DE69826119T2

DE69826119T2 - Heteropolysaccharid-konjugate, halbinterpenetrierende polysaccharidgele und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69826119T2
Application number: DE69826119T
Authority: DE
Inventors: Marcos Mares-Guia; Camillo Ricordi
Original assignee: Biomm Inc Miami; BIOMM Inc
Current assignee: Biomm Inc Miami; BIOMM Inc
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: DE69826119D1; BR9809326A; EP0977780A1; EP0977780B1; EP0977780A4; WO1998049202A1; US6281341B1; ATE275585T1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren für die Herstellung eines neuen Heteropolysaccharidkonjugats oder -komplex, Gele davon und/oder eine Zusammensetzung, z.B. Lösungen, die eine anpaßbare Viskosität aufweisen, die durch die Veränderung der Konzentration des Heteropolysaccharidkonjugats oder -komplexes und/oder der Ionenkonzentrationen, z.B. Kalzium, zubereitet werden; und/oder ein Gel oder ein Sol, das ein Heteropolysaccharidkonjugat umfaßt; die Synthese, Reinigung und Verwendung eines neuen Glykopolymers und/oder Heteropolysaccharids und/oder Gels, einer Lösung und/oder eines Sols; und insbesondere Verfahren für die Herstellung eines Neo-Heteropolysaccharidkonjugats oder -komplexes, das hierin als „Biodritin-Heteropolysaccharid" bezeichnet wird, das ein Heteropolysaccharid aus kovalenten Bindungen zwischen mindestens einem Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und mindestens einem Alginsäuresalz, z.B. Natriumalginat, vorzugsweise über eine Kopplungsreaktion über ein Verbindungsmolekül wie Divinylsulfon umfaßt.
Somit betrifft die Erfindung insbesondere Verfahren für die Herstellung eines Biodritin-Heteropolysaccharids, Gele davon und/oder einer Zusammensetzung, z.B. Lösungen, die eine anpaßbare Viskosität aufweisen, hergestellt durch die Beeinflussung der Konzentration des Biodritin-Heteropolysaccharids und/oder der Ionenkonzentrationen, z.B. Kalzium; und/oder ein Gel oder ein Sol, das das Biodritin-Heteropolysaccharid umfaßt; die Synthese, Reinigung und die Verwendung des Biodritin-Heteropolysaccharids als ein neues Glykopolymer und/oder ein Heteropolysaccharid und/oder Gele, Lösungen und/oder Sole, die Biodritin-Heteropolysaccharid umfassen. Die Gele werden durch das Hinzufügen eines anorganischen Ions, wie Kalziumionen, zu einem Biodritin-Heteropolysaccharid erhalten. Sole können durch die Behandlung eines Gels mit einem geeigneten Mittel, wie einem Natriumsalz, z.B. Zitratsalzen oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Natriumsalz erhalten werden. Die Gele können eine veränderbare Viskosität durch die Veränderung der Menge des Biodritin-Heteropolysaccharids und/oder des anorganischen Ions, z.B. eines Kalziumions aufweisen; und mit einer Kalziumionenmenge können unbegrenzte Gele erhalten werden.
Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung, die hierin als „Biodritin-Polymernetzwerk" bezeichnet wird, und Verfahren und Formulierungen für die Zubereitung eines Biodritin-Polymernetzwerks. Ein Biodritin-Polymernetzwerk umfaßt mindestens ein Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und mindestens ein Alginsäuresalz, z.B. Natriumalginat, wobei mindestens einer von den Glukosaminoglykan und dem Alginsäuresalz quervernetzt ist. Und es betrifft Verfahren und Formulierungen für die Zubereitung eines Biodritin-Polymernetzwerks, die das Mischen des Glucosaminoglykan und des Alginsäuresalzes und das Hinzufügen mindestens eines Quervernetzungsmittels, z.B. eines anorganischen Ions, umfaßt. Beispielsweise wird ein Biodritin-Polymernetzwerk, von dem angenommen wird, ohne notwendigerweise zu wünschen durch eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, daß es ein halbdurchdringendes Polymernetzwerk (s-IPN = „semi-interpenetrating polymer network") ist, durch das Hinzufügen anorganischer Ionen zu einer Lösung aus Glukosaminoglykan und einem Alginsäuresalz, z.B. durch Kalziumionen, die zu einer Lösung aus Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und Natriumalginat hinzugefügt werden (wobei Natriumalginat quervernetzt ist und Taschen aus Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und/oder nicht-quervernetzten Natriumalginat aufweist) gebildet.
Natürlich kann ein Biodritin-Polymernetzwerk, das mindestens ein Biodritin-Heteropolysaccharid enthält, durch die kovalente Bindung des Glucosaminoglykans und des Alginsäuresalz in Gegenwart eines Biodritin-Polymernetztwerks erhalten werden, zum Beispiel dadurch, daß ein Biodritin-Polymernetzwerks einer Kopplungsreaktion unterzogen wird, an der ein Verbindungsmolekül beteiligt ist; beispielsweise durch die Bildung eines Netzwerks durch das Hinzufügen anorganischer Ionen zu einer Lösung aus Glukosaminoglykan und einem Alginsäuresalz, z.B. durch Kalziumionen, die zu einer Lösung aus Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und Natriumalginat hinzugefügt werden und das Aussetzen des Netzwerks gegenüber einer Kopplungsreaktion, z.B. das Aussetzen des Netzwerks gegenüber einer Kopplungsreaktion, an der Divinylsulfon beteiligt ist.
Bei der Zubereitung eines Biodritin-Heteropolysaccharids oder eines Biodritin-Polymernetzwerks, das ein Biodritin-Heteropolysaccharid umfaßt, wird eine Lösung aus GAG, z.B. ein Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 mit einem Alginat, z.B. Natriumalginat, durch kovalente Bindung über eine Reaktion mit einem Verbindungsmolekül, wie Divinylsulfon verknüpft; die Reaktion findet vorzugsweise im alkalischem Medium statt. Bei der Ausführung der Erfindung kann man ein Verfahren einsetzten, um die Kalziumbindungsstellen des Alginats, die auch als „Eierkarton"-Stellen bezeichnet werden, zu schützen, so daß an diesen Stellen während der Verknüpfungsreaktion mit dem Verbindungsmolekül, z.B. Divivylsulfon, und GAG, z.B. Chondroitinsulfat, keine Reaktion auftritt. Man kann auch ein Verfahren einsetzten, um die verbleibenden aktiven Vinylgruppen in Biodritin nach dem Verknüpfen durch eine Reaktion mit einem Alkanolamin, wie Ethanolamin, vorzugsweise bei alkalischem pH zu entfernen. Und man kann ein Verfahren zur Reinigung des Biodritins nach der Synthesereaktion einsetzten, das die Entfernung des Kalziums nach der Synthesereaktion mit einem Molekül, das an Kalzium bindet oder es konjugiert, z.B. EDTA vorzugsweise gefolgt durch eine Präzipitation(en) mit einem Alkohol wie Ethanol beinhaltet.
Die Erfindung betrifft auch ein weiteres Verfahren, um ein Biodritin-Polymernetzwerk herzustellen, das eine dehydrothermale Quervernetzung eines Gemisches der Polymere, die ein Biodritin-Heteropolysaccharid bilden, umfaßt. Die dehydrothermale Reaktion kann die eines trockenen Kuchens, wie GAG, z.B. Chondroitinsulfat und Alginat, z.B. Natriumalginat umfaßt, sein. Der Kuchen kann durch das Gefriertrocknen einer Lösung, die Chondroitinsulfat und Natriumalginat in den richtigen Konzentrationen enthält, hergestellt werden. Die Kalziumbindungsstellen des Alginats können vor der dehydrothermalen Behandlung durch das Hinzufügen von Kalziumionen, um an die „Eierkarton"-Stellen des Alginats zu binden, geschützt werden. Das Kalzium kann aus dem „Eierkarton"-Komplexen durch die Behandlung des dehydrothermalen Reaktionsprodukts mit einem Material, das mit Kalzium komplexiert oder konjugiert oder daran bindet, z.B. Natrium-EDTA, entfernt werden. Die Reinigung kann wie oben diskutiert sein.
Für die Erleichterung der Bezugnahme können Biodritin-Polymernetzwerke und Biodritin-Heteropolysaccharide auch als „Biodritin" oder „Biodritin-Produkte" bezeichnet werden.
Eine bedeutende Verwendung von Biodritin-Produkten und/oder Produkten, die davon abgeleitet sind, besteht bei Anwendungen, bei denen die Biokompatibilität mit Wirtsgeweben und/oder die Immunisolierung Probleme darstellen, beispielsweise bei der Zelleinkapslung wie bei der Immunisolation durch Mikroeinkapslung von Langerhansschen Inselzellen für die Kontrolle von Diabetes oder von anderen Zelltypen oder Geweben. Ein Biodritin-Gel, das aus Biodritin-Heteropolysaccharid gebildet wird oder das aus einem Biodritin-Polymernetzwerk besteht (z.B. ein Gel, das mindestens ein Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitin-4 und/oder -6 und mindestens ein Alginsäuresalz umfaßt, wobei mindestens ein Glukosaminoglykan und ein Alginsäuresalz quervernetzt sind, und das Glukosaminoglykan und das Alginsäuresalz optional (und vorzugsweise) kovalent gebunden sind, vorzugsweise über eine Reaktion, die ein Verbindungsmolekül, wie ein Divinylsulfon, beinhaltet und die Quervernetzung nach der kovalenten Bindung oder davor ausgeführt werden kann; im allgemeinen ein Biodritin-Produkt oder ein Produkt aus einer Reaktion mit Biodritin) kann verwendet werden, um Perlen oder Mikrokapseln, die Zellen oder Gewebe für die Implantation enthalten, zu bilden. Und somit betrifft die Erfindung solche Perlen oder Mikrokapseln und Verfahren für die Herstellung und die Verwendung solcher Perlen oder Mikrokapseln.
Die Biodritin-Produkte und/oder Produkte davon können auch „gestrichen", gesprüht oder auf oder oben auf Wunden, zum Beispiel auf chirurgischen Wunden oder Nähten angewendet werden, und können verwendet werden, um Operations-, Überwachungs- oder andere Ausrüstungsgegenstände zu beschichten, um eine lokale Reaktion, Verletzung oder Irritation zu vermeiden. Der Fachmann kann diese ohne unzumutbare Experimente unter Berücksichtigung der hierin enthaltenen Offenbarung und der Kenntnis im Stand der Technik und typischen Faktoren, wie Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand des Patienten etc. oder der Natur der zu beschichtenden Ausrüstung, anwenden. Die Biodritin-Produkte und/oder Produkte davon dienen als Matrixmaterial für das unterstützen von Zellen für die Kultivierung oder für andere Anwendungen, in denen die Zellen einen suspendierten oder nicht-aggregierten Zustand bewaren müssen. Demgemäß betrifft die Erfindung „Farben", Sprays und Matrizen, die Biodritin-Produkte und/oder Produkte davon umfassen, und Verfahren für deren Herstellung und Verwendung.
Das neue Heteropolysaccharid, das gemäß der Erfindung hergestellt wird, und Produkte davon, sowie das halbdurchdringende Polymernetzwerk, d.h. das Biodritin-Heteropolysaccharid und Produkte davon und das Biodritin-Polymernetzwerk benutzen: die Biokompatibilität von Glukosaminoglykanen (GAG) vorzugsweise einer besonderen Gruppe der Glukosaminoglykane nämlich denen, die keine definierte Zellbindungseigenschaften aufweisen, vorzugsweise Chondroitinsulfat-4 und/oder -6, hierin als CIS bezeichnet; und die wünschenswerten Eigenschaften von Algenpolysacchariden und/oder Alginsäure, vorzugsweise in der Form eines Salzes der Alginsäure, z.B. M⁺-Alginat^-, wobei M ein Kation, wie ein Metallkation bedeutet, das als ein stoichiometrisches Gegenion dient, um die negativen Ladungen des Alginations auszugleichen, z.B. ein Metall der Gruppe I wie Natrium, Lithium oder andere Kationen, z.B. organische und komplexe Kationen, zum Beispiel Ammonium. Vorzugsweise ist das Gegeni on Natrium und das Salz der Alginsäure ist Natriumalginat, das dazu in der Lage ist in der Gegenwart von Kalziumionen unbegrenzte Gelnetzwerke zu bilden.
Die Chondroitinsulfate-4 und -6 sind bevorzugt, da sie dazu in der Lage sind, aufgrund der folgenden Charakteristika eine Biokompatibilität zu verleihen: ihrer Allgegenwart in tierischen Geweben als Bestandteile der extrazellulären Matrix oder ihrer Verknüpfung mit Proteinen auf Zelloberflächen, das Fehlen einer Immunogenität; und ihrer scheinbaren Unfähigkeit spezifisch an bekannte Rezeptoren oder Zelltypen zu binden. Diese Eigenschaften gekoppelt mit der Bildung einer kovalenten Bindung und mit den Gelbildungseigenschaften von Salzen der Alginsäure bilden die Grundlage für die vorliegende Erfindung. Obwohl Alginat in Zell- und Gewebeeinkapplungsstudien verwendet wird, gibt es im Hinblick auf das Ausmaß seiner Biokompatibilität (deVos et al., 1996) eine beträchtliche Diskussion. Die vorliegende Erfindung räumt diese Hindernisse durch die Verknüpfung von Alginat und CIS durch stabile chemische Bindung oder in physikalischen Gelen, z.B. in halbdurchdringenden Polymernetzwerken in einem solchen Maße aus, daß die gewünschten Eigenschaften jedes einzelnen bewahrt werden können und nützlich werden.
Somit betrifft die Erfindung im allgemeinen Verfahren zur Herstellung eines Heteropolysaccharids, vorzugsweise aus der kovalenten Bindung zwischen mindestens einem Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und mindestens einem Alginat oder einem Alginsäuresalz, z.B. einem das Gele bildet, wie unbegrenzte Gele in der Gegenwart von Kalziumionen beispielsweise Natriumalginat, vorzugsweise mit einer Kopplungsreaktion mit einem Verbindungsmolekül, z.B. DVS.
Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren für die Herstellung einer Formulierung, die mindestens ein Alginat und Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 vermischt in einer Lösung und polymerisiert oder quervernetzt umfaßt, um ein physikalisches Gel oder ein Polymernetzwerk durch das Hinzufügen eines Polymerisierungs- oder Quervernetzungsmittels, z.B. Kalziumionen, zu bilden; z.B. ein Gel oder ein Polymernetzwerk, das ein halbdurchlässiges Polymernetzwerk ist. Somit betrifft die Erfindung Verfahren für die Herstellung einer Formulierung, umfassend ein Gel oder Verfahren für die Herstellung eines Polymernetzwerks aus der Polymerisierung oder Quervernetzung eines Gemisches, das mindestens ein Alginat und mindestens ein Glukosaminoglykan umfaßt; beispielsweise eine Formulierung umfassend ein Gel oder ein Polymernetzwerk durch das Hinzufügen von Kalziu mionen zu einem Gemisch, das mindestens ein Alginat und mindestens ein Glukosaminoglykan umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren für die Herstellung einer Formulierung, umfassend ein Gel aus der kovalenten Bindung und Quervernetzung und der Polymerisierung eines Gemisches, das mindestens ein Alginat und mindestens ein Glukosaminoglykan umfaßt; beispielsweise ein Gel aus dem Hinzufügen von Kalziumionen zu den erfindungsgemäßen Heteropolysaccharid oder einem Gel aus dem Unterziehen eines erfindungsgemäßen Gels oder Polymernetzwerks, einer Kopplungsreaktion wie einer Kopplungsreaktion, die eine Verbindungsmolekül, wie DVS beinhaltet. Die letztere Sorte Gel weißt aufgrund der Verknüpfungen durch eine kovalente Bindung über das Verbindungsmolekül und die dieser vorausgehenden Quervernetzung oder Polymerisierung ein stabilisiertes Netzwerk auf.
Die Erfindung betrifft des weiteren Verfahren für die Herstellung einer Formulierung, die eine Kombination (Gemisch) des erfindungsgemäßen Heteropolysaccharids und/oder Gels davon und eine erfindungsgemäße Formulierung oder ein Gemisch der erfindungsgemäßen Formulierung, z.B. ein Gemisch der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Gele, umfaßt.
Daher betrifft die Erfindung noch allgemeiner:
Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung, die mindestens ein Glukosaminoglykan und mindestens ein Alginat umfaßt, wobei das mindestens eine Glukosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert ist (sind), z.B. ist das Alginat quervernetzt oder polymerisiert, beispielsweise durch das Hinzufügen eines anorganischen Salzes, wie eines Kalziumsalzes; oder
das mindestens eine Glukosaminoglykan und das Alginat sind kovalent gebunden, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion, die ein Verbindungsmolekül, wie DVS, beinhaltet oder das mindestens eine Glukosaminoglykan und/oder das Alginat sind quervernetzt oder polymerisiert, z.B. ist das Alginat quervernetzt oder polymerisiert, beispielsweise durch das Hinzufügen eines anorganischen Salzes, wie eines Kalziumsalzes, und das mindestens eine Glukosaminoglykan und das Alginat sind kovalent gebunden, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion, die ein Linkermolekül, wie DVS, beinhaltet und die kovalente Bindung kann vor der Quervernetzung oder der Polymerisierung oder umgekehrt durchgeführt werden; und
Gele, die Zusammensetzungen umfassen; Gemische solcher Gele oder von mindestens einem solchen Gel und mindestens einer solcher Zusammensetzung; und
Verfahren für die Herstellung solcher Zusammensetzung und Gele; und
Verfahren für die Verwendung solcher Zusammensetzung und Gele umfassend die Verwendung als „Farben", Sprays, Matrizen, Perlen, Mikrokapseln; und
Produkte, die die Zusammensetzung oder das Gel umfassen, z.B. „Farben", Sprays, Matrizen, Perlen, Mikrokapseln.
Eine Biodritin-Heteropolysaccharidlösung wird durch das Tropfen der Lösung in eine Kalziumchloridlösung zu Gelmikrokapseln umgewandelt. Eine Biodritin-Heteropolysaccharidlösung wird durch das In-Kontakt-bringen des Biodritin-Heteropolysaccharids und der Kalziumchloridlösung zu einem Block jeder gewünschten Form modelliert und somit durch das Gelieren des Biodritins in den Formen der gewünschten Gestalt, so daß die Gestalt des Gels wie gewünscht verändert werden kann. Die Gelmikrokapseln oder der Block können darin Langerhanssche Inselzellen aufweisen.
Biodritin kann auch in eine „Spaghetti"-ähnliche Struktur geformt werden, die durch die Extrusion einer Biodritin-Heteropolysaccharidlösung über einen Faden, z.B. durch eine zylindrische Katheterröhre, die innen ein Baumwoll- oder chirurgischen Faden enthält, hergestellt werden. Die Biodritin-Lösung wird zusammen mit dem Faden in eine Lösung extrudiert, die Kalziumionen enthält, wobei sich unmittelbar ein Gel bildet, das den Faden enthält. Das Gel wird dann in einer Kalziumionenlösung reifen gelassen. Man kann dann eine schützende äußere Schicht, zum Beispiel aus Poly-Lysin/Biodritin über den Biodritin-Spaghetti bilden, um der Vorrichtung eine begrenzte Permeabilität zur Verfügung zu stellen. Die Strukturierung der Spaghettivorrichtung erfolgt durch den Faden im Inneren und setzt sich davon weiter in den umgebenden Gelzylinder, zum Beispiel durch laterale Verlängerung des Fadens oder durch die, die auf der Oberfläche des Fadens durch das Kratzen beispielsweise durch eine Messerschneide hervorgerufen werden, fort.
Eine Biodritin-Spaghettischnur kann für die Implantation von Zellen oder darin enthaltenen Geweben zum Beispiel von den lateralen Verlängerungen verwendet werden; oder mehr als eine Biodritin-Spaghettischnüre kann unter Zusammenbinden an jedem Ende verwendet werden. Die Schnüren können des weiteren in ein biokompatibles Material eingeführt werden, so daß die Biodritin-Spaghettischnüre gegenüber den mechanischen Belastungen der Implantation geschützt sind. Und diese Schnürenvorrichtungen können als Mittel für die Implantation von Zellen oder Geweben in Menschen oder Tieren für die Verhinderung oder Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, wie das für Langerhanssche Inselzellimplantate für die Diabetes-Behandlung der Fall ist.
Der Fachmann kann eine Zusammensetzung, die Zellen, wie Inselzellen enthält, ohne unangemessene Experimente unter Berücksichtigung der typischen Faktoren, wie dem Alter, dem Geschlecht, dem Zustand etc. des Patienten und der Rate der Sekretion des gewünschten Expressionsprodukts der Zellen, z.B. Insulin (siehe auch USSN 08/417,652, die am 5. April 1995 eingereicht wurde, hierin durch Verweis aufgenommen) transplantieren.
Somit betrifft die Erfindung diese Produkte und Verfahren für deren Herstellung und Verwendung.
Analoge Verfahren können verwendet werden, um Produkte aus Biodritin-Polymernetzwerken herzustellen; und die Erfindung bezieht sich demgemäß auf diese Produkte und Verfahren für deren Herstellung und Verwendung.
Im Hinblick auf Glukosaminoglykane, wie Heparansulfat, Heparin und Hyaluronsäure sind diese für die Erfindung nicht bevorzugt, da sie definierte Zellbindungseigenschaften aufweisen können. Im Hinblick auf ein Material, das definierte Zellbindungseigenschaften aufweist, die es für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ungeeignet machen, bindet die Hyaluronsäure spezifisch an CD-44, der auch als „Lymphozytenzielrezeptor" (Hermes-Antigen) oder „Haupt-Hyaluronsäurerezeptor von Säugetierzellen" (Aruffo et al., 1990) bekannt ist. CD-44 wird auf den Oberflächen der meisten Säugetierzellen, auf hämatopoietischen Nagetier- und Primatenzelltypen, auf Fibroblastoiden, auf neuralen und Muskelzellen (Rosenmann and St. John, 1993) exprimiert. Die Hyaluronsäure bindet auch an Versican, einem großen Proteoglykan, das durch Fibroblasten sekretiert wird, das die Zelladhäsion durch die Interak tion mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix und Zelloberflächenglykoproteinen fördert (Zimmermann, 1993).
Des weiteren ist es im Hinblick auf die Verwendung von Materialien, die ungewünschte definierte Zellbindungseigenschaften aufweisen, für Heparin auch nicht bevorzugt in der Zusammensetzung mit Alginat verknüpft zu sein, aufgrund seiner gut bekannten Inhibition des Blutverklumpungsmechanismus. Heparansulfat ist aufgrund seiner Teilnahme an Zell-Zelladhäsionsmechanismen auch nicht bevorzugt. Heparansulfat ist mit einem Membrangebundenen Proteoglykan, das NCAM (Neurales Zelladhäsionsmolekül) bindet, verknüpft, wodurch die homophile Zelladhäsion gefördert wird (Cole et al., 1986). Die Heparansulfat-Bindungsdomäne des Fibronectins ist für die Bindung von Neuronen, Lymphozyten und anderen Zelltypen an Fibronectin im Prozeß der Zell-Zelladhäsion verantwortlich (Liao, et al., 1988). Des weiteren sind Heparansulfatproteoglykane, die auf Zelloberflächen und in der extrazellulären Matrix gefunden werden, Bindungsstellen für den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) (Moscatelli et al., 1988).
In dem so etabliert wurde, daß CIS für die Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung das wünschenswerteste Glukosaminoglykan ist, bilden sich die erfinderischen Heteropolysaccharide, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, aus den stabilen kovalenten chemischen Bindungen zwischen Strukturen aus mindestens einem Alginsäuresalz, z.B. Natriumalginat, und mindestens einem Glukosaminoglykan, z.B. CIS beispielsweise durch eine Kopplungsreaktion mit Divinylsulfon DVS. Diese Reaktanten können ein neues neo-Heteropolysaccharidkonjugat, das die gewünschten Eigenschaften für die Verwendung der Zell- und Gewebebiologie aufweist, erzeugen wenn immer Biokompatibilität oder Immunisolation entscheidene Probleme darstellen. In derselben Weise kann ein halbdurchdringendes Polymernetzwerk durch das Mischen von CIS und Alginat mit den gewünschten Konzentrationen und durch die Bildung eines Gels durch das Hinzufügen von Kalziumionen hergestellt werden, daß zu den erfindungsgemäßen Heteropolysacchariden ähnliche Eigenschaften und Vorteile aufweist.
Somit betrifft die Erfindung mindestens zwei Verfahren.
Erstens stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Heteropolysaccharids zur Verfügung, das die kovalente Bindung mindestens eines Glukosaminoglykans, z.B. CIS oder mindestens eines Alginsäuresalzes, z.B. Natriumalginats vorzugsweise durch eine Kopplungsreaktion mit einem Verbindungsmolekül, z.B. DVS umfaßt, so daß die Kalziumbindungsstellen im Alginat während der Kopplungsreaktion bewahrt und/oder konserviert werden. Diese Stellen stellen die Flexibilität der Verwendung des Heteropolysaccharids als Sol oder als Gel der gewünschten Stärke oder als eine Zusammensetzung, die eine anpaßbare Viskosität aufweist, zur Verfügung; und die vorliegende Erfindung betrifft solche Produkte aus dem Heteropolysaccharid und ein Verfahren für deren Herstellung und Verwendung, z.B. durch das In-Kontakt-bringen mit Ionen, wie Kalziumionen, um ein Gel beispielsweise als unbeschränktes Gel herzustellen.
Das zweite Verfahren bildet ein physikalisches Gel, z.B. vom Typ des Halb-Durchdringungspolymernetzwerktyps durch das Hinzufügen eines Polymerisierungs- oder Quervernetzungsmittels, z.B. Kalziumionen zu einer Lösung, die sowohl mindestens ein Alginat als auch mindestens ein Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 enthält. Dieses Gel kann eine Zusammensetzung sein, die variiert werden kann, um für spezifische Anwendungen geeignet zu sein. Das erfindungsgemäße s-IPN-Gel ist stabil und wird durch die Komplexierung von Kalziumionen mit Polyguluronblöcken des Alginats, um „Eierkarton"-Strukturen zu bilden, die das Gel stabilisieren, gebildet. Des weiteren kann innerhalb der gerade ausgeführten Prinzipien eine weitere Formulierung durch die geeignete Kombination der oben beschriebenen Formulierungen zubereitet werden, in dem eine gegebene Menge des kovalent gebundenen Heteropolysaccharidkonjugats in Lösung mit Alginat und CIS gemischt wird, wobei zu der Lösung Kalziumionen hinzugefügt werden, um ein Gel zu bilden.
Gleichermaßen kann eine andere Formulierung zubereitet werden, indem das erfindungsgemäßen Gel einer Verknüpfungsreaktion unterzogen wird, um Glukosaminoglykan- und Alginat-Einheiten miteinander kovalent zu verknüpfen, zum Beispiel indem ein Gel einer Kopplungsrekation, die ein Verbindungsmolekül, wie DVS, beinhaltet, unterzogen wird.
Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendungen von Gelen und Zusammensetzungen, die zu Gelen geformt werden können, insbesondere zu biokompatiblen Gelen, wie in „Farben", Sprays, Matrizen, Perlen und Mikrokapseln und ähnlichem, die auch neue Verwendungen wie ein „Spaghetti"-ähnliches Material umfassen, das ein Rückrat, z.B. eine Naht oder einen Faden, der damit verbunden ein gewünschtes Material, z.B. Zellen aufweist, die mit dem Rückrat verbunden sind und ein erfindungsgemäßes Gel, das das Rückrat zum Beispiel in einer zylindrischen Weise umgibt.
Dokumente sind in dieser Offenbarung mit einem vollem Zitat für jedes erscheinen zitiert. Diese Dokumente betreffen den Stand der Technik, den diese Erfindung betrifft.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zellen und Gewebe können durch drei grundlegende Verfahren immobilisiert und immunisoliert werden: In extravaskulären Kammern isoliert aber im Weg des Blutstroms, in kugelförmigen Dispersionen oder Mikrokapseln und innerhalb von Mikrokapseln. Unter Verwendung dieser Verfahren ist eine Vielzahl von Zellen und Geweben verschiedener Tiere immunisoliert worden und in Tiere für die Entwicklung therapeutischer Systeme implantiert worden (übersichtsartig dargestellt durch Christenson et al. (1993)). Tatsächlich sind zukünftige Anwendungen immunisolierter Zelltherapie für Erkrankungen oder Zustände, wie Diabetes, Hämophilie, Leberversagen, Alzheimer-, Parkinson- und Huntington-Erkrankungen, affektive Erkrankungen, Leberversagen und Fertilitätsproblemen vorausgesehen worden (Christenson et al., 1993). Eine vollständige Übersicht über die Fragen, die mit der Verkapslung und Immunisolierung verknüpft sind, wird in einem aktuellen von Goosen (1993) editierten Buch dargestellt.
Im Falle von Diabetes mellitus ist nach Alternativen zu täglichen Insulininjektionen für die Kontrolle der Typ-I-Diabetes oder der Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (IDDM = „insulin-dependent diabetes mellitus") gesucht worden. Diese umfaßten Pankreastransplantate, Pumpen um Insulin durch ein kontrolliertes Programm zu verabreichen und kürzlich die Transplantation von Langerhansschen Inseln. Ein Überblick über Implantate für eine langanhaltende Freisetzung, für die Insulinverabreichung, ist publiziert worden (Wang, 1991).
Mehrere Wissenschaftler haben verschiedene Ansätze vorgeschlagen, um das Inselzellgewebe von dem Angriff des Wirts nach der Transplantation zu schützten. Diese umfaßten die Einkapslung von Inselzellen in verschiedene Materialien, so daß das Insulin sekretiert werden kann, aber die β-Zellen in dem Inselgewebe vom Wirt immunologisch isoliert sind. Polysaccharide sind vorgeschlagen worden, um Membranen zu bilden, wie das der Fall für Agarose durch Howell et al. (1982) ist oder Alginat durch Tze und Tai (1982). Die verwendeten Mate rialien umfassen synthetische Polysäuren und Polybasen, Gelatine und Polyaminosäuren (Young et al., 1989) sowie verschiedene Polysaccharide: chemisch modifiziertes Dextran, um polyionisch verbundene Kapseln zu bilden (Lim und Hall, 1988, PCT Int. Anmel. WO 8,800,327), Einschluß in Alginat gefolgt von der Stabilisierung mit Polylysin und Alginat (Chang und Wong, 1992, US 5,084,350 ) sowie die Kombination von Chitosan und Carboxymethylzellulose, um Kapseln kontrollierter Permeabilität zu bilden (Shioya und Hirano, 1990 US 5,089,272 ).
Zusätzlich zeigte eine kürzliche Arbeit, die sich mit der Regeneration von Haut in Kultur beschäftigte, die Bedeutung der Rolle von GAG in dem Prozeß in Studien auf, bei denen Gemische aus Kollagen und GAG als Träger verwendet wurden (Murphy et al., 1990; Yannas et al., 1990). In gleicher Weise erzeugten Keratinozyten und Fibroblasten, die auf einem Nylonnetz wuchsen, eine Dermis-ähnliche Matrix, die Proteoglykane enthielt (Slivka et al., 1993).
Die Bedeutung der extrazellulären Matrixbestandteile für die normale Entwicklung des Hautsystems unterstützt eine Grundlage der vorliegenden Erfindung, z.B. das fremde Moleküle kombiniert oder mit bestimmten GAGs strukturiert, z.B. vorzugsweise CIS, im Falle dieser Erfindung ideale Schutzmaterialien bei der Transplantation oder Implantation von Zellen oder Geweben menschlichen oder tierischen Ursprungs, zum Zwecke der Behandlung oder der Kontrolle einer Erkrankung, darstellen. Der vorherige Stand der Technik versäumt es jedoch, die bestimmten Heteropolysaccharidpolymernetzwerke und Produkte davon und Prozesse und Verwendungen dieser Erfindung zu lehren oder nahezulegen.
Des weiteren sind sie wesentliche Bestandteile der extrazellulären Matrix in Bindegeweben, von Zellmembran und der Endothelauskleidung und das gesamte Vorhandensein der GAGs zeigt deren Wichtigkeit bei der Matrixbildung und -verlängerung bei Zell-Matrix und Zell-Zellwechselwirkungen auf. Obwohl die GAGs in Organismen in erster Linie mit Proteinen verknüpft als Proteoglykane auftreten, ist gezeigt worden, daß nur der Proteinteil immunogen ist; das Glukosaminoglykan, z.B. die CIS-Komponente, ist selbst nicht immunogen (Hirschmann und Dziewiatkowski, 1966; Loewi und Muir, 1965).
Die Verwendung von GAG mit einem Alginatsalz, beispielsweise GAG-Alginatbiomolekülen, z.B. über eine Kopplungsreaktion mit einem Verbindungsmolekül, um ein Heteropolysaccharidkonjugat und Produkte davon zu bilden und Verfahren und Verwen dung der Erfindung sind bisher nicht gelehrt oder nahegelegt worden. Darüber hinaus ist die Bildung eines Polymernetzwerks, z.B. eines halbdurchdringenden Polymernetzwerks, beruhend auf den zwei Bestandteilen Alginat und GAG, z.B. CIS, das durch das Hinzufügen von Ionen wie anorganische Ionen, z.B. Kalziumionen, in eine Gel-Form gebracht werden, nicht im Stand der Technik gelehrt oder nahegelegt worden. Es ist auch kein Polymernetzwerk, das ein Heteropolysaccharid, das aus der Kopplung von GAG-Alginat entstanden ist, das in einem GAG-Alginatpolymernetzwerk vorhanden ist, umfaßt, vorher gelehrt oder nahegelegt worden.
Im Falle der Diabetes wird die Ernsthaftigkeit des Interesses daran, den besten Weg für die Verwendung von Inselzellen bei der Transplantation zu entdecken durch zwei kürzlich veröffentlichte Publikationen demonstriert, von denen die eine von der Lagerung und Konservierung von Inseln (Jindal und Gray, 1994) und die andere von der Wirkung von Prednison auf die Inselautotransplantatfunktion (Rodrigues Rilo et al., 1994) handelt.
Das U.S. Patent Nr. 4,409,331 von Lim betrifft die Verkapslung von Inseln in einem polymeren Material, das aus Alginat und Polylysin gebildet wurde; Lim und Sun (1980) diskutieren die Mikroeinkapslung von Inseln, um eine bioartifizielle Bauchspeicheldrüse zu bilden. Chitosanmikrokugeln wurden entwickelt, die an die GAG-Rezeptoren auf Zelloberflächen binden (Gallo et al. U.S. 5,129,877). Die Kollagen-GAG-Mikrokapseln wurden als Arzneistoffverabreichungssysteme vorgeschlagen, um antimikrobielle Mittel zu verabreichen (Rase et al. U.S. 5,169,631). Polyacrylate wurden auch als Einkapslungsmaterialien entwickelt und sind auch mit Alginat copolymerisiert worden wie durch Stevenson und Sefton (1993) diskutiert. Die Verwendung von GAG mit einem Alginatsalz, von GAG-Alginatbiomolekülen, z.B. in einem physikalischen Gemisch oder über eine Kopplungsreaktion mit einem Verbindungsmolekül gebunden, um ein Heteropolysaccharid oder ein physikalisches Netzwerk zu bilden, z.B. ein s-IPN, ein Gel und Produkte davon und Verfahren und Verwendungen der Erfindung sind nicht gelehrt oder nahe gelegt.
Es wird jedoch betont, daß zuvor im Stand der Technik GAG nicht als wichtiges Biokompatibilitätsmittel zwischen einer fremden chemischen Struktur oder Vorrichtung und einem Wirtsorganismus, insbesondere einer Zusammensetzung mit einem Alginat gewirkt hat.
Die Synthese und die Eigenschaften von Glykokonjugaten sind in einem Buch, das durch Lee und Lee (1994) editiert wurde, übersichtsartig dargestellt. Die neuen hierin beschriebenen Strukturklassen gehören zu einer Gruppe von Glykopolymeren, die durch Verknüpfung zweier verschiedener natürlicher Heteropolysaccharide durch Reaktion mit einer nicht-natürlichen Verknüpfung, z.B. Divinylsulfon, gebildet werden. Diese neue Klasse die Liste der neo-Glykokonjugate, die durch Magnusson et al. (1994) zusammen gestellt wurde, unter der Überschrift „Glykopolymere mit Gel-bildenden Eigenschaften" aufgenommen werden.
Auf der anderen Seite gehört das physische Gel, das durch das Hinzufügen von Kalziumionen zur Lösung, die veränderlicher Konzentrationen von GAG, z.B. CIS und Alginat enthalten gebildet wird, zu der Gruppe von Polymeren, die als halbdurchdringende Polymernetzwerke bekannt sind, welche kürzlich durch LaPorte (1997) diskutiert wurden. In dieser Kategorie wird ein Polymertyp durch einen zweiten Polymertyp verstrickt und gefangen, der quervernetzt ist, um die Struktur zu stabilisieren.
Daß die Zusammensetzungen der Erfindung jedoch als „Glykopolymere mit Gel-bildenden Eigenschaften" oder als „Polymernetzwerk", z.B. „ein halbdurchdringendes Polymernetzwerk", charakterisiert werden können, bedeutet nicht, daß die Erfindung bisher gelehrt oder nahegelegt wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Herstellung eines neuen Heteropolysaccharidkonjugats oder -komplexes, von davon abgeleiteten Gelen und/oder Solen und für die Synthese, Reinigung und Verwendung des neuen Glykopolymers und/oder Heteropolysaccharids und/oder von Gelen, Lösungen und/oder Solen, die hierin als Biodritin bezeichnet werden, zur Verfügung. Das Heteropolysaccharid wird vorzugsweise durch kovalente Bindung zwischen mindestens einem Glukosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und mindestens einem Alginsäuresalz, z.B. so daß ein Gel und/oder ein Sol zum Beispiel in der Gegenwart eines geeigneten Gegenions, z.B. Kalziums, gebildet wird.
Eine weitere Formulierung, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, verbindet die zwei Polysaccharide Alginat und GAG, z.B. CIS, in wäßrigen Lösungen, die variable Konzentrationen jedes Bestandteils aufweisen durch die Bildung eines Gels des Halbdurchdringungs-Polymernetzwerktyps durch das Hinzufügen eines Quervernetzungs- oder Polymersierungsmittels, z.B. von Kalziumionen. Eine dritte Formulierung verbindet die zwei Konzepte in derselben Zubereitung in geeigneten Proportionen, die durch den Fachmann ohne unzumutbare Experimente auf Grundlage dieser Offenbarung und dem Wissen im Stand der Technik bestimmt werden können.
Daher stellt die Erfindung Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Verfügung, die mindestens ein Glukosaminoglykan, z.B. CIS und mindestens ein Alginat, z.B. Natriumalginat umfaßt, wobei:
das mindestens eine Glukosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert sind, z.B. das Alginat ist quervernetzt oder polymerisiert beispielsweise durch das Hinzufügen eines anorganischen Salzes, wie ein Kalziumsalz; oder
das mindestens eine Glukosaminoglykan oder Alginat kovalent gebunden sind, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion an der ein Linkermolekül wie DVS beteiligt ist; oder
das mindestens eine Glukosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert sind; z.B. das Alginat beispielsweise durch das Hinzufügen eines anorganischen Salzes wie ein Kalziumsalz quervernetzt oder polymerisiert ist; und
das mindestens eine Glukosaminoglykan und das Alginat kovalent gebunden sind, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion an der ein Verbindungsmolekül wie DVS beteiligt ist und die kovalente Bindung vor dem Quervernetzen oder der Polymerisierung oder anders herum durchgeführt worden ist; und
Gele, die diese Zusammensetzung umfassen, Gemische solcher Gele oder von mindestens einem solchen Gel und mindestens einer solchen Zusammensetzung; und
Verfahren für die Herstellung solcher Zusammensetzungen und Gele; und
Verfahren für die Verwendung solcher Zusammensetzungen und Gele, die „Farben", Sprays, Matrizen, Perlen, Mikrokapseln umfassen; und
Produkte, die die Zusammensetzung oder das Gel, z.B. „Farben", Sprays, Matrizen, Perlen, Mikrokapseln umfassen.
Die Zusammensetzung kann durch das Mischen von 0,5% bis 5,0% z.B. 1% bis 3% nach Gewicht oder Volumen des Alginats z.B. Natriumalginats und etwa 1,0% z.B. 1,5% oder 2,0% bis zu 20% zu 30% z.B. 25% nach Gewicht oder Volumen des GAG, z.B. CIS erhalten werden. Das bedeutet im allgemeinen, daß bei der Bildung der Zusammensetzungen das Alginat zu GAG-Verhältnis 0,5:30 betragen kann, aber vorzugsweise ist drei-(3)- bis vier-(4)-mal mehr GAG als Alginat (nach Gewicht oder Volumen) vorhanden, d.h. ein bei der Bildung der Zusammensetzung bevorzugtes Alginat zu GAG-Verhältnis ist 1:3 bis 1:4. Die Alginate sind in veränderlicher Viskosität, z.B. hoher Viskosität, mittlerer Viskosität erhältlich. Alginate mit mittlerer Viskosität sind bevorzugt, da Alginate hoher Viskosität zu festeren Perlen führen können. Des weiteren kann die Menge des bei der Bildung der Zusammensetzung verwendeten Alginats durch die Viskosität des Alginats beschränkt werden; wobei ein Alginat mittlerer Viskosität mit 5% Alginat nach Gewicht oder Volumen recht viskos ist. Des weiteren kann der Fachmann ohne weiteres erkennen, daß das Volumen und die Viskosität oder Härte der Zusammensetzungen, Gele und der Produkte davon z.B. Perlen etc. ohne unzumutbare Experimente durch die Variation der Menge des GAG, z.B. CIS und des Alginats, z.B. Natriumalginats variiert werden können. Beispielsweise wird, wenn eine weichere Zusammensetzung, ein Gel oder ein Produkt, das ein größeres Volumen hat, erwünscht ist, mehr GAG eingesetzt, die Menge des GAGs nach Gewicht oder Volumen wird erhöht; und wenn die physikalische Resistenz, Härte und ähnliche Eigenschaften gewünscht werden, wird mehr Alginat verwendet, d.h. die Menge des Alginats nach Gewicht oder Volumen wird erhöht.
Wenn ein Verbindungsmolekül bei der Bildung der erfindungsgemäßen Verbindung verwendet wird, kann es in einer Menge relativ zu der Menge des Alginats oder zu der Menge des vorhandenen GAGs verwendet werden, z.B. in einer Menge von 50% bis zur gleichen Menge nach Gewicht, Volumen oder stöichiometrisch zu der Menge des vorhandenen Alginats oder zu der Menge des vorhandenen GAGs oder zweifach oder dreifach das Gewicht, Volumen oder die stöichiometrische Menge des vorhandenen Alginats oder GAGs. Wenn ein anorganisches Ion bei der Bildung einer Zusammensetzung der Erfindung als Quervernetzungs- oder Polymerisierungsmittel verwendet wird, ist das anorganische Ion vorzugsweise ein Kalziumion, z.B. Kalziumchlorid, das in einer Menge relativ zu der Menge des vorhandenen Alginats zum Beispiel in einer Menge von etwa 0,05% bis 2,0% nach Gewicht oder nach Volumen, z.B. etwa 1,0% nach Gewicht und nach Volumen verwendet werden kann.
Die Gele können im wesentlichen kovalent oder teilkovalent oder zum Teil durchdringend sein. Aus der Analyse der erfindungsgemäßen Gele, z.B. zeigt die HPLC-Analyse Banden, die zu Alginat, CIS und einer kovalenten Struktur korrespondieren, wird vermutet, daß die Gele der Erfindung durchdringende Netzwerke bilden. Der Anmelder wünscht jedoch nicht durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein.
Biodritin kann auf chirurgische Wunden oder Nähte angewendet werden, um vor dem Anheften zu schützen; es kann auch als Matrixmaterial für das Tragen von Zellen für die Kultivierung oder andere Anwendungen, in denen die Zellen in einem suspendierten oder nicht-aggregierten Stadium gehalten werden müssen, dienen.
Diese und andere Ausführungsformen werden in der folgenden detaillierten Beschreibung beschrieben werden und/oder daraus ersichtlich sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1 zeigt eine chematische Struktur des Biodritins (in rot – auch als „r" markiert gebundene Alginatketten, die mit den Kalziumionen assoziieren, um die „Eierkarton"-Strukturen im Gelstadium zu bilden in blau – auch als „b" markiert, Alginatketten; grün – auch als „g" markiert, DVS-Moleküle, die CIS und Alginat quervernetzen. Das idealisierte Bild am unteren Rand zeigt die an Alginat gebundenen CIS-Moleküle, wobei die „Eierkarton"-Strukturen für den gelierten Zustand charakteristisch sind; die quervernetzten Bindungen haben die Struktur -CH₂-SO₂-CH₂-);
Die 2A zeigt ein, Schema eines Biodritin-Spaghettizylinders, die den strukturierenden Baumwollfaden mit seinen kleinen lateralen Hervorstehungen, den umgebenden Biodritin-Gelzylinder, der die Inseln enthält, die durch runde oder ovale schwarze Punkte dargestellt werden, enthält;
2B zeigt eine Wiedergabe einer Gruppe von 9 Biodritin-strukturierten Spaghetti, die zu einem Bündel zusammengebunden sind;
3 ist ein Foto einer Biodritin-Perle mit ihrer äußeren Poly-L-Lysin/Biodritin Kapsel, die drei Monate nach der intraperitonealen Implantation aus einer Maus entfernt wurde (eine saubere und durchscheinende Oberfläche ist deutlich erkennbar); und
4 ist ein Schema der Struktur eines halbdurchdringenden Polymernetzwerks, das aus CIS und Alginat gebildet wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Ohne zu wünschen das Vorangehende notwendigerweise zu beschränken soll das Folgende die Erfindung im Hinblick auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen diskutieren. Es ist nunmehr gefunden worden, daß die chemische Polymerisation eines Algenpolysaccharids der Alginsäure in der Form des Natriumalginats mit einer bestimmten Sorte von Tier-Heteropolysacchariden, z.B. Chondroitinsulfat-4 und -6, CIS, neue Materialien ergibt, z.B. Biodritine, die als neo-Heteropolysaccharidkonjugate klassifiziert werden können, die neue Eigenschaften im Hinblick auf die Ausgangsmoleküle besitzen, während sie die meisten der chemischen Charakteristika beider Ausgansmoleküle bewahren. Die allgemeinen Eigenschaften dieser Klasse von Verbindungen umfassen jede oder alle und vorzugsweise sind alle Biodritine Polyanionen, die sowohl Carboxylat- und Sulfatgruppen tragen (Alginat enthält Carboxylate während Chondroitinsulfat Carboxylate und Sulfate enthält); die Biodritine bilden unbeschränkte Gele, wenn sie mit Kalziumionen behandelt werden, eine Eigenschaft, die durch den Alginatrest beigetragen wird. Biodritine lösen sich ohne weiteres in Wasser auf. Zusätzlich kann die Viskosität der Lösungen durch das Anpassen der Konzentration des Biodritins sowie durch die Konzentration des Kalziums angepaßt werden.
Die Biodritine können auch durch die Polymerisation von CIS und Alginat in gemischten Lösungen durch das Hinzufügen von Kalziumionen hergestellt werden, was zu Bildung stabiler Gele eines halbdurchdringenden Polymernetzwerks führt, in dem der CIS-Bestandteil im Gelnetzwerk, das durch das Kalziumalginat gebildet wird, gefangen ist.
Durch das Hinzufügen von Kalzium in einer ausreichenden Konzentration bilden die Biodritine stabile Gele, da der Syntheseprozeß der Erfindung entworfen wurde, um mit extremer Vorsicht die Kalziumbindungsstellen in dem Alginatbestandteil zu bewahren. Die Gegenwart der Chondroitinsulfatkomponente verleiht auf der anderen Seite den Biodritinen die stärkere negative Ladung der Sulfate und eine Ähnlichkeit zu der extrazellulären Matrix wodurch sie vollständig für die Anwendung unter anderem bei der Transplantation von Zellen und Geweben biokompatibel gemacht werden.
Die Permeabilitätsbarriere der Biodritin-abgeleiteten Materialien können durch die ionische Komplexierung mit positiv geladenen Polymeren wie Poly-L-Lysin oder Poly-L-Ornitin, die eine dünne äußere Kapsel um das Gel bilden, kontrolliert werden. Die Porengröße dieser Kapsel kann wie gewünscht durch die Änderung der Konzentration und des Molekulargewichts des positiv geladenen Polymers während der Kapselbildung angepaßt werden.
Bei der Synthese der Zusammensetzung der Erfindung weist Biodritin vorzugsweise einen GAG-Gehalt auf, der abhängig von den spezifischen Reaktionsbedingungen von 2 bis 200 Gew.% der Alginatzusammensetzung reicht. Die endgültige Zusammensetzung kann durch die Verbindung von Biodritin, das quervernetzt worden ist, mit Biodritin, das durch die gelierung von Alginat gebildet worden ist, in derselben Lösung angepaßt werden. Innerhalb dieses Bereiches können die Verbindungen die gewünschten Eigenschaften für die Verwendung als Transplantationsmaterialien aufweisen. Unlösliche Materialien können auch durch die Kontrolle der Polymerisierungsbedingungen zubereitet werden. Diese können eine Anwendbarkeit als Füllstoffe bei der Gewebereparatur oder als Oberflächen, um das Zellwachstum in Kultur zu erlauben, aufweisen.
Die Oberfläche von Biodritin-Perlen, die gegenüber einem wäßrigen Lösungsmittel ausgesetzt ist, trägt die Funktionalitäten sowohl des Alginats und des Chondroitinsulfats (GAG) Carboxylate, Sulfate, Hydroxyle sowie glykosidische Verknüpfungen und die Sulfongruppe des Quervernetzungsrests; die negativ geladenen Sulfat- und Carboxylatgruppen sind dazu in der Lage starke Ionen-Ionenkomplexe mit Polykationen wie Polylysin oder Poly-Ornitin zu bilden, wodurch den Perlen zusätzliche externe Struktur und Schutz verliehen wird, der in Alginatkapseln beobachtet worden ist. Diese Komplexe, die an der äußeren Oberfläche der Mikrokapsel gebildet werden, helfen auch dabei die Porengruppe zu definieren.
Die viskose Lösung, die durch das Auflösen von Biodritin in Wasser oder einer Salzlösung oder eines anderen gewünschten wäßrigen Mediums erhalten wird, wird leicht handhabbar, insbesondere wenn die Konzentration unter 4% (w/v) gehalten wird und wenn sie nicht gegenüber Kalziumionen ausgesetzt wird. Solche Lösungen können durch die Komplexierung mit Kalziumionen zu unbeschränkten Gelen umgewandelt werden; z.B. erhält man durch das Tropfen dieser aus Spritzen oder Kapilaren in Kalziumchloridlösungen Mikroperlen der gewünschten kugelförmigen Größe. Die weitere Behandlung mit positiv geladenen Molekülen wie Polylysin führt zu einer dünnen äußeren Kapsel, die wiederum durch das Auftragen von Biodritin darauf aus einer verdünnten Lösung geschützt werden kann.
Eine Biodritin-Lösung kann, z.B. aus einer dünnen Röhre direkt in eine Kalziumchloridlösung extrudiert werden, wobei ein Gel in der Form eines Stabs oder Zylinders einem gleichmäßigen Durchmesser erhalten wird. Zellen oder Gewebe können innerhalb dieser Zylinder zum Zwecke der Kultivierung oder der Transplantation gehalten werden.
Das Biodritin-Gel kann auch, z.B. als Platte einer geeigneten Größe und Form, wobei die Zellen oder die Gewebe zum Zwecke der Kultivierung oder Implantation eingeschlossen werden, können geformt werden.
Eine weitere Verwendung des Biodritins besteht im Schutz von frischen Nähten: ein Biodritin-Sol kann „gemalt" oder direkt mit einem sterilen Pinsel oder um einen Nahtbereich gesprüht werden, gefolgt von einem Sprühen mit einer geeigneten Kalziumchloridlösung. Ein weiches schützendes Gel lege sich unmittelbare um den Nahtbereich, was ihn gegen eindringende Zellen durch die Blockierung der Zelladhäsion schützt. Das Biodritin-Gel selbst kann auf eine Naht gesprüht, gemalt oder aufgetragen werden, um sie vor Anhaftungen zu schützen. Der Fachmann kann eine geeignete Viskosität des Gels und die Menge davon, die gesprüht, gemalt oder angewandt wird, ohne unangemessene Experimente aus seiner Kenntnis des Stands der Technik, der hierin enthaltenen Offenbarung und typischen Faktoren, wie der Wunde oder der Naht und dem Zustand des Patienten, bestimmen.
Die chemische Kopplung der zwei Biodritin-Hauptbestandteile vorzugsweise Natriumalginat und Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 wird durch die Reaktion mit einem Verbindungsmolekül z.B. Divinylsulfon, abgekürzt DVS, ausgeführt. Ein Verbindungsmolekül ist ein kleines Molekül, das gegenüber einem nukleophilen Angriff sehr zugänglich ist (siehe USSN 08/417,652, im Hinblick auf andere Sorten der Verbindungsmoleküle und Sorten der Kopplungsreaktionen). Die Reaktion wird bei einem alkalischen pH unter Bedingungen, die es erlauben die Kalziumbindungsstellen im Alginat vor der Reaktion zu schützten, ausgeführt. Das Endprodukt der Quervernetzungsreaktion wird dann löslich gemacht, und kann von den Reagenzien durch Reinigung durch wiederholte Alkoholpräzipitation abgetrennt werden.
Die Konzentration des Verbindungsmoleküls z.B. DVS, das in der Reaktion verwendet wird, kann die Endlöslichkeit des Glykopolymerkomplexes definieren; über einen bestimmten Bereich hinaus bilden sich unlösliche Materialien.
Eine Alternative zu der chemischen Kopplung von CIS und Alginat besteht in der Herstellung von Biodritin durch die Bildung eines physikalischen Gels aus einer Lösung, die beide Polymere in den gewünschten Konzentrationen enthält. Dieses Gel bildet sich, wenn Kalziumionen zugefügt werden und das sich ergebende Gel ist vom Typ eines halbdurchdringenden Polymernetzwerks, s-IPN. In diesem polymeren Geltyp ist die quervernetzte Struktur aus einer Komponente z.B. dem Alginat durch die Bildung der „Eierkarton"-Strukturen, die sich aus der Bindung der Kalziumionen an die Polyguluronblöcke im Alginat bilden, abgeleitet. Das sich ergebende Gelnetzwerk schließt die CIS-Ketten, die mit dem Alginat verflochten sind, ein und hält sie, so daß die CIS-Moleküle als Bestandteil der Gelstruktur zurückgehalten werden, wodurch der Gelstruktur die Eigenschaften des CIS verliehen werden.
Ein Element der Erfindung ist die Fähigkeit des Endprodukts, Biodritin-Gele mit Kalziumionen zu bilden. Dies wird durch das Schützen der Kalziumbindungsstellen im Alginat, die auch „Eierkarton"-Stellen genannte werden, vor der Reaktion mit der Quervernetzungsreagenz während der Synthese der chemisch gekoppelten Variante des Biodritins erreicht. Dies wird durch das Hinzufügen einer geeigneten Kalziumionenmenge zu der Alginatlösung vor der Kopplungsreaktion in einer solchen Weise erreicht, daß die Kalzium-„Eierkarton"-Komplexe vorgeformt werden, wobei eine starke Gelierung vermieden wird und die Lösungskopolymerisationsreaktion nicht blockiert wird.
Früh in den Reinigungsschritten des Endprodukts werden die schützenden Kalziumionen aus den „Eierkarton"-Komplexen entfernt, was die Auflösung der Partikel zur Bildung einer viskosen Lösung erlaubt, die dann wie gewünscht behandelt werden kann.
Die Fähigkeit der Zusammensetzung durch die Manipulation der Kalziumionenkonzentration leicht und rasch von einer Lösung zu einem Gel und von einem Gel zu einer Lösung zu ge hen, ist eine weitere beachtenswerte Eigenschaft der Verbindung und führt zu weiteren Anwendungen dieses neuen Materials außerhalb des Transplantationsbereichs.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die chemische Verbindung des Alginats z.B. Natriumalginat und des GAG, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 durch eine dehydrothermale Reaktion bei Temperaturen von etwa 100°C ausgeführt. In diesem Fall wird DVS nicht verwendet und Esterbindungen werden zwischen den alkoholischen Hydroxylen und den Säuregruppen im Alginat und Chondroitinsulfat gebildet. Auch unter Verwendung der DHT wird ein Schutz der „Eierkarton"-Stellen erhalten und dies ist für den Erhalt der Gelierungseigenschaften des Biodritins nützlich.
Es wird betont, daß aufgrund der Reinigungsschritte nach der Reaktion, kommerziell erhältliche Reaktanten in allen Testserien hierin ohne vorhergehende Reinigung und ohne negative Auswirkungen auf die Eigenschaften des Endprodukts Biodritin verwendet worden sind.
Eine schematische Wiedergabe der komplexen chemischen Struktur des Biodritins wird in der 1 bzw. 4 für das chemisch gekoppelte und das physikalische Gel gezeigt.
Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele werden nur zum Zwecke der Illustration wiedergegeben und sollen nicht als eine Beschränkung der Erfindung angesehen werden, da viele offensichtliche Veränderungen davon möglich sind, ohne vom Geist oder vom Umfang davon abzuweichen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Herstellung der Reaktantenlösungen
Chondroitinsulfat: Das verwendete kommerzielle CIS enthält 70% des 4-Sulfats und 30% des 6-Sulfats; 2,5 g wurde es erlaubt sich in 25 ml 0,1 mol/l Natriumcarbonatlösung aufzulösen, um eine 100 mg/ml Endkonzentration zu ergeben. In anderen Formulierungen wurden höhere Konzentrationen des CIS verwendet, um eine Endkonzentration von 150, 200 oder 250 mg/ml zu ergeben.
Das Natriumalginat (5,0 g) wurde in 45 ml Wasser, das auf 40°C erhitzt war, suspendiert, wonach weitere 30 ml Wasser in 10 ml Teilen hinzugefügt wurden, um die Auflösung zu er möglichen und die Viskosität der Endlösung zu verringern. Die Menge des verwendeten Natriumalginats korrespondiert zu 28,3 mmol/l eines Einheits-Disaccharidrests des Alginats (F. Wt. = 176,2).
Beispiel 2 – Teilweiser Schutz der Kalziumbindungsstellen
Die vollständige Blockierung der Kalziumstellen in der Alginatlösung würde 6,5 ml einer 4,5 mol/l CaCl₂-Lösung erfordern, die praktisch nicht zu verwenden ist. Eine 4,5 mol/l Kalziumstammlösung wurde 1:5 verdünnt und 200 μl Teile wurden in Intervallen zu der Natriumalginatlösung hinzugefügt. Während des Hinzufügens und danach wurde die Lösung mit Hilfe eines elektrischen Mixers kräftig gemischt, um vollständig die Bildung von Gelklumpen zu verhindern. Acht solcher Hinzufügungen plus einer wurden bis zu einer Gesamtmenge von 1.800 μl ausgeführt, die 1,5 mmol/l hinzugefügten Kalziumionen entsprechen.
Es können auch Biodritin-Zubereitungen hergestellt werden, in denen die Kalziumbindungsstellen in geringerem Maße von 25% bis 75% des oben beschriebenen blockiert sind. Dies führt auch zu löslichen Materialien unter der Voraussetzung, daß die Kopplung mit DVS nicht ausgiebig ist.
In Anwendungen, bei denen das s-IPN-Gel zubereitet wird, ist der Schutz der Kalziumbindungsstellen nicht notwendig, da es keine chemische Reaktion mit dem Alginatbestandteil des Biodritins vor dem Gelbildungsschritt gibt.
Beispiel 3 – DVS-Kopplungsreaktion
Während das Alginatgel mit den geschützten Kalziumbindungsstellen unter ständiger kräftiger Mischung gehalten wurde, wurden 25 ml der CIS-Lösung hinzugefügt, zu welchem Zeitpunkt die Viskosität der Lösung abnahm. Die Lösung wurde rasch durch das kräftige Mischen homogenisiert und das Kopplungsreagenz DVS wurde in zehn Teilen von jeweils 0,3 ml unter fortgesetztem Mischen in 2–3 Minutenintervallen hinzugefügt.
Wenn die DVS-Hinzufügung abgeschlossen war, wurde das Gemisch für 2 Stunden in einem Wasserbad bei 40°C gehalten. Am Ende dieses Intervalls zeigt das Reaktionsgemisch eine leicht lilane Farbe; es wurde aus dem Wasserbad entfernt und über Nacht bei Raumtemperatur belassen.
Während der Reaktionsschritte ist ein beständiges Mischen erforderlich, das ohne weiteres mit Hilfe eines elektrischen Mischers mit Klingen oder Paddeln erreicht werden kann.
Beispiel 4 – Aufarbeitung und anfängliche Reinigung
Nach dem die Reaktion abgeschlossen ist gleicht das Gemisch einem Mus. Zu jedem 100 ml Teil dieses Materials wurden 15 ml 1 mol/l NaCl und 5 × 1 ml Teile einer 0,63 mol/l EDTA-Lösung hinzugefügt, um die Kalziumionen aus den „Eierkarton"-Stellen zu entfernen. Das Mischen wurde beibehalten, um die Auflösung zu ermöglichen. Eine sehr viskose und bräunliche Lösung wurde schließlich erhalten.
Die Lösung wurde in einem Eiswasserbad gekühlt, worauf 3 × 100 ml Teile eiskalten Ethanols langsam unter starkem Mischen mit einem Spatel, um das Produkt zu präzipitieren, hinzugefügt wurden. Ein weißes faserähnliches üppiges Präzipitat bildete sich; das Gemisch wurde für 1 Stunden in dem Eiswasserbad belassen, worauf es bei 4°C bei 6.000 upm für mindestens 20 Minuten in 250 ml Plastikflaschen zentrifugiert wurde.
Beispiel 5 – Blockierung der verbleibenden aktiven Vinylgruppen
Nach dem Verwerfen des Überstands wurde die Zentrifugenflasche für die Ableitung der überschüssigen Flüssigkeit umgedreht, das Präzipitat wurde entnommen und unter Verwendung behandschuhter Hände zwischen Filterpapieren gepreßt. Es wurde dann in 50 ml 1 mol Ethanolamin bei pH 9,5 suspendiert, zu dem auch 1 ml 0,63 mol/l EDTA hinzugefügt wurde. Wenn die Auflösung begann, wurden weitere 50 ml Ethanolaminlösung in gleichen Teilen hinzugefügt; kleine Klumpen wurden mit einem Spatel aufgebrochen. Die Lösung wurde dann unter Erhitzung auf etwa 40°C gerührt, wobei die vollständige Lösung auftrat. Der Behälter wurde mit Parafilm verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur oder alternativ in einem Wasserbad bei 40°C für 4 Stunden gehalten. Es ergab sich eine goldgelbe transparente Lösung, die in ein 2 Liter Becherglas für die weitere Behandlung überführt wurde.
Beispiel 6 – Weitere Reinigung
Die Lösung des vorangehenden Schritts wurde in einem Eiswasserbad gekühlt und nach 30 Minuten wurden 3 × 100 ml Teile eiskalten Ethanols unter heftigem Mischen mit einem Spatel hinzugefügt. Ein weißes fasriges Präzipitat bildete sich, das leicht durch die Gravitation sedimentierte. Die Suspension wurde für 1 Stunde in einem Eiswasserbad gehalten, wonach sie bei 6.000 upm für 20 Minuten bei 4°C wie zuvor zentrifugiert wurde. Der klare Überstand wurde verworfen und das Präzipitat wie in Beispiel 4 oben gesammelt und zwischen Filterpapieren getrocknet.
Dieses Präzipitat wurde dann für eine dritte Ethanolpräzipitation in 2 × 50 ml Teilen Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde in ein 2 Liter Becherglas überführt und auf Eiswasserbadtemperatur abgekühlt. Nach dem langsamen Hinzufügen von 3 × 100 ml Teilen eiskalten Ethanols bildete sich ein weißes fasriges Präzipitat und das Gemisch wurde für 1 Stunde in dem Eiswasserbad belassen.
Das Präzipitat wurde nach der Zentrifugation, die genau wie in diesem Beispiel beschrieben, ausgeführt wurde, gesammelt; es wurde entwässert, zwischen Filterpapieren gepreßt und mit der Hilfe eines Spatels in 100 ml Wasser aufgelöst. Die Endlösung war klar, sehr viskos. Sie wurde in Petrischalen gegossen, eingefroren und gefriergetrocknet.
Das trockene Material, das nach dem Gefriertrocknen erhalten wurde, war weiß und wog im Durchschnitt 5,9 g für diese Chargengröße. Es wurde als strahlende faserförmige Blätter, die in Flocken aufbrachen, erhalten. Das Endmaterial ist vollständig in Wasser oder 0,15 mol/l NaCl-Lösung löslich. Lösungen in beiden Lösungsmitteln mit Mengen von 10 bis 30 mg/ml bilden Gelkugeln wenn sie in 1 % Kalziumchloridlösung getropft werden.
Beispiel 7 – Dehydrothermale Zubereitung des Biodritins
Die Natriumalginat- und CIS-Lösung wurden wie im Beispiel 1 mit der wichtigen Veränderung, daß das Lösungsmittel für jedes nun Wasser war, zubereitet.
Die „Eierkarton"-Stellen wurden mit Kalziumionen wie im Beispiel 2 verbunden. Die CIS-Lösung wurde dann zu dem Alginat hinzugefügt; die CIS-Lösung kann auch vor der Kalziu mionenhinzufügung zugefügt werden. Ein elektrischer Mischer wurde dann verwendet, um alle Klumpen, die sich bei dem Kalziumchloridhinzufügungsschritten gebildet haben könnten, aufzubrechen. Die sehr viskose Endmischung wurde in Petrischalen überführt, gefroren und gefriergetrocknet.
Der harte trockene Kuchen in den Petrischalen wurde dann der dehydrothermalen Behandlung wie folgt unterzogen: die Schalen, die die Kuchen enthielten wurden unter eine elektrische Haube, die bei 102–106°C gehalten wurde, eingebracht und dort für 24 Stunden aufbewahrt. Nach dieser Zeit, die für die Reaktion erlaubt wurde, wurden die Kuchen stehen gelassen, um auf Raumtemperatur abzukühlen und weiter verarbeitet. An diesem Punkt wird im Durchschnitt 6,7 g Kuchen erhalten; er wird zu Pulver verkleinert und in ~ 75 ml Wasser, zu dem 5– 6 ml 0,63 mol/l EDTA hinzugefügt wurde, um das Kalzium aus den „Eierkarton"-Stellen zu entfernen, suspendiert. Zu 100 ml des Gemisches werden 10 ml 1 mol/l NaCl hinzugefügt, um es auf 0,1 mol/l NaCl zu bringen und das Gemisch wird vorsichtig erhitzt. Große Klumpen, die sich nicht mit einem Spatel auflösen lassen, werden entfernt und das Gemisch wird zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Der klare Überstand wird durch Ethanolpräzipitation wie in Beispiel 6 beschrieben, gereinigt; eine Gesamtzahl von drei Präzipitation werden ausgeführt, die erste nach zwei Hinzufügungen von 2 ml EDTA, um die vollständige Kalziumentfernung sicherzustellen. Nach der dritten Präzipitation wird der Kuchen in ~ 75 ml Wasser suspendiert, vorsichtig erwärmt, um die Lösung zu ermöglichen. Die erhaltene klare Lösung wird dann in Petrischalen überführt, gefroren und gefriergetrocknet. Eine typische Ausbeute für eine solche Charge beträgt 5,6 g Endprodukt.
Das sich ergebende Pulver ist leicht wasserlöslich in Konzentrationen von 10–40 mg/ml Wasser oder 0,1 mol/l NaCl; die Viskosität ist ein wenig geringer als die entsprechenden Konzentrationen des Biodritins, das durch eine chemische Copolymerisation mit DVS hergestellt wurde, aber Mikrokapseln werden gebildet, wenn die Lösung in Kalziumchlorid getropft wird.
Beispiel 8 – Zubereitung von Biodritin-Poly-L-Lysinmikrokapseln
Eine Stammlösungen des Biodritin-Heteropolysaccharids wurde mit 10, 15, 20 mg/ml (DVS polymerisiertes Biodritin) oder 30 mg/ml (DHT-Biodritin) in 0,15 mol/l NaCl bei Raumtemperatur zubereitet. Die Auflösung ist schnell und einfach. Die Biodritin- Heteropolysaccharidlösung wurde aus einer Spritze in eine 1,1% CaCl₂-Lösung unter leichter Bewegung aus einer Höhe von etwa 15 cm getropft und formte Perlen. Die Perlen wurden für verschiedene Zeitintervalle von 5 bis 40 Minuten in der Kalziumchloridlösung zur Reifung belassen und wurden dann wie durch Sun et al. (1984) beschrieben, weiter verarbeitet.

i- In Kürze: Die Perlen wurden aufeinanderfolgend in 0,1 % CHES (Cyclohexyl-Ethansulfonsäure) und 1,1 % Kalziumchlorid gewaschen; sie wurden dann für 6 Minuten in 0,5% Poly-L-Lysinlösung behandelt, um eine Kapsel eines Biodritin-Polylysinkomplexes an der Perlenoberlfäche zu bilden.
ii- Die Perlen wurden dann in 0,1 % CHES und 1,1 % Kalziumchlorid und 0,15 mol/l NaCl in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei jede Waschung zwei Minuten dauerte.
iii- Eine äußere Beschichtung des Biodritins wird nun durch die Inkubation der Kapseln mit einer 0,03% Biodritin-Heteropolysaccharidlösung für 4 Minuten aufgetragen, wonach die Kapseln ausgiebig in 0,15 mol/l NaCl gewaschen werden. Sie werden in 0,15 mol/l NaCl bis zur Verwendung gelagert.

In diesem Beispiel wurden keine Zellen eingekapselt; die Mikrokapseln enthielten nur Biodritin-Kalziumgel und die äußeren Beschichtungen. Reine Mikrokapseln werden verwendet, um die Biokompatibilität in Tierexperimenten zu untersuchen. Der äußere Durchmesser, der in diesem Beispiel hergestellten Mikrokapseln betrug 4–5 mm aber unter Verwendung von Vorrichtungen, bei denen ein koaxialer Luftstrom um die Spitze der Spritzennadel fließt, können viel kleinere Mikrokapseln hergestellt werden, wie es dem, der mit dem Bereich vertraut ist, bekannt ist.
Beispiel 9 – Zubereitung von Biodritin als ein s-IPN-physikalisches Gel
In diesem Beispiel wurden Lösungen zubereitet, die die folgenden Konzentrationen der Bestandteile aufwiesen: Das Lösungsmittel war 0,15 mol/Natriumchlorid, die Alginatkonzentration wurde bei 3,0% fixiert und die verwendeten CIS-Konzentrationen betrugen 1,5%, 3% beziehungsweise 6%, was zu CIS-Alginat-Verhältnissen von 0,5:1, 1:1 und 2:1 nach Gewicht führte. Das halbdruchdringende Polymernetzwerk wurde durch das Tropfen jeder Lösung in eine Lösung aus Kalziumchlorid mit 1,1% wie oben beschrieben in Perlenform gebildet.
Die Perlen wurden aus einer Spritzennadel der Größe 20 mit einer Rate von 1 ml/min (peristaltische Pumpe) gebildet. Diese Nadel wurde in eine größere eingeführt, die mit einer Luftpumpe verbunden war, so daß Luft um die Tropfnadel geblasen werden konnte, um durch die Luftzerlegung der herausfließenden Flüssigkeitssäule, die in die Kalziumchloridlösung tropfte, Mikroperlen zu erzeugen. Eine typische Zubereitung bestand aus dem Bilden von Perlen aus 3 ml einer Lösung, die in einem kleinen Becherglas in 30 ml 0,15 mol/l NaCl aufgenommen wurde. Unmittelbar danach wurden die Perlen in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt, wo sie vorsichtig für 10 Minuten mit der Kalziumlösung gemischt wurden. In diesem Schritt können Zeiträume von wenigen Minuten zu viel längeren, wie beispielsweise 40 Minuten, abhängig vom gewünschten Grad der Gelierung variieren.
Nach diesem Zeitraum werden die Perlen mit niedriger Kraft abzentrifugiert (1.000 upm, 3 Minuten) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mit 0,15 mol/l NaCl gewaschen. Eine Waschsequenz, wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde angewendet. Eine Polylysinkapsel kann genau wie oben beschrieben auf die Perlen aufgetragen werden.
Die Biodritin-Perlen des s-IPN-Typs wurden auf ihre Stabilität ohne die Polylysinkapsel durch Inkubation für 140 Stunden bei Raumtemperatur in 0,15 mol/l NaCl untersucht. Die Analyse des Ausströmens von CIS und Alginat, die durch ultraviolett Spektrophotometrie bei 204 und 215 nm ausgeführt wurde, offenbarte, daß nur 6% des gesamten Alginats in den Perlen innerhalb der ersten 50 Stunden für Perlen, die 6% CIS enthielten, auslief, etwa 4% Alginat lief aus Perlen mit 3% CIS aus und ca. 1% lief aus Perlen mit 1,5% CIS aus, was ungefähr derselbe Auslauf war, der mit Alginatkontrollperlen beobachtet wurde. Das Auslaufen von CIS war andererseits in allen Fällen minimal, weniger als 1 %. Nach diesem Zeitraum wurden die Perlen durch tägliches Auswechseln des 0,15 mol/l NaCl weiter gewaschen. Die auslaufenden Mengen verringerten sich und erreichten nach dem dritten Austausch, d.h. nach 72 Stunden für alle Perlen null. Diese Daten zeigen, daß die durch s-IPN gebildeten Perlen stabil sind und ihre Zusammensetzung nach der Gelierung beibehalten. Die Perlen, die in diesem Beispiel gebildet wurden, hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von 550 μm.
Beispiel 10 – s-IPN-Gel, das aus einem Gemisch aus DVS-CIS-quervernetzten Biodritin und hinzugefügtem CIS gebildet wurde
Eine Biodritin-Lösung mit 2% (w/v) wurde in 0,15 mol/l NaCl zubereitet. Die verwendete Biodritin-Pulverzubereitung hatte ein DVS-quervernetzten CIS-Gehalt von ca. 2 Gew.%. Der durch das Hinzufügen von CIS auf 15% erhöht wurde. Die Endlösung hatte daher eine Zusammensetzung aus 2% Alginat und 0,2% CIS auf Grundlage von w/v. Die Perlen wurden durch das Tropfen dieser Lösung in eine 1,1 % Kalziumchloridlösung gefolgt von einer 40 minütigen Inkubation in derselben Lösung hergestellt. Die weitere Behandlung beinhaltete die Bildung einer Poly-L-Lysinkapsel, des weiteren beschichtet mit Biodritin und das Waschen wie in Beispiel 8 beschrieben. Die Perlen und Kapseln, die in dieser Weise zubereitet wurden, haben zu Perlen gleicher Zusammensetzung, die aus Alginat und CIS in Beispiel 9 hergestellt wurden, identische Eigenschaften. Sie können genauso, wie die Perlen, die in den nächsten Beispielen beschrieben werden, behandelt werden.
Beispiel 11 – Sterilisierung der Mikrokapseln
Zusätzlich zu der Möglichkeit der Sterilisierung der Biodritin-Heteropolysaccharidlösung sowie aller anderen bei der Kapselzubereitung verwendeten Lösungen durch Membranfiltration vor dem Gelierungsschritt, können die Biodritin-Mikrokapseln auch durch die Behandlung mit 70% (v/v) Isopropanol in 0,15 mol/l NaCl sterilisiert werden. Daher wurden Biodritin-Mirkokapseln aufeinanderfolgend durch Isopropanol/0,15 mol/l NaCl-Lösung mit ansteigenden Isopropanolkonzentrationen wie folgt behandelt: 25%, 50% und 70%, alles in Volumenprozent.
Die ersten zwei Behandlungen wurden für jeweils 30 Minuten angewendet, um die langsame Dehydration der Kapseln durch die ansteigende Konzentration des Isopropanols zu erlauben. Wenn sie 70% Isopropanol unterzogen wurden, wurden die Kapseln für bis zu 4 Tage bei Raumtemperatur gelassen.
Unter diesen Bedingungen schrumpften sie auf etwa die Hälfte des anfänglichen Durchmessers und zeigten auf der Oberfläche Falten. Wenn sie 4 Tage später durch absteigende Isopropanolkonzentrationen in umgekehrte Reihenfolge wie oben bis 0,15 mol/l NaCl erreicht wurde, regeneriert wurden, gewannen sie ihre ursprüngliche sphärische Form ohne Gestaltverän derungen, Brüche oder Abpellen der äußeren Schicht wieder. Die Oberflächenuntersuchung wurde mit Hilfe einer Lupe mit verschiedenen Vergrößerungsgraden ausgeführt.
Abweichend davon schrumpften Mikrokapseln, die allein aus Alginat hergestellt wurden, die in derselben Weise und in parallelen Experimenten behandelt wurden, auf 1/3 des ursprünglichen Volumens und erlangten ihre ursprüngliche kugelförmige Form nicht zurück. Die meisten wurden zu Rotationselipsoiden mit intakten Oberflächen, die Falten aufwiesen, die mit der Zeit nicht verschwanden.
Die wie in den Beispielen 8 und 9 behandelten Mikrokapseln wurden auch in Mäuse implantiert, um ihre Biokompatibilität zu testen.
Beispiel 12 – Die Intaktheit der äußeren Mikrokapselmembran (Biodritin/Polylysin/Biodritin)
Der Erhalt der äußeren Membran nach der Sterilisierung und Dehydrierung wurde durch das Auflösen eines beachtlichen Teils des Gels im Inneren der Mikrokapsel durch die Behandlung mit 0,050 mol/l Natriumzitrat getestet.
Die Mikrokapseln wurden mit Natriumzitrat bei Raumtemperatur für verschiedene Zeiten während der Beobachtung unter einer Lupe bei hoher Vergrößerung inkubiert. Abhängig von der Kapselgröße ändert sich der Zeitablauf der Vorgänge, aber für eine Gruppe größere Mikrokapseln wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: nach ~ 10 Minuten wurde der zentrale Kern durch eine schmale, sehr transparente Zone umgeben, wobei die letztere durch die äußere Membran begrenzt wurde.
Nach 30 Minuten der Beobachtung erreichte die Auflösung des Biodritin-Gels durch Kalziumentfernung durch das Zitrat etwa 50% des Kapseldurchmessers; die äußere Membran war intakt. Das Mischen der Mikrokapselsuspension durch Rotation des Kolbens machte es möglich die wellenförmige Bewegung der intakten äußeren Membran zu beobachten, was auch daraufhin deutet, daß sie durchlässig ist und es der Flüssigkeit erlaub sich hinein und hinaus zu bewegen.
Da der Membran die Unterstützung der darunterliegenden Gelstruktur fehlt, die durch die Wirkung des Zitrats aufgelöst wurde, kann sie durch starkes Ansaugen mit einer Pipette aufgebrochen werden.
Beispiel 13 – Mikrokapselfärbung mit Alcianblau
Alcianblau ist ein gut bekannter Farbstoff für Chondroitinsulfat (Turnbull, 1993); wir haben gefunden, daß es auch Alginat färbt, obwohl mit geringerer Intensität. Die Mikrokapseln wurden in 0,5% Alcianblau in 2% Essigsäure für 20 Minuten gefärbt; die Entfärbung fand in 2% Essigsäure mit wiederholten Waschungen statt. Die Biodritin-Mikrokapseln ergeben, wie erwartet, ein tieferes Blau als die Alginatkapseln. Wenn Biodritin-Mikrokapseln, die wie in Beispiel 8 zubereitet wurden, in Hälften geschnitten werden und gefärbt werden, färbt sich das Innere der Kapseln intensiver als das Äußere, was daraufhin deutet, daß die äußere Membran eine Wirkung auf die Farbstoffdiffusion in das Kapselinnere hat.
Beispiel 14 – Zubereitung von strukturierten "Spaghetti"-ähnlichen Zylindern aus Biodritin für die Zell- und Gewebeimplantation
Eine neue Verwendung der Biodritin-Erfindung besteht in der Zubereitung von strukturierten Spaghetti-ähnlichen Zylindern, um Zellen oder Gewebe für die Implantation zu enthalten, die selbst eine Erfindung darstellen, die hierin zum ersten Mal beschrieben werden, die Biodritin-Spaghetti genannt werden. Diese Biodritin-Spaghetti werden als „strukturiert" bezeichnet, da der dünne Gelzylinder, der den Namen Spaghetti erhält, eine innere Struktur aufweist, die aus einer Schnur eines Nähgarns oder alternativ einem chirurgischen Nahtfaden gebildet wird. Der Baumwollfaden hat eine Vielzahl sehr feiner lateraler Verlängerungen, wie kurze Zweige an einem langen Zweig, die aus der Fadenoberfläche hervorspringen und in das Gel eingebettet sind. Der chirurgische Wundfaden hat keine solchen Zweige, aber diese können durch das Aufkratzen der Oberfläche des Fadens mit einer Messerklinge vor der Sterilisierung erzeugt werden. Diese lateralen Verlängerungen des zentralen Fadenkerns stellen weitere Bereiche für die Adhäsion zwischen der Gelmatrix und den zentralen Kern zur Verfügung, was die Struktur in einer Weise verstärkt, die der von Stahldraht in Beton ähnlich ist.
Strukturierte Biodritin-Spaghetti werden wie folgt hergestellt: 1) Ein sterilisierter Baumwollnähfaden, der Größe 50 oder dünner, wird in einen 10 bis 20 cm langen sterilen Polyethylen katheter des gewünschten Durchmessers – üblicherweise der Größe 60, aber die Größe 90 kann mit dünneren Fäden verwendet werden – bis zu dem Punkt eingeführt, bis der Faden die Nadel erreicht, die selbst mit der Spritze verbunden ist. Ein chirurgischer Nahtfaden kann anstelle des Baumwollfadens mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet werden. Der Faden sollte für 4 bis 5 cm über das freie Ende des Katheterschlauchs reichen, so daß er später in dem Verfahren gehandhabt, verankert oder zurückgehalten werden kann (siehe 2A).

2) Eine Biodritin-Heteropolysaccharidlösung der gewünschten Konzentration beispielsweise zwischen 0,5 und 3% in dem erforderlichen Lösungsmittel (Salzlösung, Kulturmedium, oder Hank's Medium) und die gewünschte Zell- oder Gewebezubereitung enthaltend, wird in den Katheterschlauch durch Spritzenaufsaugen durch den Katheter mit dem Faden an Ort und Stelle eingeführt. Nachdem eine vorgegebene Menge des Katheters mit der Lösung gefüllt ist, wird die Katheterspitze und die Fadenverlängerung kurz mit Lösungsmittel gespült und die Anordnung ist für die Spaghettibildung bereit.
3) Ein strukturierter Spaghetti wird wie folgt gebildet: Der mit Biodritin-Heteropolysaccharidlösung, die Zellen enthält, gefüllte Katheter, der mit der Spritze verbunden ist, wird schnell in eine Kalziumchloridlösung in einer großen Petrischale oder einem flachen Tablett plaziert und der Spritzenkolben wird gedrückt, während der Katheter beständig in die Kalziumchloridlösung vorwärtsbewegt wird. Wenn die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung den Katheter verläßt, tritt sie in unmittelbare Berührung mit den Kalziumionen und bildet unmittelbar ein zylindrisches Gel um den Baumwollfaden oder den chirurgischen Faden. Wenn die gesamte Biodritin-Heteropolysaccharidlösung in dem Katheter durch die Spritze ausgetrieben wurde, verbleibt ein zylindrisches Gel, das um den Faden gebildet wurde, dessen Ausdehnung durch die Menge der ursprünglich in dem Katheter befindlichen Biodritin-Heteropolysaccharidlösung bestimmt wird. An jedem Ende des Biodritin-Gels gibt es ein zusammenhängendes Fadenstück, das nunmehr verwendet wird, um den Gelzylinder während der weiteren Bearbeitung zu halten.
4) Die Biodritin-Spaghetti werden nun für einen gegebenen Zeitraum in der Kalziumchloridlösung belassen, um das Gel zu festigen. Dieser Zeitraum variiert abhängig von dem gewünschten Geltyp und reicht von 5 bis 40 Minuten. Nach der Inkubation mit Kalziumionen werden die Biodritin-Spaghetti genauso wie in Beispiel 8 behandelt, um eine Biodritin-Poly-L-Lysinmembran, die die Spaghettioberflächenfläche abdeckt, zu bilden. Diese äußere Biodri tin/Polylysin/Biodritin-Membran hilft dabei, das Gel zu unterstützen und kontrolliert die Permeabilität anhand der Molekulargröße.
5) Wenn Langerhanssche Inseln oder andere Zellen oder Gewebe in den Biodritin-Spaghetti suspendiert werden, verteilen sie sich selbst in dem doppelzylindrischen Raum, der innerhalb der Begrenzungen der Baumwoll- oder chirurgischen Fadenoberfläche auf der Innenseite und der Biodritin/Polylysin/Biodritin-Membran auf der Außenseite enthalten ist, wie in der 2A gezeigt. Die Zahl der pro zylindrische Volumeneinheit enthaltenen Inseln, kann durch die Inselsuspension, die ursprünglich in der Biodritin-Lösung zubereitet wurde, kontrolliert werden. Die biokompatible Biodritin-Gelstruktur, die den Großteil der Spaghetti ausmacht, unterstützt die Inseln in Abstand voneinander und verhindert, daß sie zusammenklumpen, wodurch eine zentrale Nekrose in Inselaggregaten vermieden wird.
6) Die Biodritin-Spaghetti mit den Fadenverlängerungen an jedem Ende können individuell oder zusammengeschnürt durch die Fadenenden vor der Implantation wie in der 2B gezeigt, implantiert werden. In dieser Weise kann eine viel größere Zellmasse in einem eher begrenzten Raum, aber unter Bedingungen, die die individuellen Spaghetti enthalten, implantiert werden.
7) Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die, die eine Gruppe von Biodritin-Spaghettischnüren mit Zellen, die wie in 3B zusammengebunden sind, innerhalb eines porösen, schützenden und biokompatiblen äußeren Zylinders, der ursprünglich aus Venen oder Arterien eines Tiers oder von dem Empfänger selbst zubereitet wurde, eingesetzt wird. Sobald sie innerhalb eines solchen biokompatiblen Behälters befestigt sind, um eine An lebend Gewebekassette zu bilden, können die Biodritin-Spaghettischnüre in einen Patienten implantiert werden. Eine mögliche und interessante Alternative, die in dieser Erfindung vorgeschlagen wird, ist durch die Nabelschnurnarbe in einer solchen Weise, daß letztlich Ersatzkassetten unter Verwendung einer vergleichsweise einfachen chirurgischen Technik ausgetauscht werden können.
8) Unter den oben beschriebenen Herstellungsbedingungen würde ein Biodritin-Spaghetti mit einer Gellänge, die 10 cm entspricht, die folgenden ungefähren Dimensionen aufweisen (4): A) Gellänge – 100 mm; B) gesamter innerer Durchmesser – 0,76 mm; C) Baumwollfa dendurchmesser – 0,20 mm; D) Dicke des Biodritin-Gelzylinders (B-C) – 0,50 mm; Volumen des Biodritin-Gels – 42,2 mm³ oder 4,22 mm³ pro lineare Zentimeterlänge.

Beispiel 15 – Tierimplantate aus Biodritin-Mikrokapseln: Biokompatibilität
Die Biodritin-Mikrokapseln mit einem Durchmesser von 4–5 mm wurden intraperitoneal in Mäusen, 3 Kapseln pro Maus, 2 Mäuse pro Gruppe gemäß chirurgischem Standardverfahren und zugelassenen Protokollen implantiert.
In Zeiträumen von einer Woche, einem Monat und drei Monaten nach der Implantation wurden die Kapseln aus den Tieren entfernt. Die eine Woche lang implantierten Kapseln wurden frei im Peritonealraum, sauber und ohne Anheftungen gefunden; es konnten keine inflammatorischen Reaktionen in oder um die Stelle, an der sie gefunden worden, beobachtet werden.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Mikrokapseln gefunden, die für einen Monat oder drei Monate intraperitoneal in den Mäusen verblieben. Die Kapseln zeigten eine klare schimmernde Oberfläche, die frei von allen Anheftungen war. Wie bei den 1 wöchigen Experimenten wurde keine inflammatorische Reaktion bemerkt. Die 4 zeigt eine Kapsel, die aus einer Maus nach drei Monaten intraperitonealer Implantation entfernt wurde. Eine histologische Untersuchung der Zubereitungen unterstützte im vollen Umfang die Schlußfolgerungen: Auf der Oberfläche der Perlen wurden nach der intraperitonealen Implantation für 8 Tage, 1 Monat und 3 Monate keine Zellen gefunden.
Somit wurde die Biokompatibilität dieses neuen Materials wie aufgrund der Allgegenwärtigkeit des Chondroitinsulfats im Tierreich und aufgrund seiner gezeigten inherenten fehlenden Immunogenität erwartet, bewiesen.
Beispiel 16 – Chirurgische Biodritin-Farbstoff oder -Spray für den Nahtschutz
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine 0,8 bis 1,5% (w/v) Biodritin-Heteropolysaccharidlösung in einer Salzlösung auf und um eine chirurgische Naht gestrichen; unmittelbar danach wurde eine 1 % (w/v) Kalziumchloridlösung kurz als Nebel über den bestrichenen Bereich gesprüht. Es bildet sich unmittelbar über dem bestrichenen Bereich ein Biodritin-Gel, das ihn vor eindringenden Zellen oder vor dem Anheften an an grenzende Gewebe schützt. Dies hat bedeutende Anwendungen in abdominalen Operationen, bei denen sich nach den chirurgischen Verfahren unerwünschte Anheftungen bilden können. Als eine alternative Anwendungsweise kann die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung über und um die Naht gesprüht werden, gefolgt von dem Sprühen der Kalziumchloridlösung, um das Biodritin-Gel zu bilden.
Eine dritte Weise der Biodritin-Anwendung besteht in dem Mischen der Biodritin-Heteropolysaccharidlösung mit einem unlöslichen Kalziumsalz, wie Trikalziumzitrat, die Bildung einer gleichmäßigen Suspension des Kalziumsalz und unmittelbar vor der Anwendung dem Mischen dieser mit einer wäßrigen Lösung des δ-Laktons der Glukonsäure, die langsam zu Glukonsäure hydrolisiert, welches die Kalziumionen des Zitrats auflöst, wodurch das Biodritingel in situ gebildet wird. Diese Formulierung wird als „interne Gelierung" bezeichnet, und ist durch Johansen und Fink (1988) verwendet worden, um mikrobielle Zellen zu verkapseln. Um diese Formulierung auszuführen werden die folgenden Verhältnisse empfohlen: zu jeden 8 ml der Biodritin-Heteropolysaccharidlösung einer angemessenen Konzentration (beispielsweise 2,5%) füge 1 ml einer Trikalziumzitratlösung (11,4 mg/ml) und schließlich 1 ml Glukonolakton (10 mg/ml) hinzu. Nach dem Hinzufügen des Glukonolaktons findet die Lösung der Kalziumionen in Minuten statt, wenn sich das Gel zu bilden beginnt. Dies ist die bevorzugte Ausführungsform dieser Anwendung.
In dem somit detailliert die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben worden sind, soll es verstanden werden, daß die Erfindung, die durch die angefügten Ansprüche definiert ist, nicht durch bestimmte in den obigen Beispielen dargestellten Details beschränkt werden soll.
Referenzen

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Claims

Verfahren zur Herstellung einer biokompatiblen Zusammensetzung, die mindestens ein Glycosaminoglycan und mindestens ein Alginat umfaßt, wobei: das mindestens eine Glycosaminoglycan und/oder das Alginat quernetzvernetzt oder polymerisiert ist (sind) und das mindestens eine Glycosaminoglycan und das Alginat kovalent gebunden sind, umfassend die Schritte des Mischens des mindestens einem Glycosaminoglycan und des mindestens einem Alginats und das In-Kontaktbringen des Gemisches mit einem anorganischen Ion und das kovalente Binden des mindestens einem Glycosaminoglycan und des mindestens einem Alginat entweder vor dem In-Kontaktbringen des Gemisches mit dem anorganischen Ion oder nach dem In-Kontaktbringen des Gemisches mit dem anorganischen Ion und Reinigen der Zusammensetzung durch In-Kontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Verbindung, die an das anorganische Ion bindet oder es komplexiert oder es konjugiert und das Präzipitieren der Zusammensetzung aus einer Alkohollösung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alginat quervernetzt oder polymerisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anorganische Salz ein Kalziumsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Glycosaminoglycan und das Alginat mittels einer Kopplungsreaktion, die ein Linkermolekül beinhaltet, kovalent gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Linkermolekül ein Sulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Linkermolekül Divinylsulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Glycosaminoglycan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert ist (sind) und das mindestens eine Glycoaminoglycan und das Alginat kovalent gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das anorganische Salz ein Kalziumsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das mindestens eine Glycosaminoglycan und das Alginat mittels einer Kopplungsreaktion, die ein Linkermolekül beinhaltet, kovalent gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Linkermolekül ein Sulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Sulfon Divinylsulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 7, welches dadurch gebildet wird, daß die kovalente Bindung vor dem Quervernetzen oder dem Polymerisieren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, welches dadurch gebildet wird, daß die Quervernetzung oder Polymerisierung vor dem Durchführen der kovalenten Bindung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Glycosaminoglycan keine bestimmten Zellbindungseigenschaften aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das mindestens eine Glycosaminoglycan Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alginat in der Gegenwart eines anorganischen Ions ein Gel bildet.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das anorganische Ion ein Kalziumion ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Alginat Natriumalginat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anorganische Salz ein Kalziumion ist, des weiteren umfassend den Schritt des Anpassens der Viskosität durch die Veränderung der Zusammensetzung und/oder der Kalziumionenkonzentration(en).
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt des Reagierens des mindestens einen Glycosaminoglycan und des Alginats mit einem Linkermolekül und Schützen der Kalziumbindungsstellen des Alginats vor der Reaktion.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Linkermolekül ein Sulfon ist und die Reaktion im alkalischen Medium durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Sulfon ein Divinylsulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 20, des weiteren umfassend das Entfernen der aktiven Vinylgruppen in der Zusammensetzung durch das Reagieren mit einem Alkanolamin bei einem alkalischen pH.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Alkanolamin Ethanolamin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Alkohol Ethanol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anorganische Ion Kalzium ist und die Verbindung EDTA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Aussetzen eines trocknen Kuchens, der das mindestens eine Glycosaminoglycan und das mindestens eine Alginat umfaßt, gegenüber einer dehydrothermalen Reaktion.
Verfahren nach Anspruch 27, des weiteren umfassend das Herstellen des trockenen Kuchens durch Gefriertrocknen einer Lösung, die das mindestens eine Glycosaminoglycan und das mindestens eine Alginat umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 27, des weiteren umfassend das Schützen der Kalziumbindungsstellen durch das Hinzufügen von Kalziumionen.
Verfahren nach Anspruch 29, des weiteren umfassend die Entfernung von Kalzium aus den Kalziumbindungsstellen durch das In-Kontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Verbindung die an Kalzium bindet oder es komplexiert oder es konjugiert.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Verbindung EDTA ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Alkohol Ethanol ist.
Verfahren für das Zubereiten eines Sols, das das In-Kontaktbringen der Zusammensetzung, die gemäß Anspruch 1 oder 20 hergestellt wurde, mit einem Natriumsalz umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Natriumsalz ein Zitratsalz oder ein Ethylendiamintetraessigsäuresalz ist.
Verfahren für die Zubereitung einer Gelmikrokapsel umfassend das Tropfen einer Lösung, die eine Zusammensetzung, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wurde, umfaßt, in eine anorganische Ionenlösung.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die anorganische Ionenlösung eine Kalziumionenlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Kalziumionenlösung eine Kalziumchloridlösung ist.
Verfahren für die Zubereitung eines Gels umfassend das Gestalten der Zusammensetzung, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 zubereitet wurde in die Form eines gestalteten Objekts und In-Kontaktbringen der Zusammensetzung mit einem Gelierungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Gelierungsmittel ein Kalziumion umfaßt und die Zusammensetzung in Lösung ist, wenn sie in Form eines gestalteten Objekts gestaltet wird.
Verfahren zur Zubereitung einer Matrix umfassend die Co-Extrusion der Leine, der Zusammensetzung, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 zubereitet wurde, und eine anorganische Ionenlösung.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die anorganische Ionenlösung eine Kalziumionenlösung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 41, des weiteren umfassend das Bilden einer äußeren Schicht einer Polylysin-Zusammensetzung über der zylindrischen Struktur.
Eine Matrix die des weiteren innerhalb der Zusammensetzung, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 herstellbar ist, Zellen umfaßt.
Matrix nach Anspruch 43, die des weiteren Perlen umfaßt.
Matrix nach Anspruch 43, die des weiteren eine zylindrische Struktur umfaßt.
Matrix nach Anspruch 43, die des weiteren eine Gelmikrokapsel umfaßt.
Matrix nach Anspruch 43 bis 46, wobei die Zellen Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse sind.
Verwendung einer Matrix nach Anspruch 47, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Diabetes.
Vorrichtung umfassend mindestens zwei Matrizes nach Anspruch 45, die an jedem Ende zusammengebunden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 49, die des weiteren ein zusätzliches biokompatibles Material umfaßt, das die zylindrische Struktur zum Schutz gegen mechanische Belastungen umgibt.
Vorrichtung nach Anspruch 49, wobei die Zellen Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse sind.
Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 51, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Diabetes.
Verwendung einer Farbe oder eines Sprays umfassend eine Zusammensetzung, die gemäß Anspruch 1 hergestellt wurde, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Wunden oder die Abdeckung von chirurgischen Nähten.
Verfahren für das Abdecken von Operationsgeräten umfassend das Anbringen einer Farbe oder eines Sprays umfassend eine Zusammensetzung, die gemäß Anspruch 1 zubereitet wurde.