CN115850809B - 二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,该可注射水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与MoS2纳米片组成,MoS2纳米片均匀分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中;该可注射水凝胶中,MoS2纳米片的含量为70~100μg/mL,交联巯基化透明质酸的含量为10~30mg/mL。本发明还提供了该可注射水凝胶的制备方法及其在骨修复领域的应用。本发明提供的可注射水凝胶可以改善干细胞在该水凝胶材料上的粘附性能,能有效缓解现有用于软骨修复的凝胶材料存在的干细胞粘附性差的不足。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域,涉及二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
关节软骨缺损是一类常见的骨科疾病,由于关节软骨无血管,无淋巴,无神经,因而难以自我修复。现有的治疗方法主要依赖于自体软骨细胞移植,但是该治疗方法受限于供体细胞的不足以及在培养过程中易分化。组织工程通过将体外分离扩增的种子细胞协同生长因子种植在支架材料上,将其移植到人体内后可以形成新的软骨组织以达到软骨修复与重建的目的,因而受到了越来越多的关注。因此,理想的支架对于缺损软骨的重建是至关重要的。水凝胶有利于维持种子细胞圆形或者椭圆形的形态,这种形态同种子细胞在天然的软骨基质中的形态一致,同时水凝胶具有好的渗透性,有利于营养物质的传输和代谢活动的进行,细胞可以被水凝胶三维包裹在水凝胶中。因此,水凝胶已被广泛应用于软骨组织工程并且展现出了巨大的潜力。
透明质酸是软骨细胞外基质最主要的成分之一。透明质酸的结构和生物学性能可调控细胞信号、伤口愈合和基质的形成。透明质酸水凝胶有良好的生物相容性、生物降解性、高保水性以及促进软骨形成的特性,但是透明质酸生物材料会抑制细胞的附着,无法达到应用要求。CN 104892962A公开了一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶,但该水凝胶仍然会抑制细胞附着,其细胞粘附性较差,干细胞在其上铺展困难。因此,若能进一步改善透明质酸水凝胶的细胞粘附性能,对于促进透明质酸凝胶材料在软骨修复领域的实际应用将起到积极的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶及其制备方法与应用,以改善干细胞在该水凝胶材料上的粘附性能,有效缓解现有用于软骨修复的凝胶材料存在的干细胞粘附性差的不足。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,该可注射水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与MoS2纳米片组成,MoS2纳米片均匀分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中;该可注射水凝胶中,MoS2纳米片的含量为70~100μg/mL,交联巯基化透明质酸的含量为10~30mg/mL;
所述MoS2纳米片为单层MoS2纳米片,所述交联巯基化透明质酸是由巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成。
上述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的技术方案中,巯基化透明质酸的结构式如式(Ⅰ)所示,
上述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的技术方案中,巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30%~70%。
进一步地,上述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的技术方案中,巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的,作为改性基础的透明质酸的分子量优选为0.1~2.0MDa。
上述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的技术方案中,所述MoS2纳米片的尺寸优选为0.2~5μm、厚度为1nm左右。
本发明还提供了上述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)MoS2纳米片充分分散在去离子水中,然后用碱性溶液调节所得溶液的pH值至7.4~7.8,再加入pH值为7.4~7.8的PBS缓冲液调节溶液中的MoS2纳米片的浓度至70~100μg/mL,得到MoS2纳米片溶液;
(2)将巯基化透明质酸酸溶解于步骤(1)制备的MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中巯基化透明质酸的浓度为10~30mg/mL;
(3)用碱性溶液调节步骤(2)所得混合溶液的pH值至7.4~7.8,在34~40℃静置,使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成水凝胶,即得二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶。
上述制备方法的技术方案中,所述PBS缓冲液的浓度优选为0.01~0.02mol/L。
上述制备方法的技术方案中,所述碱性溶液优选为0.5~2mol/L的NaOH溶液。
本发明通过体外细胞实验证实,骨髓间充质干细胞在二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶中成团生长并且细胞粘附性良好,本发明提供的二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶可有效解决现有的透明质酸凝胶存在的细胞铺展困难的问题。二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶能够很好地维持骨髓间充质干细胞的活力,促进骨髓间充质干细胞的增殖。二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶对骨髓间充质干细胞分泌糖胺多糖的促进作用优异。
基于以上实验结果,本发明还提供了上述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶在骨修复领域的应用,特别是在软骨修复领域的应用。具体地,可将二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架。
采用二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架的步骤如下:
(1)MoS2纳米片充分分散在去离子水中,然后用碱性溶液调节所得溶液的pH值至7.4~7.8,再加入pH值为7.4~7.8的PBS缓冲液调节溶液中的MoS2纳米片的浓度至70~100μg/mL,得到MoS2纳米片溶液;
(2)将巯基化透明质酸酸溶解于步骤(1)制备的MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中巯基化透明质酸的浓度为10~30mg/mL;
(3)用碱性溶液调节步骤(2)所得混合溶液的pH值至7.4~7.8,立即将所得混合溶液注射至生物体内的待修复部位,巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成水凝胶,即得软骨组织工程三维支架;
或者,向步骤(2)所得混合溶液中加入骨髓间充质干细胞悬浮液并混匀,然后用碱性溶液调节步骤(2)所得混合溶液的pH值至7.4~7.8,巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹骨髓间充质干细胞的水凝胶,即得软骨组织工程三维细胞支架;
或者,向步骤(2)所得混合溶液中加入骨髓间充质干细胞悬浮液并混匀,然后用碱性溶液调节步骤(2)所得混合溶液的pH值至7.4~7.8,立即加入模具中,在34~40℃静置,巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹骨髓间充质干细胞的水凝胶,将包裹骨髓间充质干细胞的水凝胶从模具中取出浸没于培养基中,置于培养箱中在34~40℃、3%~5%的CO2的条件下培养至少1天即得软骨组织工程三维细胞支架,培养期间定期更换培养基;所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上添加青霉素-链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到的。
进一步地,α-MEM培养基中添加的青霉素和链霉素混合液的浓度为0.8%~1.2%,抗坏血酸的浓度为40~60μg/mL,胎牛血清的浓度为8%~12%。
在制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时,所采用的PBS缓冲液的浓度优选为0.01~0.02mol/L,所采用的碱性溶液优选为0.5~2mol/L的NaOH溶液。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果:
1.本发明提供了一种二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,该水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与MoS2纳米片组成,MoS2纳米片均匀分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中,透明质酸是软骨细胞外基质最主要的成分之一,具有良好的生物相容性以及生物可降解性能,由于巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率适当,并且该水凝胶中交联巯基化透明质酸与MoS2纳米片的含量及比例关系适当,因而本发明提供的二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶克服了透明质酸凝胶缺乏细胞粘附位点、无法实现细胞铺展生长的问题,能够促进骨髓间充质干细胞的铺展生长和有利于细胞维持表型,在软骨损伤修复领域有着重要的潜在应用价值。
2.本发明还提供了一种二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的制备方法,该方法通过在交联巯基化透明质酸水凝胶中引入少量的MoS2纳米片即可解决现有的透明质酸凝胶不利于细胞粘附和无法实现细胞铺展生长的问题,赋予透明质酸水凝胶优异的细胞粘附性能。本发明所述方法的操作简单,通过调整巯基化透明质酸和MoS2纳米片的浓度和比例关系,即可制备出适合骨髓间充质干细胞存活、增殖的水凝胶。
3.本发明通过体外细胞实验证实,骨髓间充质干细胞在二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶中成团生长并且细胞粘附性良好,本发明提供的二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶可有效解决现有的透明质酸凝胶存在的细胞铺展困难的问题。二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶能够很好地维持骨髓间充质干细胞的活力,促进骨髓间充质干细胞的增殖。二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶对骨髓间充质干细胞分泌糖胺多糖的促进作用优异。基于以上实验结果,本发明还提供了二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶在骨修复领域的应用,特别是在软骨修复领域的应用。根据具体的应用需求,可将该水凝胶直接原位注射至生物体的待修复部位形成软骨组织工程三维支架,或者是将融合了骨髓间充质干细胞等活性物质的水凝胶原位注射至生物体的待修复部位形成软骨组织工程三维细胞支架,或者是将融合了骨髓间充质干细胞等活性物质的水凝胶利用模具在体外形成并培养至骨髓间充质干细胞达到所需活性之后注入生物体的待修复部位,应用方式多样化,使用方式简单。
附图说明
图1是实施例中采用的MoS2纳米片在不同放大倍数下的透射电镜照片。
图2是实施例2制备的MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶(A~C图)和巯基化透明质酸水凝胶(D~F图)冷冻干燥后在不同放大倍数的扫描电镜照片。
图3是实施例3中各实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的CCK-8检测分析结果。
图4是实施例4的Normal组和M组培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜照片,图中,a1~a4图、b1~b4图分别是Normal组和M组的三维细胞支架的骨髓间充质干细胞及其细胞骨架的显微镜照片。
图5是实施例4的HM组和HS组培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜照片,图中,a1~a5图、b1~b5图别是HM组和HS组的三维细胞支架的骨髓间充质干细胞及其细胞骨架的显微镜照片。
图6是实施例5中各实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的CCK-8检测分析结果。
图7是实施例6中各实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的GAGs定量检测分析结果。
图8是实施例7中各实验组中兔关节软骨缺损模型的实验图以及术后一个月的缺损肉眼观察图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶及其制备方法与应用作进一步说明。有必要指出,以下实施例只用于对本发明作进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施,仍属于本发明的保护范围。
本发明中涉及的所有动物实验均获得四川大学医学伦理学委员会的批准,所有动物手术均按照四川大学实验动物护理和使用指南进行。
实施例1
本实施例中,制备巯基化透明质酸(HA-SH),步骤如下:
(1)将分子量为0.34MDa的透明质酸钠溶解于去离子水中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),充分溶解,然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl),充分溶解,用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75,在室温反应2h,然后加入半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)溶液,在室温反应24h,之后用1mol/L的NaOH溶液调节反应液的pH值至8.5,加入二硫苏糖醇(DTT)溶液,在室温反应12h。
该步骤中,透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)与二硫苏糖醇(DTT)的摩尔比为1:2:4:4:12。
(2)用1mol/L的HCl溶液调节步骤(1)所得反应液的pH值至3.0~3.5,在pH值为3.0~3.5的去离子水中透析72h,冷冻干燥,得到巯基化透明质酸(HA-SH),采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度,该HA-SH中半胱氨的接枝率为65.5%。
实施例2
本实施例中,制备MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,步骤如下:
(1)将MoS2纳米片充分分散在去离子中,用1mol/L的NaOH调节所得溶液的pH值至7.5,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度为70μg/mL,得到MoS2纳米片溶液。
取少量MoS2纳米片充分分散在去离子水中,配制成7μg/mL的溶液,并采用透射电镜观察其中MoS2纳米片的微观结构。
(2)将实施例1制备的HA-SH灭菌。
(3)该步骤包括以下2个实验组:
实验组①,将HA-SH溶于MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中HA-SH的浓度为15mg/mL;
实验组②,作为对照,将HA-SH溶于去离子水中,得到15mg/mL的HA-SH溶液。
实验组①和实验组②的溶液的总体积相等,分别用1mol/L的NaOH溶液调节实验组1和实验组2的溶液的pH至7.5,在37℃静置一段时间即可形成水凝胶。实验组①制备得到的是MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,记作HM,实验组②制备得到的是巯基化透明质酸可注射水凝胶,记作HS。
图1是本实施例采用的MoS2纳米片在不同放大倍数下的透射电镜照片,透射电镜照片显示MoS2纳米片为单层分散的纳米片。
将实验组①制备的MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶和实验组②制备的巯基化透明质酸可注射水凝胶冷冻干燥,之后采用扫描电镜观察它们的微观结构,结果如图2所示。图2的A~C图为MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜照片,扫描电镜照片显示水凝胶表面具有颗粒状凸起,颗粒直径约为几百纳米,呈均匀分布。图2的D~F图片为巯基化透明质酸水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜照片,扫描电镜照片显示水凝胶表面十分光滑。由图2可知,在MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶中,MoS2纳米片均匀分布于巯基化透明质酸形成的三维网络中。
实施例3
本实施例中,将不同浓度的MoS2纳米片溶液与骨髓间充质干细胞共培养,考察不同浓度的MoS2纳米片溶液对骨髓间充质干细胞的活力的影响。
(1)将MoS2纳米片充分分散在去离子中,用1mol/LNaOH溶液调节所得溶液的pH值至7.5,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度形成以下五个实验组:
实验组①,MoS2纳米片的浓度为100μg/mL;
实验组②,MoS2纳米片的浓度为70μg/mL;
实验组③,MoS2纳米片的浓度为50μg/mL;
实验组④,MoS2纳米片的浓度为30μg/mL;
实验组⑤,MoS2纳米片的浓度为10μg/mL。
这5个实验组的溶液体积相等,向各实验组的溶液中分别加入骨髓间充质干细胞悬液并充分混合,各实验组中骨髓间充质干细胞浓度为1×106cells/mL,该骨髓间充质干细胞从兔子的骨髓中提取,然后分别用1mol/L的NaOH溶液调节各实验组所得混合溶液的pH值至7.5。
(2)将5个实验组的混合溶液加入到含有细胞爬片的培养基中,然后均置于培养箱中在37℃、5%的CO2的条件下培养,培养期间每隔1d更换新鲜的培养基。所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到,该培养基中双抗的体积浓度为1%,抗坏血酸的浓度为50μg/mL,胎牛血清的体积浓度为10%。
分别于培养1d、2d和3d后取出各实验组得到的三维细胞支架,使用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液清洗2遍,在孔板中配置100μL的细胞悬液,将培养板在培养箱预培养24h(37℃,5%CO2),每孔各加入10μL CCK-8溶液,将培养板放入培养箱中孵育1~4h,然后用酶标仪测定450nm处的OD值。
图3为本实施例中5个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的CCK-8检测分析结果。图3的5组条形图中,每组条形图包括3根条形图,每组条形图从左至右的三根条形图分别代表培养时间为1d、2d和3d。由图3可知,实验组②在培养1d、2d和3d后所测得的OD值均是最高,且OD值随着培养时间的延长而不断增加。从CCK-8检测分析可以看出,浓度为70μg/ml的MoS2纳米片溶液在维持骨髓间充质干细胞的活力上具有最好的效果,很好地促进了骨髓间充质干细胞的增殖。
实施例4
本实施例中,制备软骨组织工程三维细胞支架,并考察骨髓间充质干细胞的生长状态和分布情况。
(1)将MoS2充分分散在去离子中,用1mol/LNaOH溶液调节所得溶液的pH值至7.5,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度至70μg/mL,得到MoS2纳米片溶液。
(2)将实施例1制备的HA-SH灭菌。
(3)该步骤包括以下4个实验组:
实验组①(HM组),将HA-SH溶于步骤(1)配制的MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中HA-SH的浓度为15mg/mL;
实验组②(HS组),作为对照,将HA-SH溶于去离子水中,得到浓度为15mg/mL的HA-SH溶液;
实验组③(M组),作为对照,只吸取步骤(1)配制的MoS2纳米片溶液;
实验组④(Normal组),作为空白对照,只吸取去离子水。
这4个实验组的溶液的体积相等,分别向各实验组的溶液中加入骨髓间充质干细胞悬液并充分混合;HM组和HS组得到的混合溶液中,骨髓间充质干细胞浓度为5×106cells/mL;而M组与Normal组得到的混合溶液中,骨髓间充质干细胞浓度为1×106cells/mL;所述骨髓间充质干细胞从兔子的骨髓中提取;然后分别用1mol/L的NaOH溶液调节各组混合溶液的pH值至7.5。
将HM组和HS组的混合溶液在调节好pH值后立即注入到环状模具中,在空气环境中于37℃静置30min形成三维包裹软骨细胞的水凝胶。
(4)将HM组和HS组得到的三维包裹软骨细胞的水凝胶从模具中取出,浸没于培养基中,然后另取两份加入了细胞爬片的培养基分别加入M组和Normal组的混合溶液中。4组培养基置于培养箱中在37℃、5%的CO2的条件下培养得到软骨组织工程三维细胞支架,培养期间每隔1d更换新鲜的培养基。所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到,该培养基中双抗的体积浓度为1%,抗坏血酸的浓度为50μg/mL,胎牛血清的体积浓度为10%。
分别于培养3d、5d、7d和14d后取出各实验组得到的三维细胞支架,使用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液清洗2遍,拍摄照片对比观察各实验组三维细胞支架的颜色、形状和大小等变化。将清洗后的三维细胞支架浸没于含有1μg/mL的FDA和1μg/mLPI的PBS缓冲液中染色1min,然后用PBS缓冲液清洗1次,通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察各实验组的三维支架中的骨髓间充质干细胞的生长状态和分布情况。
图4是本实施例的Normal组和M组培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜照片,图中,a1~a4图、b1~b4图分别是Normal组和M组的三维细胞支架的骨髓间充质干细胞及其细胞骨架的显微镜照片。图5是本实施例的HM组和HS组培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜照片,图中,a1~a5图、b1~b5图别是HM组和HS组的三维细胞支架的骨髓间充质干细胞及其细胞骨架的显微镜照片。
由图4~5可知,4个实验组的三维细胞支架都具有良好的生物相容性,几乎没有死细胞,包裹在三维细胞支架中的骨髓间充质干细胞都随着培养天数的增加正常增殖。HM组、Normal组和M组的三维细胞支架具有优良的细胞粘附性,骨髓间充质干细胞可在其内铺展生长;而HS组的三维细胞支架则不具备粘附性,骨髓间充质干细胞铺展困难。骨髓间充质干细胞在HM组的三维细胞支架中成团生长并且细胞粘附性良好,骨髓间充质干细胞的数量随着培养时间延长而增加,说明MoS2纳米片的引入,有效改善了巯基化透明质酸组三维细胞支架骨髓间充质干细胞铺展困难的问题。
实施例5
本实施例中,制备软骨组织工程三维细胞支架,并考察骨髓间充质干细胞在支架中的增殖情况。
(1)将MoS2充分分散在去离子中,用1mol/LNaOH溶液调节所得溶液的pH值至7.5,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度至70μg/mL,得到MoS2纳米片溶液。
(2)将实施例1制备的HA-SH灭菌。
(3)该步骤包括以下4个实验组:
实验组①(HM组),将HA-SH溶于步骤(1)配制的MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中HA-SH的浓度为15mg/mL;
实验组②(HS组),作为对照,将HA-SH溶于去离子水中,得到浓度为15mg/mL的HA-SH溶液;
实验组③(M组),作为对照,只吸取步骤(1)配制的MoS2纳米片溶液;
实验组④(Normal组),作为空白对照,只吸取去离子水。
这4个实验组的溶液的体积相等,分别向各实验组的溶液中加入骨髓间充质干细胞悬液并充分混合;HM组和HS组得到的混合溶液中,骨髓间充质干细胞浓度为5×106cells/mL;而M组与Normal组得到的混合溶液中,骨髓间充质干细胞浓度为1×106cells/mL;所述骨髓间充质干细胞从兔子的骨髓中提取;然后分别用1mol/L的NaOH溶液调节各组混合溶液的pH值至7.5。
将HM组和HS组的混合溶液在调节好pH值后立即注入到环状模具中,在空气环境中于37℃静置30min形成三维包裹软骨细胞的水凝胶。
(4)将HM组和HS组得到的三维包裹软骨细胞的水凝胶从模具中取出,浸没于培养基中,然后另取两份加入了细胞爬片的培养基分别加入M组和Normal组的混合溶液。4组培养基置于培养箱中在37℃、5%的CO2的条件下培养得到软骨组织工程三维细胞支架,培养期间每隔1d更换新鲜的培养基;所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到,该培养基中双抗的体积浓度为1%,抗坏血酸的浓度为50μg/mL,胎牛血清的体积浓度为10%。
分别于培养3d、7d和14d后取出各实验组得到的三维细胞支架,用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液清洗2遍,在孔板中配置100μL的细胞悬液,将培养板在培养箱预培养24h(37℃,5%CO2),每孔各加入10μLCCK-8溶液,将培养板放入培养箱中孵育1~4h,采用酶标仪测定450nm处的OD值。
图6为本实施例中4个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的CCK-8检测分析结果。由图6可知,所有实验组的OD值都随着培养时间的增加而增加,M组的数值略高于Normal组,HM组的数值是最高的,而HA组的数值则是最低的。从CCK-8检测分析结果可知,MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶能够很好地维持骨髓间充质干细胞的活力,促进骨髓间充质干细胞的增殖。
实施例6
本实施例中,制备软骨组织工程三维细胞支架并进行GAGs定量检测。
(1)将MoS2充分分散在去离子中,用1mol/LNaOH溶液调节所得溶液的pH值至7.5,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.5的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度至70μg/mL,得到MoS2纳米片溶液。
(2)将实施例1制备的HA-SH灭菌。
(3)该步骤包括以下4个实验组:
实验组①(HM组),将HA-SH溶于步骤(1)配制的MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中HA-SH的浓度为15mg/mL;
实验组②(HS组),作为对照,将HA-SH溶于去离子水中,得到浓度为15mg/mL的HA-SH溶液;
实验组③(M组),作为对照,只吸取步骤(1)配制的MoS2纳米片溶液;
实验组④(Normal组),作为空白对照,只吸取去离子水。
这4个实验组的溶液的体积相等,分别向各实验组的溶液中加入骨髓间充质干细胞悬液并充分混合;HM组和HS组得到的混合溶液中,骨髓间充质干细胞浓度为5×106cells/mL;而M组与Normal组得到的混合溶液中,骨髓间充质干细胞浓度为1×106cells/mL;所述骨髓间充质干细胞从兔子的骨髓中提取;然后分别用1mol/L的NaOH溶液调节各组混合溶液的pH值至7.5。
将HM组和HS组的混合溶液在调节好pH值后立即注入到环状模具中,在空气环境中于37℃静置30min形成三维包裹软骨细胞的水凝胶。
(4)将HM组和HS组得到的三维包裹软骨细胞的水凝胶从模具中取出,浸没于培养基中,然后另取两份加入了细胞爬片的培养基分别加入M组和Normal组的混合溶液。4组培养基置于培养箱中在37℃、5%的CO2的条件下培养得到软骨组织工程三维细胞支架,培养期间每隔1d更换新鲜的培养基;所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液(双抗)、抗坏血酸以及胎牛血清得到,该培养基中双抗的体积浓度为1%,抗坏血酸的浓度为50μg/mL,胎牛血清的体积浓度为10%。
分别于培养14d和21d后取出各实验组得到的三维细胞支架,使用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液清洗2遍,浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48h,然后用OCT包埋,迅速放于冷冻台上冰冻至包埋剂与组织冻结成白色冰体,通常的冰冻时间为1~3min,然后在冰冻切片机上进行切片,厚度为5~10μm,随后对切片进行GAGs定量检测。
图7为本实施例中4个实验组中培养不同时间得到的三维细胞支架的GAGs定量检测分析结果。由图7可知,所有实验组在培养21d后的GAG/DNA(μg/μg)数值都高于培养14d时的GAG/DNA(μg/μg)数值。HM组和HS组的数值都高于Normal组和M组,尤其是HM组在培养14d和21d后的GAG/DNA(μg/μg)数值都是最高的,Normal组的数值则是最低的。从GAGs定量检测结果可知,4个实验组的三维细胞支架中培养的骨髓间充质干细胞均能分泌糖胺多糖,MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶对骨髓间充质干细胞分泌糖胺多糖的促进作用最好,这十分有利于MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶应用于骨修复支架。
实施例7
本实施例中,建立兔膝关节软骨缺损模型并对其进行修复,步骤如下:
(1)配置浓度为3%的戊巴比妥钠溶液,通过耳缘静脉注射进行麻醉,待兔子(大白兔)完全麻醉后,用剃毛刀将兔子膝关节处的绒毛剔除干净,再用碘伏擦拭灭菌(每只动物的两条后腿都进行手术)。
(2)在膝关节内侧开口,髌骨外侧脱位,暴露膝关节后用不锈钢钻在滑车部位构建一个直径3mm,深度1mm的软骨缺损。将制备好的软骨缺损模型在同一时间、同一蓝色背景下,经由同一实验员进行拍摄。
(3)术后用无菌生理盐水冲洗缺损2~3次,无菌纱布拭干,将事先备好的经过灭菌的支架材料植入软骨缺损内,支架材料填入后,进行皮下组织及皮肤的逐层缝合。按照植入的支架材料的种类将兔软骨缺损模型分为3个实验组:
实验组①(空白组),作为对照,不植入支架材料;
实验组②(HA-SH组),作为对照,植入的支架材料为HA-SH水凝胶,HA-SH水凝胶的制备方法与实施例2中MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的制备方法基本相同,不同之处仅在于制备时不添加MoS2;
实验组③(HA-SH+MoS2组),植入的支架材料为实施例2制备的MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶。
(4)术后3天每天肌肉注射抗生素(庆大霉素),预防感染。
(5)定期观察兔子进食、排便以及精神状况,做好记录。
(6)术后三个月,用耳缘静脉空气栓塞法处死兔子,将兔膝关节离体,分别在同一时间点将三组离体样本分别置于同一蓝色背景下,由同一实验员进行拍摄。
图8的第一行图为本实施例中3个实验组的兔软骨缺损模型的照片,图8的第二行图为术后三个月兔软骨缺损的照片。由图8可知,相比于HA-SH组和空白组,HA-SH+MoS2组的软骨缺损修复的效果明显更好。说明在HA-SH凝胶中引入适量的MoS2纳米片,可以有效提高其骨修复性能。
实施例8
本实施例中,制备MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,步骤如下:
(1)将MoS2纳米片充分分散在去离子中,用1mol/L的NaOH调节所得溶液的pH值至7.8,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.8的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度为100μg/mL,得到MoS2纳米片溶液。
(2)参照实施例1制备半胱氨的接枝率约为30%的HA-SH,将制备的HA-SH灭菌。
(3)将HA-SH溶于MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中HA-SH的浓度为30mg/mL,用1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH至7.8,在37℃静置1min即可形成水凝胶,由此制备得到MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶。
实施例9
本实施例中,制备MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,步骤如下:
(1)将MoS2纳米片充分分散在去离子中,用0.5mol/L的NaOH调节所得溶液的pH值至7.4,然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节溶液中MoS2纳米片的浓度为80μg/mL,得到MoS2纳米片溶液。
(2)参照实施例1制备半胱氨的接枝率约为45%的HA-SH,将制备的HA-SH灭菌。
(3)将HA-SH溶于MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中HA-SH的浓度为10mg/mL,用0.5mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH至7.4,在37℃静置1min即可形成水凝胶,由此制备得到MoS2增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶。
Claims (6)
1.一种二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶,其特征在于,该可注射水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与MoS2纳米片组成,MoS2纳米片均匀分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中;该可注射水凝胶中,MoS2纳米片的含量为70~100 μg/mL,交联巯基化透明质酸的含量为10~30 mg/mL;
所述MoS2纳米片为单层MoS2纳米片,MoS2纳米片的尺寸为50~500 nm;所述交联巯基化透明质酸是由巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成,巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的,作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1~2.0 MDa,巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30%~70%。
2.权利要求1所述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)MoS2纳米片充分分散在去离子水中,然后用碱性溶液调节所得溶液的pH值至7.4~7.8,再加入pH值为7.4~7.8的PBS缓冲液调节溶液中的MoS2纳米片的浓度至70~100 μg/mL,得到MoS2纳米片溶液;
(2)将巯基化透明质酸酸溶解于步骤(1)制备的MoS2纳米片溶液中形成混合溶液,该混合溶液中巯基化透明质酸的浓度为10~30 mg/mL;
(3)用碱性溶液调节步骤(2)所得混合溶液的pH值至7.4~7.8,在34~40 ℃静置,使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成水凝胶,即得二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶。
3.根据权利要求2所述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的制备方法,其特征在于,所述PBS缓冲液的浓度为0.01~0.02 mol/L。
4.根据权利要求2或3所述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶的制备方法,其特征在于,所述碱性溶液为0.5~2 mol/L的NaOH溶液。
5.权利要求1所述二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶在制备骨修复材料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,将二硫化钼增强的巯基化透明质酸可注射水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架。
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