CN104189956B - 一种可注射填充植入剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可注射填充植入剂，所述可注射填充植入剂的有效成分为生物细胞外基质材料，所述生物细胞外基质材料的交联度为50％-70％。本发明还涉及所述可注射填充植入剂的制备方法。本发明提供的制备方法，可以获得优于现有技术的可注射填充植入剂。本发明所提供的可注射填空植入剂，交联程度高，粒径范围合适，体内降解时间长，生物相容性好。

Description

一种可注射填充植入剂及其制备方法

技术领域

本申请涉及一种可注射填充植入剂及其制备方法。

背景技术

一个世纪以来，软组织充填剂被广泛应用于美容外科手术以改善面部轮廓、修正皱纹、填平凹陷瘢痕和填充体积(如唇部)等，现今对于软组织填充剂的需求越来越大。

理想的软组织填充剂，应该具有便宜易得、良好的生物惰性、生物相容性和稳定性、无毒性、无致癌性、无感染性、无急性或慢性炎症反应、易于注射和取出、能够维持长期甚至永久的外观修复效果且恢复时间短。但至今为止，仍没有如此理想的注射式填充剂问世。

现有的美容植入产品均存在一定缺陷，且目前国家对于美容植入剂类产品要求非常严格，如：要明确控制交联程度、粒径分布范围、分子量大小、降解周期等，需满足的技术条件很高。

中国专利CN200510044005.5公开了一种可注射软组织生物填充材料的制备方法，其采用新宰杀小猪皮为原料，经过去皮下组织、脱脂、碱处理、剖层、酶处理、戊二醛交联、漂白处理以及微粒化加工，最后经包装及钴60灭菌而成。该专利制备微粒的方法只是将皮片通过物理方法切制为边长为300～500μm的微粒，但微粒直径过大，无法采用直径较小的针头注射；且最终只是将微粒进行简单包装，无法直接注射使用。

中国专利CN95106720.6公开了一种采用人胎盘为原料制备颗粒性胶原的方法，其是先对胎盘进行辐照灭活病毒，清洗、粉碎后采用有机试剂提取胎盘中的胶原，最后经浓缩透析并加入利多卡因而得到的可注射胶原溶液。该专利使用原料与本专利相近，但工艺中使用大量有机试剂提取胶原，易存在有机试剂残留。

中国专利CN201010117490.5公开了一种制备注射用的透明质酸凝胶微粒的方法。该专利所用原料为透明质酸干粉，将其用碱性溶液溶解后加入交联剂交联，制备得到透明质酸凝胶后再采用透析方法去除交联剂。该方法可能无法彻底去除凝胶中的交联剂等试剂残留，另外清洗效率较低，需要透析4～5天。

中国专利CN200810007484.7公开了一种采用人发角蛋白制备软组织填充材料的方法，该专利利用人发中段作为原料，经过清洗、漂白、研磨加工、冻干、包装、钴60辐照处理，将人发制备成粉体匀浆及液体人发角蛋白颗粒。该专利仅采用物理碾磨方法制备粒径60～80μm的人发角蛋白颗粒匀浆，根据发明人实验经验，将不溶于水的不同固体物质进行物理碾磨而没有筛分、均质化等后续步骤，得到的粒径分布范围通常在100～1000μm，很难得到较小粒径范围。

中国专利CN02156797.2公开了一种注射性胶原蛋白的制备方法及其产品和应用，该专利通过提取动物组织中的胶原蛋白纤维来制备注射性胶原蛋白，在制备过程中会完全破坏动物组织原有结构及其他成分，损失了天然组织中具有生物活性或生物功能的天然成分，只能起到单纯的胶原蛋白填充作用。

由上可见，目前已上市的各种美容植入产品及国内同类专利公开的美容植入剂制备方法均存在一定缺点，尤其是同类胶原植入剂产品除了包含胶原基质外，并未包含生物活性因子，因此其作用仅仅是填充，当这些填充材料被机体分解吸收后，美容修复效果会减弱或消失，因而该类植入剂产品的美容效果是暂时性的。

羊膜，从细胞滋养层衍化而来，是胚胎双层膜的内层，由上皮细胞层，基底膜和无血管基质组成。羊膜中包含了多种胶原蛋白成分及活性因子，包括胶原、层粘连蛋白(LN)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、其它蛋白酶抑制因子等。

正是羊膜中含有以上较多的能够抑制血管生成、抗炎症的活性因子，能够起到促进眼表上皮化、减轻炎性反应、抑制纤维组织增生和新生血管形成的作用，从而在临床上广泛应用于眼表各类疾病修复、皮肤烧创伤修复等方面。目前尚无采用羊膜为原料制备可注射充填材料的产品，亦无专利及文献报道。

发明内容

为了解决现有注射填充剂存在的问题，本发明提供一种可注射填充植入剂及其制备方法。

作为本发明的一个方面，涉及一种可注射填充植入剂，所述可注射填充植入剂的有效成分为生物细胞外基质材料，所述生物细胞外基质材料的交联度为50％-70％，优选为60％-70％，最优选为70％。作为优化，所述可注射填充植入剂还可含有95％-97％、pH7.5的磷酸盐缓冲液。作为优选，所述生物细胞基质材料为羊膜基质。

作为本发明的另一方面，还涉及一种可注射填充植入剂制备方法，包括如下步骤：

将消毒处理后的生物细胞材料用胰蛋白酶消化；

胰蛋白酶消化的生物细胞材料在交联体系中交联，所述交联体系为含有终浓度0.1～0.2mol/L的EDC、0.01～0.05mol/L的NHS和0.01～0.2mol/L的MES的水溶液。

所述将消毒处理后的生物细胞材料用胰蛋白酶消化是指，将消毒处理后的生物细胞材料先用纯化水清洗，再用pH7.5的PBS清洗后，用0.1～0.5％的胰蛋白酶消化后，再采用纯化水和pH7.5的PBS清洗。

所述胰蛋白酶消化的生物细胞材料在交联体系中交联是指，在所述交联体系中重复交联两次。

所述交联体系为含有终浓度0.2mol/L的EDC、0.05mol/L的NHS和0.2mol/L的MES的水溶液。

作为优先，所述生物细胞材料是指羊膜。

具体地，所述可注射填充植入剂制备方法，步骤如下：

将冻存羊膜取出，经PBS清洗和清水冲洗后，60～90％酒精浸泡1～2h；

将消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗，再用pH7.5的PBS清洗，加入0.1～0.5％的胰蛋白酶，匀速震荡，室温0.5～4h或4℃过夜后，纯化水和pH7.5的PBS清洗；

将胰蛋白酶消化后的羊膜在交联体系中变性交联两次，用交联体系为含有终浓度0.2molEDC、0.05molNHS和0.2molMES的水溶液；

改性交联的羊膜超高速低温粉碎，筛分选取粒径50～400μm范围的羊膜微粒。

本发明至少实现了如下有益效果：

本发明提供的制备方法，可以获得优于现有技术的可注射填充植入剂。

本发明所提供的可注射填空植入剂，交联程度高，粒径范围合适，体内降解时间长，生物相容性好，并可有效保留羊膜本身抑制炎症、抑制瘢痕生成的活性特点。

说明书附图

图1为本发明所提供的清洗装置。

1为旋转轴，2为固定板。

具体实施方式

本发明所涉及的实验材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

本发明中所用PBS，在未经特别说明的情况，均为pH7.5。

本发明的清洗过程，可以在本发明所提供的清洗装置中进行。本发明所提供的清洗装置为，一个盒体内横贯一个旋转轴1，在该旋转轴1上设置若干固定板2，所述固定板2随着旋转轴1的旋转而旋转。所述固定板上还可以设置若干贯穿孔。可以将材料固定到各固定板上，在旋转轴的作用下，在清洗液中运动，以实现清洗目的。当然，本发明的清洗过程也可以不使用本发明所提供清洗装置进行，只要达到清洗的目的即可。

本发明的技术路线概述如下(以羊膜为例)：

步骤一、前处理：将冻存羊膜取出，分别PBS清洗，清水冲洗，之后60～90％酒精浸泡1～2h进行病毒灭活。

本步骤通过对羊膜进行消毒处理，可降低羊膜的微生物负载，同时灭活多种可能存在的病毒，保证羊膜在后续处理时的安全性，避免羊膜上携带的微生物污染。

步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗次，再用pH7.5的PBS清洗，用0.1～0.5％的胰蛋白酶消化处理，可以在加入胰蛋白酶后匀速震荡，室温0.5～4h或4℃过夜，最后再采用纯化水和PBS清洗。

本步骤通过温和的化学及物理方法去除羊膜中的细胞成分，可降低羊膜的免疫原性，并同时最大程度保留了羊膜的胶原及活性因子(含有Ⅰ型胶原300ug/mg以上，Ⅲ型胶原380ug/mg以上；成纤维细胞生长因子20ug/mg以上，表皮生长因子9ug/mg以上，肝细胞生长因子110ug/mg以上，角质细胞生长因子40ug/mg以上。)，为制备保留羊膜生物活性的植入剂提供原料。

步骤三、改性处理：为获得一种在体内保留时间较长，又保留较高生物特性的胶原基质结构，故将步骤二得到的羊膜用温和的化学方法进行改性处理，改性所用交联体系含有终浓度0.1～0.2molEDC、0.01～0.05molNHS、0.01～0.2molMES的水溶液；交联条件为室温下2～20h，重复交联两次。这种温和的交联方法既可以保证低交联剂残留，又有效保证了交联强度。

对比结果如下表所示：

注：由上表可知，使用EDC+NHS+MES交联体系进行交联可以获得高交联的产品，并且可以减少交联剂使用的总浓度，保证较低的交联剂残留，其中，使用EDC+NHS+MES交联体系进行2次交联，可以获得更高的交联度，而交联剂残留差异不大，均小于BDDE交联剂残留标准(2ug/ml)。高交联度可以有效保证产品的耐降解性和稳定性。

本步骤中温和的改性方法，可为最终制备不同降解时间的羊膜微粒植入剂提供选择，适用于面部不同部位的修复，本发明人经过实验验证，降解时间短的羊膜微粒植入剂可用于真皮层浅层区域以修复浅表细纹，例如眼角四周等区域，降解时间长的羊膜微粒植入剂可用于真皮层深层部位以修复较深皱纹，例如鼻唇沟等区域。另外，通过改性处理可将羊膜中保留的活性成分尤其是各种因子固定于羊膜中，减少因后续清洗、干燥、粉碎工艺造成的损失，并且通过本方法0.1～0.2M的EDC+0.01～0.05M的NHS+0.01～0.2M的MES进行改性处理后的羊膜膜片在粉碎后，可以获得较高的羊膜微粒(50～400μm范围)回收率(70％左右)，高于EDC、核黄素、核糖、戊二醛或紫外线照射进行交联处理的羊膜膜片粉碎筛分后(50～400μm范围)的回收率(50％左右)。

步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水和PBS分别进行清洗，然后进行室温风干或真空冷冻干燥处理，最后于2～8℃下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎，分别使用1.0mm、0.5mm、0.2mm的筛网依次进行粉碎，每次1分钟，转速为20000rpm，即可获得成20～800μm大小的颗粒，经再次筛分，选取粒径50～400μm分布范围的羊膜微粒。

本步骤先对羊膜进行干燥处理，有利于羊膜粉碎，通过对粒径的进一步控制，获得更窄范围的粒径分布，保证产品的稳定性和可控性；方便后期获得均一，稳定的羊膜基质植入剂，以及不同降解时间的羊膜微粒植入剂。并且经过验证，通过步骤三的交联体系进行交联的羊膜在粉碎时，比使用EDC、核黄素、核糖、戊二醛或紫外线照射进行交联处理的羊膜，在粉碎后可以获得更高的回收率(回收率高20％左右)，粉碎时损失较少。

步骤五、羊膜基质植入剂的制备：将步骤四制备的羊膜微粒与配置好的磷酸盐缓冲液混匀，经高速微射流设备均质化，循环3～10次。随后，先将羊膜微粒悬液经无菌真空灌装，再经10～30kGy伽马射线辐照灭菌，或者先将羊膜微粒悬液经10～30kGy伽马射线辐照灭菌，再进行无菌真空灌装，制得的可供临床使用的羊膜微粒植入剂：浓度为20～100mg/mL羊膜微粒悬液，羊膜微粒的平均粒径为50～200μm。

该步骤采用的高速微射流设备，可通过流体运动产生的剪切力来进一步粉碎步骤四制备得到的羊膜微粒，得到均匀分散在磷酸盐缓冲液中的羊膜微粒成品。本发明人通过巨噬细胞吞噬实验验证，直径小的羊膜微粒(10～40μm)植入体内后，容易被巨噬细胞吞噬，材料很快降解，无法达到修复效果；通常临床为了控制准确注射至真皮层需要修复的部位，使用的针头为27～30g，粒径过大容易堵塞注射美容针头。

单纯EDC交联方法，交联强度大多只有20-30％左右，本发明交联度在50—70％，抗降解能力大大增强，使用蛋白酶K体外降解72h还有30-50％左右残留，而其他工艺产品24-48h基本降解完全。

实施例1

步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用纯化水清洗3次，然后用体积浓度为75％的乙醇水溶液对羊膜进行消毒处理60分钟；

步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗3次，再用0.5mol/L的氢氧化钠水溶液对羊膜进行震荡处理10分钟，振荡频率为50rpm，最后采用纯化水清洗3次；

步骤三、交联改性处理：将步骤二得到的羊膜用0.3mol/L的EDC(pH为5.0)水溶液在25℃下处理12小时；

步骤四、粉碎处理：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水震荡清洗3次，然后真空冷冻干燥，最后于4℃下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成粒径约20-800μm的微粒；将所得羊膜微粒进行筛分装置筛分，获得50-400um大小范围的羊膜微粒。

步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将筛分出的羊膜微粒与pH为7.2的磷酸氯化钠生理溶液混匀，使用均质机制备成浓度为35mg/mL的羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径约50～400μm。最后将羊膜微粒悬液经无菌真空灌装，再经15kGy伽马射线辐照灭菌，即制备得到可临床使用的羊膜微粒植入剂。

结果：本实施例制备得到的羊膜微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，经检测，所制备产品的交联度在30％-35％之间，尤其多见于35％，粉碎后获得的羊膜微粒量为初始原料量的一半左右，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为24小时，大鼠皮下植入结果显示3～4个月后羊膜微粒植入剂基本降解。

实施例2

步骤一、按照实施例1中方法对羊膜进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的羊膜用0.5mol/L的氢氧化钠进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的羊膜进行改性处理，交联条件0.1M的EDC+0.01M的NHS+0.01M的MES；25℃下12h。

步骤四、将改性处理后的羊膜进行粉碎，获得羊膜微粒，回收所需微粒(50-400um)。

步骤五、制备羊膜微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的羊膜微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后羊膜基质紧密，经检测，所制备产品的交联度在40％-45％之间，尤其多见于40％；粉碎后获得的羊膜微粒量为初始原料量的60％，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为96小时，大鼠皮下植入结果显示6-8个月后羊膜微粒植入剂基本降解完全。

实施例3

步骤一、按照实施例1中方法对羊膜进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的羊膜用0.2％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的羊膜进行改性处理，交联条件为0.3M的EDC；25℃下反应12h。

步骤四、将改性处理后的羊膜进行粉碎，获得羊膜微粒，回收所需微粒(50-400um)。

步骤五、制备羊膜微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的羊膜微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后羊膜基质松散，检测交联度为37％，粉碎后获得的羊膜微粒量为初始原料量的50％，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为36小时，大鼠皮下植入结果显示4-6个月后羊膜微粒植入剂基本降解完全。

实施例4

步骤一、按照实施例1中方法对羊膜进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的羊膜用0.2％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的羊膜进行改性处理，交联条件0.2M的EDC+0.05M的NHS+0.2M的MES；25℃下反应12h。

步骤四、将改性处理后的羊膜进行粉碎，获得羊膜微粒，回收的所需微粒(50-400um)为总羊膜质量的70％左右。

步骤五、制备羊膜微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的羊膜微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后羊膜基质松散，经检测，所制备产品的交联度在60％-65％之间，尤其多见于60％，粉碎后获得的羊膜微粒量为初始原料量的70％，回收率高，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间为96小时以上，大鼠皮下植入实验结果显示，8-11个月后羊膜微粒植入剂基本降解完全。

实施例5

步骤一、按照实施例1中方法对羊膜进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的羊膜用0.2％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的羊膜进行改性处理，交联条件0.2M的EDC+0.05M的NHS+0.2M的MES；25℃下反应6h，重复进行一次。

步骤四、将改性处理后的羊膜进行粉碎，获得羊膜微粒，回收的所需微粒(50-400um)为总羊膜质量的70％左右。

步骤五、制备羊膜微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的羊膜微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后羊膜基质松散，经检测，所制备产品的交联度在65％-70％之间，尤其多见于70％，粉碎后获得的羊膜微粒量为初始原料量的70％，回收率高，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间为96小时以上，大鼠皮下植入实验结果显示，11-13个月后羊膜微粒植入剂基本降解完全。

实施例6

步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将牛心包浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用75％的乙醇水溶液进行消毒处理；

步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的牛心包用0.3％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次；

步骤三、交联改性处理：将步骤二得到的牛心包用0.3mol/L的EDC(pH为5.0)水溶液在25℃下处理12小时；

步骤四、将改性处理后的牛心包进行粉碎，获得牛心包微粒，回收所需微粒(50-400um)。

步骤五、制备牛心包微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的填充植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后牛心包基质松散，检测交联度为37％，粉碎后获得的微粒量为初始原料量的50％，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为36小时，大鼠皮下植入结果显示4-6个月后填充植入剂基本降解完全。

实施例7

步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将牛心包浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用75％的乙醇水溶液进行消毒处理；

步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的牛心包用0.3％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次；

步骤三、交联改性处理：将步骤二得到的牛心包用0.3mol/L的EDC(pH为5.0)水溶液在25℃下处理6小时，重复进行一次；

步骤四、将改性处理后的牛心包进行粉碎，获得牛心包微粒，回收所需微粒(50-400um)。

步骤五、制备牛心包微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的填充植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后牛心包基质松散，检测交联度为45％，粉碎后获得的微粒量为初始原料量的50％，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为72小时，大鼠皮下植入结果显示6-8个月后填充植入剂基本降解完全。

实施例8

步骤一、按照实施例1中方法对猪小肠黏膜下层进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的猪小肠黏膜下层用0.5mol/L的氢氧化钠进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的猪小肠进行改性处理，交联条件0.1M的EDC+0.03M的NHS+0.01M的MES；25℃下12h。

步骤四、将改性处理后的猪小肠基质进行粉碎，获得猪小肠微粒，回收所需微粒(50-400um)。

步骤五、制备猪小肠微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的猪小肠填充植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后猪小肠的胶原基质紧密，经检测，所制备产品的交联度在40％-45％之间，尤其多见于40％；粉碎后获得的微粒量为初始原料量的60％，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为96小时，大鼠皮下植入结果显示6-8个月后填充植入剂基本降解完全。

实施例9

步骤一、按照实施例1中方法对猪小肠黏膜下层进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的猪小肠黏膜下层用0.5mol/L的氢氧化钠进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的猪小肠进行改性处理，交联条件0.1M的EDC+0.03M的NHS+0.01M的MES；25℃下6h，重复进行一次。

步骤四、将改性处理后的猪小肠基质进行粉碎，获得猪小肠微粒，回收所需微粒(50-400um)。

步骤五、制备猪小肠微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的猪小肠填充植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后猪小肠的胶原基质紧密，经检测，所制备产品的交联度在50％左右；粉碎后获得的微粒量为初始原料量的60％，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为96小时，大鼠皮下植入结果显示6-9个月后填充植入剂基本降解完全。

实施例10

步骤一、按照实施例1中方法对牛肌腱进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的牛肌腱用0.2％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的牛肌腱进行改性处理，交联条件0.2M的EDC+0.06M的NHS+0.2M的MES；25℃下反应12h。

步骤四、将改性处理后的牛肌腱进行粉碎，获得牛肌腱微粒，回收的所需微粒(50-400um)为总牛肌腱质量的70％左右。

步骤五、制备牛肌腱微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的牛肌腱微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后羊膜基质松散，经检测，所制备产品的交联度在60％-65％之间，尤其多见于60％，粉碎后获得的牛肌腱微粒量为初始原料量的70％，回收率高，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间为96小时以上，大鼠皮下植入实验结果显示，8-11个月后填充微粒植入剂基本降解完全。

实施例11

步骤一、按照实施例1中方法对牛肌腱进行清洗、酒精消毒；

步骤二、将步骤一处理的牛肌腱用0.2％的胰蛋白酶进行脱细胞，清洗3次

步骤三、将步骤二处理的牛肌腱进行改性处理，交联条件0.2M的EDC+0.06M的NHS+0.2M的MES；25℃下反应6h，重复进行一次。

步骤四、将改性处理后的牛肌腱进行粉碎，获得牛肌腱微粒，回收的所需微粒(50-400um)为总牛肌腱质量的70％左右。

步骤五、制备牛肌腱微粒植入剂，浓度为35mg/ml。无菌灌装，辐照灭菌。

结果：本实例制备得到的牛肌腱微粒植入剂细胞相容性良好，脱细胞后主要成份为Ⅰ、Ⅲ型胶原，脱细胞后羊膜基质松散，经检测，所制备产品的交联度在60％-70％之间，尤其多见于70％，粉碎后获得的牛肌腱微粒量为初始原料量的70％，回收率高，采用0.2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间为96小时以上，大鼠皮下植入实验结果显示，9-12个月后填充微粒植入剂基本降解完全。

本发明经过更多试验发现，EDC的含量范围在0.1～0.2M、NHS在0.01～0.05M和MES在0.01～0.2M之间变动，均能得到符合本发明要求的产品，实现本发明预期的技术效果。即可以得到交联度在60-70％的脱细胞生物工程材料。将所制得的脱细胞生物工程材料与PBS(体积浓度优选为95-97％)混合，即可制得最终临床可用的填充注射剂。

由几个实施例对比可知：使用胰蛋白酶脱细胞，脱细胞生物工程材料相容性良好，分布松散，之后采用EDC+NHS+MES进行交联改性，使用交联剂浓度低且交联度高，干燥后粉碎筛分，可以获得更多需要的脱细胞生物工程产品微粒(50-400um；若粒径过大，不便于临床注射使用；粒径过小，则在体内易被吞噬降解，不能保证有效性)。并且胰蛋白酶相比其他如氢氧化钠等的脱细胞方法，生物相容性更高；使用EDC+NHS+MES交联改性的产品，交联度高，体内存留时间长、耐降解性也更好。

本发明原料取自人体羊膜或者牛心包等生物材料，进行病毒灭活处理后，使用改良的脱细胞方法。本发明使用生物相容性更好的胰蛋白酶进行脱细胞，获得以胶原为主的脱细胞生物工程基质材料，保证了低免疫原性和所用生物材料的天然生物特性；

本发明使用一定比例的EDC+NHS+MES交联体系进行温和的化学交联，并通过一次或二次重复交联进行改性处理，其中，低浓度的二次重复交联可以减少交联时间，保证低交联剂残留，又有效保证了交联强度，保证体内的耐降解性。有效的提高了所制备产品在体内的有效性，并且通过此交联反应体系方法，保证了产品的有效性和安全性更加稳定。

通过对粒径的筛分控制使产品更均一，粒径大小分布更窄，可显著提高产品使用性和可控性，便于制备不同效用的不同型号产品。

目前胶原类产品大多是动物源性，使用前多需要进行皮试，注射后可能的并发症有引起出血斑、肉芽瘤、急性过敏、延迟性过敏反应和全身不适反应等。而之前有报道的人体胎盘或人自体细胞体外培养等，分别由于有效性不足和成本过高等不利于普遍推广使用。

本发明原材料取自人体羊膜时，同源性更高，且羊膜已被公认为是一种优良的组织工程材料，其光滑，无血管、淋巴和神经；羊膜自身还可阻止白细胞浸润，抑制多种蛋白酶如：胰蛋白酶、纤维蛋白酶、胶原蛋白酶等的活性，通过抑制相应的蛋白酶，从而减轻炎症程度。

其次，通过对脱细胞生物材料进行化学修饰，既EDC+NHS+MES交联体系反应，得到交联的生物细胞外基质产品，交联后的生物细胞外基质植入剂在体内有效性大幅提高，并且具有极低的免疫原性和炎症反应。尤其是对于羊膜来讲，相对于其他动物源性产品具有的可能性潜在并发症有明显优势。

目前市场上的产品大多粒径跨度大，如瑞蓝产品粒径为80～1000，平均粒径为400，人发角蛋白通常为100～1000μm。本发明通过无菌筛分，对粒径进行有效控制，可以得到更均一、稳定的生物细胞外基质产品，更加保障了产品的可控性，也便于生产不同粒径范围的适用于不同病症的产品。

本发明通过实验发现，对生物细胞材料，尤其是羊膜进行脱细胞处理后，其主要成分为胶原和一些天然生物活性因子，胶原在皮肤中构成了一张细密的弹力网，可以有效锁住水分，支撑皮肤。其附带的天然活性因子，可有效保留羊膜本身抑制炎症、抑制瘢痕生成的能力。

本发明通过实验发现，将所制备产品注入大鼠皮下真皮深层，观察植入部位的炎症反应和其它病理变化，并观察每个时间节点的降解材料情况(即体内有效性)，得知，本发明的产品有效性高，在52周时，材料依然保留较多；且炎症反应(HE结果)很低，前期亦无明显炎症反应。

尽管已参照优选实施例表示和描述了本发明，但本领域技术人员应该理解，在不脱离由权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对这些实施例进行各种修改和变换。

Claims (7)

1.一种可注射填充植入剂，其特征在于，所述可注射填充植入剂的有效成分为生物细胞外基质材料，所述生物细胞外基质材料的交联度为60%-70%，所述生物细胞外基质材料为羊膜基质。

2.权利要求1所述可注射填充植入剂，其特征在于，所述生物细胞外基质材料含有95%-97%、pH7.5的磷酸盐缓冲液。

3.权利要求1所述可注射填充植入剂，其特征在于，所述羊膜基质成分的交联度为70%。

4.一种可注射填充植入剂制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将消毒处理后的生物细胞材料用胰蛋白酶消化；

胰蛋白酶消化的生物细胞材料在交联体系中交联，所述交联体系为含有终浓度0.1～0.2mol的EDC、0.01～0.05mol的NHS和0.01～0.2mol的MES的水溶液，所述生物细胞材料是指羊膜。

5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述将消毒处理后的羊膜用胰蛋白酶消化是指，将消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗，再用pH7.5的PBS清洗后，用0.1～0.5%的胰蛋白酶消化后，再采用纯化水和pH7.5的PBS清洗。

6.权利要求5所述可注射填充植入剂制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶消化的羊膜在交联体系中交联是指，在所述交联体系中重复交联两次。

7.权利要求6所述可注射填充植入剂制备方法，其特征在于，所述交联体系为含有终浓度0.2mol的EDC、0.05mol的NHS和0.2mol的MES的水溶液。