医学中，通过直接重编程产生功能性黑色素细胞，建立了获得自体黑色素细胞的可扩展来源的手段，其然后可用于开发基于细胞的治疗，用于色素性病症如白癜风和与先天性病症相关的色素沉着不足。将成纤维细胞重编程为特异于黑素瘤患者的黑色素细胞，也是研究黑素瘤病因的有力策略。
实施例2白癜风治疗
患有稳定白癜风的患者在诊所接受治疗。最大尺寸的褪色面积超过5厘米。病变在过去6-12个月内稳定。从患者的手臂取3mm活检，并从活检组织分离成纤维细胞。可以使用几种方法来产生表达实施例1中所述的转录因子的细胞。可以用含有MITF、Sox10和Pax3的载体、这3个因子的合成mRNA、或直接注入细胞的蛋白质，转染成纤维细胞。任何引起这三个因子的足够水平的蛋白质表达的方法都包含在本发明中。转染后，这些成纤维细胞将在上述培养基中培养25-40天。然后，我们使用FACS或免疫组化法测量培养物中黑色素细胞的百分比。将所得细胞悬浮在培养基中或接种到生物相容性膜上。使用机械方法(例如擦除)或激光方法将白癜风区域中的表皮除去。然后将黑色素细胞施用于具有白癜风的区域。然后用绷带覆盖该区域，表皮颜色将愈合。在优选的实施方案中，表皮颜色在1-2周内愈合。
实施例3使用本发明的黑色素细胞筛选用于治疗疾病的治疗剂
本发明提供了筛选用于治疗多种病症的小分子的新方法。例如，可以获得患有p16损失的患者的成纤维细胞。如上文实施例1所述，将成纤维细胞重编程成黑色素细胞。如此产生的黑色素细胞可以在存在和不存在测试试剂的情况下孵育。这些细胞暴露于紫外线辐射后，抑制其恶性转化的试剂应当具有治疗这种病症的功效。
实施例4
在延迟或预防头发灰白的方法中，可以获得老年患者的成纤维细胞。如上所述，成纤维细胞将被重编程至黑色素细胞。这些黑色素细胞将用于筛选预防延迟黑色素细胞衰老的小分子。如此鉴定的分子可用来有利地预防或治疗头发灰白。
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尽管上文已对本发明的某些优选实施方案进行了描述和具体示例，但这并非意图将本发明限于这些实施方案。在不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可以对其进行各种修改。

Claims (26)

1.一种用于产生黑色素细胞的方法，包括：
a)提供能够转分化成黑色素细胞的细胞；
b)在化学限定的培养基中培养所述细胞；
c)将与小眼畸形有关的转录因子(MITF)、SRY相关的HMG盒(SOX10)转录因子和配对盒-3(PAX-3)转录因子中的至少两种，或将编码所述转录因子的核酸，引入所述细胞中，由此诱导所述细胞转分化成表达黑色素细胞标记物TYR、DCT、S-100和Melan-A的黑色素细胞；以及，可选地
d)分离所述黑色素细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，引入所有三种转录因子，并且所述细胞是成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物源细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞是人源细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞是胎儿成纤维细胞。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞是成人成纤维细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转录因子由一个或多个重组表达载体编码。
8.一种用于权利要求1所述的方法的重组表达载体，所述载体包括在所述细胞中起作用的表达控制序列，所述表达控制序列与选自以下的至少一种转录因子可操作地连接：小眼畸形有关的转录因子(MITF)、SRY相关的HMG盒(SOX10)和配对盒-3(PAX-3)组成的组中。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其表达两个所述转录因子，所述两个转录因子为MITF和SOX10。
10.根据权利要求8所述的重组载体，其表达所有三个转录因子。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为合成的mRNA。
12.根据权利要求8所述的重组表达载体，其选自由裸质粒、疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺-相关病毒组成的组中。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述转录因子直接引入细胞中。
14.一种由权利要求1所述方法产生的分离的黑色素细胞。
15.一种将黑色素细胞递送到有需要的患者的方法，包括：
a)由所述患者提供自体细胞，所述细胞能够转分化为黑色素细胞；
b)由权利要求1或权利要求2所述的步骤b)的细胞来制备黑色素细胞；
c)收获步骤b)的黑色素细胞，和
d)将所述黑色素细胞引入所述患者，所述黑色素细胞表达黑色素细胞特异性标记物并产生色素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述引入步骤包括从受影响区域除去表皮，由此形成治疗位点，以及将包括所述分离的黑色素细胞的组合物直接施用至所述治疗位点。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述组合物进一步包括角化细胞。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述引入步骤包括从受影响区域除去表皮，由此形成治疗位点，以及将具有所述黑色素细胞的生物相容性膜直接施用至所述治疗位点。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述生物相容性膜也种植有角化细胞。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述患者具有皮肤病况。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，所述皮肤病况是色素沉积病症。
22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述色素沉积病症选自：斑驳症、白化病、白癜风和头发灰白。
23.根据权利要求14所述的方法，其中，所述色素沉积病症是白癜风。
24.一种鉴别调节黑色素细胞活力和功能的试剂的方法，包括：
a)提供通过如权利要求1或权利要求2的方法制备的黑色素细胞；
b)在存在和不存在测试试剂的情况下孵育所述细胞；和
c)分析所述试剂是否改变与黑色素细胞活力或功能相关的细胞参数，从而鉴别改变所述参数的试剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述功能是色素产生。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述试剂抑制所述黑色素细胞暴露于UV辐射后的恶性转化。
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