MXPA00004740A - Soporte polimerico biodegradable - Google Patents

Abstract

Se describe un soporte polimérico queincluye una red macroporosa ampliamente interconectada;el soporte polimérico tiene macroporos con un diámetro de entre 0.5 y 3.5 mm, y preferiblemente de entre 1.0 y 2.0 mm;el soporte polimérico se prepara utilizando un procedimiento novedoso que preferiblemente combina las técnicas de lixiviación de partículas y de inversión de fases para crear un proceso que amplifique los medios mediante los cuales se controla la morfología del soporte polimérico resultante;es posible utilizar el soporte polimérico en elárea de ingeniería de tejidos, particularmente como un soporte para el crecimiento celular tanto in vitro como in vivo.

Description

SOPORTE POLIMERICO BIODEGRADABLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente Invención se refiere al uso de un soporte polimérico biodegradable para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Muy particularmente, la presente invención se refiere a un soporte polimérlco macroporoso novedoso que tiene un alto nivel de interconectlvidad entre macroporos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tratamientos de hueso por lesiones, malformaciones genéticas y enfermedades requieren comúnmente la implantación de injertos. Se sabe bien que los autoinjertos y aloinjertos son los implantes más seguros; sin embargo, debido al suministro limitado y a los riesgos de transmisión de enfermedades y rechazo encontrados con estos injertos, también se han usado ampliamente biomateriales sintéticos como implantes. Complicaciones in vivo observadas con algunos de estos biomateriales, tales como desajustes mecánicos (protección de tensión) y aparición de restos de desgaste llevaron a la atrofia de huesos, osteoporosis o osteollsis alrededor de los Implantes (Woo et al., 1976; Terjesen et al., 1988). Un nuevo enfoque, definido como Ingeniería de Tejidos (TE), ha originado recientemente bastante interés. La ingeniería de tejidos implica el desarrollo de una nueva generación de biomateriales capaces de interacciones específicas con tejidos biológicos para producir equivalentes de tejidos funcionales. El concepto subyacente es que pueden aislase células de un paciente, expandirse en cultivos de células y sembrarse sobre un soporte preparado de un biomaterial específico para formar un material mixto biológico/de soporte llamado una "construcción de TE". La construcción puede ser injertada después en el mismo paciente para funcionar como un tejido de remplazo. Algunos de estos sistemas son útiles para el remplazo de tejidos de órganos en donde existe una disponibilidad limitada de órganos de donadores o cuando, en algunos casos (por ejemplo pacientes jóvenes) están disponibles reemplazos naturales inadecuados. El propio soporte puede actuar como un vehículo de suministro para porciones biológicamente activas a partir de factores de crecimiento, genes y fármacos. Este enfoque revolucionario para la cirugía tiene extensas aplicaciones con beneficios tanto para el bienestar del paciente como para el avance de los sistemas del cuidado de salud. La aplicación de la ingeniería de tejidos al crecimiento de tejidos de hueso implica cosechar células madre osteogénicas, sembrarlas y permitirles crecer para producir un nuevo tejido in vitro. El tejido recién obtenido puede usarse después como un autoinjerto. Los poliésteres biodegradables -en particular poli(láctido-co-glicólido)s- se han usado como soportes para ingeniería de tejidos de diferentes poblaciones de células, por ejemplo: condrocitos (como los descritos por Freed et al., en J. of Biomed. Mater. Res. 27:11-13, 1993), hepatocitos (como los descritos por Mooney et al., en Journal of Biomedical Mat. Res. 29, 959-965, 1995) y más recientemente, células derivadas de la médula ósea (como las descritas por Ishaun et al., en J. Biomed. Mat Res. 36: 17-28, 1997 y Holy et al., en Cells and Materials, 7, 223-234, 1997). Específicamente, se prepararon estructuras porosas de estos poliésteres y se sembraron con células; sin embargo, cuando se cultivaron células derivadas de la medula ósea sobre estas estructuras porosas, sólo ocurrió el crecimiento interno de hueso dentro del borde exterior de un soporte polimérico de tres dimensiones (Ishaug et al., supra; Holy et al., supra). De esta manera, los soportes poliméricos preparados estos casos no fueron adecuados para permitir el crecimiento de células necesario para hacer un tejido adecuado para implantación o para usarse como un autoinjerto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora que los soportes poliméricos caracterizados por macroporos en la escala de tamaño milimétrica con interconexiones como las observadas en el hueso trabecular, son particularmente útiles para la ingeniería de tejidos, toda vez que permiten el crecimiento interno de células que es crucial para el desarrollo de tejidos tridimensionales. Dichos soportes poliméricos pueden prepararse usando un procedimiento novedoso que combina las técnicas de inversión de fases y lixiviación de partículas.

En consecuencia, en un aspecto de la presente invención se provee un soporte polimérico que comprende macroporos, que varía en tamaño entre 0.5 mm a 3.5 mm, y que tiene una porosidad interconectante similar a la encontrada en el hueso trabecular humano. Muy particularmente, se provee un soporte polimérico macroporoso con una morfología trabecular que tiene una porosidad de por lo menos 50%; dicho soporte polimérico macroporoso ¡ncluye macroporos que tienen un diámetro promedio en la escala de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3.5 mm, los macroporos tienen paredes de poro definidas por puntales poliméricos, e incluyen pasajes macroporosos que interconectan los macroporos. En otro aspecto de la presente invención, se provee un procedimiento para hacer un soporte polimérico que comprende los pasos de: combinar un polímero en un medio líquido con partículas para formar una mezcla de polímero en partículas; estabilizar la mezcla de polímero en partículas; sumergir la mezcla de polímero en partículas en un solvente en el cual el polímero sea insoluble para precipitar el polímero y producir una mezcla de polímero en partículas solidificada; y sumergir la mezcla de polímero en partículas solidificada en un solvente en partículas durante un tiempo suficiente para disolver las partículas.

En otro aspecto de la invención se provee un método para hacer crecer tejido, con distribución penetrante, en un soporte polimérico macroporoso tridimensional con una morfología trabecular hasta una profundidad de por lo menos 2.5 veces el tamaño de macroporo promedio en el soporte, que comprende los pasos: sembrar células de tejido sobre el soporte polimérico, dicho soporte polimérico macroporoso tiene una porosidad de por lo menos 50%, dicho soporte polimérico macroporoso incluye macroporos que tienen un diámetro promedio en la escala de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3.5 mm, los macroporos tienen paredes de poro definidas por puntales de polímero, e incluyen pasajes macroporosos que interconectan dichos macroporos, y pasajes microporosos que interconectan dichos macroporos; y cultivar dichas células. La presente invención provee también un procedimiento para hacer crecer tejido, con distribución penetrante, en un soporte polimérico macroporoso tridimensional con una morfología trabecular hasta una profundidad de por lo menos 2.5 veces el tamaño de macroporo promedio del soporte, que comprende los pasos: sintetizar un soporte polimérico macroporoso con una morfología trabecular que tiene una porosidad de por lo menos 50%, dicho soporte polimérico macroporoso incluye macroporos que tienen un diámetro promedio en la escala de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3.5 mm, los macroporos tienen paredes de poro definidas por puntales poliméricos, e incluyen pasajes macroporosos y pasajes microporosos que interconectan dichos macroporos; sembrar células de tejido sobre el soporte polimérico; y cultivar dichas células de tejido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las modalidades de la presente invención se describen en mayor detalle con referencia a los dibujos anexos y a las micrografías digitalizadas por computadora, en los cuales: la figura 1 es una representación diagramática de una porción de un sistema de poro de polímero que ¡lustra diferentes componentes como los definidos más adelante en la presente; la figura 2 es una micrografía de luz de las trabéculas de hueso en el cuello de los fémures, que muestra las áreas isotrópicas y anisotrópicas (micrografía de luz modificada de Tobin WJ, en J. Bone Jt Surg 37A(1 ) 57-72, 1995); la figura 3A es una micrografía de luz de un polímero de acuerdo con la presente invención (ancho de campo = 1.8 cm); la figura 3B es una micrografía de luz de una sección de 20 µm del soporte polimérico de la figura 3A (ancho de campo = 3.5 cm); la figura 3C es una micrografía electrónica de barrido de las paredes de poro del soporte polimérico de la figura 3A; la figura 4A es una gráfica que ¡lustra la curva de tensión/resistencia de los soportes poliméricos cuando se someten a una prueba compresiva a una velocidad de 1% de deformación por segundo; la figura 4B es una gráfica que ¡lustra el efecto de la concentración de polímero en las propiedades mecánicas de soportes poliméricos. El Módulo de Young de la primera región elástica se indica como Yi y el Módulo Young de la segunda región elástica se indica como Y2; la figura 5 es una micrografía electrónica de barrido de la estructura de la pared de poro de un soporte preparado con una concentración de 0.05 g/ml de PLGA 75:25 en DMSO; la figura 6 es una micrografía electrónica de barrido de la estructura de la pared de poro de un soporte preparado con una concentración de 0.02 g/ml de PLGA 75:25 en DMSO; la figura 7A es una micrografía electrónica de barrido de soportes de PLGA 75/25 obtenidos usando partículas de menos de 0.35 mm; la figura 7B es una micrografía electrónica de barrido de soportes de PLGA 75/25 obtenidos usando partículas que varían de 0.54 a 0.8 mm; la figura 7C es una micrografía electrónica de barrido de soportes de PLGA 75/25 obtenidos usando partículas que varían de 0.8 a 2.0 mm; la figura 8 es una micrografía electrónica de barrido de una membrana de PLGA 75/25 preparada en ausencia de partículas; la figura 9A es una micrografía electrónica de barrido de una espuma de PLGA 75/25 obtenida a Tmix = 11°C, y Tno solvente = 0°C; la figura 9B es una micrografía electrónica de barrido de una espuma de PLGA 75/25 obtenida a Tmix = -20°C, y Tno solvente = 0°C; la figura 9C es una micrografía electrónica de barrido de una espuma de PLGA 75/25 obtenida a Tmix = -20°C, y Tno solvente = 40°C; la figura 10 es una micrografía electrónica de barrido del recubrimiento con CaP de un soporte de PLGA 75/25; la figura 11 es una micrografía confocal de un soporte Dex+ cultivado durante 42 días (ancho de campo = 1.8 mm); la figura 12 es una micrografía de luz iluminada con luz UV de un soporte Dex+ teñido con tetraciclina (ancho de campo = 2.0 cm); la figura 13 es una micrografía de luz de un soporte marcado inmunológicamente con osteocalcina (ancho de campo = 1.1 cm); la figura 14 es una micrografía de luz de una sección de soporte cultivada con Dex+ y teñida con hematoxilina y eosina (ancho de campo = 0.8 cm); la figura 15 es una micrografía de luz de una sección de soporte cultivada con Dex+ y teñida con hematoxilina y eosina (ancho de campo = 0.6 cm); la figura 16A es una micrografía electrónica de barrido de un soporte membranoso de PLGA 75/25 de la técnica anterior creado con partículas de menos de 0.35 mm; la figura 16B es una micrografía electrónica de barrido de un soporte membranoso de PLGA 75/25 de la técnica anterior creado con partículas que varían en tamaño de 0.54 y 0.8 mm. la figura 16C es una micrografia electrónica de barrido de un soporte membranoso de PLGA 75/25 de la técnica anterior creado con partículas que varían en tamaño de 0.8 a 2.0 mm; la figura 16D es una micrografia electrónica de barrido de un soporte intermedio de PLGA 75/25 creado con partículas de menos de 0.35 mm; la figura 16E es una micrografia electrónica de barrido de un soporte intermedio de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0.54 a 0.8 mm; la figura 16F es una micrografia electrónica de barrido de un soporte intermedio de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0.8 a 2.0 mm; la figura 16G es una micrografia electrónica de barrido de un soporte tipo hueso de PLGA 75/25 creado con partículas de menos de 0.35 mm; la figura 16H es una micrografia electrónica de barrido de un soporte tipo hueso de PLGA 75/25 con partículas que varían en tamaño de 0.54 a 0.8 mm; y la figura 161 es una micrografia electrónica de barrido de un soporte tipo hueso de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0.8 a 2.0 mm.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La figura 1 es una representación diagramática de una porción de un soporte polimérico que muestra dos macroporos ¡nterconectados entre sí por una interconexión macroporosa. Los dos macroporos también están conectados a los macroporos circundantes por pasajes microporosos (también conocidos como microporos). Estos y otros términos usados en la descripción del soporte polimérico producido de acuerdo con la presente invención se definen a continuación. Soporte: dispositivo diseñado como un vehículo de células para ingeniería de tejidos o aplicaciones relacionadas. Este dispositivo tiene preferiblemente una morfología porosa que será colonizada por células. En este caso específico, el soporte tiene una morfología de poro abierto. Macroporos: huecos dentro del soporte polímérico delineados por paredes poliméricas. Los macroporos tienen típicamente un diámetro de entre 0.5 y 3.5 mm. Paredes de poro: puntales poliméricos que delinean macroporos. Cuando los puntales de polímero forman paquetes anisotrópicos, en los cuales las interconexiones microporosas separan los puntales unos de otros en el mismo paquete, la estructura de la pared del poro se define como "laminar". Cuando los puntales son isotrópicos, no forman paquetes y están ampliamente separados unos de otros principalmente por interconexiones macroporosas, la pared de poro se define como "tipo puntal". Ambas estructuras de pared de poro tipo puntal y laminares exhiben nanoporos cuando son cortadas. Interconexiones microporosas (también llamadas microporos o pasajes microporosos): huecos encontrados en paredes de poro laminares. Cada puntal o laminilla de polímero es separada una de otra por estructuras de poro paralelas y alargadas llamadas microporos. El tamaño de estos poros es de menos de 200 µm. Los microporos contribuyen a la interconectividad general de los soportes. Interconexiones macroporosas: pasajes entre disposiciones laminares de paredes de poro, o entre puntales poliméricos. Contribuyen principalmente a la interconectividad de los macroporos, y varían en tamaño entre 200µm y 2 mm. Naoporos: huecos encontrados en el cuerpo general del polímero. Los cortes transversales del material polimérico general, ya sea de puntales de pared de poro o de estructuras laminares de pared de poro, exhiben concavidades redondas que podrían o no perforar al material de polímero completo. Esos nanoporos pueden originarse a partir de un no solvente atrapado dentro del cuerpo general del polímero, o a partir de la degradación autocatalítica de la masa del polímero. Los nanoporos se distribuyen en las paredes del soporte. Sólo contribuyen a la intercontividad general de los macroporos cuando pasan a través del material general completo. Interconexiones: los pasajes de flujo que conectan los macroporos unos con otros. Las interconexiones comprenden las interconexiones macroporosas (pasajes), las interconexiones microporosas (pasajes) y los nanoporos que perforan el material general completo definido arriba. La presente invención provee un soporte polimérico macroposoro que comprende macroporos e interconexiones. Los macroporos tienen un diámetro en la escala de 0.5-3.5 mm, e interconexiones como las observadas en el hueso trabecular. La morfología de los soportes poliméricos (también llamados estructuras de espuma) descritos en la presente se basa en la del hueso trabecular. El hueso trabecular ha mostrado ser metabólicamente el sitio más activo en el hueso (como se describe por Rodan GA, en Bone 13, S3-S6 1992). La geometría de poro abierto específica del hueso trabecular afecta de manera favorable la formación y resorción de hueso, y es por la tanto de interés considerable en el contexto de ingeniería de tejidos de hueso: de hecho, el diseño de un soporte ideal para ingeniería de tejidos de hueso también debe permitir una rápida formación y resorción de hueso. La morfología de las trabéculas de hueso ha servido por lo tanto como un modelo para crear las nuevas estructuras de soporte polimérico descritas en la presente. La arquitectura de las trabéculas del hueso depende del sitio anatómico en el que se encuentre el hueso y, en un menor grado, en la edad del paciente. Martin RB (en CRC Critical Reviews in Biomedical Engineering, 10(3), 179-222, 1984) describen las trabéculas de hueso como "un complejo sistema de paredes y puntales interrumpidos". Los huecos encontrados entre las trabéculas se llaman "espacios de médula". Las direcciones de las trabéculas son irregulares; sin embargo, una organización global de la geometría trabecular es algunas veces visible y sigue las fuerzas que actúan sobre el hueso. Las áreas en donde las trabéculas siguen cierta dirección son áreas anisotrópicas, mientras que las áreas en donde las trabéculas están dispuestas aleatoriamente son isotrópicas {cf. Figura 2). Whitehouse y Dyson {supra) así como Martin {supra) describieron la porosidad de las trabéculas en los fémures en mayor detalle. El cuadro 1.1 indica diferentes porosidades y ancho trabecular determinadas por Whitehouse y Dyson para todas las áreas de los fémures.

CUADRO 1.1 Porosidad del hueso trabecular femoral y ancho de las trabéculas La estructura del hueso trabecular se ha investigado para el ancho, porosidad, anisotropia y patrones generales de las trabéculas tales como conectividad y volumen de estrella. Las micrografías de luz y electrónicas de barrido publicadas sobre los huesos trabeculares indican que los espacios de médula delineados por trabéculas (es decir, poros) varían de uno a varios milímetros en tamaño y están interconectados con agujeros que varían de aproximadamente 0.3 a un milímetro. Cuando el uso de las trabéculas producidas del polímero que forma la presente invención es para aplicaciones fisiológicas, el soporte polimérico se prepara preferiblemente a partir de cualquier polímero biocompatible. El término "biocompatible", según se usa en la presente, intenta abarcar polímeros que no son tóxicos para las células y que permiten que las células formen colonias sobre los mismos. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen poli(láctido), poli(láctido-co-glicólido) (PLGA) de relaciones variables, poliestíreno, poli(glicólido), poli(acrilato)s, poli(metilmetacrilato), poli(hidroxietilmetacrilato), alcohol poli(vínílíco), poli(carbonato), polí(etileno-co-acetato de vinilo), poli(anhídrido), poli(etileno), poli(propileno), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxivalerato), poli(uretano)s, poli(éter uretano), poli(éster uretano), poli(arilato), poli(imida), poli(anhidrido-co-imida), poli(aminoácidos) y poli(fosfaceno). Los poliésteres alifáticos biodegradables tales como ácido poliláctico y polímeros derivados del mismo, representan una clase particularmente útil de polímeros en aplicaciones de los presentes soportes, los cuales se relacionan con el transplante de células debido al hecho de que ya han sido aprobados para su uso clínico en humanos. A este respecto, un polímero que se prefiere usar como soporte es PLGA, particularmente las mezclas que comprenden más de 50% de poli(DL-láctido) tales como PLGA 85:15 y PLGA 75:25. Las aplicaciones adecuadas para los presentes soportes variarán con la composición y estructura del polímero. Por ejemplo, los soportes de polímeros biodegradables son adecuados para usarse ya sea en aplicaciones in vitro y/o en transplantes de células in vivo. Las matrices pueden servir entonces como soportes para permitir que ocurra el crecimiento de células in vitro antes del implante in vivo. Los soportes también pueden usarse directamente in vivo, sin ser pre-sembrados con células. En ambas aplicaciones (con o sin siembra de células), la matrices de polímero biodegradables de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para el crecimiento de tejido tridimensional y pueden usarse en el crecimiento de tejidos conectivos, tales como hueso, cartílago, tejido parodental, así como tejidos dentales y otros órganos, tales como tejidos del hígado o senos. Una característica significativa del presente soporte polimérico es la presencia de macroporos, por lo menos 50% de los cuales tienen un diámetro en la escala de 0.5 a 3.5 mm, una escala representativa de aquélla encontrada en el hueso trabecular humano. De preferencia, los macroporos tiene un diámetro de por lo menos 1.0 mm, y muy preferiblemente los macroporos tienen un diámetro de entre aproximadamente 1.0 mm y 3.5 mm. Además de su estructura macroporosa, el soporte se caracteriza también por un alto nivel de interconectividad que incrementa tanto la penetración de las células en el soporte como el flujo de nutrientes a las células. Las interconexiones macroporosas de por lo menos 0.35 mm proveen un ambiente de "celda abierta" en el soporte polimérico, el cual es importante para propiciar el crecimiento de tejidos a lo largo del soporte, es decir, crecimiento de tejido tridimensional. Los macroporos son delineados por paredes de polímero porosas que pueden o no exhibir una estructura laminar. El grosor total de las paredes de poro no es mayor de aproximadamente 0.4 mm, y de preferencia no más de aproximadamente 0.3 mm. El grado de interconectividad en las paredes de poro depende, entre otros factores, de las temperaturas de procesamiento.

Un resultado sorprendente e inesperado es que cada macroporo está en comunicación de flujos con un número significativo de macroporos adyacentes por medio de interconexiones tanto macro- como microporosas. Los soportes con diferentes estructuras de pared de poro obtenidas a diferentes temperaturas de procesamiento usando este procedimiento de lixiviación de partículas e inversión de fases novedoso se describen en el presente documento. La porosidad del soporte polimérico está por lo menos a un nivel de 50% para todos los soportes obtenidos, calculado usando un programa de análisis de imagen Northern Eclipse, y preferiblemente a un nivel de más de 50%. El nivel de porosidad del presente soporte polimérico contribuye también a la naturaleza de "celda abierta" del mismo, dando como resultado un traslape significativo entre macroporos (originando los pasajes macroporosos) que define la naturaleza altamente interconectada del presente soporte e incrementa más su utilidad como un soporte para el crecimiento de células. A este respecto, el nivel de porosidad es preferiblemente mayor de aproximadamente 75%, aunque el nivel de porosidad que más se prefiere es mayor a aproximadamente 85%. Las características del presente soporte lo hacen particularmente adecuado para usarse en ingeniería de tejidos y más notablemente, transplante de células, gracias a que provee un soporte biocompatible que puede ser colonizado por células de una manera tridimensional por medio de la red macroporosa inteconectada del soporte. Esto es significativo cuando se considera el transplante de cualquier célula que produzca tejidos, especialmente aquellas que requieren neoangiogénesis tales como el tejido de hueso. Además, cuando se usa para el transplante de células, el soporte es biodegradable, cuya degradación puede controlarse de manera tal que el crecimiento de células pueda ser simultáneo con la degradación del soporte. Se entenderá por los expertos en la técnica que el presente soporte polimérico puede modificarse para incrementar más sus propiedades para usarse como un soporte para el crecimiento celular. Las modificaciones que afecten típicamente las estructuras usadas como soporte para crecimiento celular también serían adecuadas para modificar el presente soporte polimérico. Dichas modificaciones funcionan para incrementar la respuesta biológica e incluyen, por ejemplo, modificaciones de superficie con colágeno, fosfato de calcio, proteoglucanos, proteínas, péptidos, carbohidratos y polisácaridos, o mediante tratamiento con ácido/base. Además, el soporte polimérico puede servir como un receptáculo para el suministro de moléculas activas, tales como proteínas, factores de crecimiento, etc. que mejoren la función celular. El presente soporte polimérico puede hacerse usando un procedimiento novedoso que combine metodología de lixiviación de partículas con metodología de inversión de fases. En un paso inicial, el soporte polimérico seleccionado se prepara como un polímero líquido. Según se usa en la presente, el término polímero en un medio líquido ¡ncluye un polímero liquidificado formado fundiendo un polímero a la forma líquida calentándolo hasta su punto de fusión, ya sea solo o mezclado con otro líquido, o puede ser una solución polimérica formada mezclando el polímero en un solvente para formar una solución de polímero. Cualquier solvente generalmente útil para preparar una solución de polímero puede usarse para este propósito, incluyendo sulfóxido de dimetilo (DMSO), cloruro de metileno, acetato de etilo, cloroformo, acetona, benceno, 2-butanona, tetracloruro de carbono, cloroformo, n-heptano, n-hexano y n-pentano. Como apreciará un experto en la técnica, solventes no citotóxicos tales como DMSO se usan preferiblemente para preparar la solución para no afectar adversamente el crecimiento celular. La concentración del polímero en la solución polimérica variará con las características del polímero usado para hacer el soporte. El polímero líquido se mezcla después con partículas de un tamaño adecuado en relación con la fase de lixiviación de partículas del procedimiento. Son adecuadas las partículas que tienen un diámetro que corresponde al diámetro deseado de los macroporos en el soporte polímérico, específicamente partículas que tienen un diámetro en la escala de 0.5-3.5 mm. Muy preferiblemente, las partículas tienen un diámetro de más de 1.0 mm y más preferiblemente las partículas tienen un diámetro de entre 1.0 y 2.0 mm. Ejemplos de partículas adecuadas para mezclarse con el polímero incluyen polisacáridos (tales como glucosa), sales orgánicas e inorgánicas, proteínas y lípídos de un tamaño adecuado que puedan disolverse en un solvente que no sea un solvente para el polímero (es decir, un no solvente de polímero). La cantidad de partículas mezcladas con la solución de polímero variará de nuevo con las características de polímero usado para hacer el presente soporte. Una vez que las partículas se han mezclado cuidadosamente con el polímero líquido para formar una mezcla de polímero en partículas, el polímero es sometido a un paso de inversión de fases en el cual se convierte de un líquido a un sólido. Este paso se logra sumergiendo la mezcla de polímero en partículas en un no solvente de polímero, un solvente en el cual el polímero no sea soluble. Dicho no solvente de polímero ¡ncluye, por ejemplo, agua, alcohol, 1 ,4-dioxano y anilina. Para obtener un soporte polimérico sólido de una forma particular, la mezcla de polímero puede colocarse en un molde durante el paso de inversión de fases. De preferencia, el polímero líquido puede estabilizarse alrededor de las partículas, por ejemplo, congelando la suspensión de polímero-partículas. Por lo tanto, no se usa molde alguno y el procedimiento de inversión de fases ocurre simultáneamente desde todas las superficies exteriores. Cuando el solvente de polímero es DMSO, por ejemplo, la mezcla de polímeros se enfría a una temperatura menor que o igual a 12°C, que es la temperatura de congelación del DMSO. También pueden usarse temperaturas más frías, tales como temperaturas de menos de 0°C. Una consecuencia del uso de bajas temperaturas (por ejemplo, -20°C a -80°C) durante esta etapa del procedimiento es la formación subsecuente de un soporte polimérico con una morfología diferente (véase ejemplo 4), como la de una estructura de piel más gruesa, la cual puede removerse antes de usarse como un soporte para el crecimiento tridimensional de células, como se describe en el ejemplo 1. Además del enfriamiento, se pueden usar otros métodos para estabilizar la mezcla de polímero-partículas, por ejemplo, gelificación (incremento de la viscosidad). Después de la conversión de la mezcla de polímero de la fase líquida a la sólida, el polímero es sometido a la lixiviación de partículas. En este paso del procedimiento, el polímero es sumergido en un solvente en partículas, es decir como un solvente que funciona para disolver las partículas dispersas a lo largo del polímero pero que no disuelve al propio polímero. Los solventes de partículas adecuados dependerán, por supuesto, de la naturaleza de las partículas y del polímero. Ejemplos de solventes de partículas adecuados incluyen agua, alcohol, 1-4,dioxano y anilina. La temperatura del solvente de partículas puede variarse con efecto mínimo en el soporte polimérico resultante. Sin embargo, la temperatura estará generalmente entre el punto de congelación del solvente en partículas y la temperatura de transición de vidrio del polímero, de manera tal que el soporte polimérico no se funda o se vuelva viscoso bajo el efecto de la temperatura de no solvente. En un ejemplo, se aplica una temperatura de solvente de partículas de entre aproximadamente 0°C y 45°C cuando el solvente de partículas es agua y el polímero es PLGA 75:25. El polímero se sumerge en el solvente de partículas durante una cantidad de tiempo adecuada para permitir la disolución completa de las partículas dispersas a lo largo del soporte polimérico. Generalmente, se requiere un periodo de por lo menos 24 horas para obtener una disolución de partículas completa en el soporte polímérico, aunque se prefiere un periodo de por lo menos 48 horas. Para acelerar la disolución eficiente de las partículas, es deseable sumergir el polímero en solvente fresco a intervalos frecuentes durante el periodo de disolución, por ejemplo a intervalos de aproximadamente 8-9 horas o mediante el uso de un baño de solvente circulante. Los procedimientos de inversión de fases y de lixiviación de partículas pueden ocurrir en un paso con un solvente que sea simultáneamente un no solvente de polímero y un solvente de partículas. En un ejemplo, su usó agua doblemente destilada (ddH20). El soporte polimérico se remueve del solvente de partículas después de un periodo de disolución de partículas adecuado y puede secarse al vacío antes de usarse o desinfectarse en alcohol (tal como etanol al 70%), enjuagarse y acondicionarse en medio de cultivo para su uso subsecuente. Si el soporte polimérico no se requiere para uso inmediato, se almacena deseablemente seco en un desecante para evitar la retención de humedad y la posible degradación del polímero. El presente procedimiento produce ventajosamente un soporte polimérico que tiene características únicas, y en particular, produce un soporte polimérico que tiene una red macroporosa interconectada. Otra ventaja significativa del presente procedimiento de dos etapas es que provee medios amplificados para controlar la morfología del soporte polímérico resultante. En otras palabras, el procedimiento provee dos niveles, lixiviación de partículas e inversión de fases, con los cuales llevar a cabo la morfología del soporte polimérico. Por ejemplo, el tamaño y distribución de los macroporos puede alterase durante ambas etapas -lixiviación de partículas y de inversión de fases- del procedimiento y son regidos por una distribución y tamaño de partículas y, en un menor grado, por las temperaturas de procesamiento del soporte. Además, la formación de interconexiones y tamaño puede ser influenciada variando la velocidad de la inversión de fases. La velocidad de inversión de fases puede alterarse alterando un número de variables que incluyen temperatura, tipo de no solvente de polímero y concentración de polímero. De esta manera puede controlarse la morfología final del soporte. De preferencia, la morfología resultante simula la de un hueso trabecular humano. En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para cultivar células para el crecimiento tridimensional utilizando el soporte polimérico descrito en la presente. La estructura macroporosa ¡nteconectada novedosa del presente soporte polimérico es especialmente adecuada para ingeniería de tejidos, y notablemente ingeniería de tejidos de hueso, una alternativa intrigante para las terapias de reparación de hueso disponibles actualmente. A este respecto, la siembra de células derivadas de la médula ósea en el soporte polimérico se lleva a cabo usando métodos convencionales, los cuales se conocen bien por los expertos en la técnica (como los descritos en Maniatopoulos et al, en Cell Tissue Res 254, 317-330, 1988). Las células son sembradas sobre el soporte polimérico y cultivadas bajo condiciones de crecimiento adecuadas. Los cultivos se alimentan con medios adecuados para establecer el crecimiento de los mismos. Como se mencionó anteriormente, células de varios tipos pueden crecer a lo largo del presente soporte polimérico. No obstante, el soporte polimérico de la presente invención es particularmente conveniente para el crecimiento de células osteogénicas, especialmente células que elaboran matriz ósea. Para la ingeniería de tejidos, las células pueden tener cualquier tipo de origen. Preferiblemente, las células son de origen humano. El presente método para el crecimiento de células en un soporte polimérico tridimensional de conformidad con la invención permite a las células osteogénicas sembradas, por ejemplo, penetrar el soporte polimérico para elaborar matriz ósea, durante la etapa in vitro, con distribución penetrante en la estructura del soporte polimérico y particularmente a una profundidad de al menos 2.5 veces la profundidad del tamaño promedio del macroporo. La penetración de las células osteogénicas y, como resultado, la elaboración de matriz ósea, puede ser incrementada utilizando medios mecánicos, ultrasónicos, de campo eléctrico o electrónicos. Las modalidades de la presente invención se describen en los ejemplos específicos siguientes, que no se interpretarán como que limitan el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Preparación de un soporte polimérico de PLGA 75:25 Se preparó un soporte polimérico de PLGA 75:25 de conformidad con la invención utilizando PLGA 75:25 (distribuido por Birmingham Polymer Inc.), con una viscosidad inherente de 0.87 dl/g. Se mezcló 1 ml de 0.1 g/ml de PLGA 75:25 en DMSO con 2 g de cristales de glucosa (tamaño de la partícula entre 0.8 mm y 2 mm) en un molde de aluminio. La mezcla de PLGA 75:25-DMSO se enfrió a -20°C. Esta temperatura de la mezcla de PLGA 75:25-DMSO se designa como Tmezcia-Posteriormente, los bloques de PLGA 75:25 congelados se sumergieron en una suspensión en agua con hielo de ddH20 a 0°C, que es un no solvente para el polímero. Esta temperatura del agua se designa como Tno solvente- Los bloques permanecieron en ddH20 durante 48 horas, período durante el cual se cambió el ddH20 aproximadamente cada 8 horas. Los soportes obtenidos se sacaron del agua, fueron secados al vacío durante 72 horas a 0.01 mm Hg y fueron almacenados a 4°C en un deshidratador bajo vacío hasta su utilización. Los soportes obtenidos utilizando las condiciones antes mencionadas fueron totalmente analizados. La estructura macroporosa de secciones de 2 mm de espesor de soporte polimérico fue observada a pequeña ampliación (16X) utilizando un microscopio de disección como se ¡lustra en la figura 3A. Se observó una distribución uniforme de macroporos interconectados y con una gama de tamaños de entre 0.8 y 1.5 mm en todo el soporte polimérico. Los macroporos tenían formas elípticas y paredes porosas espesas (con un espesor de alrededor de 300 µm) que contienen microporos. Posteriormente, el soporte polimérico fue incrustado en un medio de incrustación Tissue-Tek (Miles #4583). y seccionado en un criostato a -20°C. Una serie de secciones de 20 µm de espesor (50 secciones) se colocó en portaobjetos (VWR Canlab). Las secciones fueron fotografiadas en pequeña ampliación (16X) utilizando un microscopio de disección, y se escudriñaron. La figura 3B es una sección de soporte escudriñada que identifica los componentes porosos del soporte, los macroporos, las interconexiones entre macroporos (pasajes) y las interconexiones entre microporos (pasajes). Se observó una película delgada de polímero (esto es, una capa de membrana) en la superficie externa del soporte polimérico. Las imágenes fueron convertidas en archivos IFF y analizadas es una computadora PC utilizando software de análisis de imagen Northern Eclipse. Se seleccionó "medición única" en el menú de opciones para medir los tamaños de las paredes de los poros (área, perímetro, diámetro, etc.) para cada sección escudriñada. En la rutina de "medición de datos" se calculó el área y el número de puntales de pared del poro por cada portaobjetos escudriñado. Estas mediciones se convirtieron de unidas pixel a milímetros medíante un sistema de calibración, utilizando la ampliación antes mencionada de las imágenes escudriñadas para determinar la relación pixel/milímetros. Se determinó el tamaño de los macroporos dibujando manualmente una línea con una herramienta software sobre la imagen digitalízada de la sección del soporte polimérico de la pared de un poro a la pared del poro adyacente. Las características del soporte polimérico resultante determinadas mediante el uso del software de análisis de imagen Northern Eclipse son las siguientes: Tamaño del macroporo 1.79+/-0.42 mm Interconexiones entre macroporos 0.37+/-0.15 mm Espesor de la pared del poro 0.29+/-0.13 mm Microporos 0.10+/-0.05 mm Porosidad 86.7+/-2.43% La porosidad de las matrices poliméricas se determinó asimismo mediante porosimetría de mercurio (Quantachrome Autoscan 60). Se utilizó un penetrómetro sólido con un volumen de vastago de células de 5 cm3 para las muestras en una gama de 0.015 a 0.020 g. Los valores de volumen hueco fueron calculados a partir del volumen de intrusión del mercurio. Se calculó que la porosidad a partir del volumen de intrusión del mercurio fue de 89.6%. La porosidad estimada utilizando el software de análisis de imagen Northern Eclipse (~ 87%) es sustancialmente equivalente al ~ 90% determinado mediante porosimetría de mercurio, considerando que el método de porosímetría de mercurio no es exacto cuando se analizan soportes poliméricos con diámetros de poro superiores a ~ 75 µm.

Asimismo, se preparó el soporte polimérico para su análisis utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Se hizo una sección transversal del soporte a un espesor de aproximadamente 2 mm y se revistió mediante espurreado con oro bajo una atmósfera de argón (Polaron Instrument Inc., Doylestown, PA). Se tomaron micrografías a través de un microscopio electrónico de barrido Hitachi 2500 SEM a un voltaje de aceleración de 15 kV. Se confirmó mediante las micrografías SEM que los macroporos tenían un diámetro de entre 1 y 1.5 mm, aunque no siempre se observó una separación clara entre cada macroporo, lo que indica una estructura de interconexión muy abierta de estos soportes poliméricos. La naturaleza microporosa de las paredes de los poros, observada a través de un microscopio óptico, se confirmó por SEM, como se ¡lustra en la figura 3C. Se hizo una prueba de mecánica del soporte polimérico de la siguiente manera. Se preparó un soporte polimérico con forma cilindrica y con un diámetro y altura de 1.5 cm y se probó utilizando un instrumento de prueba mecánica de Instron. Los experimentos mecánicos se realizaron en una máquina de prueba servohidráulica uniaxial (marco de carga Instron modelo 1331 con controlador de la serie 2150). Se utilizó una celda de carga de 1 kg (Sensotec, modelo 31/4680) para todas las pruebas de compresión. Se midió la deflección del accionador mediante un transformador diferencial linealmente variable de CD (LVDT, Intertechnology, modelo SE 374). Durante la prueba, se mostraron las señales provenientes de la celda de carga y del LVDT en un osciloscopio de almacenamiento digital (Gould, modelo 1425). Las señales se introdujeron asimismo en un convertidor análogo a digital (A/D) de 12 bits y 16 canales en una computadora Apple lie acelerada. La velocidad de obtención de datos de estos experimentos fue de 430 pares de puntos de datos por segundo. La compresión del soporte polimérico ocurrió a una velocidad de 0.1 mm/s. Como se ilustró en la figura 4A, una gráfica de resistencia a la compresión contra el porcentaje de deformación del soporte polimérico mostró dos módulos. El modulo de Young para la primera región elástica (en lo sucesivo Y-i) fue de 0.76±0.12 MPa, y para la segunda región elástica (en lo sucesivo denominada Y2) fue de 0.18±0.016 MPa.

EJEMPLO 2 Efecto de la concentración de polímero sobre la estructura del soporte polimérico El efecto de la concentración de PLGA 75:25 en DMSO sobre la estructura del soporte polimérico resultante se determinó utilizando el protocolo descrito detalladamente en el ejemplo 1. Se utilizaron tres concentraciones distintas de PLGA 75:25 en DMSO (0.05 g/ml, 0.1 g/ml y 0.2 g/ml) para hacer las matrices poliméricas, mientras que el resto de las condiciones se mantuvieron constantes de conformidad con las descritas en el ejemplo 1. Cada soporte polimérico preparado fue cortado a la mitad utilizando una navaja de rasurar. Se encontró una estructura membranosa en cada una sin importar la concentración inicial de PLGA 75:25 en DMSO. Se determinaron las propiedades mecánicas de 3 soportes poliméricos distintos y se ilustraron en la figura 4B. Se observó una disminución importante del modulo de Young en el soporte polimérico preparado utilizando PLGA 75:25 en DMSO de 0.05 mg/ml, mientras que el soporte más rígido se obtuvo con una concentración de PLGA 75:25 de 2 mg/ml. Estos soportes se observaron asimismo bajo microscopio óptico y SEM. No se detectaron diferencias en las estruturas de los tres soportes poliméricos bajo el microscopio óptico. Sin embargo, cuando se observaron bajo el SEM, los soportes creados con 0.05 g/ml de PLGA 75:25 en DMSO presentaron más estructura laminar de la pared con más interconexiones entre microporos (ver figura 5), que las creadas con 0.2 g/ml de PLGA en DMSO, donde se observaron menos interconexiones entre microporos (ver figura 6).

EJEMPLO 3 Efecto de las partículas sobre la estructura del soporte polimérico El efecto sobre la estructura del soporte polimérico de variar la cantidad y el tamaño de las partículas de glucosa mezcladas con el polímero PLGA se determinó de la siguiente forma. Se mezclaron cantidades de partículas de glucosa (0.5 g, 1 g y 2 g) por separado con una solución de polímero de 1 ml, conservando constantes todas las demás condiciones descritas en el ejemplo 1. Se valoró el efecto del tamaño de las partículas sobre la morfología final del soporte utilizando las partículas tamizadas siguientes: (tamices de prueba estándar, VWR, West Chester, PA): 1 ). cristales de NaCI (< a 0.35 mm), 2) cristales de sacarosa (0.54 mm < a tamaño del cristal < a 0.8 mm) y 3) cristales de glucosa (0.8 mm < a tamaño del cristal < a 2 mm). Los soportes poliméricos resultantes se observaron mediante un microscopio óptico. Al mezclar la solución polimérica con las partículas, se observó que para las cantidades pequeñas de partículas (esto es 0.5 g/ml), la solución polimérica no estuvo totalmente sumergida en el lecho de partículas. Esta capa de solución polimérica se obtuvo tras la inversión de fases en una estructura membranosa similar a la que se puede observar cuando no se utilizan partículas. Las densidades mayores de partículas en la solución ( esto es, 2.0 g/ml) infiltraron la solución polimérica por completo, de manera que el soporte resultante contenía una distribución de macroporos sin esta estructura membranosa. El tamaño de los macroporos fue directamente proporcional al tamaño de las partículas utilizadas, por ejemplo, el tamaño de los macroporos fue de ~ 0.33 mm cuando se utilizaron partículas < a 0.35 mm (comparar con figura 7A), y de ~ 0.75 mm cuando se utilizaron partículas de entre 0.54 y 0.8 mm ( comparar con figura 7B). Finalmente, para las partículas de más de 0.5 mm se observaron mícroporos de ~ 1.4 mm (comparar con figura 7C). Cuando no se mezclaron partículas en la solución de polímero-DMSO, la estructura polímérica resultante fue un cilindro hueco compuesto de una membrana espesa que contenía microporos, como se ilustra en la figura 8. Esta membrana era muy parecida a la estructura membranosa resultante de un proceso de inversión de fases normal.

EJEMPLO 4 Efecto de las temperaturas de procesamiento sobre la estructura del soporte polimérico Se estudiaron los efectos de tres Tmezcia distintas ( 11 °C, -20°C y -80°C) a una Tno solvente constante ( 0°C). Se obtuvieron dos estructuras de soporte distintas principales: 1 ) Tmezcia = 11 °C y 2)Tmezcia = -20°C y Tmezcia = -80°C. Los soportes obtenidos con una Tmezc?a = 11 °C y Tno solvente = 0°C no tenían membrana y mostraban una estructura muy abierta. Como se ¡lustra en la figura 9A, los tamaños de los macroporos parecían haberse expandido y se determinó mediante SEM que alcanzaron ~ 2.72 mm. Las paredes de los poros tenían menos microporos pero más interconexiones entre macroporos, dando una estructura en general más abierta a los soportes. Los soportes obtenidos de una Tmezcia = a -20°C y -80°C tuvieron una estructura membranosa. En el caso de la Tmezcia = 20°C los macroporos parecían más pequeños que en los soportes obtenidos por TmeZcia más elevadas y su tamaño determinado mediante SEM fue de ~ 1.8 mm. Las paredes de los poros fueron laminares, con menos interconexiones entre los macroporos pero más interconexiones entre los microporos (comparar con figura 9B). Se observó que el tamaño de los macroporos disminuyó con una Tmezcia inferior. Las diferencias en los tamaños de los macroporos fueron particularmente importantes entre los soportes creados a una T mezcia = a11 °C y una T mezcia = a -20°C, mientras que se observaron diferencias mínimas en el tamaño de los microporos entre los soportes creados a una Tmezcia = a -20°C y una Tmezcia = a 80°C. Al disminuir los tamaños de los macroporos con la Tmezcia, también cambió la estructura de la pared de los poros, como se describió anteriormente. Las diferencias en la Tmezcia pudieron haber afectado la tasa de precipitación del polímero y por tanto la complejidad de la estructura de la pared de los poros. Se estudiaron asimismo Tno solvente distintas (40°C, 20°C y 0°C), con una Tmezcia constante de -20°C. En este caso, la diferencia principal entre los soportes fue el espesor de las paredes de sus poros. Las Tno solvente menores causaron paredes de los poros más espesas y complejas, mientras que las Tno solvente mayores crearon paredes de los poros delgadas y compactas, comparables a los puntales poliméricos que demarcan cada macroporo. Las figuras 9B y 9C ilustran las distintas morfologías de las estructuras de los soportes a una Tno solvente = a 0°C y 40°C, respectivamente. La mayoría de las diferencias estructurales se observó entre los soportes creados a una Tno solvente = a 0°C y una Tno solvente =a 20°C se notaron menos diferencias en los soportes obtenidos a una Tno solvente = a 20°C o 40°C. Mientras una Tno solvente menor (0°C) produjo paredes porosas laminares ( comparar con figura 9B), una Tn0 solvente mayor (40°C) produjo morfologías de las paredes de los poros similares a puntales (comparar con figura 9C).

El espesor de las paredes de los poros de los soportes creados a Tno solvente distintas se estimó mediante SEM. A una Tno solvente = a 0°C, las paredes de los poros se estimaron en 0.29 mm, mientras que a una Tno solvente = a 20°C, el tamaño de las paredes de los poros fue de ~ 0.10 mm. No se encontraron diferencias importantes entre las Tno solvente = a 20°C y 40°C. Todos los soportes creados con las distintas temperaturas antes mencionadas fueron seccionados, y se midieron los tamaños de los poros y el espesor de las paredes de los poros. Asimismo, se estimó la porosidad mediante un software de análisis de imagen Northern Eclipse. Se obtuvieron los siguientes resultados: EJEMPLO 5 Modificación de la superficie del soporte polimérico Los soportes obtenidos de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1 se sometieron a una modificación adicional de su superficie mediante un tratamiento con ácido/base; deposición de colágeno y deposición de fosfato de calcio. Los procedimientos y resultados fueron los siguientes: El tratamiento con ácido/base se desarrolló para incrementar la carga de superficie y cambiar la topografía de superficie. Se mantuvieron los soportes en distintas concentraciones de ácido acético (0.1 M, 1 M, 5M) durante 24 horas. Asimismo, los soportes se mantuvieron en distintas concentraciones de NaOH durante 24 horas para observar la hidrólisis de cadena de polímero de superficie. Bajo SEM, los soportes tratados con ácido acético a 5M ó con NaOH a 0.1 M durante 24 horas, mostraron cambios en la topografía de superficie, con aparición de nanoporos. Se diseñó un experimento de deposición de colágeno para incrementar la adhesión celular sobre las superficies poliméricas. Los soportes se mantuvieron en 0.1% de colágeno durante 1 hora, 5 horas, 8 horas, y 24 horas. Se probó un experimento de deposición de fosfato de calcio para incrementar la adhesión de las células sobre las superficies de los soportes.

Estos se mantuvieron durante una semana en un medio plenamente complementado (de conformidad con el ejemplo 6) a 37°C. Los cristales de fosfato de calcio sobre la superficie de los soportes se visualizaron mediante tinción de Von Kossa. Se llevaron a cabo experimentos adicionales de deposición de CaP, en los que los soportes se sumergieron en 1.5 mm de Na2HP0 durante dos horas a temperatura ambiente y posteriormente se equilibraron en una solución saturada de Ca2+ durante una noche. Posteriormente se analizaron los soportes a través de un SEM y se observaron cristales con formas de hojuelas sobre la estructura de estos soportes (comparar con figura 10).

EJEMPLO 6 Cultivo de células derivadas de medula ósea sobre los soportes poliméricos Se prepararon soportes poliméricos de PLGA 75:25 de conformidad con lo antes descrito: se dispersaron cristales de glucosa de 2 g/ml en una solución de 0.1 g/ml de PLGA 75:25 en sulfóxido de dimetilo (DMSO, BDH, Toronto, ON). La suspensión polimérica se enfrió a 11 °C. Posteriormente, el polímero se precipitó y se extrajeron los cristales de glucosa del polímero precipitado en ddH20 a 40°C. Se secaron los soportes a una masa constante (10 µm Hg, 72 horas) se desinfectaron en 70% de EtOH durante media hora, se lavaron tres veces con a-MEM y se equilibraron en -MEM estéril a 37°C durante 6 días.

Se sembraron células derivadas de médula ósea primarías de primer paso en soportes de 0.25 cm3, utilizando protocolos y medios descritos con detalle en otros documentos (conforme a lo descrito por Maniatopoulos et al., supra, y Davies ef al., en Cells and Materials, 1 :3-15,1991). En resumen, se tomaron células derivadas de la médula ósea de los dos fémures de adultos jóvenes machos de ratas Wistar (aproximadamente 150 g) en un medio plenamente complementado (FSM): a-MEM complementado con 15% de suero de bovino fetal, 50 mg/ml de ácido ascórbico, 10 mm de ß-glicerofosfato y antibióticos (0.1 mg/ml de penicilina G, 0.05 mg/ml de gentamicina y 0.3 mg/ml de fungizona); se añadió 10"8 de M Dexametasona (Dex) al FSM de los cultivos Dex+ únicamente. Las células se mantuvieron durante 6 días en un cultivo, y se realimentaron con FSM en el segundo y quinto día. El sexto día, las células Dex fueron tripsinizadas con 0.01 % de tripsina en PBS, mientras que los cultivos Dex+, que tenían signos visibles de calcificación, se tripsinizaron con 0.01% de tripsina y 10 µm de ácido etílendiaminotetraacético (EDTA) en PBS. Posteriormente, las células Dex+ y Dex- se sembraron en soportes prehumedecidos distintos, a una concentración de 7.5x105 células/soporte. Los cultivos se mantuvieron durante 42 días a 37°C y 5% de C02, y se realimentaron cada 2 ó 3 días con FSM. Se añadió Dex al FSM de los cultivos de células Dex+ a una concentración de 10"8 M por cada realimentación. Se disolvió polvo de HCl de tetraciclina (Sigma, St. Louis, MO) en a-MEM para preparar una solución de base de 90 mg/ml. Se preparó un nuevo medio plenamente complementado con tetraciclina (TFSM) de a-MEM que contenía 15% de suero de bovino fetal, 50 mg/ml de ácido ascórbico, 10 mm de a-glicerofosfato y 9 mg/ml de tetraciclina. El TFSM se utilizó para la última realimentación el día 40. El día 42, se lavaron los cultivos con a-MEM (10 veces, cada una durante ~ 3 minutos), y se fijaron en fijador de Karnovsky (2.0% de paraformaldehído, 2.5% de glutaraldehído y 0.1M de regulador de pH de cacodilato de sodio, pH 7.2-7.4) durante la noche. Se guardaron algunos cultivos para ser observados bajo SEM y se deshidrataron en una serie de soluciones de alcohol graduadas (70%, 100%), y fueron secados por congelamiento a 0.01 mm Hg durante 2 días. El resto de los cultivos se conservó en el regulador de pH de cacodilato para observaciones histológicas o confocales. Las observaciones confocales se llevaron a cabo de la siguiente manera: se colocaron muestras en cámaras hechas a la medida en 0.1 M de regulador de pH de cacodilato (proporcionado por BDH). Las cámaras fueron selladas con un cubreobjetos de vidrio. Se detectaron señales fluorescentes mediante un seccionamiento óptico en un microscopio láser confocal Bio-Rad MRC-600, utilizando un filtro de BHS. El soporte sembrado con células Dex(+) mostró una marca fluorescente hasta una profundidad de aproximadamente 1 mm, como se puede observar en la figura 11. No se pudo observar fluorescencia más hacia el interior de los soportes debido a que la profundidad de campo del microscopio confocal era insuficiente. Por tanto, se seccionaron los soportes a un espesor de aproximadamente 2 mm y se analizaron mediante el microscopio confocal por ambos lados. Se observó fluorescencia en todo el soporte. La marca fluorescente se observó también utilizando secciones de soportes sembrados con células Dex(+) (ver figura 12). Se observaron secciones transversales de soportes poliméricos sembrados con células Dex(-) y Dex(+) bajo luz UV. Se detectó una señal fluorescente brillante únicamente en las secciones Dex(+) en todo el soporte. Específicamente, se visualizó la matriz ósea elaborada, según fue observada a través de la señal fluorescente, en toda la profundidad de un soporte polimérico de 0.5 cm que fue utilizado en el cultivo. El factor limitante en esta prueba fue la profundidad del soporte polimérico; de esta forma, al incrementar la profundidad del soporte polimérico, se incrementaría la profundidad en la que pudiera alcanzarse la penetración celular, y por tanto la formación de matriz ósea, en este soporte polimérico. Los soportes fueron asimismo ¡nmunomarcados para osteocalcina. Se determinó la expresión de osteocalcina tanto en los cultivos Dex+ como en los cultivos Dex- medíante métodos inmunhistoquímicos utilizando antisuero de osteocalcina anti-rata de cabra (Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, MA) a una dilución final de 1 :6000. La prueba se finalizó con un segundo mareaje de anticuerpos con IgG anti-cabra de burro conjugada con antisuero de peroxidasa de rábano picante, a una concentración de 1 :250. Se utilizó un equipo de sustrato de 3,3-diaminobenzidina (DAB) para peroxidasa (Vector laboratories, Burlingame, CA) complementado con cloruro de níquel para desarrollar la tinción. La figura 13 ilustra un soporte marcado con osteocalcina sembrado con células Dex+ y mantenido en cultivo durante 6 semanas. Se obtuvieron secciones histológicas de los soportes de la manera siguiente: se incrustaron muestras en Tissue Tek y se seccionaron en sentido vertical a 6 mm de espesor. Se observó el crecimiento celular en el interior de los soportes en las secciones histológicas. A pequeña ampliación, toda la sección del soporte podía ser visualizada mediante LM. Tanto en los cultivos Dex+ como en los Dex-, se encontró cobertura de células en toda la estructura del soporte. La tinción de hematoxilina y eosina fue visible en todos los macroporos, sobre las superficies externas, así como en medio de los soportes. Las figuras 14 y 15 ¡lustran una pequeña ampliación de espumas cultivadas de Dex+ y Dex-. La cantidad de matriz elaborada en los cultivos Dex- fue mucho más abundante que la producida en los cultivos Dex+, como se puede apreciar con una ampliación mayor. En los cultivos Dex+ se detectaron sólo unas cuantas capas de células revistiendo las paredes de los poros y produciendo matriz en yuxtaposición cercana a las paredes de los poros, mientras que en los cultivos Dex-, los volúmenes totales de los macroporos se encontraban rellenos de matriz.

EJEMPLO 7 Sembrado de células de médula ósea humana sobre el soporte polimérico Se prepararon matrices de PLGA 75:25 de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1. Estos soportes fueron desinfectados en 70% de etanol durante 30 minutos, antes de ser sembrados con células estromáticas de médula ósea humana de donadores jóvenes, utilizando los protocolos y los medios que contienen dexametasona (dex) descritos detalladamente por Parker et al., (J. of Bone Min. Res., 12(1 ), S300:F298, 1997).

EJEMPLO 8 Efectos del tamaño de los macroporos y de su interconectividad sobre la invasión celular Se crearon tres morfologías de soportes distintas: 1 ) soportes obtenidos por lixiviación de partículas únicamente, denominados soportes membranosos, que forman parte de la técnica anterior y que se ¡lustran en las figuras 16A, 16B y 16C, brevemente descritas a continuación; 2) soportes obtenidos por inversión de fases por lixiviación de partículas utilizando bajas temperaturas de procesamiento, de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1 , denominados soportes intermedios; y 3) soportes obtenidos por inversión de fases por lixiviación de partículas utilizando temperaturas de procesamiento más elevadas, de conformidad con lo descrito en el ejemplo 4, denominados soportes similares a los huesos. A partir de estas tres rutas básicas de procesamiento, se crearon las tres estructuras de soporte con diversos tamaños de macroporos, de manera que se obtuvo un total de 9 soportes distintos. Estas 9 estructuras se ilustran en las figuras 16A a 161. Los soportes membranosos se crearon utilizando una técnica de lixiviación de partículas únicamente (de conformidad con lo descrito por Mikos et al., en Biomaterials 14, 323-330, 1993), ver la técnica anterior, que se ilustra en las figuras 16A, 16B y 16C. En resumen, se vacío una solución en cloroformo de PGLA 75/25 (Birmingham Polymers) sobre partículas tamizadas, ya sea 1 ) NaCI (tamaño < a 0.35 mm); 2) cristales de sacarosa (tamaño entre 0.54 y 0.8 mm); ó 3) cristales de glucosa (tamaño entre 0.8 y 2 mm). Las estructuras poliméricas se dejaron a temperatura ambiente para permitir la evaporación del cloroformo, tras de lo cual se disolvieron las partículas en ddH20. Los soportes intermedios y los similares a los huesos se produjeron de conformidad con lo descrito en los ejemplos 1 a 4 al extraer las mismas partículas distintas antes descritas del polímero precipitado. Los soportes intermedios fueron creados a una temperatura de solución polimérica de -20°C y un no solvente a temperatura ambiente, mientras que los soportes similares a los huesos se produjeron a una temperatura de solución polimérica de 11 °C y un no solvente a temperatura ambiente. Los soportes obtenidos se desinfectaron en 70% de etanol durante 30 min. antes de ser sembrados con células. La colonización celular de los soportes se confirmó mediante un microscopio confocal, y la diferenciación celular en toda la estructura del soporte se confirmó utilizando la prueba de mareaje de osteocalcina descrita en el ejemplo 6. Se observaron los siguientes resultados: CUADRO 2 Tamaños de los soportes y configuraciones de la colonización celular La colonización celular de los soportes, como se indica en el cuadro 2, requiere de un tamaño mínimo de interconexión de 0.35 mm y un tamaño de los macroporos de 0.7 mm. En este ejemplo, los soportes membranosos con un tamaño de microporos de 1.1 mm no fueron colonizados por células, mientras que los soportes similares a los huesos con tamaños de macroporos de 0.7 mm fueron completamente colonizados por células. En conclusión, este ejemplo demuestra que los soportes obtenidos por la técnica de inversión de fases por lixiviación de partículas permitió la colonización celular en toda la morfología del soporte, mientras que los soportes de técnicas anteriores fueron colonizados por células únicamente dentro de las capas superficiales de sus poros. La descripción anterior de las modalidades preferidas de la invención es a manera ilustrativa mas no limitativa de los principios de esta invención. El alcance de la invención será definido mediante las modalidades incluidas en las reivindicaciones siguientes y en sus equivalentes.

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un soporte polimérico macroporoso con una morfología particular, que tiene una porosidad de al menos 50%, y este soporte polimérico macroporoso ¡ncluye macroporos con un diámetro promedio de entre 0.5 y 3.5 mm, y los macroporos tienen paredes de los poros definidas por puntales poliméricos; e incluyen pasajes de los macroporos que interconectan a los macroporos entre sí.

2.- El soporte polimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los pasajes de los macroporos tienen un tamaño de entre 200 µm y 2 mm.

3.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque las paredes de los poros incluyen pasajes microporosos que interconectan a los macroporos adyacentes.

4.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 0 3, caracterizado además porque las paredes de los poros entre los macroporos adyacentes tienen un espesor promedio de menos de 0.4 mm.

5.- El soporte polimérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque los pasajes microporosos que ¡nterconectan a los macroporos tienen un tamaño en una escala de entre 50 y 200 µm.

6.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque es biocompatible.

7.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6, caracterizado además porque es biodegradable.

8.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque tiene una porosidad de al menos 75%.

9.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque tiene una porosidad de al menos 85%.

10.- El soporte polimérico de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, caracterizado además porque ¡ncluye un polímero derivado de pol¡(láctído- co-glicólido).

11.- El soporte polimérico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque ¡ncluye un polímero poli(láctido-co-glicólido) en una relación de 75% de poliláctido y 25% de poliglícólido.

12.- Un procedimiento para hacer un soporte polimérico que incluye los pasos de: combinar un polímero líquido con partículas para formar una mezcla de partículas-polímero; sumergir la mezcla de partículas-polímero en un no solvente de polímeros para producir una mezcla de partículas-polímero solidificada; y sumergir la mezcla de partículas-polímero solidificada en un solvente de partículas durante el tiempo suficiente para permitir la disolución de las mismas.

13.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el polímero líquido se forma al combinar un polímero con un solvente de polímeros.

14.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el solvente de polímero es DMSO.

15.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque las partículas tienen un diámetro de entre 0.5 y 3.5 mm.

16.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque las partículas tienen un diámetro de entre 1.0 y 2.0 mm.

17.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque las partículas antes mencionadas se seleccionan de un grupo que consiste de partículas de azúcar o sal, o de ambas.

18.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque las partículas antes mencionadas son partículas de azúcar.

19.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque incluye el paso de modificar la superficie del soporte polimérico.

20.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la superficie de soporte polimérico es modificada utilizando un tratamiento seleccionado del grupo que consiste de tratamiento con ácido, tratamiento con base, tratamiento por deposición de colágeno y tratamiento por deposición de fosfato de calcio.

21.- Un procedimiento para el crecimiento de tejidos, con distribución penetrante en un soporte polimérico macroporoso tridimensional con morfología trabecular hasta una profundidad de al menos 2.5 veces el tamaño de macroporo promedio en el soporte, que ¡ncluye los pasos de: proporcionar un soporte polimérico macroporoso con una morfología trabecular que tiene una porosidad de al menos 50%, y este soporte polimérico macroporoso incluye macroporos con un diámetro promedio de entre 0.5 y 3.5 mm, y los microporos tienen paredes de los poros definidas por puntales poliméricos y que incluyen pasajes macroporosos que ¡nterconectan a los macroporos antes menciones, así como pasajes microporosos que ¡nterconectan a esos macroporos; sembrar el soporte polimérico con células de tejidos; y cultivar esas células de tejidos.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque los pasajes macroporosos tienen un tamaño de entre 200 µm y 2mm, y caracterizado porque los pasajes microporosos tienen un tamaño de entre 50 y alrededor de 200 µm.

23.- El método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado además porque el soporte polimérico macroporoso es biocompatible y tiene una porosidad de al menos 85%.

24.- Un procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 21 , 22 ó 23, caracterizado además porque incluye el paso de modificar la superficie del soporte polimérico.

25.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la superficie del soporte polímérico es modificada utilizando un tratamiento seleccionado de un grupo que consiste de tratamiento con ácido, tratamiento con base, deposición de colágeno y deposición de fosfato de calcio.

26.- Un procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 21 , 22, 23, 24 ó 25, caracterizado además porque las células de tejidos son células osteogénicas.

27.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque las células de tejidos antes mencionadas elaboran matriz ósea.

28.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque las células de tejidos antes descritas son de origen humano.

29.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque las células de tejidos son seleccionadas de un grupo que consiste de células de tejido periodontal, células de tejido de cartílago, células de tejido dental, células de tejido hepático y células de tejido mamario.

30.- El método de conformidad con las reivindicaciones 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29, caracterizado además porque las células antes mencionadas se mantienen para aplicaciones in vitro e in vivo.