PL236298B1

PL236298B1 - Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Info

Publication number: PL236298B1
Application number: PL422916A
Authority: PL
Inventors: Marcin Majka; Maciej SUŁKOWSKI; Maciej Sułkowski
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2020-12-28
Also published as: US11739295B2; US20200216804A1; EP3684916A1; EP3684916A4; WO2019059792A1; PL422916A1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. induced Pluripotent Stem cells - iPS) do komórek upigmentowanych. Uzyskiwane za pomocą tego protokołu komórki produkują czarny pigment - melaninę.

Melanina jest to naturalny barwnik skóry, którego dotychczasowe źródła są bardzo ograniczone. Melaninę izoluje się z biopsji skórnych lub włosów, jednak w bardzo małej ilości i w stanie mocno zdegradowanym. Dotychczasowe metody uzyskiwania komórek upigmentowanych in vitro są niezwykle mało wydajne.

Celem wynalazku jest dostarczenie wydajnego sposobu otrzymywania bogatych w melaninę komórek ludzkich.

Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) zawiesinę konfluentnych komórek iPS wysiewa się na szalkę uniemożliwiającą adhezję komórek w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632 w gęstości 2-2,5 x 104 komórek/cm², a następnie hoduje się przez 4 dni do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB,

b) uzyskane w etapie a) ciałka embrioidalne EB zbiera się oraz wysiewa się na szalkę adherentną i prowadzi hodowlę w medium do komórek iMEF przez 18 godzin,

c) prowadzi się selekcję progenitorów w medium N1 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, fibronektynę w stężeniu 250 ng/ml, roztwór antybiotyków zawierający penicylinę i streptomycynę P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 μg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, przez 10 dni, usuwając okresowo martwe komórki oraz uzupełniając składniki pożywki,

d) uzyskane komórki progenitorów rozdysocjowuje się, wysiewa się w gęstości 0,5-2 x 10⁵/cm², na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną oraz prowadzi się ich ekspansję przez 7 dni w medium N2 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, bFGF w stężeniu 20 μg/ml, FGF8 w stężeniu 100 ng/ml, P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 μg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, a uzyskane komórki przed ich wykorzystaniem w kolejnym etapie ewentualnie przechowuje się zamrożone w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 miliony komórek/ml,

e) prowadzi się przez 7-16 dni ostateczne różnicowanie komórek poprzez ich hodowlę w medium N3 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, dibutyrylo-cAMP w stężeniu 0,5 mM, kwas askorbinowy w stężeniu 200 μM, P/S w stężeniu 100 U/ml /100 μg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, uzyskując ludzkie komórki upigmentowane melaniną.

Korzystnie, pożywki N1, N2 i N3 składają się wyłącznie ze wskazanych składników.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórek uzyskiwanych w sposobie według wynalazku określonym powyżej do otrzymywania melaniny metodą in-vitro.

Prowadzona zgodnie z wynalazkiem hodowla komórkowa in vitro jest dogodnym, i jednocześnie nieograniczonym źródłem melaniny, dostępnej w formie niezdegradowanej. Znane sposoby uzyskiwania melaniny in vitro nie posiadają zbliżonej wydajności do uzyskiwanej zgodnie z wynalazkiem. Za pomocą wynalazku można uzyskać znaczące ilości pigmentu gotowego do badań biofizycznych w krótkim czasie i relatywnie niskim kosztem. Wyizolowana melanina może znaleźć wiele zastosowań przemysłowych, w tym jako substrat do opracowania nowej generacji naturalnych kremów chroniących przed promieniowaniem UV. Uzyskane komórki mogą także zostać wykorzystane do leczenia chorych na bielactwo jako naturalny substytut melanocytów. Protokół uzyskiwania komórek upigmentowanych zamieszczono poniżej.

Przykład 1. Sposób uzyskiwania wysoce upigmentowanych melaniną komórek ludzkich z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wykorzystywano konfluentne komórki piPS (protein-iPS) zakupione od firmy System Bioscience (cat no. SC801A-1, SC802A-1) (Kim et al. 2009) lub linie wyprowadzone w Zakładzie Transplantologii CMUJ poprzez reprogramowanie komórek somatycznych dawców.

W pierwszym etapie konfluentne komórki iPS (Fig. 1A.) hodowane na warstwie odżywczej z komórek iMEF zbierano akutazą oraz wysiewano w postaci zawiesiny pojedynczych komórek na szalkę

PL 236 298 Β1 uniemożliwiającą adhezję komórek, w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632, w gęstości 2-2,5 χ 10⁴/cm². Następnie komórki iPS hodowano w zawiesinie przez 4 dni, aż do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB (Fig. 1B.).

Skład medium do komórek iPS:

Składnik	Stężenie
KSR (ThermoFisher Scientific)	20%
β-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)	0,1mM
Non-essential Amino Acids (ThermoFisher Scientific)	1X
Penicylina/ Streptomycyna (P/S) (ThermoFisher Scientific)	100 U/ml/100 pg/ml
bFGF (ThermoFisher Scientific)	10 ng/ml
DMEM/F12 (ThermoFisher Scientific)

W kolejnym kroku ciałka embrioidalne zebrano, żwirowano (300 rpm, 5 minut) oraz wysiano na szalkę adherentną o takiej samej powierzchni jak użyta szalka nieadherentna w medium do komórek iMEF. Skład medium do komórek iMEF:

Składnik	Stężenie
Fetal Bovine Serum (EurX)	10%
L-glutamina (ThermoFisher Scientific)	2mM
P/S	100 U/ml/100 pg/ml
DMEM 4,5g/l (Lonza)

Po ok. 18 godzinach rozpoczęto selekcję progenitorów (Fig. 1C.) zmieniając medium na medium N1 o składzie:

Składnik	Stężenie
Suplement N2 (ThermoFisher Scientific)	1x
Fibronektyna (ThermoFisher Scientific)	250 ng/ml
P/S	100 U/ml/100 pg/ml
DMEM/F12 (ThermoFisher Scientific)

PL 236 298 Β1

Selekcję w bezsurowiczym medium N1 prowadzono przez 10 dni co drugi dzień usuwając martwe komórki oraz podając świeże medium N1. Wykorzystano Suplement N2 oferowany przez firmę Life Technologies zawierający ludzkie: insulinę (0,1 mg/ml), holotransferynę (5 μg/ml), progesteron (20 μΜ), putrescynę (0,1 mM), selenian sodu (30 nM) (stężenia końcowe, po rozcieńczeniu w medium).

W kolejnym kroku prowadzono ekspansję wyselekcjonowanych progenitorów (Fig. 1D.). Komórki rozdysocjowano trypsyną na pojedyncze komórki oraz wysiano w gęstości 0,5-2 x 10⁵/cm² na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną.

Ekspansję komórek prowadzono przez 7 dni w medium N2 o składzie:

Składnik	Stężenie
Suplement N2	1x
Laminina (ThermoFisher Scientific)	1 mg/ml
bFGF	20 pg/ml
FGF8 (ThermoFisher Scientific)	100 ng/ml
P/S	100 U/ml /100 pg/ml
DMEMF12

Progenitory mrożono w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml. Po zakończonej ekspansji przez 7-16 dni prowadzono terminalne różnicowanie komórek zmieniając medium z N2 na medium N3. Skład medium N3 prezentuje poniższa tabela:

Składnik	Stężenie
Suplement N2	1x
Laminina	1 mg/ml
Dibutyrylo-cAMP (Sigma-Aldrich)	0,5 mM
Kwas askorbinowy (Sigma-Aldrich)	200 pM
P/S	100 U/ml / 100 pg/ml
DMEM/F12

W wyniku opisanej metody różnicowania w sposób bardzo powtarzalny rutynowo otrzymywano wysoce upigmentowane komórki (Fig. 1E—I.). Wydajność procesu różnicowania była zawsze podobna i pozwalała na uzyskanie znacznej liczby (>3 χ 10⁶) silnie upigmentowanych komórek.

Na fig. 1 zaprezentowano wyniki kolejnych etapów różnicowania komórek iPS do komórek upigmentowanych. A - Komórki piPS rosnące na warstwie odżywczej. B - wielokomórkowe ciałka embrioidalne EB w zawiesinie. C - wyselekcjonowane komórki NPC zostały poddane ekspansji (D). W ostatecznym etapie różnicowania komórki przyjmowały czarne zabarwienie (E-l)

Przykład 2. Charakterystyka uzyskanych komórek oraz izolowanego z nich pigmentu.

Uzyskiwany pigment został jednoznacznie zidentyfikowany jako melanina za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) (Fig. 2A.) oraz barwienia Fontany-Massona (Fig. 2B.).

Uzyskane upigmentowane komórki zostały scharakteryzowane pod kątem analizy ekspresji genów za pomocą reakcji RT-PCR (Fig. 3.) oraz za pomocą barwienia immunocytochemicznego (ICC) (Fig. 4.).

Na fig. 3 została zaprezentowana ekspresja markerów na poziomie RNA. A - Upigmentowane komórki, w przeciwieństwie do komórek iPS, posiadają ekspresję markerów melanocytów (MITF-M,

PL 236 298 B1

TRP1, TYR). B - W kolejnych etapach różnicowania komórek (A-F) spada ekspresja markerów embrionalnych (OCT-4, NANOG, TERT), a rośnie ekspresja markerów neuro-ektodermalnych (NURR1, TUJ-1, TH). TERT- telomeraza, TUJ-1 - tubulina β III, TH - hydroksylaza tyrozyny NURR1 - białko związane z receptorem jądrowym, Gen konstytutywny GAPDH posłużył jako kontrola pozytywna reakcji PCR.

Na fig. 4 została zaprezentowana ekspresja markerów na poziomie białka. Uzyskane komórki posiadają ekspresję markerów melanocytów - TRP1 oraz MITF (A i B). W otrzymanej heterogennej populacji komórek obecne są również neurony dopaminergiczne posiadające ekspresję TUJ-1 oraz TH (C i D).

Subkomórkowa lokalizacja melaniny została określona za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) (Fig. 5.)

Na fig. 5 została zaprezentowana subkomórkowa lokalizacja melaniny w uzyskanych komórkach. Melanina uorganizowana jest w organellach przypominających kolejne stadia rozwoju melanosomów (I-IV w A). Organella te otoczone są podwójną błoną komórkową (B).

Uzyskane wyniki pozwalają jednoznacznie stwierdzić, że uzyskany pigment to melanina. Zróżnicowane upigmentowane komórki pod wieloma względami przypominają melanocyty (ekspresja markerów, profil ekspresji genów, obecność błoniastych, wewnątrzkomórkowych organelli wypełnionych pigmentem). Jednak ilość upigmentowanych komórek oraz stopień upigmentowania uzyskanych komórek są nieoczekiwanie wysokie w porównaniu ze znanymi ze stanu techniki. Opisany sposób dostarcza bardzo dużych ilości niezwykle silnie upigmentowanych komórek, które mogą posłużyć do izolacji czystej, niezdegradowanej melaniny w dużych ilościach i relatywnie niskim kosztem.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) zawiesinę konfluentnych komórek iPS wysiewa się na szalkę uniemożliwiającą adhezję komórek w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632 w gęstości 2-2,5 x 104 komórek/cm², a następnie hoduje się przez 4 dni do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB, b) uzyskane w etapie a) ciałka embrioidalne EB zbiera się oraz wysiewa się na szalkę adherentną i prowadzi hodowlę w medium do komórek iMEF przez 18 godzin,

c) prowadzi się selekcję progenitorów w medium N1 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, fibronektynę w stężeniu 250 ng/ml, roztwór antybiotyków zawierający penicylinę i streptomycynę P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 gg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, przez 10 dni, usuwając okresowo martwe komórki oraz uzupełniając składniki pożywki,

d) uzyskane komórki progenitorów rozdysocjowuje się, wysiewa się w gęstości 0,5-2 x 10⁵/cm², na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną oraz prowadzi się ich ekspansję przez 7 dni w medium N2 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, bFGF w stężeniu 20 gg/ml, FGF8 w stężeniu 100 ng/ml, P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 gg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, a uzyskane komórki przed ich wykorzystaniem w kolejnym etapie ewentualnie przechowuje się zamrożone w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 miliony komórek/ml,

e) prowadzi się przez 7-16 dni ostateczne różnicowanie komórek poprzez ich hodowlę w medium N3 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, dibutyrylo-cAMP w stężeniu 0,5 mM, kwas askorbinowy w stężeniu 200 gM, P/S w stężeniu 100 U/ml /100 gg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, uzyskując ludzkie komórki upigmentowane melaniną.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywki N1, N2 i N3 składają się wyłącznie ze wskazanych składników.
3. Zastosowanie komórek uzyskiwanych w sposobie określonym w zastrz. 1-2 do otrzymywania melaniny metodą in-vitro.