JP6207313B2 - 組織工学用支持体 - Google Patents

Description

本発明は、生体組織の代替品として使用され、特に形状安定性に優れ且つ内部に細胞を播種及び／または培養させることが可能な生体吸収性高分子材料から成る組織工学用支持体に関する。

近年、手術，外傷等によって喪失した生体組織を体細胞や幹細胞等によって再構築し、それを患者に移植することにより喪失した生体組織を再生する治療が行われている。この治療において生体組織を再生するためには、播種する細胞が生体組織を再建するまでの間に空間を維持し，細胞を保護する足場となる支持体（マトリックス）が重要となる。

従来の支持体としては、乳酸，グリコール酸，カプロラクトン等から成る生体吸収性高分子材料をジオキサン等の有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させて作製された孔径が５〜１００μｍ程度のスポンジ状の組織工学用支持体がある（例えば、特許文献１参照。）。また、このようなスポンジ状の組織工学用支持体の作製時に溶液中に粒子径が約５０〜５００μｍの水溶性で無毒性の粒子状物質（例えば、塩化ナトリウム粉末等）を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生分解性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を取り除くことで作製される約５０〜５００μｍの円形開放大孔と２０μｍ未満の円形開放小孔とを持つ多孔質構造の生体吸収性高分子材料の細胞の支持体がある（例えば、特許文献２参照）。しかし、これらの多孔質構造を持つ生体吸収性高分子から成る支持体はスポンジ状のブロックであるため強度が低く、必要とされる形状を生体内で維持できないという問題があった。また、隣り合う孔をつなぐ空間が小さくなるため細胞や培養液の分散性が低いという問題があった。そこで本出願人は、細胞が十分内部まで行き渡る空隙を持ち、なお且つ播種細胞が表面並びに内部へ侵入し増殖し易いような広い面を有し、更に支持体の強度も低下しない生体吸収性高分子材料から成るブロック状組織工学用支持体を開発した（例えば、特許文献３，４参照。）。

このようなブロック状組織工学用支持体は、細胞及び培養液を導入し、培養して移植体とした後に、生体中の患部に埋植して使用される。しかし、術前に患部の大きさを正確に予測するのは困難であり、用意した移植体が患部に対して大きすぎることもしばしばある。このような場合には術者がメス等の刃物を用いて移植体を切断することが行われていた。しかし、細胞播種後の多孔質構造のブロック状組織工学用支持体は、硬い部分と柔らかい部分とが混在していることから、硬すぎて切れなかったり、柔らかすぎて多孔質構造が潰れてしまったりする等、術中に、望みの形状に切断することは非常に困難であった。
また、上記問題に対しては、事前に大きさが異なる移植体を多種類用意すればよいが、非常にコストがかかることに加え、使用しなかった移植体は無駄になってしまうことから現実的ではなかった。

特開平１０−２３４８４４号公報 特表２００２−５４１９２５号公報 特開２００６−１３６６７３号公報 特開２００９−２２６１４８号公報

そこで本発明は上記問題に鑑み、多孔質構造を有するブロック状組織工学用支持体から構成され、分割せず用いることも、必要に応じて適当な大きさに容易に分割して用いることも可能な組織工学用支持体を提供することを課題とする。

本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、生体吸収性高分子材料から成り多孔質構造を有する複数のブロック状組織工学用支持体を合わせ、その合わせたブロック状組織工学用支持体同士を部分的に溶着または合着してブロック状組織工学用支持体を一体化した構造とすれば上記課題を解決できることを見出して本発明を完成させた。

即ち本発明は、生体吸収性高分子材料から成り多孔質構造を有する複数のブロック状組
織工学用支持体同士が部分的に溶着または合着されて一体化されており、分割して用いることが可能であることを特徴とする組織工学用支持体である。

本発明に係る組織工学用支持体は、細胞播種後であっても大きな患部に対しては分割せずそのまま適用でき、比較的小さな患部に対しては適当な大きさに容易に分割して適用することができる組織工学用支持体である。

本発明に係る組織工学用支持体の一実施例を示す展開斜視図及び斜視図。 本発明に係る組織工学用支持体の他の実施例を示す展開斜視図及び斜視図。 本発明に係る組織工学用支持体の更に他の実施例を示す展開斜視図及び斜視図。

本発明において用いられる生体吸収性高分子材料は、生体に安全であり、一定期間体内でその形態を維持できれば特に限定することなく用いることができる。例えば、従来から用いられているポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリオルソエステル及びそれらの共重合体中から選択される少なくとも一種を例示することができ、中でもポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体が米国食品医薬庁（ＦＤＡ）から人体に無害な高分子として承認されていること及びその実績の面から最も好ましい。生体吸収性高分子材料の重量平均分子量は５,０００〜２,０００,０００であることが好ましく、より好ましくは１０,０００〜５００,０００である。

本発明に係る組織工学用支持体において、ブロック状組織工学用支持体は、従来の多孔質構造を有するブロック状組織工学用支持体を使用することが可能である。特に特許文献４及び５に開示されている、平均孔径が１０〜３０００μｍ、好ましくは１５０〜１０００μｍであり、空隙率が７５〜９７％であって、破壊強度が０.０５〜２ＭＰａであるブロック状組織工学用支持体であることが好ましい。平均孔径が１０μｍより小さいと細胞を自由に通す効果が小さくなり内部まで十分に細胞を播種することができなくなる。３０００μｍよりも大きいと支持体の強度が低下してしまう。

なお、本発明において空隙率とは、体積が同じである同じ材料を用いた場合において、孔を有する材料の重量をＷ₁，孔のない材料の重量をＷ₂としたときに、（１−Ｗ₁／Ｗ₂）×１００で示される数値を言う。ブロック状組織工学用支持体の空隙率が７５％未満では空隙が少ないため細胞の培養効率が不足してしまい、９７％を超えると生体吸収性高分子材料の割合が低くなるため強度が低下してしまい細胞の足場としての機能を低下させることになり細胞の培養効率が低下する傾向がある。

ブロック状組織工学用支持体の破壊強度が０.０５ＭＰａ未満では形状に関係なく培養中の形状維持及び生体内で必要とされる形を維持することが困難となる。一方、２ＭＰａを超える破壊強度のものを作製することは技術的に難しい。なお、本願での破壊強度とは直径１０ｍｍ×高さ２ｍｍの円柱状の試験体をクロスヘッドスピード１ｍｍ／分で圧縮させた際の圧縮破壊強度を意味する。

平均孔径が１０〜３０００μｍであり、空隙率７５〜９７％であって、破壊強度が０.０５〜２ＭＰａであるブロック状組織工学用支持体の作製方法は、有機溶媒に生体吸収性高分子材料を溶解することにより作製された溶液に該有機溶媒には溶解せず且つ該生体吸収性高分子材料を溶解しない液によって溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子をミル等で粉砕してから該粒子状物質を該生体吸収性高分子を溶解しない液によって溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れ、加圧及び加熱して作製する方法が例示される。なお、予め生体吸収性高分子材料内に粉末状のリン酸カルシウム、例えばハイドロキシアパタイトやβ三リン酸カルシウムを分散させてからブロック状組織工学用支持体を作製してもよい。

上記加圧の条件は生体吸収性顆粒状多孔質物質の材質，形状や大きさによって異なるが、５００〜３０００ｇｆ／ｃｍ^２であることが好ましい。この範囲から外れると、水分に触れたときの体積変化が大きくなってしまう。更に、５００ｇｆ／ｃｍ^２未満ではブロック状組織工学用支持体の形状安定性が不足してしまう虞があり、３０００ｇｆ／ｃｍ^２を超えると細胞が十分に増殖可能な孔が残り難い。より好ましくは１０００〜２０００ｇｆ／ｃｍ^２である。

上記加熱の条件も生体吸収性顆粒状多孔質物質の材質，形状や大きさによって異なるが、上記の加圧を行った状態で体積を保って加熱するのであれば６０〜２００℃の範囲であればよい。６０℃未満では生体吸収性顆粒状多孔質物質同士の結合が弱くなり顆粒を集めてブロック体とすることが難しくなる傾向がある。一方、２００℃を超えると生体吸収性顆粒状多孔質物質が溶融してしまう虞がある。

以下、図面を用いて本発明に係る組織工学用支持体について詳細に説明する。
図面中１は本発明に係る組織工学用支持体であり、複数の上記ブロック状組織工学用支持体１ａ同士が部分的に溶着または合着されて一体化されている構造を有している。互いを合わせるために、各ブロック状組織工学用支持体１ａは少なくとも一つの面１ｂを有していることが好ましい。ここで面１ｂは必ずしも平らである必要はなく、凹凸面や曲面でもよいし、突起や孔が設けられてもよい。また、支持体同士が該面１ｂで係合するようにしてもよい。

合わされたブロック状組織工学用支持体１ａ同士を部分的に溶着または合着し一体化することにより、組織工学用支持体１が作製される。ここで部分的に溶着または合着とは、各ブロック状組織工学用支持体が容易に分離してしまうことがない強度で最小限の面積または溶着または合着部１ｃの数にて溶着または合着を行うことを示す。溶着または合着部１ｃの面積が小さく、数が少ないほど使用時に分割する作業が容易になる。各ブロック状組織工学用支持体１ａが面１ｂを有している場合には、該面１ｂ同士で接触させ、その接触面の外周及び／または内部の複数箇所を溶着または合着することが好ましい。

ブロック状組織工学用支持体１ａ同士の溶着または合着方法としては、ブロック状組織工学用支持体１ａを構成する生体吸収性高分子材料を溶かして溶着する方法や、ブロック状組織工学用支持体１ａの孔に噛み合うように生体吸収性高分子材料を溶かさない接着材を流し込むことにより合着する方法等を選択できる。
溶着には、加熱により行う方法と、ブロック状組織工学用支持体１ａを構成する生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶剤を介して行う方法との何れかを採用するのが好ましい。有機溶剤としては生体吸収性高分子材料を溶解させたものを使用すると接着力が向上するので好ましい。

図面中の１Ａ及び１Ｂ，２Ａ及び２Ｂ、並びに３Ａ及び３Ｂは、合わせる前の状態を示す展開斜視図であるＡ図、及び合わせて溶着または合着した後の組織工学用支持体を示す斜視図であるＢ図をそれぞれ示している。なお、図２及び３は、各ブロック状組織工学用支持体が多孔質であることの表現が省略されている。

本発明に係る組織工学用支持体は、図１に示したように同じ形状のブロック状組織工学用支持体を重ね合わせても良いし、図２に示したように異なる大きさや、図３に示したように異なる形状のブロック状組織工学用支持体を合わせても良い。

以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック
ジオキサンに分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体を溶解させ、更に粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む平均孔径２５μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、３００〜７１０μｍの篩に順次かけて平均粒径４９０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を直方体の型に入れ１５００ｇ／ｃｍ^２の圧力を保ったまま、温度１０５℃で加熱することによって、孔のサイズが平均５４０μｍ，空隙率８５％，９ｍｍ×１０ｍｍ×３ｍｍのブロック状組織工学用支持体を作製した。このブロック状組織工学用支持体の破壊強度は０．２５ＭＰａであった。なお、各実施例に記載の破壊強度は第１４段落に記載した条件で測定した。
同様の方法によって、直方体形状のブロック状組織工学用支持体を３個作製し、重ね合わせた。重ね合わせた直方体の接触面の外周部を直径約１ｍｍの範囲で１６か所を温度１２０℃で加熱することによって、各ブロック状組織工学用支持体が溶着されて一体化されている組織工学用支持体を作製した。

＜実施例２＞
ポリＬ-乳酸（ＰＬＬＡ）ブロック
クロロホルムに分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸を溶解させ、更に粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してクロロホルムを除去して塩化ナトリウム粒子を含む孔径２０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、７１０〜１０００の篩にかけて平均粒径８４０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ８００ｇ／ｃｍ^２の圧力を保ったまま、温度２３０℃で加熱することによって、孔のサイズが平均４６０μｍ，空隙率８７％，直径９ｍｍで厚さ４ｍｍ，破壊強度が０．６ＭＰａのブロック状組織工学用支持体を３個作製した。同様の材料を用いて直径６ｍｍで厚さ４ｍｍのブロック状組織工学用支持体を２個作製した。
直径９ｍｍのブロックの間に直径６ｍｍのブロックを重ね、その接触面の外周部を直径約１ｍｍの範囲で８か所を温度２６０℃で加熱することによって、各ブロック状組織工学用支持体が溶着されて一体化されている組織工学用支持体を作製した。

＜細胞の準備＞
細胞１ ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を１０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地で懸濁した後、有核細胞数１×１０^５細胞個／１０ｃｍ^２を培養皿へ移し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回の割合で培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル，ベックマンコールター社製）で計測し、そして５，０００細胞個／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。

細胞２ ウサギの大腿骨・脛骨から採取した間葉系幹細胞
６週齢のウサギの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断し、αＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，３２単位／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で骨髄内を洗浄した。よく懸濁して骨髄液をほぐした後、３００×ｇで５分間遠心分離して細胞を分離した。前記骨髄から約７×１０^７個の有核細胞を得た。骨髄から採取した細胞を有核細胞３．７５×１０^７細胞個／７５ｃｍ^２で培養フラスコへ移し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、以後３日に１回の割合で培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル，ベックマンコールター社製）で計測し、そして５，０００細胞個／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。

実施例１及び２の組織工学用支持体をそれぞれＤＭＥＭ培地中に浸漬させて減圧状態とし，培地を内部まで浸潤させた後，吸水体の上に移動して，上記の通り準備した移植細胞を、実施例１の支持体には細胞１を、実施例２の支持体には細胞２を滴下することにより播種し、各々の条件下で培養した。

＜細胞１の培養＞
軟骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０^−７Ｍデキサメサゾン，５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸，１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β，６．２５μｇ／ｍｌインスリン，６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン，６．２５ｎｇ／ｍｌセレン酸，５．３３μｇ／ｍｌリノレイン酸，１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）に２０，０００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞１（０．５ｍｌ）を実施例１で作製した組織工学用支持体の上に滴下して播種し、培地とともに容器に入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して軟骨組織再生用細胞移植体を作製した。

＜細胞２の培養＞
軟骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０^−７Ｍデキサメサゾン，５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸，１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β，６．２５μｇ／ｍｌインスリン，６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン，６．２５ｎｇ／ｍｌセレン酸，５．３３μｇ／ｍｌリノレイン酸，１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）に２０，０００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞２（０．５ｍｌ）を実施例２で作製した組織工学支持体の上に滴下して播種し、培地とともに容器に入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して軟骨組織再生用細胞移植体を作製した。

実施例１及び２で作製された細胞播種後の組織工学用支持体をメスで分割する作業を行った。何れの支持体も複数の溶着または合着部を切り離すことで容易にブロック状組織工学用支持体に分割することができ容易に大きさを調整できることが確認された。

１ 組織工学用支持体
１ａ ブロック状組織工学用支持体
１ｂ 面
１ｃ 溶着または合着部

Claims (6)

1. 生体吸収性高分子材料から成り多孔質構造を有する複数のブロック状組織工学用支持体同士が部分的に溶着または合着されて一体化されており、分割して用いることが可能であることを特徴とする組織工学用支持体。
2. 前記複数のブロック状組織工学用支持体同士は、それぞれの面で接触し、その接触面の外周及び／または内部の複数箇所が溶着または合着されて一体化されている請求項１に記載の組織工学用支持体。
3. 溶着方法が熱溶着である請求項１または２に記載の組織工学用支持体。
4. 溶着方法が有機溶剤による溶着である請求項１または２に記載の組織工学用支持体。
5. 前記ブロック状組織工学用支持体は平均孔径が１０〜３０００μｍであり、空隙率７５〜９７％であって、破壊強度が０.０５〜２ＭＰａである請求項１〜４の何れか１項に記載の組織工学用支持体。
6. 生体吸収性高分子材料が、ポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリオルソエステル及びこれらの共重合体中から選択される少なくとも一種である請求項１〜５の何れか１項に記載の組織工学用支持体。

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