KR20150111372A

KR20150111372A - 주사 시술용 보형물

Info

Publication number: KR20150111372A
Application number: KR1020157025171A
Authority: KR
Inventors: 피 응우엔; 록 판; 바오 트란; 투언 응우엔
Original assignee: 미바 메디컬 아이엔시.
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-11
Publication date: 2015-10-05
Also published as: WO2013071216A1; JP2014521492A; EP2776077A4; KR20140059238A; EP2776077A1; CN103917256A

Abstract

시스템 및 방법은 다음의 목적으로 공개된다;
● heteropolysaccharide를 교차결합하여 단일 교차결합 물질을 형성하여 상호 침투 고분자 그물 (IPN)를 갖는 생체 적합성의 가교 고분자를 형성하는 방법
● 단일 교차결합 물질에 추가로 교차결합을 실시하여 다중 교차결합 물질을 형성하는 방법. 이중 다중 교차 결합 물질은 단일 교차 결합 물질에 비하여 생분해에 오래가게 만드는 하나 이상의 IPN부위를 포함하며, 또한 복수의 단일 교차 결합 익스텐션을 가진 하나 이상의 IPN부위를 가지게 되어 이가지 부위의 의 조합은 생분해 방지, 부드러움 촉감, 체내 주입 용이등의 특징을 제공한다.

Description

주사 시술용 보형물{INJECTABLE FILLER}

본 특허 신청은 지난 11년 11월 11일에 신청된 잠정특허신청 (번호 61/558669)및 11년 11월 22일에 신청된 유틸리티 특허 (번호 13301785)에 대한 우선권을 주장한다. 그 특허들의 내용은 여기에 참고항목으로 포함되어 있다.

본 발명은 생체에 적합한 점탄성 고체 액체 혼합물의 폴리머 젤과 그를 제조하는 방법, 그리고 그의 배합내용에 관련한다.

인간이 노화함에 따라, 피부의 탄력도는 떨어지고, 피하 지방은 유실되게 된다. 따라서, 깊고 얕은 주름이 생기게 된다. 의사들은 오랜동안 다양한 방법과 재료를 사용하여 인간의 안면 연부 조직의 볼륨 소실을 개선하도록 연구해 왔다. 가장 일반적인 방법 중 하나가 자기 지방이식이다. 수술등의 방법으로 환자 자신의 복부 등에 위치한 지방을 채취 및 가공하여 자신의 진피 및 연부조직에 이식, 주름을 개선하고 젊은 외모를 가질 수 있게 하는 것이다. 자가 지방 이식술은 좋은 결과를 기대할 수 있는 바람직한 주름 제거술이다. 그러나, 수술을 통한 이 방법은 시간이 오래걸리며, 환자의 통증 유발, 과다 비용, 과다한 회복기간, 수술처치에 일반적으로 생길 수 있는 부작용 등의 문제점이 있다.

요약

본 (특허) 신청은 아래와 같은 항목을 상세히 기술한다.

1. 순차 교차 결합

2. 하이루론산 분자량 조절

3. 유리기 제거제: 비타민, 효소 등

4. 반 하이루론산 분해효소 (Anti-Hyaluronidase) 및 엘라스틴 가수분해 효소 (Anti-Elastase)

순차 교차 결합

다음과 같은 면이 최적화된 연부조직 미용보정용 교차결합 HA를 만들어 내는 시스템과 방법을 논한다.

1. 제품 주입의 용이함

2. 주변 조직 적응력

3. 보형물의 이동을 제어할 수 있도록 더 높은 점력

4. 생체내 분해성향 프로파일

한번 특정하게 교차결합된 HA를 다시한번 교차결합하여 서로를 관통하는 부분이 있는 네트워크 ( IPN)을 만들어 낸다. 이렇게 생겨난 IPN 배열 형태는 미용성형에 특장점이 있는 교차결합 HA를 만들어 낼 수 있게 한다. 이렇게 생겨난 IPN 심지 (작은 공의 형태)는 같은 방법으로 일회 교차결합된 HA에 비하여 인체 내에서 분해되는 기간이 길어 지게 된다. 더우기, 심지에서 부터 뻗어져 나가며 물리적인 성질이 지속적으로 변화하는 폴리머는 더욱 내성이 강하고, 주위의 인체조직과의 친화력이 높고, 촉감이 자연 조직과 유사하게 된다.

위에서 언급된 HA는 본 폴리머에 대한 주위 인체 조직의 반응을 최소화하기 위한 약품 주입을 조절하여 최적화될 수 있다. 이러한 약품이 혼합되면 교차결합 HA가 하나의 페이즈(phase)가 되는 다단계 혼합물이 된다.

이러한 위상을 적용하는 일은 아래 언급하는 하나 혹은 그 이상의 방법을 포함할 수 있다. 본 시스템은 생체친화적이며 인체의 어떤 생리적인 현상이 있을 경우에 정확한 타이밍에 맞추어 분비될 수 있도록 한다. 예를 들어, 수술 등에 동반하는 통증을 잡기위한 리도케인 등의 마취제가 포함된 제품이라면 즉각적이고 빠른 분비가 가장 효과적인 방출기작이 될 것이다. 이 시스템은 또한 중기 지효성 분비 시스템에서 쓰일 수 있는 데, 그 예는 이성물질이 신체에 노출됨으로써 생길 수 있는 염증반응이 나타날 때와 동시에 분비되면 가장 효과적인 코티조스테로이드나 스테로이드계 약품 즉 dexamethasone 혹은 triamcinolone을방출하는 데 쓰일 수 있다. 이 시스템은 또한 중장기 분비 기작을 가지게 되면 효과적인 약품에도 쓰일 수 있다. 예로, 미관상 보기 좋지 않은 지나친 흉터나 피막이 생기는 것을 막아 주는paclitaxel, serolimas, 5-flourouracil 등의 항증식성 약품을 제공하는 데 쓰일 수도 있다.

하이루론산 분자량 조작

현 발명의 또 하나의 측면은 다양한 분자량을 조절함으로 써생분해 프로파일 최적화하고 주입된 보형물이 원치 않는 곳으로 이동하는 것을 막는 방법이다. 본 시스템은 생분해 프로파일을 최적화하며 보형물의 이동을 조절한다. 시스템은 다양한 분자량 측정방식 (M_n, M_w 및 M_z) 및 그들의 PDI (Poly Diversity Index)를 조합하여 보형물의 이동을 조절하며생분해 프로파일을 최적화 하여 그 프로파일이 Hypervolumic이 아니라 Isobvolumic이거나 Hypovolumic이 되도록 한다.

유리기 제거제: 비타민, 효소 등

체내의 HA는 산화 반응및 가수 분해 반응이라는 두개의 주요 메카니즘에 의해 분해된다. 포유동물의 세포 내에서는 이 메카니즘은 효소성 가수분해로서 hyaluronidase (hyase), b-d-glucuronidase 및 β-N- acetyl-hexosaminidase라는 세가지의 효소에 의해 이루어진다. 그리고, 세포 외에서 이 메카니즘은 산소 유도 유리기 (간혹 반응성 산소종: Reactive Oxygen Species(ROS)이라 불리는)에 의해 일어나는 산화반응이다. 이들은 결합되지 않은 전자를 포함한 원자나 원자 그룹이며 이는 산소가 특정한 분자와 반응할 때 생성한다.

ROS는 정상적인 세포신진대사의 결과로 생성된다. 특히, 산화적 손상의 주범은 과산화수소 (H2O2)이며 이는 미토콘드리아에서 새어나온 과산화물이 변형되어 생긴다. 과산화수소 분해효소와 과산화물 디스무타아제는 이러한 과산화물이나 초산화물들을 무해한 물질인 물과 산소로 변형시켜 이들이 가할 수 있는 손상효과를 경감시킨다. 그러나, 이러한 변환은 100% 효율적인 것이 아니며 과산화물은 세포내에 상존하게 된다. ROS는 정상적인 세포활동의 결과로 생성되는 것이지만, 지나친 양은 유해한 영향을 미친다. 알츠하이며 병과 같은 기억력 감퇴는 대표적인 퇴행성 질환으로 이는 산화적 손상이 누적되는 것과 같이한다. 최근의 연구결과가 밝혀낸 것은 ROS가 누적되면 산화적 손상이 노화를 일으켜 생명체의 체력을 감소시키는 것이다. 특히, 산화적 손상이 누적되면 인지 장애를 일으킬 수가 있으며 이는 미토콘드리아 대사물질을 주입받고 인지 테스트를 받은 늙은 쥐의 실험에서 실증되었다. 산화적 손상이 누적되면 미토콘드리아의 효율성을 떨어뜨리며 그리하여 ROS의 생산을 증가시킨다. 다른 많은 연구는 산화적 손상이 나이와 관련한 뇌기능 저하의 원인이라는 것을 말한다. 늙은 게르빌루스쥐에서는 젊은 쥐에 비하여 많은 양의 산화 단백질이 발견된다. 유리기를 제거한 물질로 젊은 쥐와 늙은 쥐를 치료하면 젊은 쥐에서는 변화가 발견되지 않으나 늙은 쥐에서는 산화 단백질이 감소한다. 또한, 늙은 쥐는 치료기간 동안 인지 능력이 증가하나 그 치료가 중단되면 산화 단백질이 증가하여 인지능력이 도로 떨어진다.

더욱 더, 일단 한번 형성되면 이 반응성이 좋은 유리기들은 연쇄반응을 일으킬 수 있다. 이들의 주된 위험은 DNA나 세포막과 같은 중요한 세포의 요소들과 반응한다는 것이다. 이런 일이 일어나면 세포들은 기능하지 못하거나 죽어 버린다. 이런 유리기의 피해를 방지하기위해 신체는 항산화제라는 방어 기작을 가지고 있다. 유리기와 항산화제는 쉽게 바로 서로가 결합한다.

산소로 도출된 유리기가 HA를 분해하는 반응은 신체 내 윤활액에 포함된 HA를 연구하여 얻어졌다. 이는 HA가 과산화물 유리기에 의해서 바로 분해 되는 것을 보여준다. 이 반응은 이차 유리기가 존재할 때 가장 원활하게 일어난다. Neutrophil(호중성백혈구)는 일종의 산소도출 유리기를 만들어 HA를 식세포적으로 먹어 치운다. 이러한 WBC(?)는 산소가 도출한 유리기가 HA를 파괴하는 가장 큰 파괴자이다. 그러므로 이 발명의 한 측면은 유리기가 HA를 분해하기 전에 항산화 비타민등의 유리기 제거재를 사용하여 유리기의 효과를 없애는 것이다.

항산화제는 세포손상으로 인한 질병 방지-암, 노화 및 각종 여타 질환의 기작 -- 와 밀접한 연관이 있다. 항산화제는 유리기들과 안전하게 결합하여 이들이 중요한 체내 분자를 손상시키기 전에 그 연쇄반응을 멈추는 분자들이다. 인체내에는 유리기를 없애주는 효소가 몇가지 있지만, 주요한 미량영양소 (비타민) 항산화제로는 비타민 E, 베타 카로텐, 그리고 HA의 경우는 비타민 C가 예외이다. 추가적으로, 신체내에서 효소적 항산화 시스템이 잘 동작하도록 도와주는 셀레니움 또한 이 카테고리에 속할 수 있다. 인체는 이러한 미세영양소를 만들어 낼 수 없으므로 이들은 외부로 부터 섭취되어야 한다.

다음은 항산화 비타민과 그들의 역할, 하루 권장 섭취량이다.

비타민 E: D-Alpha 토코페롤. 지용성비타민으로 견과류, 씨, 채소, 피쉬오일, 홀 그레인, 강화 시리얼, 그리고 살구에 들어 있다. 현재 하루 일일 권장 섭취량(RDA)는 남자15 IU, 여자 12IU이다.

비타민 C: HA의 경우 예외는 비타민C는 HA의 수명에 해롭다는 것이다. 그러나, 비타민 C는 애스크로빈 산이며, 지용성 비타민이다. 다음과 같은 음식에 많이 포함되어 있다. 오렌지류, 파프리카, 양배추, 시금치, 브로콜리, 케일, 캔타루프, 카위, 딸기 등. RDA는 하루 60mg 이며 어떤 사람의 경우 2000mg이상 섭취는 부작용을 일으킬 수 있다.

비타민 A: 베타 카로텐은 비타민 A(레티놀)이며 이는 간, 계란 노른자, 우유, 버터, 시금치, 홍당무, 호박, 브로콜리, 고구마, 토마토, 캔타루프, 복숭아, 그리고 곡물류에 많이 포함되어 있다. 베타 카로텐이 비타민 A로 변환되기 때문에 여기에는 정해진 권장량이 없다. 대신, 둘간의 관계를 명확히 하기 위해RDA는 RE (retinol equivalent)로 표기된다. (주: 비타민 A는 항산화작용이 없으며 과량으로 섭취했을 경우 독성이 있을 수 있다.)

글루타치온(GSH): GSH는 glutamate side chain의 카르복실 기와 시스테인의 아민기 사이에 감마 펩타이드 링크가 있는 트라이 펩타이드이다. 이는 유리기와 과산화물과 같은 반응성 산화종이 일으키는 피해를 막아 주는항산화제이다. Thiol기는 환원제이며, 동물의 세포내에 약 5mM의 농도로 존재한다. 글루타치온은 전자를 제공함으로써 시스토플라즈믹 단백질내에 형성된 disulfide결합을 환원시켜 시스테인으로 만든다. 이 과정에서 글루타치온은 산화된 형태인 글루타치온 다이설파이드(GSSG)로 변환되며, 이는 L(-)-글루타치온이라고도 불리운다.

일단 산화되면, 글루타치온은 NADPH를 전자 공여자로 사용하여 다시 글루타치온 리덕타제로 환원될 수 있다. 세포 내의 환원 글루타치온과 산화 글루타치온의 비율은 흔히 세포독성치의 기준이된다.

요산: 이는 인체에서 가장 중요한 플라즈마 항산화제이며 탄소, 질소, 산소, 수소의 헤테로고리 화합물로서 그 분자식은 C5H4N4O3이다. 이는 또한 요산염이라 불리는 이온과 염기를 형성하며 암모니아산염과 같은 산염을 형성한다. 요산은 푸린 뉴클리오티드가 신진대사적으로 분해되면서 생성된다. 혈중 요산농도가 높으면 통풍이라 불리우는 일종의 신경통의 원인이 된다. 이 화합물은 당뇨나 신장결석으로 인한 암모니아산염의 형성 등의 다른 의학적 증상과 관련이 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 HA의 수명을 연장하기 위해 항산화효소를 사용하는 데 있다. 이 효소들은 유리기를 줄여주어 ROS로부터 HA의 분해를 방어한다. 그들은 alpha-1-microglobulin, superoxide dismutases, catalases, lactoperoxidases, glutathione peroxidases 그리고 peroxiredoxins이다.

반 하이루론산 분해효소 (Anti- Hyaluronidase ) 및 엘라스틴 가수분해 효소 (Anti-Elastase)

교차결합된 HA를 노화하는 피부의 젊음을 되돌리는 미용 보정용으로 사용하는 데 있어서 당 발명의 한 측면은 Hyaluronidase 억제제 (anti-HA)를 사용하여 HA의 폴리머라제이션이 풀리는 것을 막아 HA의 수명을 늘리는 데 있다. HA의 수명을 유지하는 것은 중요하다. 이는 노화의 징후및 주름의 출현과 직접적인 연관이 있다.

HA는 지구상 생존하는 모든 생물에 중요한 분자이다. 이는 모든 동물계에서 발견되는 복합기능 고분자 다당류이며 특히 연골조직의 세포간 매트릭스 (ECM)에서 발견된다. HA는 다양한 생물학적 프로세스에서 역할을 하는 것으로 알려졌는 데, 특히 발생, 세포간 이동, 상처의 치유, 악성 변환, 조직 변환 등에서 레벨이 높아진다. HA를 분해하는 효소, Hyaluronidase (HAases)는 진핵생물적과 원핵생물적으로 모두 표현된다. 이 효소들은 발생으로 부터 노화에 이르기까지 생리학적, 병리학적 프로세스에 모두 간여하는 것으로 알려져 있다.

Hyaluronidase가 만들어 내는 HA의 분해 는 연결조직의 삼투압능을 증가시키고 체액의 점성을 감소시키며 또한 박테리아성 발병, 독의 퍼짐, 첨체 반응, 난자 착상, 암의 전이 등에 관련이 있다. 더우기 이 효소들은 병원균과 숙주 세포간의 직접 접촉을 증진시킨다. HA의 폴리머를 해체하는 것은 ECM의 역할에 역효과를 내며 성장요소, 항염증인자(시토킨), 정보 변환에 간여하는 다양한 효소의 저장처로서의 역할 저해한다. 그러므로 HA 분해를 막는 것은 질병의 악화 및 독소/병원균의 퍼짐을 잡는 데 있어서 중요하다. Hyaluronidase 억제제는 강력하며 신체내에서 흔히 발견되는 제어제로서 HA의 동화작용과 이화작용을 제어하는 데 간여한다. Hyaluronidase 억제제는 또한 피임제로, 항종양제로, 박테리아 번식 억제제, 및 독소 억제제로 작용한다. 추가적으로, 이 분자들은 HA와 Hyaluronidase의 임상적이고 병리적인 역할을 연구하는 데 약제로 쓰인다.

HA의 분해에서 Hyaluronidase의 분해 메카니즘은 다음 5개 스텝을 따른다.

Step 1.	효소는 hydrophobic patch를 구성하는 양극 residue를 사용하여 음극으로 차지된 물질의 바인딩 cleft에 달라붙는다.
Step 2.	이는 촉매물질 Asn 349, His 399, 및 Tyr408 이 간여하는 촉매반응이며 결과로 beta I- 4결합이 접히며 결과물인 이당류가 생겨난다.
Step 3.	효소와 마이크로 환경 물이 수소를 교환하여 효소가 자연상태로 돌아가게 되며 다음있을 촉매반응에 대비하게 된다.
Step 4.	cleft내부의 음극 패치를 사용하여 이당류 결과물을 내어 놓는 비가역반응
Step 5.	물질의 환원단 쪽으로 이당류 한개를 보내어 남아있는 HA의 위치를 변경한다.

다음의 테이블은 Hyaluronidase 억제제의 종류를 보인다.

도 1은 복수 교차결합 HA를 만드는 예시적인 시스템을 보여줌.
도 2는 복수 교차결합 HA를 만드는 또다른 예시적인 시스템을 보여줌.
도 3은 결과로 생성된 복수 교차결합 HA의 예시적인 모식도를 보여줌

설명

먼저, 하이루론산의 준비가 논의된다. 다음, 하이루론산의 진피층의, 혹은 피하적인 사용을 위해 추가적인 화학물질을 도입하여 그 성질을 개선시키는 방법이 논의된다.

바실러스균을 이용하여 하이루론산을 재조합하는 것이 배양액 안에서 직접 이루어 지기 때문에, 배양액에서 하이루론산을 정제하는 과정이 필요하다. 먼저, 바실러스 세포와 세포 찌꺼기들이 물리적으로 배양액에서 걸러진다. 필요하다면 배양액의 점도를 내리기 위해 배양액을 희석하는 과정이 있을 수 있다. 배양액에서 세포를 걸러내는데는 원심분리, 마이크로 필터링 등 많은 기법들이 알려져 있다. 필요하다면, 남아있는 상청액을 ultra-filtration등의 방법으로 걸러내어 소분자량의 불순물을 하이루론산으로부터 농축, 제거한다. 세포와 세포 찌꺼기를 제거한 후 이미 알려져 있는 많은 방법으로 하이루론산을 단순 침착시켜 배양액과 분리시킨다. 염기, 알콜, 염기와 알콜의 혼합법 등이 침착시 사용될 수 있다. 일단 침착되면 하일루론산은 물리적인 방법으로 쉽게 분리가 된다. 동결건조, 스프레이 드라잉 등의 방법으로 침전물을 말리거나 농축하여 최종적인 하이루론산을 얻는다.

분자량

하이루론산의 내용물은 변형 카바졸법(Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334)결정될 수 있다. 더우기, 하이루론산의 분자량 개체평균은 다음에 기술된 표준 방법으로 결정된다. Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull . 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; and Wyatt Technologies, 1999, “Light Scattering University DAWN Course Manual” and “DAWN EOS Manual” Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Calif.

한 경우에서 하일루론산 혹은 그 염기의 분자량은 약10,000 ~ 약10,000,000 Da 이다. 좀 더 선호되는 경우는분자량 약25,000 ~ 약5,000,000 Da 이다. 가장 선호되는 경우는 분자량 약50,000 ~ 약3,000,000 Da 이다.

다른 경우에서 하일루론산 혹은 그 염기의 분자량은 약300,000 ~ 약3,000,000 Da 이다. 좀 더 선호되는 경우는 분자량 약400,000 ~ 약2,500,000 Da 이다. 그보다 더 선호되는 경우는 분자량 약500,000 ~ 약2,000,000 Da 이다. 가장 선호되는 경우는 분자량 약600,000 ~ 1,800,000 Da 이다.

또 다른 경우는 하일루론산 혹은 그 염기는 낮은 개체 평균 분자량인 약10,000 ~ 약800,000 Da 이다. 좀 더 선호되는 경우는 분자량 약20,000 ~ 약600,000 Da 이다. 그보다 더 선호되는 경우는 분자량 약30,000 ~ 약500,000 Da 이다. 그보다 더 선호되는 경우는 분자량 약40,000 ~ 약400,000 Da 이다. 가장 선호되는 경우는 분자량 약50,000 ~ 약300,000 Da 이다.

예시

예시1 - DVS 교차결합 미세입자 이멀젼의 제조

본 예시는 DVS로 교차결합된 미세입자의 준비를 설명한다. Sodium Hyaluronate (HA, 580 kDa, 1.90g)를 수성 NaOH (0.2M, 37.5ml)에 넣고 상온에서 3시간동안 강력하게 교반하여 균질용액을 얻는다. Sodium Chloride (0.29g)를 첨가하여 잠깐동안 섞어 준다. 미네럴 오일 (10.0g)과ABIL® EM 90 surfactant (Cetyl PEG/PPG-10/1 Dimethicone, 1.0 g)을 저으며 첨가한다.

Divinylsulfone (DVS, 320 microliter)을 수성alkaline HA-solution에 넣고 1분간 저어주어 수성상태에서 균질 배분이 이루어 지도록 한다. 저속 물리교반을 행하는 동안 2분 내에 증류상을 유지상에 첨가한다. 즉각 이멀젼이 형성되며 그 상태에서 저속 교반을 30분간 상온에서 계속해 준다. 그 상태의 이멀젼을 상온에 하루밤 방치한다. 이멀젼에HCI (4 M, approx. 2.0 ml) 수용액을 첨가하고 40분간 교반하여 pH 7.0으로 중화한다.

예시 2 - pH 측정기를 이용하여 중화된 DVS 교차결합 미세입자 이멀젼의 제조

이 예제에서는 pH 지시약을 이용한 중화 법으로 DVS-교차 결합 미립자의 조제를 예시한다. 히알루 론산 나트륨 (HA 580 kDa 1.88 g)은 실온에서 2 시간 균질 한 용액이 얻어 질 때까지 강하게 교반되고 NaOH 수용액 (수산화 나트륨) (0.2 M, 37.5 ml)에 용해시켰다. 브로 모 티몰 블루의 pH 지시약 (6.6-6.8의 pH 범위 상당)가 첨가된 (15 방울 용액 파란색). 염화나트륨 (0.25 g)을 첨가하여 짧은 시간에 혼합되었다.

미네랄 오일 (10.0 g) 및 ABIL ® EM90 계면 활성제(Cetyl PEG/PPG-10/1 Dimethicone, 1.0 g)은 교반하여 혼합되었다.

Divinylsulfone (DVS 320 마이크로 리터)는 수성 알칼리 HA 용액에 첨가 된 액상에서 균일 한 분포를 얻도록 30 ~ 60 초 동안 아주 강하게 혼합되었다. 그런 다음30 초 이내에 수용액을 지용성 액체에 첨가하여기계적으로 400 RPM으로 교반한다. 즉시 에멀젼이 형성되며 교반은 실온에서 30 분간 계속된다. 중화는 수용액 HCI (4 M, 1.6ml)을 첨가하고 에멀젼을 4 시간 동안 실온에서 자석 교반 하며 방치함으로써 이루어진다. 젤 입자에 포함 된 pH 인디케이터의 색이 녹색으로 변경되었다. 에멀젼의 pH는 pH 스틱이3-4가 되는 것으로 측정되었다. 에멀젼은 밤새 냉장고에 보관되었다. 젤 입자에 놓아둔 pH 인디케이터가 노란색으로 바뀌었다.

예시 3 - 에멀젼의 상분리와 미립자의 팽창 · 분리

이 예제에서는, 그리고 상분리와 투석의 다음에 일어나는W/O 에멀젼의 파괴를 설명한다. 교차 결합된 HA 미세입자는 유기 용매 추출에 의해 W/O 에멀젼에서 분리되었다. W/O 에멀젼 (5 g)과 n-부탄올/클로로포름의 혼합물 (1/1 v% 4.5 ml)을 상온에서 시험관을 선회하여 강하게 혼합하였다. 상분리를 얻기위하여추가 mQ-물 (20ml)을 첨가하였다. 시험관을 원심 분리하여 맨 아래의 유기상, 중간 층의 유기상, 맨 위의 투명한 수용액상의 3개의 상을 얻을 수 있었다. 맨아래와 맨위층을 제거하고 중간층의 젤 입자를 투석 튜브(MWCO12-14, 000, 직경 29mm, 볼륨/길이 6.4ml/cm)로 옮겼다. 샘플은 상온에서 하루밤동안MilliQ®-water을 사용하여 투석되었다. Dialysate를 2회 더 교체해 가며 하루밤 동안 방치하였다. 결과물은 농후하고 점성이 있는 젤로서 약 50ml정도의 부피로 늘어났다. 이는0.004 g HA/cm³의 비율이다.

예시 4 - 에멀젼의 DVS 교차 결합 준비 및 미립자의 분리

이 예제에서는 DVS 교차 결합 HA 미립자의 조제를 예시한다. 히알루론산 나트륨 (HA 580 kDa, 1.89 g)을 NaOH 수용액 (0.2 M37.5 ml)에 용해시켰다. 염화나트륨 (0.25 g)이 첨가 된 균질 한 용액이 얻어 질 때까지 그 용액을 실온에서 1 시간 자석 교반 하였다. TEGOSOFT ® M (10.0 g) 오일 및 ABIL ® EM 90 계면 활성제 (세틸 PEG/PPG-10/1 지메 치콘, 1.0g)을 교반하여 혼합하였다.

Divinylsulfone (DVS 320 마이크로 리터)을 수성 알칼리 HA 용액에 첨가한 후 액상에서 균일 한 배포를 얻도록 1 분간 혼합하였다. 이어서2 분 이내에 수상액에 유상 용액을 첨가하여 기계적으로 교반(300 RPM)한다. 에멀젼이 즉시 형성되고 실온에서 30 분간 계속하여 교반하였다.

에멀젼은 당량의 HCI (4 M, 1.8 ml)을 첨가한 후 약 40 분간 교반하여 중화되었다. 에멀젼은 n-부탄올/클로로포름 혼합물 (1 : 1 v%, 90 ml)과 정상 MilliQ ® - water (100 ml)을 첨가한 후 자기 교반하여 파괴하였다. 윗층은 약 175ml의 볼륨으로 분리되었다. 유기상은 최종 세척을 위해 mQ water (30ml)과 함께 혼합되었다. 결합 물/젤 상태 (205 ml)는 투석 시험관 (MWCO12-14, 000, 직경 29 mm, 부피/길이 6.4 ml/cm)로 옮겨져 실온에서 MilliQ ® water에 밤새도록 투석되었다. MilliQ ® water를 3회 바꾸어 주고 2일밤 동안 투석을 실시한 후 전도도는 0.67 micro-Sievert/cm로 감소했다. 미립자는 현미경 법 (DIC 200 배)에 의해 평가되었다. (그림 1을 참조) 하나의 입자의 단면을 골라 "21,587.92 nm"로 표시하였다.

예시 5 - 에멀젼의 상분리 및 미세입자의 추출

이 예제에서는 W/O 에멀젼의 파괴 및 겔 미립자의 추출을 예시한다. 젤 입자는 유기 용매 추출법에 의해 W/O 에멀젼에서 분리되었다. 이 추출에 사용 된 유기 용매의 예는 각각 75:20 ~ 20.80의 부피비 (v%)에서 부탄올/클로로포름의 혼합물이다. W/O 에멀젼과 유기 용매와의 중량비 (w%)는 약 1:1이다.

*소규모의 분리 : W/O 에멀젼 (5g)는 원심 분리 관 (50 ml)에 중량 재어졌다. 부탄올/클로로포름 화합물이 준비되어 (1:1 v%)이 중에서 4.5 ml (5g 상당)의 혼합물을 시험관에 첨가하였다. 에멀젼 전체가 용해되도록 하기 위해 시험관을 신중하게 혼합하였다. 시험관을 선회 혼합하여 혼합한 후, 상분리를 위해 상온에서 방치되었다. 수성상이 맨위, 유기상이 맨 아래, 그리고 그 중간에 흰색의 에멀젼이 생기는 상분리가 종종 관찰되었다. 더 많은 물과 유기상을 첨가하면 분리는 더욱 향상된다. 수성액은 조용히 따라 내는 것으로 분리되고 추후 정제된다.

예시 6 - 기름속의 물방울 에멀전의 준비

이 예제에서는 HA 미입자가 형성된 조성물을 설명한다.

찬물B에 뜨거운 오일 상을 합치는 것으로 냉/온 제조 방법이 사용될 수 있으며 그렇게 하여 양산 제조 시간이 단축될 수 있다.

이 하나의 예에 한정되지 않는 포뮬레이션 예는 다음과 같다:

Phase A:

2.0% ABIL® EM 90 (cetyl PEG/PPG-10/1 dimethicone)

20.0% Mineral oil (or TEGOSOFT® M)

Phase B:

0.5% Sodiumchloride

3.8% Hyaluronic acid

0.2 M NaOH (aq) up to 100%

Phase C:

Approx. 0.6% Divinylsulfone

준비:

1. 상온에 Phase A를 놓아 둔다.

2. Phase B: 하일우론산(Hyacare®)을 수용성 NaOH에 저어 넣어녹게한다. 그리고 NaCl을 첨가하여 젓는다.

3. DVS를 Phase B에 첨가하여 1분간 젓는다.

4. Phase B를 Phase A에 천천히 저으며 넣어 준다.

5. 호모지나이저를 쓰거나 손을 짧게 저은 후 방치하여 반응하게 한다.

6. 저음과 부품.

7. 30° C이하에서 계속 저음.

8. 중화함.

예시 7 - DVS 로 교차 결합된 미세입자의 준비 및 분리

히알루론산 나트륨 (HA 580 kDa, 1.88 g)를 NaOH 수용액 (0.2 M, 37.5 mL)에서 용해시켰다. 염화나트륨 (0.25 g)을 첨가하고 균질 한 용액이 얻어 질 때까지 그 용액을 실온에서 1 시간 자석 교반 하였다. 오일,TEGOSOFT ® M (10.0 g) 및 계면활성제, ABIL® EM 90 (Cetyl PEG/PPG-10/1 Dimethicone, 1.0 g) 는 교반하여 혼합되었다. Divinylsulfone (DVS 320 microliter)을 수성 알칼리 HA 용액에 첨가하여 액상에서 균일 한 분포를 얻도록 1 분간 혼합하였다. 이어서2 분 이내에 수상액에 유상 용액을 첨가하여 기계적으로 교반(300 RPM)한다. 에멀젼이 즉시 형성되고 실온에서 30 분간 계속하여 교반하였다.

에멀젼은 당량의 HCI (4 M, 1.8 mL)을 첨가하여 약 40 분간 교반하여 중화하였다. 에멀젼은 분액 깔때기에 옮겨 n-부탄올/클로로포름 혼합물 (1:1 v%, 90 mL) 및 추가의 MilliQ ® water (100 mL)을 첨부 한 후 강하게 흔들어 섞는다. 약 175ml의 부피가 윗부분에 분리상으로 형성된다. 유기상은 millliQ ™ water (100ml)와 함께 혼합하여 세척했다. 결합 물/젤 상태 (205 ml)는 투석 시험관 (MWCO12-14, 000, 직경 29 mm, 부피/길이 6.4 ml/cm)로 옮겨져 실온에서 MilliQ ® water에 밤새도록 투석되었다. MilliQ ® water를 3회 바꾸어 주고 2일밤 동안 투석을 실시한 후 전도도는 0.67 micro-Sievert/cm로 감소했다.

예시 8 -미세입자를 정제하기 위한 세정법

이 예에서는 미립자의 최종 분리 및 정제를 예시한다.

이전에 분리 된 100mL의 입자가 Na2HPO4/NaH2PO4 완충액 (0.15 M, 400 mL)에 다시 현탁되어 30분 동안 천천히 교반되었다. 현탁액은 5℃ 상태에서 2 시간 방치되어 굳어진 기름이 제거되었다. 이어 용액이 메쉬를 통해 여과되고 버퍼의 2x50 mL로 더욱 세척되었다. 입자 특성화 (그림 5) 전에 드립 드라이 할 수 있었다.

예시 9 -미세입자의 유변학적 특성 연구

이 예에서는 입자에 대한 유동 학적 연구의 실시를 설명한다. 입자 시료는 50 mm 2 °의 콘 플레이트 형상을 이용하여 Anton Paar 레오 미터(Anton Paar GmbH, Graz, Austria, Physica MCR 301, Software: Rheoplus)로 분석된다.

우선, 소재의 점탄성 모형 G '(저장 탄성률)와 G "(손실 계수)의 선형 범위가 가변 왜곡 γ에서 진폭 측정으로 결정된다. 다음은 조 주파수 스윕을 해 점탄성 모형 값 및 G '과 G "의 값에 따라 탄젠트 δ가 강/약 젤 거동 값으로 계산 될 수 있다.

예시 10 - 텍스쳐 분석기 실험을 퉁한 주사기 능력 연구

이 예제에서는 시료의 균질성 기능으로, 일정한 속도로 주입하기 위해 들어가는 힘을 조사한 것을 예시한다. 입자 시료는 27G × ½ "또는 30G × ½"바늘을 붙인 주사기에 옮겨, 텍스처 분석 장치(Stable Micro Systems, Surrey, UK, TA.XT Plus, SoftWare: Texture Component 32)에 장착한다. 실험은 일정한 거리에서 12.5mm/분의 사출 속도로 진행된다.

예시11 · DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔의 조제

이 예시에서는 동시 팽윤 및 pH 조정 DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔을 조제하는 것을 예시한다.

히알루 론산 나트륨 (HA 770 kDa, 1g)을 0.2M NaOH에 용해시켜, 1 시간 동안 약 20℃의 실온에서 교반하여 4% (중량/부피)의 용액을 얻었다. 3 개의 동일시료가 준비되었다. 이어 각 10:1,7:1,5:1의 HA/DVS의 중량비를 얻을 수 있도록 충분한 양의Divinylsulfone (DVS)가 HA 용액에 첨가되고. 이 화합물은 5 분 동안 실온에서 교반 한 후 1 시간 실온에서 방치되었다. 이어 젤은 표 1과 같이 160mL의mL phosphate buffer (pH4.5 또는 6.5)에서 24 시간 팽창되었다.

DVS-HA 하이드로겔의 조제 조건
Gel ID	HA/DVS 무게비	팽창 시 사용된Phosphate buffer
1	5:1	160 ml (pH 4.5)
2	7:1	80 ml (pH 4.5) + 80 ml (pH 6.5)
3	10:1	160 ml (pH 6.5)

젤의 pH는 팽창 과정에서 안정화되었다. 팽창 된 후, 별도의 버퍼는 여과에 의해 제거되고 하이드로 겔 시트는 IKA ® ULTRA-TURRAX ® T25 균질기 (Ika Labortechnik, DE)를 사용하여 쉽게 균질화되었다. 젤 부피와 pH 측정되었다. (표 2 참조)

하이드로 겔의 pH는 7.1에서 7.6의 범위에 있었다 (표 2). 이것은 팽윤 공정이 이 과정에서 pH를 조정하는 데 사용할 수있는 것을 확인한 것이다. 모든 하이드로 겔은70mL 부피에 약 1.4% (중량/부피 (w/v)) HA 농도에 해당하였다. 이들은 투명하고, 균질하며, 끈끈한 특성이 있었다. 부드러움은 교차결합도의 감소와 함께 증가했다 (표 2 참조).

예시12 · 균질 DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔의 조제

본 예시에서는 매우 균질 한 DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔의 조제를 설명한다.

히알루 론산 나트륨 (770 kDa, 2g)은 약 1 시간 실온에서 0.2M의 NaOH에 용해되어 8% (무/부피)의 용액을 얻었다. HA/DVS의 중량비가 7:1이되도록, DVS이 첨가되었다. 5 분 동안 실온에서 교반 한 후 시료의 하나는 2 시간 50℃에서 교반없이 열처리되어 밤새도록 실온에서 방치되었다. 완성 된 교차 결합 젤은 42 또는 55 시간에서 37℃에서 200ml의 Phosphate Buffer(pH 5.5)에서 팽윤되고나서 최종적으로 100ml의 증류수로 2 회 세척되었다. 또한 그 부피, pH 및 27G * ½ 주사 바늘을 통해 주입하는 데 필요한 압력이 측정되었다. (표 3 참조)

이 예에 따라 제조 된 교차결합 결합 HA 하이드로 겔은 열처리되지 않은 대조 하이드로 겔에 비해 더 높은 팽윤 비율 및 증가된 부드러움을 얻은 것으로 나타났다 (표 3). 27G * ½ 바늘을 통해 주입하는 동안 더한 압력은 후자의 시료보다안정된 것으로 나타나, 교차 결합 HA 하이드로 겔이 더 균질하다는 것을 보여준다.

예시13 · DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔의 생물학적 안정성

이 예제에서는 효소 분해를 이용하여DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔의 체외 생물학적 안정성을 예시한다.

황소 고환 히알루로니데이즈 (HAase) 용액 (100 U/mL)가 30mM의 구연산, 150mM의 Na2 HPO4, 150mM의 NaCl (pH 6.3)에서 준비되었다. DVS-HA 교차 결합 하이드로 겔 시료 (약 1mL)는 안전 장치 유리 병에 넣어 동결 건조되고 무게가 측정되었다. ((W 0; 공식 1) 여기에 효소 용액 (4mL, 400 U)이 각 샘플에 첨가되고 유리 병은 가볍게 흔들어 주며 (100-200 rpm) 37℃에서 배양되었다. 일정 시간마다 부유물은 제거되고 시료는 잔류 소금을 제거하도록 증류수로 완전히 세척되었다. 그 후 동결 건조되고 마지막에 무게가 측정되었다. (W t, 공식 1).

생분해는 시료의 초기 부게 대비 중량 손실의 비율로 표현된다. (공식 1). 중량 감소는 효소 분해 시험 전후의 각 시료에 대한 무게측정에서 산출되었다. 생분해 실험은 각각 3 회 반복되었다. 예시 2에서 언급 한 바와 같은 방법으로 제조 된 DVS-HA 하이드로 겔 ( '열처리 있음')는 열처리되지 않은 DVS-HA 하이드로 겔 ( '열처리 없음')과 비교되었다. 두 가지 젤 모두, 분해가 처음 4 시간 동안은 빨랐다, 그 후 24 시간뒤 완료 될 때까지 점점 늦어져갔다. 중요한 것은 예시 2에서 언급한 열처리 공정을 사용하여 제작 된 하이드로 겔은 열처리되지 않은 시료와 비교할 때 중량 손실에 주목할만한 변화가 있었다. 이것은 예시 2의 방법으로 매우 균질 한 DVS 교차 결합 하이드로 겔을 얻을 수있는 것을 분명히 보여주고있다.

예시 14 - 화장품 용 W/O 에멀젼 (기름 중 물방울 형 에멀젼 )의 조제

본 예시 및 앞으로 나오는 예시에서는, DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔이 크림이나 세럼으로제조된 경우를 설명한다. 이 크림과 세럼은 피부에 발랐을 때 피부의 습윤과 탄력성을 증가시키고 즉각적인 안티에이징 효과 및 도막 형성 효과를 나타낸다.

W/O 에멀젼의 일반적인 제제는 2%의 DVS 교차결합 HA를 포함한다. 각 상 (A ~ E)은 각각 다음과 같은 재료를 혼합하여 제조되었다. (표 4 참조) 이어서 상 B를 상 A에 40℃ 미만에서 기계 힘으로 추진하는 교반 장치로 교반하며 첨가하였다. 계속 교반하며 상 C, 상 D, 그리고 상 E의 차례로 첨가하었다. 상D에서는, HA 하이드로 겔의 농도가 각각 4%, 6%, 8%가 되도록 하여W/O 제재에 범위를 주도록 제작되었다.

2%의 DVS 교차결합 HA를 포함한, W/O 에멀젼의 또 다른 일반적인 제제는 표 5에 나타난다. 표 5에서 각 상 (A ~ F)은 각각의 성분을 혼합하여 별도로 조정되었다. (표 5 참조) 상 B와 상 A를 혼합하여 얻은 유지상은 75℃로 가열되었다. 상 C도 75℃까지 가열되었다. 유지상은 75℃에서 상 C에 첨가되고 기계적인 힘으로 추진하는 교반 장치로 교반되었다. 이어서 이 에멀젼은 40℃ 이하로 식혀졌다. 그 다음, 상D, 그리고 상 E와 상 F가 첨가되고 교반되었다. 상 E에서 HA 하이드로 겔의 농도가 각각 4%, 6%, 8%의 제재도 W/O 제재의 범위를 주도록 제작되었다.

예시 15 -실리콘 세럼의 제조

표 6에 2%의 DVS 교차결합 HA를 포함한 실리콘 시럼의 일반적인 제조방식이 설명되어 있다. 모든 성분은 40℃ 미만에서 고속 교반을 해 주며 동시에 혼합했다. (표 6 참조). HA하이드로 겔의 농도가 각각 4%, 6%, 8%로 세럼이 범위를 가지도록 로 제작되었다.

예시 16 - 팽창시의 pH 평형; 속도론 연구

속도론 연구는phosphate buffer (pH 7.0)에8 ~ 14 시간(교차결합도에 따라) 담가 놓음으로서 중성 pH의 DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔을 얻을 수 있음을 보여 주었다. 위에서 설명한 방법으로 DVS 교차 결합 HA 하이드로 겔 세트가, 4% ~ 8%의 HA 솔루션 및 DVS 죠차 결합제의 다양한 양을 이용하여 만들어 졌으며 상세 조성은 표 7에 표시되었다.

정기적으로 (매 2 시간), 하이드로 겔은 열처리 중에 들어내어 액체를 따라내고 pH를 측정하었다 (그림 2 참조). 매번 측정 후에는 새로운 팽창 buffer가 사용되었다. 결과는 모든 하이드로 겔의 pH는 팽윤 2 시간 후의 경우는 11 ~ 12 사이이며, 다음은 점차 7.2 ~ 7.5로 떨어왔다.

하이드로 겔의 교차 결합이 느슨하면 느슨한수록 즉, HA/DVS의 비율이 높을수록 그 저하속도가 빨라졌다. HA 6% 용액의 경우와, HA · DVS의 2 가지 비율의 경우에 pH 저하가 그림 2에 표시되었다. 여기서 HA/DVS 비율이 10:1이면 삼각으로 표시되고 HA/DVS 비율이 15:1의 경우 사각형으로 표시된다. 이 두 경우는 pH는 8 시간 내에 중화되었다. 반면, 더 높은 HA 농도 (예를 들면 8%) 또는 더 높은 가교도 (예를 들어 2.5의 HA/DVS 비율)의 하이드로 겔은 팽윤 14 시간 후에 중성 pH에 도달할 수 있었다. 이 관측은 낮은 교차 결합 하이드로 겔의 HA 분자가 더 큰 자유와 유연성을 보여주어, 충분한 수분을 흡수할 수 있고 그것을 통해 빠른 pH 균형에 이른다는 사실과 일치한다.

예시 17 · DVS 교차 결합 HA 기반 하이드로 겔의 점탄성 모형의 특성

유동학 측정은 일정한 온도(25° C.)에서 판대판 기하학 을 이용하여 Physica MCR 레오 미터 (Anton Paar, 오스트 필 데른, 독일)로 실시되었다. 시료의 점탄성 특성은 소재가 사인 전단 왜곡을받은 동적 진폭 전단 진동 테스트에서 조사되었다. 먼저 왜곡 진폭 스위프 실험은 선형 점탄성의 활성화 변형 영역을 평가하기 위해 실시되었다. 왜곡의 전형적인 범위는 0.01 ~ 200%이며, 주파수는 1 Hz로 설정되었다. 다음 선형 점탄성 영역에서 전단 저장 비율 (또는 탄성률 G ')과 전단 손실 계수 (또는 점성 율 G ")의 값은 일정한 전단 변형 (10%)와 0.1 ~ 10 Hz 사이의 주파수로 주파수 스윕 실험에서 기록되었다. 모양, NF, 간격은 각각 PP25, 2,1 mm였다.

G '는 변형이 일어나는 동안 소재에 저장된 탄력성 또는 소재에 저장되는 에너지에 대한 정보를 제공한다. 반면 G "는 점도 특징 또는 열로 발생되는 에너지에 대해 설명한다. 특히 탄성률은 시료가 하중 을 지속하고, 스트레스를 부담한 후, 또는 변형 후 초기 구성으로 복원 능력에 대한 정보를 제공한다. 모든 실험에서 각 샘플은 적어도 3회 측정되었다.

더 강력한 교차결합이 되어 있는 하이드로 겔 (즉, 더 낮은 HA/DVS 비율 : 10/1)의 경우 G '가 G "보다 한 자리수 높다. 이것은이 시료가 강한 젤 소재로서 움직이는 것을 나타낸다 . 간단히 말하면, 전체적인 레올로직 반응은 물리적 교차결합과 화학적 교차결합에 의한 것이고, 고분자 사이의 위상적인 상호 작용에 의한 것이다. 체인 사이의 상호 작용은 그 고유 이동도의 감소를 초래하여 스트레스를 해소 할 수없게 만들고, 그 결과적으로 소재는 부하 스트레스 적응의 기본 모드가 네트워크의 변형이 되는 3 차원 네트워크로 동작한다. 또한,이 하이드로 겔은 더 낮은 교차결합의 하이드로 겔(즉, 더 높은 HA/DVS 비율 : 15:1)보다 탄력성이있다. 사실, 영구적인 공유 결합 성 가교 결합의 수가 많을수록, 하이드로 겔의 탄성 응답성이 높아진다.

예시 18 · 방부제가 첨가된 교차 결합 HA/ DVS 하이드로 겔

DVS 교차 결합 HA 히드로 겔이0.2 M NaOH용액에 1.5g의 Sodium HA를첨가하여 6% (w/v) 용액으로 제조되었다. HA/DVS 중량 비율은 10:1이었다. 히드로 겔은 예시 2에 설명 된 방법으로 팽윤 단계까지 3 개의 반복으로 준비되었다. 그 다음, 2 시간 동안 50℃ 의 인큐베이터에서 준비한 후, 하이드로 겔 은 방부제 (2-phenoxyethanol/3 (2-ethylhexyl) oxy] 1,2-propanediol)가 들어있는 Na2HPO4/NaH2PO4 완충액 (1 L, 50 mM, pH 7.0)에 담겨졌다.

팽윤 된 하이드로 겔의 최종 농도1% (v/v) 에 맞추기 위해 방부제의 농도는 10 mL/mL로 조절한다. 인큐베이션 하는 동안 방부제는 하이드로 겔에 스며들어 갈 것으로 예상되었으며, 동시에 버퍼 내의 미생물 오염을 방지 할 수있을 것으로 예상되었다.

용기는 파라 필름으로 덮여, 37℃의 오븐에 넣어졌다. 1 시간 후 팽윤을 위한 용액은 제거되고 히드로 겔은 6 ~ 7 시간 동안10 mL/mL의 방부제가 들어있는 신선한 phosphate buffer속에서 팽창되었다. 이 공정은,어디서 pH를 재어도, 팽윤 시간이 12 시간이 될 때까지 반복되었다. 팽창은 2.5시간 후 중성 pH에 도달 할 때 까지 계속되었다.

히드로 겔에 포함된 방부제의 양은 UV-분광 광도계 (Thermo Electron, Nicolet, Evolution 900, equipment nr. 246-90)에 의해 측정되었다. Phosphate buffer 중의 방부제 A1% (v/v) 용액은 먼저 분석되고 파장을 선택했다. 약 5 mL의 히드로 겔을 피펫을 사용하여 채취gk었다. 시료는 일반적으로 팽창 된 둥근 히드로 겔의 중심부와 젤의 위, 오른쪽, 왼쪽, 아래의 사방에서 채취된다.

이어 시료는 큐벳에 옮겨져 흡광도 292 nm에서 측정된다. 각 시료는 각각 3 번 측정되며 흡광도는 방부제를 포함하지 않는 DVS 교차 결합 HA 히드로 겔을 영점으로 기준했다.

그 결과, DVS-HA 히드로 겔 시트에 포함 된 방부제의 양이 0.91% ~ 1.02% 사이의 범위였던 것으로 나타났다 (표 10 참조). 같은 실험을 되풀이 하여도 아주 좋은 재현성이 나타났다. 중요한 것은 같은 히드로 겔에서 채취한 시료 간에 현격한 차이가 관찰되지 않아 히드로 겔 내부에서 방부제의 균일 한 확산을 말해 주었다.

예시 19 · 생분해 성 고분자의 선택

분해 시간은 아래 표 1에서의 고분자 화합물에 따라 조절할 수 있다. 다음의 예1 및 예 2는 약물의 방출을 제어하기위한 생분해 성 고분자에 약물 또는 약물 모체 기본 예제이다.

표1: 생분해 시간 및 성분

생분해 성 고분자의 다양한 종류가 분해 시간의 제어 및/또는 분해 부산물 제어를 위해 사용될 수 있다. 다음은 몇 가지의 생분해 고분자이다.

● PGA, PLA와 그들의 중합체는 기본 PLA/PGA 테마 안에서 고분자 조성물을 변경하여 성질을 조정할 수있는 특성 때문에 잘 이용되는 생분해 성 고분자 소재이다.

o Poly(glycolic acid) (PGA)는 가수 분해에 매우 쉽게 일어난다.

o Poly(lactic acid) (Polylactic acid-PLA)는 D 및/또는 L 광학 이성체의 혼합물 안에 존재한다.

폴리 (젖산) (Polylactic acid-PLA)로 인해 결정 영역에 D 및/또는 이러한 결과 L 거울상 이성질체 혼합물이 다른 생분해 타이밍에 존재하고 그들이 가능한 가수 분해 수준을 제한하는 화합물 인 경우 해당 양식

■ Polydioxanone (PDS)

■ Poly(ε-caprolactone)

■ Poly(DL-lactide-co-ε-caprolactone)

계면활성제의 선택

미소피막의 크기는 유기상과 수상의 계면 화학에 의해 직접 제어된다. 계면 활성제는 종종 유성 물질과 수성 환경 사이의 계면 화학을 중개하는 데 사용된다. 계면 활성제는 수용액 속에있는 세제이다. 계면 활성제는 극성과 무극성의 두 끝을 가진 거대 분자이다. 분자의 극성 끝, 또한 극성 분자는 물에 달라 붙는. 분자의 비극성 끝은 NAPL (비 수상 액체) 합성물을 끌어들인다.

가용화에 사용되는 계면 활성제의 예는 다음과 같다.

1. Sioponic 25-9 : 직렬 알코올이며, 2.75g/g의 가용화값이 있는 직렬 알코올

2. Tergitol : 1.21g/g의 가용화값이 있는 산화 에틸렌/프로필렌 산화물

3. Tergitol XL-80N : 일차 알코올, 1.022g/g의 가용화값이 있는 산화 에틸렌/프로필렌 산화물 알콕시 환율

4. Tergitol N-10 : 0.964g/g의 가용화값이 있는trimethyl nonal ethoxylate

5. Rexophos 25/97 : 0.951g/g의 가용화값이 있는 인산화 노닐 페놀에 톡실 레이트

예시 20 - 항 염증성 코르티코 스테로이드 나 스테로이드를 포함한 생분해 성 미립자

a. 30일 지연

b. 120일 지속의 조절 분비

유기 상:

- Methylene Chloride를 이용하여 20%의 DLPLG 고분자를 제조

- DLPLG 고분자는 65% DL과 35%의 PLG를 함유

- 유리관에0.02g의 triamcinolone 을 측정하여 투입

- triamcinolone이 있는 유리관에 2mL의 20% DLPLG 고분자 용액을 투입

- 궤도 혼합기를 사용하여 약물을 완전히 용해

*수성 상:

- 0.1 몰 농도의 SDS (sodium dodecyl sulfate))100mL를 DI Water를 사용 제조.

- 약물/폴리머 용액에 0.1 몰 용액의 8mL SDS를 투입

용매 증발 :

- 임펠러 혼합기의 밑에 반응 혼합물이 들어있는 유리관을 설치

- 1200 RPM까지 혼합기 가동

- 바람직한 입자 크기를 생산하는 데 필요한 속도가 알려져 있지 않으면, 천천히 시작하여 원하는 입경 크기를 제조할 수 있을 때까지 임펠러의 속도를 서서히 올림.

- 바람직한 크기를 생산하는 속도에 도달하면 80℃의 물을 넣은 욕조에서 용기를 연속적으로 혼합하면서 가열 시작

- 유기상의 모든 모든 메틸렌 클로라이드가 끓어서 없어지면 가열을 멈춘다. (이 경우 시간은 45 분)

- 혼합을 계속하며 반응물을 실온에서 천천히 냉각

- 냉각 속도 및 혼합 속도는 입자 간의 상호 응집 비율에 영향을 초래

- SDS는 DI Water로 혼합 용액을 연속적으로 교환하여 세척 할 수 있다.

- 여과에 의해 입자를 수집

- 진공 오븐 80℃에서 입자를 건조

유동층의 피막화

- 3% 및 5%고분자 조성물 을 제조: PL과 PLG 비율50:50의 methylene chloride에 넣음.

- 유동층에 약물이 포함된 건조 입자를 추가.

- 5% 폴리머 용액을 사용하여 약물이 포함된 입자위에 폴리머의 균일 층을 증착시킨다. 최적화 된 입자층을 얻도록 분사 속도와 공기 흐름을 조정한다.

- 프로세스를 종료하기 위하여 3%의 고분자 용액을 사용하여 바늘 구멍이 없는 것을 확인한다. 핀홀은 약물의 바람직하지 않은 조기 분비를 일으킬 수 있다.

예시 21 - 항 증식성 제제를 포함하는 생분해 성 미립자

a. 60일 지연

b. 365일간의 조절된 분비

유기상:

- methylene chloride를 이용하여 20% DLPLG고분자를 제조

- DLPLG고분자는 100% PGA를 포함

- 0.02g의sirolimus를 유리 시험관에 질량을 측정하여 넣는다.

- Triamcinolone이 들어 있는 시험관에 2mL의 20% DLPLG고분자 용액을 넣는다.

- 궤도 믹서를 사용하여 약품을 완전히 섞음.

수성상:

- 100mL의SDS (sodium dodecyl sulfate)을 DI water를 사용한 0.1molar 농도로 만든다.

- 8 mL의 0.1 molar SDS용액을 약품/고분자 용액에 넣는다.

용매증발:

- 임펠러 혼합기의 밑에, 반응 혼합물이 들어 있는 시험관을 위치한다.

- 1200 RPM까지 혼합기의 속도를 올린다.

- 바람직한 입자 크기를 생산하는 데 필요한 속도가 알지 못 할 경우, 천천히 시작하여 원하는 입자 크기를 제조 할 수있는 임펠러의 속도까지 속도를 서서히 올려 준다.

- 바람직한 크기를 생산하는 속도에 도달하면 80℃의 물이들어 있는 욕조에서 시험관을 연속적으로 혼합하면서 가열하기 시작한다.

- 유기상의 모든 모든methylene chloride가 끓어 없어 지게되면 가열을 멈춘다. (이 경우 시간은 45 분)

- 혼합을 계속하며 반응 용액이 실온이 될 때 까지 천천히 냉각한다.

- 냉각과 혼합의 속도는 은 입자 간의 상호 응집에 영향을 준다.

- SDS는 DI Water와 혼합 용액을 연속적으로 교환하여 세척 할 수 있다.

- 여과에 의해 입자를 수집함.

- 진공 오븐 80℃에서 입자를 건조

유동층의 피막화

- 3% 및 5%고분자 조성물 을 제조: PL과 PLG 비율65:35의 methylene chloride에 넣음.

- 유동층에 약물이 포함된 건조 입자를 추가.

예시 22 - 마취제, 코르티코 스테로이드 및 항 증식성 약품을 포함한 피부 필러 조성

a. 30 일 대기 후 120 일 동안 제어 되며 분비되는, 코르티코 스테로이드가 포함된 생분해성 미소피막

b. 60 일 대기 후, 365 일 동안 제어되며 분비되는, 안티 증식 성 약을 포함하는 생분해성 미소피막

조성의 혼합물 (건조)

- 히알루론산, 교차 결합된 60% - 95%

- 미립자를 포함한 항 염증성 약품 5% - 20%

- 미립자를 포함한 항 증식제 5% - 20%

- 마취약 (염산 리도카인) 0.1% - 5%

- 0.024g/mL 농도의 인산 완충 식염수 속에서 재구성.

예시 23 - 항증식성 약품 및 생분해성 아크릴산 중합체의 피막화

껍질 형성 페이즈

- 유기상으로 구성될 다음을 녹인다.

o 생분해 성 아크릴산 중 합체 0.25g

o sirolimus 0.75g

o methylene chloride 2mL

o 에탄올 0.1mL

- 수성상은:

o 상온의 75mL 0.5% polyvinyl alcohol 용액

■ 1200rpm 또는 바람직한 입자 크기를 얻을 수있는 적절한 속도의 기계적 믹서를 사용하여 2 phase를 분산시킴.

■ 적절한 양의 amine을 추가 (이 경우 triethyl amine)

■ 80 ℃의 중탕기에서 2 시간 혼합 계속

■ Jeffamine(T-403) 0.1mL 을 추가하여 피막 표면을 경화

■ 혼합을 계속하며 반응액이 실온이 되도록 천천히 냉각

■ 냉각과 혼합의 속도는 입자 간의 상호 응집에 영향을 줌.

■ Polyvinyl alcohol은 신선한 DI Water와 혼합 용액을 연속적으로 교환하여 세척 할 수 있다.

■ 여과에 의해 입자를 수집

■ 진공 오븐 80℃에서 입자를 건조

유동층의 피막화

- 유동층에 약물이 포함된 건조 입자를 추가.

생체 적합성뿐만 아니라, 다양한 의료 분야에서 그 유용성을 결정하는 구현하는 젤 슬러리의 중요한 특성은 그의 유동성 특질이다. 이러한 특성은 점도와 절단 속도의 의존, 다이나믹 모드에서 탄성과 점성의 특성 사이의 비율, 릴랙스 시 동작 특성 및 아래에 자세히 설명하는 몇 가지 요소가 포함되어있다. 일반적으로, 한 구현에서 제품의 점탄성은 기본적으로 두 가지 방법에 의해 매우 넓은 범위에서 제어 할 수 있다. 첫 번째 방법은 점탄성을 가진 젤 슬러리를 형성하는 두개의 페이즈 각각의 유동학 적 특성은 원하는 유동성을 가진 최종 생산물 생산하기 위하여 통제될 수 있다. 젤 슬러리의 유동을 제어하는 두 번째 방법은 두 페이즈의 적절한 비율의 선택으로 이루어진다. 그러나 이러한 매개 변수, 즉 두 페이즈의 유동성과 그 비율은 한 구현에서 만들어 지는 제품의 몇 가지 다른 중요한 특성을 결정하기 때문에, 유동성을 제어하는 가장 좋은 방법은 각각의 특정 경우에 따라 그때 그때 선택해야한다.

한 구현에 따라 만들어진 제품에 사용하기에 적합한 젤은 딱딱하고 깨지기 쉬운 젤에서 유체처럼 매우 부드럽고 변형 가능한 젤까지 다양한 종류의 유동성을 가질 수 있다. 일반적으로 교차결합 반응없이 형성된 젤, 예를 들면 기존의 젤라틴의 경우 경도와 탄성이 고분자의 밀도의 증가와 함께 증가한다. 교차결합젤의 유변학적 특성은 일반적으로 겔의 교차결합 밀도, 고분자의 농도, 교차 결합 고분자가 팽윤되는 용매의 조성 등과 같은 여러 매개 변수의 함수이다. hyaluronan과 hylan에 따른 다른 유변학 적 특성을 갖는 젤은 상술 한 미국 특허 제 4,605,691 호, 제 4,582,865 호, 제 4,713,448 호에 기재되어있다. 이러한 특허에 따르면 젤의 유변학 적 특성은 주로 초기 반응 혼합물의 고분자 농도와 고분자와 vinyl sulfone 교차결합제의 비율을 변경하여 제어할 수 있다. 이 두 매개 변수는 주어진 젤 평형 팽윤 비율을 결정하고, 따라서 완제품의 고분자의 농도와 유변학적 특성을 결정한다.

이미 안정된 팽윤 상태에 도달하게 된 젤은 기계적으로 압축함으로써 용매의 상당부분을 제거 할 수 있다. 압축은 용매는 통과할 수 있지만 젤을 통과하지 못하는 스크린이있는 밀폐 용기에서 젤에 압력을가함으로써 얻어진다. 압력은 하나의 적절한 장치 또는 가스층 혹은 공기를 통해서 편리하게 직접 젤에 적용될 수 있다. 젤을 압축하려면 하단에 상술한 반투막이있는 용기 내에서 젤에 원심력을 가하는 방법도 있다. 고분자 젤 슬러리의 압축률은 젤의 화학적 성격, 젤의 입자 크기, 고분자 농도 및 젤 슬러리내의 자유 용매 존재 등 많은 요인에 달려있다. 일반적으로 젤 슬러리에 압력이 가 해 지면 자유용매가 먼저 빨리 빠져 나오고 그 뒤에 젤 입자에서 자유용매가 훨씬 느린 속도로 빠져 나오게 된다. 젤 슬러리에서 용매를 제거하는 속도는 압력, 온도, 장치 구성, 젤 입자의 크기 및 젤 최초 고분자 농도 등의 변수에 달려있다. 일반적으로 압력, 온도 및 여과 표면적의 증가 및 젤 입자 크기 최초 고분자 농도의 감소는 용매 제거 속도의 증가로 이어진다.

젤 슬러리에서 용매의 부분적인 제거는 슬러리의 점성을 높이도록하고 슬러리의 유변학 적 특성을 상당부분 변하게 한다. 그 변화의 크기는 최초 부피와 압축 후 부피의 비율로 표현되는 압축의 정도에 달려있다.

가능한 압축의 정도, 즉 젤 슬러리의 압축도는 젤 따라 다르다. 예를 들어, 식염수에서 hylan 젤 슬러리는 쉽게 20 이상의 압축비에 도달 할 수 있다.

압축 된 젤을 원래 사용된 용매를 사용하여 원래 고분자 농도와 같은 농도로 재구성하게 되면 원래의 젤과 동일한 젤을 생성한다. 이것은 유변학적 특성측정 및, 젤에서 원심 분리를 이용한 의한 용매 제거의 속도의 측정에서 증명되었다.

또한, 한 실시 예에 따른 점탄성 혼합물 젤의 고분자 농도는 차례로 화합물의 최종 용도에 의해 결정되는 화합물의 바람직한 특성에 따라 광범위하게 변화 할 수 있다고 보아야한다. 그러나 일반적으로 젤의 고분자 농도는 가능하면 0.01에서 20%, 0.05에서 20%로 할 수 있다. hylan과 hyaluronan의 순수 또는 혼합 겔의 경우 겔의 고분자 농도는 0.1 ~ 10%의 범위 인 것이 바람직하다. 또한, 더욱 바람직한 경우는, 팽윤 용매가 생리 식염 용액 (0.15M 수분 염화나트륨)의 경우 0.15에서 5%이다.

상술 한 바와 같이, 한 실시 예에 따른 점탄성 젤 슬러리의 2단계를 위한 가용성 고분자의 선택은 생산물의 최종 용도에 의해 결정되는 많은 고려 사항에 의해 결정된다. 수용성 고분자의 상 중의 고분자 농도는 최종 화합물의 바람직한 특성 및 젤의 특성에 따라서 넓은 범위에 거쳐 변화하는 경우가있다. 점탄성 젤슬러리의 유변학 적 특성이 최대 관심사일 경우, 수용성 고분자 농도는 그에 맞게 고분자의 화학적 성질과 그 분자량에 충분히 배려하여 선택할 수 있다. 일반적으로 용해 단계의 고분자 농도는 0.01% ~ 70% 사이이며 더 바람직하게는 0.02% ~ 40%이다. 또는 히알루 론산은 수용성 고분자로 사용되는 경우에는 그 농도는 0.01 ~ 10% 범위이며, 바람직하게는 0.02 ~ 5%의 범위 내이다. 콘드로이친 황산이나 데르 마탄 황산 등등과 같은 다른glycosaminoglycan 이 수용성 고분자로 사용되는 경우는 훨씬 낮은 분자량을 가지고 있기 때문에 그 농도는 크게 높아질 수 있다.

한 실시 예에 따른 점탄성 젤 슬러리를 형성하는 두 phase는 교반기 및 혼합기와 같은 어떠한 전통적인 방법으로도 혼합 될 수 있다. 폴리머 용액내의 젤의 균일 한 분포를 달성하기 위해 혼합은 충분한 시간동안 되어져야한다. 상술 한 바와 같이, 이미 젤phase로 되어 있는 경우는 메쉬 또는 구멍이있는 플레이트에서 누르거나 빠른 속도로 적당한 교반기에서 교반하는 전통적인 방법으로 분리시켜 젤 슬러리를 얻을 수 있다. 그 외에도, 점탄성의 혼합 젤 슬러리는 폴리머 용액으로 큰 젤을 혼합 한 후, 위의 전통적인 방법에 의한 점탄성 슬러리의 혼합물을 분리시킴으로써 제조 할 수 있다. 전자에 예시된 방법으로 혼합 젤 슬러리를 준비하는 한 실시 예의 경우, 젤 슬러리 Phase는 평형상태까지 팽창된 젤로 만들어 질 수 있고, 이 경우 젤 입자 간 자유 용매가 없거나 약간의 자유 용매가 있다. 후자의 경우는이 자유로운 용매는 두 번째 Phase로 사용되는 고분자 용액의 농도를 희석한다. 세 번째 유형의 젤 phase로 사용되는 젤 슬러리는 위에서 설명된 특성을 가지고 있는 압축 젤이다. 압축 젤 슬러리가 폴리머 용액과 혼합되었을 때 어떤 경우에는 각 성분과 그 화합물의 열역학에 의해 용액 상에서의 용매가 젤 phase에 들어가 젤 phase를 평형에 더 팽창시키는 경우가 있다.

한 실시 예에 따른 점탄성 혼합 젤 슬러리의 조성은 넓은 범위에서 변화 할 수 있다. 혼합물에서 고분자 용액은 0.1 ~ 99.5%, 바람직하게는 0.5 ~ 99%, 더욱 바람직하게는 1 ~ 95%를 차지하고 나머지는 젤 phase가된다. 혼합물의 적절한 조성물의 선택은 두 성분의 특성과 그 조성에 따라, 슬러리의 바람직한 특성 및 최종 용도에 의해 결정된다.

한 실시 예에 따른 점탄성 젤 혼합물은 폴리머 젤 슬러리 및 폴리머 용액의 두 가지 주요 성분 이외에, 생산물의 최종 용도에 따라, 미결정 셀룰로오스, 금속 분말, 무기 염류, 불용성 무기 염류, 염료, 계면 활성 물질, 기름, 점도 조정제, 안정제 등과 같은 약품, 필러 등 다양한 생리 활성 물질 등 많은 다른 성분이 포함 될 수 있다.

한 실시 예에 따른 점탄성 젤 슬러리는 본질적으로 규칙적인 또는 불규칙적인 모양의 개별 점탄성 젤 입자가 균일하게 분포되어 유체로 유동 액으로 작용하는 지속적인 폴리머 용액 행렬을 나타낸다. 즉, 그 점탄성 젤 슬러리는 특정 점도, 탄성, 소성을 보여준다. 슬러리 조성 매개 변수, 즉, 젤 상과 용액 상 중의 고분자 농도 및 두 상간의 비율을 변화시킴으로써 지속적인 흐름의 점도, 동적 모드에서 탄성 완화 특성, 점성 거동과 탄성 거동 비율 등 슬러리의 유변학 적 특성을 제어 할 수 있다.

한 실시 예에 따른 점탄성 젤 슬러리의 조성 매개 변수의 영향을 강하게받는 다른 특성 그룹은 슬러리에 및 슬러리에서 주변 환경에 다양한 물질의 확산과 관련되어 있다. 확산 과정은 보다 상세하게 뒤어세 설명될 것이며 조직과 약물 전달 간의 유착 형성 예방 등 의료 분야에서는 점탄성 젤 슬러리의 일부 특정 응용이 매우 중요하다.

대부분의 수술 후에 가장 일반적이고 매우 바람직하지 않은 합병증 중 하나는 협착의 형성이다. 협착 형성의 메커니즘은 일반적으로 분리되었어야 할 두개의 조직이 피브린 혈전 형성에 의한 흉터 조직 발생으로 인해 다시 붙어 버리는 것에 관련있다. 협착은 다수의 원치 않는 증상을 일으키는 데, 이는 불쾌감이나 통증과 같은 가벼운 경우에서 특정 경우에는 생명을 위협할 수도 있다. 많은 경우 협착이 일어나면 단순히 협착을 제거하기 위해 최소한 재 수술이 필요하나 그렇다고 재수술이 협착제거를 보증하는 것은 아니다. 협착을 제거하는 방법 중 하나는 조직 사이의 간격에 피브리노겐의 확산을 방지하는 몇 가지 재료로 수술 중에 영향을받은 조직을 분리하여 그 사이에 연속 섬유소 덩어리가 생기지 않게 하는 것이다. 생체 적합성이 있는 점탄성 젤 슬러리는 협착을 방지하는 물질로 사용될 수 있다. 하지만 일반 젤 슬러리의 경우 낮은 분자량과 분자량 물질은 특히 슬러리가 체액과 혼합하여 젤 입자가 서로 분리 된 때 젤 입자 사이에 쉽게 나타난다. 한편, 한 실시 예에 따른 점탄성 혼합 젤 슬러리는 체내에 이식될 때 젤 입자 사이에 위치하는 고분자 용액 phase는 체액의 희석 후에도 확산을 제한하고 계속 유착을 방지한다. 또한 이 효과는 고분자 용액상의 고분자 농도의 증가와 함께 더 두드러지게된다.

한 실시 예에 따른 점탄성 혼합 젤 슬러리가 드럭 딜리버리의 수단으로 사용되는 경우에도 마찬가지이다. 슬러리의 각 상 또는 두 상은 체내에 주입 된 후 점탄성 슬러리에서 천천히 확산하는 생리 작용을 가진 약품 또는 다른 물질을 담을 수 있다. 확산 속도는 슬러리의 조성 매개 변수 변경으로 편리하게 제어 할 수 있다.

한 실시 예에 따른 점탄성 혼합 젤 슬러리의 성분은 매체를 통해 살아있는 세포의 이동 속도를 떨어 다양한 표면에 그 유착을 방지하여 살아있는 세포의 거동에 영향을 미친다. 이러한 효과의 표현 정도는 혼합물의 두 성분의 조성물 및 그 비율, 표면의 성질과 점탄성 젤 슬러리와의 상호 작용, 세포 유형 등과 같은 요소에 크게 의존한다. 그러나 어떤 경우에도 점탄성 젤 슬러리의 특성은 암의 증식과 전이 등의 경우에 세포 이동 및 세포 유착의 조절이 가장 중요하다. 어떤경우에도 점탄성 젤 슬러리는 암의 전이 방지 등의 의학 장애의 치료에 사용될 수 있다.

상기에 예시된 생체 적합성 점탄성 젤 슬러리의 두가지 응용분야 이외에, 한 실시 예에 따른 또 다른 가능한 응용은 연부 조직 보강, 안과 및 이비인후과 등의 분야에서 점성 수술 도구로서의 재료의 사용, 상처 관리, 정형 외과에서 관절염 치료 등이다. 이러한 응용의 모든 영역은 혼합 젤 슬러리의 다음 기본적인 특성이 이용된다 : 생체 적합성, 제어 가능한 점탄성 및 확산 특성, 주입 부위에 체류 시간을 용이하게 통제, 물질의 용이한 취급 (예: 가는 바늘을 통한 주입). 다음의 방법은 한 실시 예에 의해 얻어진 생산물의 특성결정을 위해 사용되었다. 용액의 hylan 또는 hylauronan의 농도는 자동화 된 카바 졸 법 (EA Balazs, et al, Analyt. Biochem. 12, 547-558, 1965)을 사용하여 hexuron산 분석 시험에 의해 결정되었다. 젤상에서의 hylan 또는 hyaluronan 의 농도는 미국 특허 제 4,582,865 호의 실시 예 1에 기재 한 바와 같이, 변형된 hexuron산분석 시험에 의해 결정되었다.

유동학적 특성은 제어 전단 비율 전산화 레오 미터이며, 점도 측정, 진동, 완화의 3 가지 모드로 작동 할 수있는 Bohlin 레오 미터 시스템으로 평가되었다. 저 · 고 절단속도의 절단 점도 측정은 점탄성 젤 슬러리 및 생산물의 많은 응용에 중요하다. 다양한 주파수에서의 점탄특성의 측정은 탄성 (저장 탄성률 G ')의 특성과 점성 (손실 탄성률 G ")의 특성 사이의 균형으로 설명되었다. 완화 성질을 규명하기 위하여 절단 계수 G의 변화로 설명하였다.

다음은, 다양한 HA의 교차결합 방법에 대해 설명한다. 다음 반응은 가장 반응성이 높은 기능 그룹인 hydroxyl기와 carboxyl기에 중점을 둔다.

1. Bisepoxide,

Ethyleneglycol diglycidyl ether

1,4-butanediol diglycidyl ether

이 방법은 원래 Agarose를 교차결합하기 위하여 개발되었다. 현재 HA를 교차결합하기 위하여 반응은 bisepoxybutane와 sodium borohydride을 사용하여 희석된 NaOH용액 내에서 진행된다. Hyaluronan과ethyleneglycol diglycidyl ether을60 °C 의 0.1 N NaOH의 에탄올 용액에서 반응시키는 것도 하이드로젤을 만들어내는 데 쓸 수 있다. (그림 4A) 결과물인 젤은 수분 함유량이 높고(>95%), 염증 (자극) · 주사 방법 약물 전달을위한 반응 분해 가능한 매트릭스로 사용하기 위해 조사되었다. Hyaluronan과 alkaline 1,4-butanediol diglycidyl ether에서 제조 된 하이드로 겔은 고도로 다공성였다. 그리고, 이 시료는 perioxidate에서 활성화 된 후 Arg-Gly-Asp (RGD)이라는 세포 접착 도메인을 포함하는 18 아미노산 펩타이드로 변형되어 히드로 겔과 세포 접착을 강화한다. 알칼리성 매체에서, divinyl sulfone도 수산기와의 반응을 통해 히알루론산을 교차결합 시킨다.

2. Divinylsulfone (DVS)

알칼리성 매체에서, divinyl sulfone도 수산기와의 반응을 통해 히알루론산을 교차결합 시킨다.

3. 내부 에스테르 화

자동교차 결합된 고분자 (ACP ™, Fidia)는 히알루론산의 수산기와 카르복시기 사이의 분자간 조인을 유도하여, 히알루론산의 내부 에스테르화 를 유도한다. ACP ™은 백색 분말로 동결 건조시켜, 투명한 젤로 수화 될 수 있다. 이 새로운 종류의 생체 적합 물질은 수술 후 를 감소시키는 장벽으로 사용되고있다.

4. 광 교차결합

hyaluronan의 methacrylate유도체는 상술 한 바와 같이 과잉의methacrylic anhydride의 에스테르 화에 의해 합성되었다. 이 유도체는 514 nm의 아르곤 이온 레이저 조사 하에서의 개시제로서 1 - 비닐 -2 - 피 롤리 돈 및 트리에탄올 아민 속의 에틸 에오신을 사용하여 안정된 하이드로겔을 형성하기 위해 광 교차결합 했다. 장애 조직을 둘러싼 접착 겔의 형성을 초래 히알루 론산 유도체의 현장 광교차결합의 사용은 주변 기관에서의 분리를 제공하여 유착의 형성을 방지 할 수 있다. 예비 세포 피막 시험은 랑게르한스섬을 이용해 인슐린의 인공생산의 근원을 성공적으로 개발했다.

5. Glutaraldehyde 교차결합

이 과정의 화학적 성질이 확인되지 않았지만, 양이온 교환 히알루론산 나트륨 (1.6 MDa)에서 추출된 히알루론산 스트랜드는Glutaraldehyde 수용액 중에서 교차결합 되었다. 그 다음, 스트랜드의 표면은 폴리-D-라이신과 폴리-L-라이신의 부착으로 재구성되었다. 폴리펩티드가 표면에 다시 떠오르는 히알루론산 스트랜드는 좋은 생체 적합성을 보여주고 세포 접착을 촉진했다.

6. 금속 양이온 촉발 교차결합

Intergel ® (FeHA, LifeCore)는 수산화제이철과 킬레이트 화에 의해 형성된 히알 론산 히드로 겔 제제이다.히알루론산의 유사한 교차결합이, 구리, 아연, 칼슘, 바륨 및 기타 킬레이트 화 금속을 사용하여 제조하는 기초가 되었다. 붉은 FeHA 젤은 수술 후 협착을 방지하기 위해 개발 중이다.

7. Carbodiimide 교차결합

Incert ®는 수성 isopropanol 중에서biscarbodiimide와 hyaluronan을 교차결합하여 제조 된 생체 흡수성 스펀지 (Anika Therapeutics)이다. 이 방법은 다른때라면 바람직 하지 않은 성질인 carboiimide이 hyaluronan과 반응하여 N-acylureas를 형성하는 경향을 이용한다. 이 응용방법에서는 2 개의N-acylureas결합이 형성되어 화학적으로 안정적이고 부산물없는 교차결합을 제공한다. 소수성인biscarbodiimides를 사용하므로 Incert ®는 봉합사가 없이도 조직에 달라 붙으며 혈액이 있는 상태에서도 그 효력을 발휘한다. 최근에는 토끼의 배설물 찰과상 연구에서 수술후 협착을 방지하는 데 효과적인 것으로 나타났다.

낮은 수분을 함유한 히알루론산 하이드로 겔 막은히알루론산 (1.6 MDa)막을 수용성carbodiimide을 결합제로 사용하는 교차결합을 통해 얻어졌다. 낮은 수분 히드로 겔 산이 얻은 가장 높은 교차결합도는 80% 에탄올에서 얻어졌다. 함수율 60%의 이 필름막은 완충 용액에 침지 후 2 주간 걸쳐 안정된 상태를 유지한다. L-lysine methyl ester가 존재하는 상태에서, 수용성carbodiimide 와 hyaluronan 막과의 교차결합은 hyaluronan 막의 생체 내 분해를 연장시켰다.

8. Hydrazide 교차 결합

위에서 기술한 Hydrazide화학을 사용하여 히드로 겔은 bishydrazide, trishydrazide, 및polyvalent hydrazide화합물로 만들어 졌다. 시약의 반응 조건 및 몰비를 조절하여 부드럽게 부어 낼 수 있는젤에서 기계적이고 경질의 부스러지기 쉬운 젤까지의 물리적 화학적 특징이 다른 젤을 얻을 수 있다. HA-ADH는 시중에서 판매되는 작은 분자 homobifunctional 교차결합제를 사용하여 교차결합 될 수 있다. 최근 들어, HA-ADH를 고분자 교차결합제인 PEG-dialdehyde와 생리적 조건에서 교차 결합하는인시투 중합 기술이 개발되었다.

명확하게 정의 된 기계적 강도를 가지는 생태 적합성이 있고 생분해 성이 있는 히알 론산 하이드로 젤 필름을 용매를 증발시켜 얻을 수 있었다. 이러한 하일루론산 하이드로 젤 막을 이용하여 고분자 약물을 천천히 분비할 수 있으며, 이러한 새로운 물질은 상처 치료과정에서 재상피화를 촉진했다.

1. 잔여 단백질을 이용한 교차 결합

이것의 예는 Hylan (Biomatrix)이다. 이들은 염기성 용액에서 포름 알데히드와 히알루 론산 함유 잔여 단백질을 교차하여 형성된 히드로 겔 또는 히드로 졸이다. 13 수용성 hylan은 hyaluronan에 비해 더 강한 유변학적 특성을 나타내는 고분자형태(8 - 23 MDa)의 hyaluronan이다. Hylan 젤은 수용성 hylan 소재보다 탄성과 점성이 높고, 자연상태의 hyaluronan과 같은 높은 생체 적합성을 유지할 수 있다. Hylan 수많은 의학적 응용분야에서 연구되고있다.

2. 다중 콤포넌트 반응

3~4가지의 콤포넌트로 이루어 진 반응이 있으며 이들은; (1) Passerini반응 및 (2) Ugi반응으로 알려져 있다.

Passerini 반응은 hyaluronan의 수용액이 수용성glutaraldehyde (또는 다른 수용성 디 알데하이드)와 혼합되어 반응성이 높은isocyanide, 예를 들어cyclohexylisocyanide,에 알려진 양 만큼 첨가된다.

Ugi 반응이라고 알려진 4개 콤포넌트 반응 (그림 4F)에서는 diamine이 3 성분 혼합물에 첨가된다.

교차결합도는 알데히드와 디아민의 양에 따라 통제된다.

3. 표면 변형

한 구현 예에서 폴리 프로필렌 (PP)과 폴리스티렌 (PS)의 표면이 아르곤 가스와 암모니아 가스 플라즈마로 활성화 되어 고분자 표면이 시작되도록 실시한다. 다음, 표면에 펜던트 carboxyl 작용기를 얻기 위해 발산 된 표면은succinic anhydride으로 변형되었다. 그런 다음이 펜던트 carboxyl 작용기는carbodiimide 의 존재 하에서 HA-ADH와 함께 응축되어 친수성, 비 점착성, 매끄러운 플라스틱 표면을 얻었다. 금속 표면과 유리 표면은 표면 활성화 후 적절한 히알루론산 유도체를 공유 결합으로 부착하여 변형할 수 있다.

2. HA는 다음과 같은의 4 가지의 치료 목적의 변형 옵션이 있다.

1. A : HA는 (1) 수산기의 위치한 곳과 (2) 카르복실기가 위치한, 두 곳에서 가교 할 수 있다.

2. B : 수산기 및/또는 카르복실기와 반응하기 쉬운 관능기를 가진 약품은 HA 분자에 결합되어 HA 분자가 약품의 전달 물질로 작용할 수 있다.

3. C : 개별 HA 분자는 수산기 및/또는 카르복실기와 반응하기 쉬운 펜던트 관능기를 갖는 고분자 사슬에 이식 또는 공유 결합 될 수 있다.

4. D : HA 분자는 그 작용기가 반응하기 쉬운 경우 리포솜에 이식 할 수 있다.

HA 치료 목적 변형의 옵션들은 교차결합 HA 하이드로 겔, HA 약품 bioconjugate, HA 이식 중합체, HA 리포좀을 포함한다.

HA 반응 사이트들

5. 카르복실기 화학 반응들

1. 에스테르화

에스테르화된 히알 론산 생체 적합 물질은dimethylformamide(DMF) 용액에alkyl halide와 하일루론산의 테트라 (n-부틸) 암모늄염과의 알킬화에 의해 만들어 졌다. 이러한 히알루론산 에스테르는 짜내서 멤브레인이나 필터를 만들거나, 동결건조하여 스펀지를 얻거나 미세 구체를 만들어 내기 위해 분무 건조 · 추출 · 증발 처리 할 수 있다. 이러한 고분자는 건조시는 우수한 기계적 강도를 나타내지 만, 수화 한 것은 그만큼 튼튼하지 않다. 에스테르 화 정도는 효소 분해에 대해 강도과 안정성을 높이 감도가 낮은 중합체 사슬 네트워크를 생성하는 소수성 패치의 크기에 영향을 미친다.

2. Carbodiimide로 유도된 반응

3. carbodiimide 화합물에 의한 히알루론산의 카르복실작용기의 화학적 변형은 일반적으로 pH 4.75의 물속에서 이루어진다.

6. 하이드록실기의 화학 반응

1. 황산화

DMF 안에서sulfur trioxide-pyridine중합체와 히알루론산의 황산화는 다른 정도의 황산화화를 만들어 내어, HyalSx, disaccharide당 x = 1 - 4가 된다. 다음, 황산화된 hyaluronic acid HyalS3.5는diamine polyethylene glycol유도체 및 수용성 carbodiimide를 이용하여 플라즈마 처리된polyethylene (PE)에 고정되었다.

트롬빈 시간 시험 및 혈소판 접착 유형이 이 방법이 혈액에 적합하고 혈전 PE 표면의 조제를 기대할 수있는 것을 보여 주었다. 또한 HyalSx은 빛 해리성azidophenylamino 유도체로 변환되고 테레프탈산 폴리에틸렌 (PET) 필름에 빛에 반응하여 고정되었다. 황산화히알루론산으로 코팅 된 9 표면은 코팅되지 않은 표면과 비교하여 세포 부착, 오염, 세균 증식의 현저한 감소를 보여준다. 또한 코팅은chondroitinase 와hyaluronidase에 의한 분해에 안정였다.

Hyaluronan butyrate는 약물 전달 시스템, 특히 종양 세포를 표적하는 데 사용된다. Butyric산은 세포의 분화를 유도하고 DMF 함유 디메틸 아미노 피리딘 중에서의 무수 버터와 저분자 히알 론산의 sym-collidinium 소금과의 반응을 통해, 히알 론산과 결합시키는 인간 종양의 다양한 성장을 억제하는 것으로 알려져있다.

2. Isourea 커플링 혹은 브롬화 시안의 활성화

안트라사이클린계 항생제adriamycin 및daunomycin은 브롬화 시안 (CNBr) 활성화를 통해 히알루론산과 결합시켜졌다. 이 반응 방식은 일반적으로 올리고당 축적을 활성화하고 반응성이 높은isourea 중간체를 통해 친 매트릭스를 생성하는 데 사용된다. 치료는 올리고당 축적 또는 우레탄 결합을 통해glycosaminoglycan의 수산기 기능그룹의 하나에 부착하지만, 분광 검증은 없었다. 또한 반응 조건의 거칠면 히알루 론산의 완전성과 생체 적합성을 손상시킬 수 있다.

3. Peroxidase산화

반응성이 좋은bisaldehyde작용기는 sodium peroxide의 산화에 의한 hyaluronan의 주변 2차 알코올기에 의해 생성될 수 있다. 이 화학작용은 친 고정화 또는 형광 프로브로의 변환을위한, 당 단백질의 화학 활성화의 표준 방법이다. Peroxidase로 활성화 된 hyaluronan, Primary amine과 환원 결합시킴으로써 만들어 지는 교차결합은 세포 부착 도메인 도메인을 포함하는 펩타이드 혹은, 고정 재료를 얻을 수 있다. 강력한 산화 처리는 사슬 절단 혹은 하일론산 생체 물질의 잠재적인 면역원성 연결의 가능성을 제시한다.

3. 환원단말 변형

히알루론산의 환원 단말의 환원성 아미네이션은, 친 매트릭스를 만들거나, fluorophore로 표시한 재료를 만들고, 또는 히알루론산 인지질을 만들어 히알루론산 리포좀 내에 삽입하는 데 사용된다. 예를 들어, 저 분자량 히알루 론산은phosphatidyl-ethanolamine에 공유 결합되고, 이 conjugate은 저밀도지단백 (LDL) 입자의 표면 보호를 위한 "설탕 장식"으로 사용된다. Glycosaminoglycan 하나에는 단 하나의 부착점이 있기 때문에, 끝 표지화는 히알루론산 생체 재료 또는 제약 분야 응용에 상기 설명된 응용분야 이외에 널리 사용되고 있지 않다. 이는 고분자 hyaluronan의 부하 및 교차 결합응용분야의 가능성을 현격히 떨어뜨린다.

4. Amide 변형

천연 히알루 론산은, 일부 제제에서, 유도체화 될 수있는 많은 자연 탈 실화 글루코사민 단위를 가진다. 환원 단말 변형과 마찬가지로, 이것은 매우 낮은 변형속도가 나온다. 그러나 일반적으로 사용되는 히드라진분해법이 사용되는 경우, N-아세틸 기의 변형은 중요 할 수 있다. 히알루론산의 한정된 히드라진 분해는 히알루 론산에서 자유 글루코사민 잔류물을 만들뿐만 아니라 염기 유도 백본 분해 및 환원 단말 변형을 이끌어 낼 수 있다.

또 다른 실험에서, 재료는 다음과 같은 방법을 포함 할 수 있다.

1. 실험 방법

1. 실험 0001-12: 수중 유성 에멀젼의 교차결합 반응

1. 반응은 수중 유성 에멀젼 반응이다.

2. 상온에서 1시간 반응하게 유지한다.

3. 원심분리를 이용하여 젤 입자를 수거한다.

4. 아세톤으로 씻어낸다.

2. 실험 001-14

1. X-Linker혼합물을 먼저 만들어 둔다.

2. 다음 반응 혼합물을 만든다.

3. HA에 0.775g의 X-Linker 혼합물 “a” 부터 “e”까지 첨가한다. 반응이 일어난다.

4. X-Linker가 HA에 잘 섞일 수 있도록 젓는 도구를 이용하여 잘 섞어 준다.

5. 매 30-60분마다 섞어 주며 각각의 반응이 상온에서 일어나도록 해 준다.

6. 8시간의 반응 후에는 반응물은 교차결합된 하일루론산 젤이 된다.

7. 0.5시간 마다 섞어 주며 52℃에서 3시간 방치했다.

8. PBS로 3회 세척했다.

3. HA 교차결합 프로세스에서 성분의 주변 조건

실험 001-16: X-Linker 혼합물 보관 수명 및 반응 온도

1. X-Linker 혼합물은 상온에서 24시간 이내에 사용되어져야 한다.

1. 반응온도는 50C에서 1시간 이상 지속하는 것은 안된다.

실험 001-17: 1% NaOH의 보관 수명

2. X-Linke를 포함한 NaOH용액은 제조 후 1시간 이내에 사용되어야 한다.

3. NaOH농도 1 normal은 완전히 반응한 제품을 만들기에는 너무 낮다.

2. X-Linker의 보관 수명 -BDDE

1. 실험 001-18: NaOH용액과 혼합되면, BDDE를 포함한 그 혼합액은 3시간 이내에 사용되어 져야 함을 보여 주었다.

4. X-Linker 보관 수명 -DVS “추후 결정”

5. 실험 001-19

1. A와 B를 같이 섞은 후, 잘 혼합한다.

2. 매 30분 마다 혼합하면서 상온에서 2시간 방치한다.

3. 매 30분 마다 혼합하면서 50ºC에서 방치한다.

4. 제품은 상업적으로 판매되고 있는 Juvederm과 매우 유사하게 보임.

6. 실험 001-21

1. A에 B1부터 B5까지 차례대로 넣은 후 잘 혼합한다.

2. 매 30분 마다 혼합하며 상온에서 2시간 동안 방치한다.

3. 매 30분 마다 혼합하며 50ºC에서 1시간 동안 방치한다.

7. 교차결합의 레벨에 따른 효과

1. 실험 001-22: BDDE (1,4-butanediol diglycidylether)

2. 실험 001-25: DVS(Divinyl Sulfone)

하나의 실현 방법에서 HA는 순차적으로 교차 결합되어 단일상(모노페이직)의 성질을 가진 시스템을 만들어 낼 수 있다. 생물학적 적합성을 가진 교차결합 폴리머를 IPN(Interpenetrating Network: 상호침투형 네트워크)형태로 만드는 것은 헤테로다당을 교차결합하여 단일 교차결합물질을 만들고, 이렇게 만들어진 단일 교차 결합 물질에 1회 이상의 추가 교차결합을 실시하여 다중 교차 결합 물질을 만드는 것으로 만들 수 있으며, 이렇게 만들어 진 다중 교차 결합 물질은 단일 교차 결합 물질에 비하여 인체에서 오래 유지된다. 이렇게 만들어진 결과물은 약하게 교차결합된 외피에서 강력하게 교차결합된 심부로 부드럽게 연결되는 물질이 된다. 약하게 교차결합된 하이루론산은 인체에 가는 바늘을 사용하여 쉽게 주입될 수 있으나 인체에서 오랫 동안 유지되지 못한다. 반면, 강력하게 교차결합된 하이루론산은 인체에서 오랫동안 유지되기 때문에 종전의 하이루론산 피부 필러를 사용앴을 때 처럼 지속적인 터치업 치료가 필요하지 않다.

여기서 가장 선호하는 실현방법에 의하면, 안정된, 지연되어 활성화되는 교차결합제의 비수용성 현탁액을 이용한 교차 결합시간은 다음의 하나 혹은 모두를 변화시켜 조절이 가능하다.

1) 사용된 교차결합제

2) 하이루론산 현탁액의 입자 크기

3) 하이루론산을 포함한 액체의 산도

4) 하이루론산 현탁액의 농도

5) 용액의 온도

실제예로서, 유사한 환경에서 사용되었을 때, 하일루론산의 분자량을 이용하여 수용액의 교차결합시간을 적확하게, 효과적으로, 조절할 수 있었다. 구체적으로 말하면, 분자량이 큰 쪽의 하일루론산 현탁액이 분자량이 작은 쪽 보다 교차결합에 걸리는 시간이 오래걸린다.

하일루론산 현탁액의 입자 크기의 경우는, 입자 크기가 증가할 수록 교차결합 시간이 증가한다. 반대로, 입자크기가 줄어들 수록 본 수용액의 교차결합 시간은 줄어든다.

이 수용성 고분자 용액의 교차 결합전 산성도는 교차결합 시간을 조절하는 데 사용된다. 수용성 고분자 용액의 산성도는 안정된, 지연되어 활성화되는 HA 교차결합제의 비수용성 현탁액의 용해 속도에 영향을 준다. 구체적으로 말해, 수용성 고분자 용액의 산성도가 증가할 수록, 현탁액의 주성분이 하일루론산인 경우 교차결합제 현탁액의 용해속도는 증가하며, 현탁액의 주성분이 붕사입자일 경우에는 용해 속도는 감소한다. 반대로, 입자의 크기가 감소할 수록 수용액의 교차결합에 걸리는 시간은 감소한다.

수용성 고분자 용액에 들어있는 안정된, 지연되어 활성화되는 HA 교차결합제의 비 수성 현탁액의 농도 (즉,로드)와 교차결합제 서스펜션의 성분은 모두 유사하게 수용성 고분자 용액의 교차결합 시간에 영향을 미친다. 즉, 수용성 고분자 용액에 들어있는 지연되어 활성화되는 HA 교차결합제의 비 수성 현탁액의 농도가 늘어나거나, 교차결합제 서스펜션의 성분이 늘어나면 교차결합 시간은 줄어든다. 반대로, 수용성 고분자 용액안에 들어있는 지연되어 활성화되는 붕소 교차결합제의 서스펜션의 농도 나 교차결합제 서스펜션의 함유량이 줄어들며, 수용성 폴리머 용액의 교차결합시간은 늘어난다.

온도는 수용성 고분자 용액의 교차결합시간을 조절하는 데 사용될 수 있다.

수용 성 폴리머 솔루션의 온도가 증가 함에 따라 교차결합에 걸리는 시간은 감소한다. 반대로, 수용성 폴리머 솔루션의 온도가 감소하면, 교차결합 시간은 증가한다. 또한, 수용성 고분자 용액의 교차결합시간은 안정된, 지연되어 활성화되는 HA 교차결합제의 비 수성 현탁액을 제조하는 데 사용된 클레에의 종류에 따라서 증가하거나 감소한다.

또한, 고분자 미세구체, 고분자 미셀 , 수용성 폴리머나 하이드로 겔 타입의 물질들은 의약제품을 생화학 분해작용에서 보호하는 역할을 할 수 있으므로 생명공학응용 프로그램 에서 특히 약물 전달 장치 의 구성 요소로 사용되는 데 큰 잠재력을보여 주었다. 생체 고분자(예를 들어 , 생리 학적 조건에서 사용하는 고분자 ) 의설계 및 엔지니어링 은 일반적으로 구체적이고 엄격한 요구 사항 이 적용된다. 특히 , 이러한 고분자 물질은 종종 그들이 사용되는 생물학적 환경과 호환 가능해야한다. 이는 이물질들이 어떤 특정한 친수성의 특성을 보여주는 것을 의미한다. 그들은 또한 적절한 생분해성(즉, 그들은 고분자체에서 저분자 조각으로 분해되어 몸에서 대사 또는 배설하여 아무런 흔적을 남기지 않아야 한다.)을 입증 해야한다. 생분해작용은 일반적으로 백본에 불안정한 가수 분해 결합을 가진 폴리머를 이용하거나 이를 합성하여 수행된다. 이러한 특성 을 가진 가장 일반적인 화학 작용기는 에스테르 , 무수물 , 오르토 에스테르 및 아미드 이다. 불안정한 가수분해 결합을 가진 백본을 화학적으로 가수분해하는 것이 고분자를 분해하는 사전 메카니즘이다. 자연분해되는 고분자는 자연에서 발견되거나 합성될 수 있다. 일반적으로 의료 응용 프로그램 및 생물 의학 연구 에 사용되는 합성 폴리머 는 폴리에틸렌 글리콜 ( 약동학 및 면역 반응 수정물질 ) , 폴리 비닐 알코올 ( 약물 전달체 ) 및 hydroxypropylmetacrylamide ( 약물 전달체)가 있다. 또한, 천연 고분자 역시 생물 의학 응용 분야에 사용된다. 예를 들어, 덱스 트란 , hydroxyethylstarch , 알부민, 그리고 부분적으로 가수 분해 된 단백질은 비경구 영양제, 방사성 의약품 및 혈액 조성(플라즈마) 대체재에 이르기까지 폭넓은 응용 분야에서 사용된다. 일반적으로 합성 고분자 들은 천연물질에 비하여 다양한 성질을 만들어 낸다든가 균일한 성질의 제품을 지속적으로 생산할 수 있다든 가 하는 이점을 가지고 있다.

하나의 실현방법에서, 링커가 카르보닐기 사이에 최소한 3개의 원자를 가지고 있는 dicarboxylic acid 이고 에스테르를 형성하는 데 있어 이성원자 알파를 포함하고 있으면, HA분비의 반감기는 10시간 이하이다. 그러나, 링커가 카르보닐기 사이에 최소한 3개의 원자를dicarboxylic acid 이고 에스테르를 형성하는 데 있어 이성원자 알파를 포함하고 있지 않으면, HA분비의 반감기는 100시간 이상이 된다. 여기서 링커가 카르보닐기와 반응성 수소를 가진 질소Tether사이에 두개의 원자를 가지고 있는 dicarboxylic acid 이면, HA의 분비 반감기는 0.1시간에서 약 20시간으로 되며, 분비 반감기의 측정은 0.05M phosphate buffer, 0.9% 생리 식염수, pH7.4, 37ºC의 환경에서 실시되었다. 여기서 결합의 조건이 다음이 아니다;PHF-SA-Gly-CPT, PHF-(methyl)SA-Gly-CPT, PHF-(2,2-dimethyl)SA-Gly-CPT, PHF-(2-nonen-2-yl)SA-Gly-CPT, PHF-SA-Gly-Taxol, 혹은 PHF-SA-Gly-Illudin.

일부 실시 예에서, polyal는 아세탈이다. 다른 실시 예에서, polyal는 ketal이다. 일부 실시 예에서, 아세탈은 PHF이다. 일부 실시 예에서,Ri는 H이다. 또 다른 실시 예에서, Ri는 CH3이다. 일부 실시 예에서, R2는-CH (Y)-C (O) -이며, 여기서 Y는 자연상태에서 발생하는 아미노산의 측쇄 중 하나이다. 일부 실시 예에서, R2는aryl기이다. 일부 실시 예에서, R2는heteroaryl기이다. 또 다른 실시 예에서, R2는 지방족 링이다. 일부 실시 예에서, R2는 지방족 체인이다. 일부 실시 예에서, R2는 헤테로 지방족 고리입니다. 일부 실시 예에서, Ri 및 R2은 질소와 함께 더해져 고리 형태를 이룬다. 다른 실시 예는 이 분야에 잘 알려져있다. 예를 들어, 일부 실시 예는 US2010/036413에서 설명되어 있으며 그 내용은 여기서 참조 문헌으로 둔다.

그림. 1은 순차적인 복수 교차결합을 통해 HA를 생산하는 예시적인 시스템을 보여준다. 그림1에서, HA 물질 P-15과 수산화 나트륨 P-16는 게이트 및 측정 단위 P14에 제공된다. 출력은 믹서 P17로 제공된다. 교차결합 소스 E9는 그 출력이 탱크 P21에 저장된 반응기 I-7로 제공됩니다. 저장된 교차결합 HA는 원자화 될 수 있다.

그림. 2은 순차적인 복수 교차결합 HA를 생성하는 또 다른 예시 시스템을 보여준다. 그림 2에서, HA 및 수산화 나트륨은 반응기에 넣어져 PVS1, PVS2 및 PVS3와 같은 복수의 교차결합제가 추가된다. 순차적으로 복수 교차결합된 HA는 다음 잔류물을 제거하고 pH를 약7.4로 변경시키기 위해서 챔버에서 세척된다. 챔버에는pH7.4 정도의 증류수와 PBS가 넣어 진다. 세척된 최종 결과물은 조립 및 포장 스테이션으로 옮겨 진다.

도 3은 결과물로 생성된 복수 교차결합 HA의 모식도를 보여준다. 도시된 바와 같이, 이 조성물은 약하게 교차결합된 연장부를 갖는 고분자의 첫번째 부위(300); 첫번째 부위와 겹치는 제1 교차결합 중심부와, 제1 교차결합 중심부에 인접한 하나 이상의 교차결합 연장부들을 갖는 고분자의 두번째 부위(310); 및 두번째 부위와 겹치는 제2 약한 교차결합부(350)와, 교차결합 중심부에 인접한 하나 이상의 교차결합 연장부를 갖는 고분자의 세번째 부위(320)를 포함한다. 여기서 약하게 교차결합된 연장부로 인해 이 조성물을 주사바늘을 통해 주입할 수 있고, 두번째로 교차결합 중심부는 생리적 과정에 의한 흡수에 저항한다. 상기 교차결합부(350)는 생분해 저항을 위해 다중으로 교차결합될 수 있다. 이 고분자는 콜라겐, 하일루론산, 셀룰로오스, 단백질, 당류, 생물계의 세포외 기질 중 하나일 수 있다.

또 다른 실시 예에서, 생체 교차결합 IPN 폴리머는 heteropolysaccharide를 교차결합하여서도 만들 수 있다. 그리고, 최초의 교차결합 물질을 하나 이상의 추가 교차 결합을 통해 복수 교차 결합 물질을 형성할 수 있다. 결과물로 생기는 monophasic HA는 인체 연조직 보강을 위한 생체 적합성 교차결합 폴리머 로 사용할 수 있다.

두가지 구성물을 교차결합하여 IPN이나 세미 IPN을 얻는 앞서 언급된 방법들 이외에, 자연계의산성 다당류 혹은 반 인공적인 에스테르형 유도체와 교차결합제가 있을 때 모노머를 중합하여 얻을 수도 있다.

다음의 예에서, 교차결합제의 구성 퍼센티지는 1~25%로 달라지며 HA의 구성 퍼센티지는 75%에서 99%로 다음과 같이 달라진다.

HA 의 비율이 증가하면, 만들어지는 물질은 부드럽지만, biodegration이 더 쉽게 된다. 교차결합제가 많아 질 수록, 물질은 더 딱딱해 지고, 더 오래간다. 순차 복수 교차 결합의 프로세스는 부드러운 촉감을 유지하면서도 오래 속되는 장점을 제공한다. IPN에 의해서 지속적으로 변화하는 기계적, 물리적 성질은 밖은 부드럽고 중심부는 딱딱하게 만들어 생체 적합성을 좋게 하면서 오래 가고, 또한 만졌을 때 자연스러운 느낌을 주는 물질을 만들 수 있게 한다. IPN은, 두개 이상의 폴리머 시스템이 모두 네트워크 형태로 이루어져 아주 가까이서 연결이 된 시스템으로, 적어도 하나의 시스템이 다른 시스템의 바로 옆에서 합성되었거나 교차결합된 시스템을 말한다. 둘 중 하나의 폴리머가 네트워크 형태(교차결합형태)이고 다른 하나는 선형폴리머 (교차결합되지 않은 형태)이면, 이를 세미 IPN이라 한다. IPN이라는 용어는 현재 두개의 물질이 결합되어 있지는 않으나 물리적으로 연결되어 있는 혼합물의 새로운 물질을 지칭한다.

HA의 복수 교차 결합 연결 프로세스는 개별처리 혹은 디지털 처리에 가깝다. 여기서 HA는 처음 교차결합된 후, 그 결과물이 두번째로 교차결합되고, 다음으로 세번재 교차결합이 시행된다. 그리하여, 순차적인 교차결합의 연결이 생겨난다. 이 개별처리적인 혹은 디지털한 프로세스는 전통적인 연결처리의 프로세스와 대별된다. 하나의 실시 예에서, IPN의 중심은 항상 수성의 앞부분이 있는 곳이 될 수 있다.

HA의 존속기간 연장을 위해서는, 가수 분해가 되면 안되기 때문에, 혐수성 교차결합제가 더 좋다는 것이 언급되어야 한다. 같은 이유에서 공간 역학적으로 물 분자가 들어 오지 못하게 하는 크로스 링커가 더 바람직하다. 그러나이 경우 혐수성은 HA폴리머의 생체 적합성을 떨어뜨려 원치않는 이물질 반응 등을 일으킨다. 프로세스의 모든 부분에서, 사용되는 크로스 링커의 종류는 HA의 수명, 생체 적합성 및 물리적 특성을 변화 시킨다. 응용분야에 따라 어떤 제품 특성이 이상적인지 달라진다.

순차 교차결합의 프로세스를 통해, 교차 결합 된 HA (히알루론산)의 매크로 분자 구조는수성 매체와 인터페이스되는 표면에서 가장 높게 교차결합되며 중앙 코어쪽으로 갈 수록 교차결합도가 낮아 지는 부분이 상호 침투 구조로 되어 있다.

초기 교차 결합 반응 단계 후, 교차결합 HA 체인은 상당한 이동성을 잃었다. 따라서, IPN (상호 침투 네트워크) 고분자는 이후 연속 교차결합 반응으로 쉽게 형성된다.

교차 결합 된 HA의 유동학은 비뉴턴적 유체 동작을 갖는 것으로 특징 지을 수 있다. 이론에 의하면 2차원적 캐비티 흐름을 가진 유체를 혼합하는데 있어서 효과적인 혼합의 방법은 반복적인 스트레칭과 접는 방법, 즉, “말편자 지도”라고 일컬어지는 방법에 달려 있다. 혼합은 점성이 있는 뉴턴적 유체와 비뉴턴적 유체의 혼합방법 즉, Chavan 등이 “점성 뉴톤적 유체와 비뉴톤적 유체의 혼합” PP 211-252에서 설명한 방법대로 행할 수 있으며 이 내용은 본 특허의 참조자료로 제시된다. 대안으로, Paulo E. Arratia의"시간주기 흐름에 따른 스트레칭 및 비 뉴톤 유체의 혼합"에 따라 수행될 수도 있으며 이 또한 본 특허의 참조자료로 제시된다. 혼합 프로세스의 대용량화는 Wilkens등의 “비 뉴턴 유체의 혼합 프로세스를 확장하는 방법"에서 설명된 의 내용을 따를 수 있으며 이또한 참조자료로 통합된다.

최종 제품에서 교차결합레벨은 전체HA 고분자 매트릭스 내에서 균일하지 않으며, 고분자 사슬은 이중축 지향적이 된다. 그방향은 HA 폴리머가 들어있는 매체의 극성에 따른다.

다음은 반응물을 혼합하는 다양한 방법을 설명한다:

1. 수동 혼합 - 그림 4에 설명된 모식도에서 보여진 것 처럼, 이 예에서 혼합은 수동으로 진행된다. 이 방법은 수행하기 용이하며 고가의 장비를 필요로 하지 않는다. 각 스텝에서 사용되는 교차결합제의 종류*와 그 양**은 원하는 성질에 따라 최적화될 수 있다.

a. HA를 Sodium Hydroxide (반응도는 pH가 올라갈 수록 증가한다.)에 용해한다.

b. 교차결합 반응

i. 교차결합제를 첨가한다.

ii. 혼합물을 물리적으로 교반한다.

iii. 교차결합의 회수는 원하는 물리적 성질에 따라 변화될 수 있다.

c. 스텝b.를 동일한 교차결합제나 혹은 다른 종류의 교차결합제를 사용하여 반복한다. 이 역시 원하는 물리적 성질에 따라 조절한다.

d. 반응 결과물을 정제한다. -반응 결과물에서 반응 보조제, 반응이 되지 않은 반응물, 혹은 불순물을 완전히 제거하는 것이 결과물이 간섭없이 그 기능을 하게 하는 것에 중요하다.

반응에 사용된 모든 구성요소들은 수용성이고, 반응 결과물은 비수용성이기때문에, 교차결합된 HA는 증류수로 정제가 가능하다. 또한, 증류수는 반응 결과물을 수배이상 부풀어 오르게 하기 때문에 불순물이 쉽게 빠져나와 제거하기 쉽게 한다. 증류수를 연속적으로 집어 넣어 씻어내는 것이 정제 프로세스를 빠르게 하고 효과적으로 원치않는 불순물을 제거하게 한다.

교차결합된 HA에 혼합하기 전과 후의 증류수 pH는 본 과정의 정제가 효과적으로 이루어지고 있는 지에 대한 좋은 간접 지표이다. 증류수 pH는 혼합 전과 후가 많이 달라지지 않아야 한다.

e. 인산염 버퍼 생리 식염수를 pH 약 7.4 정도에 안정화 시킨다. -- 교차결합HA에서 모든 증류수를 빼 낸다. 교차결합 HA의 최소한 3배 분량의 부피에 해당하는 신선한 PBS를 첨가하여 혼합물 용액이 안정화되도록 2시간 방치한다. 이 프로세스를 2회 반복하여 pH가 약 7.4 ± 0.7이 되게 한다.

2. 기계적 압축 펌프 -본 프로세스는 그림 5에 보여진다. 이 방법의 장점은 그 연속성에 있다. 연속프로세스의 장점은 제조될 수 있는 결과물의 양을 조절할 수 있다는 것이다. 그 양의 상한선은 있으나 고정된 양의 일괄처리방식과는 같지 않다.

a. HA를 NaOH에 용해한다.: NaOH의 농도는 HA고분자 사슬의 OH말단의 반응성에 직접적인 영향을 준다.

b. 교차결합 반응은 NaOH용액에 들어 있는 HA가 교차결합제에 노출되는 순간 즉각적으로 일어난다.

i. 교차결합제의 종류는 바뀔 수 있다.

ii. 교차결합제의 양은 바뀔 수 있다.

c. 혼합이 즉각적이고 효과적으로 일어나는 것이 결과물의 재현성에 중요하다.

i. 본 방법에 의한 혼합방법은 그림 2에 보여진 것 과 같이 내부 직경이 다른 여러개의 파이프를 따라 반응 혼합물이 움직일 때 혼합이 일어난다.

ii. 반응혼합물이 혼합 파이프를 지나는 횟수는 원하는 물리적 성질에 따라 최적화될 수 있다.

3. 기계적 연동 펌프 -본 장치는 그림 6에 나와 있다. 또한, 본 장치를 사용할 때의 혼합물은 기계적 압축펌프를 사용하여 혼합할 때와 그 조성이 다르다. 기계적 압축펌프의 방법에서는, 혼합 기작은 혼합 파이프 장치에서 일어난다 (그림1). 그리고, 연동펌프 기작은 롤러에서 일어난다. (또한 펌핑하는 기작에서도 일어난다). 그 외의 다른 내용은 그림 5와 6의 방식과 같다.

4. 이중축지향의 매크로 분자구조를 가진 교차결합 HA

a. 계면활성제의 사용

이 제시예에서.HA 분자는 수개의 수산기 단말을 가지게 된다. 이는 비닐기 단말을 가진 분자와 쉽게 에테를 결합을 하든 지 하는 등의 방법으로 알칼리성 매체에서 HA가 반응성 수산기를 가지게 한다. 그리하여 많은 HA 수정 제품을 만드는 것을 단순한 단일 단계 반응으로 가능하게 한다. 예를 들어, 보다 소수성인 교차결합제는 HA가 좀 더 분해가 잘 되지 않도록 한다. 이들은 다음과 같은 지방족 diacrylates이 될 수 있다. :

1,4-butanediol dimethacrylate,

1,4-butanediol diacrylate,

1, 6-hexanediol diacrylate,

1, 6-hexanediol dimethacrylate,

Ethylene glycol dimethacrylate

Ethylene glycol diacrylate

Poly(ethylene glycol)* diacrylate

* Poly(ethylene glycol)* dimethacrylate

여기서 *은 다양한 분자량의 polyethylene glycol족을 지칭한다.

이러한 소수성 교차결합제는 일반적으로 물에 녹거나 혼합되지 않는다. 그리하여 분자들이 서로 가까이 와서 화학 반응을 일으키는 데 유리한 환경을 조성하기 위하여 계면활성제가 필요해 진다. 만들어 지는 극성도의 스펙트럼이 계면활성제와 매체에 의해 조절되고 있기 때문에, 교차결합된 HA는 높은 강도로 이중축으로 정렬되어 있다. 극성 및 비극성 매크로 분자구조의 정렬은 그 제품이 들어 있는 매체의 극성도에 따른다.

반대되는 극성을 가진 매크로분자구조는 매질의 표면에서 멀어져서 분자구조의 중앙 코어에 결집되게 된다. 이경우, 더욱 심한 소수성 상호 관통의 교차결합 네트워크를 형성하게 된다. 그리하여 이 분자는 본래의 부드러움과 생체 적합성을 유지한다.

b. 별도로 사전 교차결합된 HA의 사용

그림7은 다른 방법으로 형성된 IPN HA의 예시를 보여 준다. 여기서는 그림에 보여진 원형들끼리 교차하게 되면 IPN이 형성된다. 한 예시에서 프로세스는 다음과 같다:

i. 균질하게 교차결합된 HA 폴리머를 선택한다 (Poly A). 또하나의 균질하게 교차결합된 HA 폴리머를 선택한다 (Poly B). 둘은 모두 저 분자량이다. 이런 식으로 Poly C, D, 및 E가 있을 수도 있다.

ii. 이 모두를 theta 용액에 담가 둔다.

iii. 다양하게 교차결합된 HA 폴리머 혼합물들을 모두 섞는다. 폴리머 A, B 등의 폴리머 사슬들은 서로 뒤섞여 꼬이며 그들이 접촉하는 부위에서 얽히게 된다.

iv. 접촉부위에 친화성이 있는 교차결합제를 투여하여 반응을 시작시킨다.

v. 딱딱한 핵은 매크로 분자 조작 방법을 사용하여 기계적으로 만들어 진다.

하나의 실시 예에 따른 제품의 특성에 사용되는 또 다른 방법의 바람직한 실시 예가 다음 예제에 설명되어 있다. 그러나, 여기에 제한되는 것은 아니다. 한 실시의 변형 및 수정은 당연히, 본 발명 의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 할 수 있다. 예를 들어, HA 는 얼굴 필러, 피부 필러, 엉덩이 필러, 유방 보형물 및 다른 신체 부위 필러 로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 보형물은 의약품 및 기타 화학 물질 또는 진단제와 함께 사용될 수 있으며 본 제품의 주입 전 후에 사용 할 수 있다. 이러한 에이전트의 예로는 항생제 , 화학 요법 , 다른 암 치료 , 지역 방사선 효과 치료 재료영역의 식별을위한 X-선 불투명 금속 재료 , 출혈의 제어를위한 지혈 소재, 성장 호르몬 치료, 면역 체계 요인 , 유전자 치료 , 생화학적 지표나 이미지 그리고 환자의 치료 또는 진단에 도움이 되는 모든 유형의 방법과 같이 사용될 수 있다.

IPN 의 실시예는 다음과 같은 장점들을 포함할 수 있다. 기존의 조직과 임플란트 사이에 점탄성 속성의 조화를 통해 자연스런 느낌을 가지게된다. 이는 입자 크기 및 입자 크기 분포 비율을 흐름 속성을 제어하는 방법으로 임플란트 의 점성 구성 요소를 조작 하여 만들어 낼 수 있다. 신축성은 IPN의 3차 구조( 분자량과 입체 주조로 인한 저해 ) 및 교차결합 농도가 가진 내재적 성질이다. 상호 침투 고분자 네트워크 하이드로겔은 다양한 바람직한 속성이 있다. 이러한 속성은 높은 수분 함량 과 높은 인장 강도 등으로, IPN을 피부 필러로 사용하기에 최적인 물질로 만들고 있다. 또 다른 장점은 다음과 같다.: 중간 터치업 없이 오래가는 지속성, 부피 축소가 균일하게 진행되는 점, 해부학적으로 인체에 친화적인 점, 삼투압을 균일하게 조절할 수 있는 점 등이 있다.

본 발명은 특히 유방, 엉덩이 , 또는 신체 이식과 관련하여 설명되어 있지만, 이러한 분야의 전문가들에게는 본 발명이 신체에 다른 부위에 응용될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 예를 들면 안면, 신체의 부드러운 조직이나 뼈 등을 대체할 수 있다. 따라서, 본 발명은 손상되거나 사라진 인체의 부드러운 조직, 구조적 조직이나 골격 혹은 미용시술용 조직이나 골격 대체품으로 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 특정 실시 예 와 관련하여 설명 되어 있지만 , 많은 다른 변형 및 수정, 그리고 다른 용도로의 사용이 본 제품을 사용하는 전문가들에게는 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 여기에 공개된 문서에 의해 제한되지 않고, 특허 청구 범위 에 의해 제한 되는 것이 바람직하다 . 하나의 실시 예에 따른 제품의 특성에 사용되는 다른 방법 은 하나의 예시의 바람직한 예를 하나 드는 것으로 설명되었으나 그것이 그 예시를 한정지어서는 안된다. 물론, 많은 변형과 수정이 본 발명 의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 되어질 수 있다.

Claims

첫번째 부위, 두번째 부위 및 세번째 부위로 이루어진 고분자를 포함하는 조성물에 있어서:
고분자의 첫번째 부위는 교차결합부를 갖고;
고분자의 두번째 부위는 첫번째 부위와 겹치는 제1 교차결합 중앙부와, 제1 교차결합 중앙부에 인접한 하나 이상의 교차결합 연장부를 가지며;
고분자의 세번째 부위는 두번째 부위와 겹치는 제2 교차결합 중앙부와, 제2 교차결합 중앙부에 인접한 하나 이상의 연장부를 갖고;
상기 조성물은 주사바늘을 통해 주입할 수 있으며, 상기 제2 교차결합 중앙부는 신체내 생체분해에 저항하며,
상기 조성물은 2상태의 혼합물로 구성된 생체 적응성 점탄성 젤 슬러리이고, 이때,
제1상은 입자로 된 생체 적합성 젤상이고, 상기한 젤상은 화학적으로 교차결합된 glycosaminoglycan을 포함하거나, 상기 glycosaminoglycan이 다당류와 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 다른 고분자와 화학적으로 교차결합하고, 상기 젤상이 생리학적으로 허용되는 수성 매체 중에 팽창되어 제 2상에 균일하게 분포되고,
제2상은 위에서 언급한 생리학적으로 허용되는 수성 매체 안에서 polysaccharides, polyvinylpyrrolidone 및 poly ethyleneoxide 로 이루어진 그룹에서 선택된 친수성 생체 적합성고분자 용액을 포함하며,
상기 2상태의 혼합물의 고분자 용액은 부피 기준으로 0.01 v%에서 99.5 v%까지로 구성되며, 젤상은 보강되어야 하는 생체 부분의 나머지 부분을 구성하게 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 고분자가 히알루론산인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 고분자가 프리 래디칼 포착제, 항산화 물질, 비타민 및 효소 억제제 중의 하나를 더 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 고분자를 수술 없이 주사기를 이용하여 주입하기 위한 조성물.