CN101903408B - 壳聚糖组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可交联的壳聚糖组合物，包含脱乙酰度30-75％的壳聚糖，其中壳聚糖是随机脱乙酰化的，和交联剂，其中基于交联剂中官能团的数量和壳聚糖的易接近的氨基的数量，交联剂和壳聚糖的摩尔比是0.2∶1或更小。本发明也提供由其形成的壳聚糖水凝胶及其用途。

Description

壳聚糖组合物
本发明涉及壳聚糖组合物，特别是由具有低脱乙酰度并在6-10的pH范围内共价交联的壳聚糖制成的壳聚糖凝胶。
发明背景
本发明涉及生物相容性多糖凝胶组合物，特别是疫苗中的壳聚糖组合物，用于药物递送、组织填充、细胞培养、有活力细胞的包囊、美容用途、矫形外科用途，用作生物材料、伤口愈合装置，用作食品工业中的增稠剂和添加剂，用作胶、润滑剂、钻孔和维护液。该凝胶是通过具有低脱乙酰度的共价交联的壳聚糖凝胶制备的。通过选择特定脱乙酰度的壳聚糖和使用有效的交联条件，可以获得具有有趣和意想不到的生物和物理性质的凝胶。这与由标准壳聚糖和使用典型的交联方案制得的其他交联壳聚糖水凝胶完全不同。本发明的凝胶可以制备成只具有非常低的毒性，它们可以制备成能够快速降解。所述凝胶的另一种显著特征是，当在中性和碱性条件下时它们不会沉淀。它们也具有刚性，这使得可以用于其他机械处理而成为，例如可注射的所谓“碎凝胶”，可以用于很多的用途。
水凝胶可以定义为其中水是分散介质的胶态凝胶。水凝胶广泛用于很多领域，在数个地区已经变成了数十亿美元的产业。典型地，水凝胶是由水溶性聚合物制成的，所述聚合物是从自然来源分离的，或者可以通过合成或天然聚合物的化学修饰来获得。根据它们的物理和生物性质来选择这些化合物，根据所期望的产品性质，单独或联合使用。一些聚合物具有使得它们适合医学应用的物理性质，而其他则用于食品工业、机械加工和制造工业，作为润滑剂、钻孔和维护液，用于美容、生物材料用途，用于生物技术例如细胞支架等等。不同的用途需要不用品质的聚合物，很多技术用途是基于低成本下可用的粗制块状品质，而医学用途则需要高纯度的品质，通常也是高成本的。有时聚合物溶液的物理性质，例如粘性是人们关注的主要参数，而在其他用途中，生物学和毒理学性质则对于其预期的应用功能变得更为突出。
一些聚合物在组织填充组合物中用于填充目的，其中凝胶单独或与固体珠一起使用。在其他用途例如，伤口愈合、药物递送、疫苗载体中，需要具有其他性质的其他聚合物来满足医疗需求。一般而言，性质例如粘性、抗微生物活性、粘连或水吸收/保持能力是必须考虑的全部性质。水分保持能力和溶胀在食品用途中是典型的重要重点，其中聚合物用作增稠剂或作为其他试剂的增溶剂和稳定剂。在医学产品中发现有种类广泛的聚合物，包括合成和天然来源的聚合物。在很多应用中，重要的是，聚合物降解和清除，而不会导致不希望有的副作用。尽管生物可降解性不总是必要的，但是，良好的生物相容性是非常重要的，以避免副反应例如炎症、免疫反应或物质排斥。因此，在医学产品中使用天然产生的无毒性多糖也就毫不奇怪了，因为它们具有优良的物理性质，同时还有人们感兴趣的生物学和医学性质，一般可以高纯度和低成本使用。一般使用的多糖是例如，纤维素、海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、淀粉或其衍生物。
在医学中，凝胶和软膏用于，例如，递送药物，美容目的，或者提供抗菌屏障以避免感染。水凝胶通常具有适当的溶解性和生物学性质，因此可以用于很多产品。形成凝胶的多糖例如透明质酸、纤维素的衍生物等已经变成了有利可图的工业领域。透明质酸是聚合物的一个例子，它可以使用的原因在于，当在生理学pH下在低浓度的水溶液中使用时它能自发形成水凝胶。其他聚合物例如纤维素不能这样使用，必须经化学修饰产生需要的性质。当由多糖制备水凝胶时，典型的方案包括该聚合物以低浓度(通常0.5-3％(w/w))溶于水溶液。当需要较高粘性时，可以通过，如果溶解性允许，向溶液中加入更多聚合物，或者通过使聚合物交联来实现。交联得到了更高分子量的聚合物，因此得到了更高的粘性。交联可以使用共价、离子或疏水性策略，通过不同的方法来进行，可以使用很多的途径。一般而言，当交联反应的产物打算用于医学用途时，需要保持尽可能低的交联水平，因为有向该交联剂引入免疫反应的危险，同时也会危害生物可降解性。
免疫学和变态反应。免疫系统可以分为先天免疫和适应性免疫。先天或非特异性免疫是对没有被感染或接种所免疫的物种所显现的固有的抵抗力。适应性或获得性免疫是这样一类免疫，其中对刺激它的抗原有可变的反应性并产生抗原特异性免疫记忆。免疫可以是主动的，即，是获得性感染或接种的结果，或者它可以是被动的，例如，是从抗体的转移获得的。抗体的被动接种有几个缺点：注射异物会引起对所注射抗体的免疫应答。单克隆抗体必须大量地注射，这使得该疗法非常昂贵。必须持续治疗以维持其功能。主动接种诱导抗体产生和免疫记忆是最常优选的。大部分天然免疫原是分子量在5kDa以上的蛋白质。甚至免疫原分子不会产生所期望的免疫水平。为了增强免疫应答的强度，将免疫原与佐剂组合。佐剂是这样一种试剂，它增强免疫应答而不会产生不希望有的抗佐剂的抗体。如果免疫原仍然不能产生可接受的免疫应答，可以将它与致免疫性更强的载体结合。分子量范围0.1-2kDa的小分子通常太小而不能被免疫系统识别，因此难于在免疫接种中使用。克服这一点的一种途径是将它们共价结合到较大的载体分子上。接种可以是经口服、鼻、皮下、粘膜下、舌下或肌内。
T-和NK细胞对外源细胞的识别和破坏称之为细胞介导的免疫(TH1免疫应答)。体液免疫与B-细胞有关(TH2免疫应答)。据报道，氢氧化铝选择性地激活TH2细胞，而弗氏完全佐剂则激活TH1细胞。壳聚糖也显示出可以增强体液和细胞介导的免疫应答(Vaccine 3，379-384，1985)。
先天免疫系统识别广谱的病原体，而不需要预先接触。负责先天免疫的主要细胞是单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞，它们吞噬微生物病原体并触发先天性、炎性和适应性免疫应答。Toll-样受体(TLRs)是一类与识别范围广泛的微生物有关的I型跨膜蛋白。它们在先天免疫系统中发挥关键作用。TLRs是模式识别受体(PRRs)的一种类型，识别病原体广泛共有但与宿主分子可识别开的分子，统称为病原体相关分子模式(PAMPs)。巨噬细胞受体也被认为是模式识别受体。巨噬细胞甘露糖受体识别具有碳C3和C4位的中轴位羟基的己糖，这使得它可以识别甘露糖、果糖、N-乙酰葡糖胺和葡萄糖(Curr.Opin.Immunol.10，50-55，1998)。
变态反应是一种非常常见的疾病，在工业国家中影响了约四分之一到三分之一的人口，例如，超过5000万的美国人患有变态反应性疾病。现在，最常用的治疗策略是靶向变态反应的效应机理，例如，通过口服摄取抗组胺类或通过局部用皮质激素。抗组胺类或皮质激素治疗可以有效地缓解变态反应症状，但是它们的使用导致整个身体暴露于药品，它们可以产生令人不快或者甚至有害的副作用。变应原-特异性免疫治疗是靶向于潜在的变态反应原因，并长效缓解症状的唯一在使用的治疗。因此，认为它是变态反应性疾病唯一的根治疗法。这种治疗是以皮下注射或舌下给药给予的。通过实行皮下注射变应原浸出物，很多文献记载了它具有的效果，同时舌下给药的变应原特异性免疫治疗的效力则较少记载。
变态反应性疾病例如哮喘和鼻炎是由对否则无害的周围抗原，即变应原不适当的免疫应答所导致的。最常见的形式是免疫球蛋白(Ig)E-介导的变态反应，特征在于存在变应原特异性IgE。现在有两种治疗IgE-介导的变态反应的常用策略，分别是药理学治疗和变应原特异性免疫治疗。药理学治疗包括用局部用皮质激素治疗，特别是在变应性哮喘和湿疹的情况下。但是，10-20％的变应性哮喘患者对于类固醇治疗没有应答。其他常用的抗变态反应药物靶向于Ig E-介导的变态反应的效应机理，例如是抗组胺类、抗白三烯类和色酮类。Ig E-介导的变态反应的唯一一种治愈性疗法，即长效缓解症状的唯一疗法是变应原特异性免疫疗法(ASIT)。与药理学治疗相反，ASIT也已经显示出可以减轻气道炎症并起保护作用，防止发展成为慢性哮喘(J Allergy Clin Immunol.1998102(4 Pt 1)，558-62)。该治疗是基于重复施用变应原，以诱导变应原特异性无应答性。目前，在ASIT中一般使用由天然来源制备并吸附到氢氧化铝(alum)中的变应原浸出物。Alum延迟了变应原的释放，并发挥佐剂的作用。但是，会出现一些与使用变应原浸出物和alum有关的缺点。在3-5年的时间里需要以较低变应原剂量进行很多次注射。为了解决问题例如引入新的致敏作用和浸出物的有害副作用，有人提出将重组变应原用于ASIT(Adv Immunol.2004；82：105-53，Nat Rev Immunol.2006，10月；6(10)：761-71)。为了实现更安全和更有效的ASIT方案，可以以不同的方法修饰重组变应原。这些新策略的例子是建立所谓低变应原，即与I gE结合能力降低但保持T-细胞活性的变应原；用变应原衍生的多肽接种或者将变应原与免疫调节剂例如包含CpG基序的免疫刺激寡核苷酸偶合(Nat Rev Immunol.2006 Oct；6(10)：761-71，Curr OpinImmunol.2002 Dec；14(6)：718-27)。已知Alum会在注射位点导致肉芽肿，而且主要刺激Th2应答。因此，ASIT需要可替代的佐剂。
佐剂是增强抗原引发免疫应答能力的物质。尽管人们做了多方面的努力，试图发展出人用疫苗的新佐剂，但是唯一广泛使用的佐剂仍然只有氢氧化铝。据显示，铝佐剂会导致神经元死亡。需要发展出新的佐剂以使新疫苗的效力最大化。理想的佐剂应当长效表达功能活性的抗体，引发细胞介导的免疫并增加对抗原具有高度特异性的免疫反应性的记忆性T和B淋巴细胞的产生。它应当立即提供防御，并对抗原的未来攻击提供保护。它也应当是生物可降解的，无毒性的，并且不会直接对佐剂本身产生免疫应答。
接种应当提供长期效果，快速产生抗体并具有较高的抗体滴度。
在US 4,372,883和US 4,814,169中已经提及了将甲壳质和壳聚糖用作佐剂。在US 5,554,388，US 5,744,166，和WO 98/42374中已经描述了壳聚糖在溶液、分散体、粉末或微球形式的疫苗中的用途。壳聚糖的交联开启了从TH2至混合型TH1/TH2应答的免疫应答。壳聚糖溶液与抗原混合用于免疫，显示了壳聚糖与弗氏不完全佐剂是等效的，优于氢氧化铝(Vaccine 11，2085-2094，2007)。
药物递送。药物递送是一个非常深入的研究领域，今天，在发现新的和改善的递送药物活性成分例如低分子量药物、基因和更具特异性的疫苗，同时使不希望有的副作用最低的制剂方面花费了大量的资金。老药在新的和改善的制剂中变成了新药。
壳聚糖的性质，包括物理和生理学性质使得它非常适合递送药物活性组分，并作为递送载体用于，例如疫苗、基因片段和微-RNA。壳聚糖有用且重要的特征是，它与所有活组织结合，具有粘膜附着性质，可降解，而且能打开细胞之间的紧密连接。通过利用这些性质，可以显著改善跨粘膜的药物递送。现在，基于壳聚糖技术的药物制剂正在发展用于不同目的，例如，作为疫苗载体、延迟释放的水凝胶、膜、纱布等。壳聚糖已经显示出可以用于，例如胰岛素的结肠递送(H.Tozaki等人，J.Pharm，ScL，86，1016-1021，1997)和鼻内递送(US 5，744，166)。壳聚糖也已经用作基因递送的载体(MacLaughlin，等人，J.ControlledRelease，56，259-272，1998)。
一些制剂设计用于经时持续释放，而其他的释放则更为瞬时。当使用壳聚糖的水凝胶时，发现交联是优选的，因为无交联剂的凝胶有溶解的趋势。使用交联的其他优点是，从凝胶中的释放速率可以通过使用不同程度的交联来调节。壳聚糖可以用于发展新的制剂，用于例如口服、经皮、皮下、颊、舌下、鼻、直肠、阴道和肌内施用。
通过常规的全身途径以未修饰方式施用的很多药物难以以有效浓度到达靶器官，或者在一定时间后由于轻易代谢而不再有效。通过使用药物递送系统(DDS)，能够克服这些问题。
癌症药物通常的特点是，血浆半衰期较短和/或显著的副作用。减轻这些问题的一种方法是通过病灶施用，即，通过植入/注射包含化疗剂的DDS，在癌症位点局部递送药物。与全身性施用相比，副作用的程度将会降低，而药物的总效果则会提高。
当发展用于癌症局部疗法的DDS时，必须考虑几个技术因素，即生物相容性；生物可降解(重要性取决于疾病、应用位点和剂量施用的次数)；无菌/灭菌；与药物和药学赋形剂相容；易于施用(优选通过注射器)；剂量、药物负载、给药位置的灵活性；控制药物释放的能力和患者的接受程度，以及对调节障碍、CoG(产品成本)和IPRs的考虑。
通过注射含药物的DDS使得较大量的负载药物定位于肿瘤位点，由此改善了癌症治疗并降低了化疗剂的有害的非特异性副作用。
组织填充。组织填充可以用于医学和美容目的。医学应用是，例如，填充组织以得到组织的功能改善。可以通过注射填充剂强化的组织的例子是声带、食管、尿道或直肠。在美容手术的领域，软组织填充可以用于校正缺陷例如疤痕和皱纹，并增大例如嘴唇或乳房。很多不同的物质-生物不可降解的和生物可降解的-已经用于修复或填充软组织。用于长期的软组织填充的物质的例子是硅酮、Gore-Tex和ePTFE。生物可降解的物质的例子是胶原、自体脂肪、交联透明质酸和合成型聚合物。
硅酮是永久的软组织填充最常用的物质。液体可注射硅酮的有害反应包括肉芽肿性反应、炎性反应和漂移。这些反应可以在初始治疗后数年内发生。此外，由于可注射的硅酮是永久的填充物，上述并发症会变成严重的问题，因为该物质不会代谢，尽管治疗但该反应仍会持续。
胶原是最常用的可注射物质之一，用于美容应用，并作为填充剂用于例如尿失禁。但是，胶原有一些缺点。它迅速降解，约3％的人显示延迟的超敏反应，这使得必须在注射前一段时间进行变态反应试验。此外，来源于牛的胶原会传染病毒性疾病。
自体脂肪的注射是公知的。这些物质也有缺点。注射到面部线条和皱纹中的脂肪会导致一些患者视力损失和栓塞。此外，自体脂肪易被身体吸收。
交联透明质酸产品用于美容治疗，以及作为填充剂用于治疗，例如尿失禁(UI)和膀胱输尿管反流(VUR)。
设计填充剂的共同方法是使用分散在生物学可降解的载体中的生物不可降解的物质的球。例子包括β-葡聚糖凝胶中的碳-包衣的珠，羧甲基纤维素中的羟磷灰石球，聚四氟-乙烯颗粒和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球。颗粒注射的一个风险是颗粒可能迁移到远端的器官例如脑和肺中。
现有的物质并不是最佳的，需要继续研究用于组织填充用途的新物质，通过细针可注射、生物可相容的、无毒性的并且在组织内有适当驻留时间的物质。
已经描述了用于软组织填充的壳聚糖凝胶(WO 97/04012，EP 1333869)。
例如Biomaterials.2000；21(21)：2165-61，J Biomed Mater ResA.2007；83(2)：521-9，和Biochimie.2006；88(5)：551-64所述，壳聚糖凝胶也已经用于细胞培养和引入有活力的细胞以用于，例如软骨组织处理。
在美容中，壳聚糖已经用于，例如皮肤用乳膏(US 20060210513，US 20040043963)，和减轻刮脸导致的皮肤刺激(US 6,719,961)。
壳聚糖也可以用作润滑剂(Nature.2003，425：163-165)。在例如Environ Sci Technol.(2002)36(16)：3446-54和Nanotechnology(2006)173718-3723中已经描述了壳聚糖用作增稠剂。它也已经用作胶(Biomacromolecules.1(2)：252-8(2000)和Fertil Steril，84，75-81(2005))和膳食增补剂(US 5,098,733，US 5,976,550，US 6,238,720和US 6,428,806)
除了医学用途，粘弹性的壳聚糖水凝胶可以用作假塑性体、包含壳聚糖的剪切稀化液体，在例如US 6,258,755中描述了一种增强该液体的热稳定性的方法。
甲壳质是地球上仅次于纤维素的最丰富的多糖。在坚硬结构和强壮物质中发现了它，它在其中具有强固棒的功能。它与钙盐、一些蛋白质和液体一起，构成了海产生物例如甲壳类和节肢动物的外骨骼。也在一些细菌和海绵的细胞壁上发现了它，它构成了昆虫坚硬的外壳和翅膀。在商业上，甲壳质是从甲壳动物的外壳分离的，甲壳动物的外壳是鱼类工业的废品。壳聚糖是一种线性多糖，由1，4-β-连接的D-葡糖胺和N-乙酰基-D-葡糖胺残基构成。甲壳质本身不是水溶性的，这极大地限制了其用途。但是，用强碱处理甲壳质使其部分脱乙酰化，得到了水溶性的衍生物壳聚糖，它具有很多不同物理形式，例如，薄膜、海绵、珠、水凝胶、膜。碱形式的壳聚糖，特别是高分子量和/或高度N-乙酰化的壳聚糖几乎不溶于水，但是其与一价酸的盐将变成水溶性的。葡糖胺残基的平均pKa是约6.8，该聚合物与例如HCl、乙酸和羟乙酸形成水溶性盐。壳聚糖的溶解性取决于若干因素，包括内在例如链长、脱乙酰度、链内乙酰基分布，也取决于外部条件例如离子强度、pH、温度和溶剂。由文献已知，约50％的乙酰化程度对于溶解性是最佳的。当在酸性环境中制备凝胶和水溶液时，具体壳聚糖的溶解性实际上设置了限制，取决于其分子量及其N-脱乙酰程度。但是，基于液体介质的重量，水性介质中壳聚糖的量典型地在1-10％或1-5％重量的范围内，如果使用低分子量的壳聚糖，该量趋向于该范围的上限(Carbohydr.Polym.25，65-70，1994)。
壳聚糖的固有性质是生物可降解、无毒性和抗菌，以及其阳离子性质和亲水性质，这使得它在药物制剂中是有吸引力的。但是，它在生理条件下溶解性较差限制了它的实际用途。科学家通过制备在生理pH下具有良好溶解性的化学修饰的壳聚糖衍生物，例如硫酸化的壳聚糖、N-羧甲基壳聚糖、O-羧甲基壳聚糖和N，O-羧甲基壳聚糖克服了其溶解性的缺点(Int J Biol Macromol.(4)，177-80，1994，Carbohydr Res.302(1-2)：7-12，1997)。
在壳聚糖上引入化学取代基的结果是改变了生物学性质，例如，改变了降解速率，并有引入对生物相容性和毒性有不利影响的基团的风险。该问题已经在US 6,344,488中解决，其中将甘油磷酸用作增溶剂，由此允许在生理pH下制备壳聚糖水凝胶，而不修饰壳聚糖结构。
壳聚糖溶液可以在酸性条件，典型地在适合Shiff碱形成的pH(pH4-5)下交联，形成水凝胶。已经使用了大量的具有不同结构和反应性的不同交联剂。已经使用了数种交联剂来由液体壳聚糖形成凝胶，例如葡萄糖胺聚糖例如透明质酸和硫酸软骨素(Ann，Pharm.Fr.5847-53，2000)、戊二醛(Ind.Eng.Chem.Res.36：3631-3638，1997)、乙二醛(US 5,489,401)、方酸二乙酯(Macromolecules 31：1695-1601，1998)、二环氧化物例如二环氧甘油醚(US5770712)、三聚磷酸盐(J ApplPolym Sci 74：1093-1107，1999)、genipin(J Polym Sci A：Polym Chem38：2804-2814，2000，Biomaterials.23：181-191，2002)、甲醛(J.Polym.Sci.Part A：Polym.Chem.38，474，2000，Bull.Mater.Sci.，29，233-238，2006)。当水凝胶是所需的产物时，强制壳聚糖及其衍生物保留在溶液中，并避免其沉淀。试图调节交联壳聚糖水凝胶的pH至生理可接受的水平，会导致限制其使用的沉淀和不溶物。需要保持尽可能低的交联程度，这也出于毒理学原因，因为高度交联会完全改变壳聚糖的行为(Eur J Pharm Biopharm.2004，57(1)：19-34.Review)。
一类特别的水凝胶是粘弹性的凝胶，该凝胶是粘性的，同时显示了弹性。粘弹性的凝胶在所使用的剪切应力的影响下会变形和流动，但是当去除应力后，液体会从某种程度的变形中缓慢恢复。这可以用于，例如，眼科学、组织填充和美容手术。凝胶的粘弹性允许进行机械处理，包括制备碎胶。透明质酸的粘弹性凝胶，例如，用于眼外科、皱纹填充或治疗尿失禁。
壳聚糖是一种天然的聚合电解质。聚合电解质在水性环境中的三维定向取决于，例如其天然/化学组成、大小、浓度和电荷密度，即电荷的数量和其荷电基团之间的距离。任何聚合电解质在溶液中的空间相互作用可以通过焓来控制，该分子将努力适应低能态，在低能态下其最稳定。这种能量最小化过程涉及不同类型的相互作用，包括分子内(相同分子内)或分子间(分子间)。分子内相互作用的例子是氢键、疏水性相互作用和聚合物上荷电基团之间的相互作用。典型的分子间相互作用是溶剂相互作用和与其他分子的相互作用。无论涉及哪种类型的相互作用，这些相互作用的驱动力是发现聚合电解质的能量上有利的构象。
当聚合电解质包含具有相同类型电荷，例如正电荷的荷电基团时，这些基团将相互排斥。为了减小其内能，聚合电解质分子将努力尽可能多地分离其内电荷，产生了伸长的聚合物链。这些伸长的聚合物不仅有更多的“空间需求”，它们也具有相对高的驻留在原子之间的强制连接中的能态。
另一方面，如果聚合电解质包含相反标记的电荷，它们将相互吸引，形成内盐桥，产生了聚合物不同的三维定向，即聚合物的不同部分彼此更加靠近。在没有任何电荷的聚合物中，没有离子相互作用，因此其三维定向取决于分子内和与周围分子和介质形成稳定的氢键能力和疏水性相互作用。与聚合电解质相反，不包含任何高能斥力的不荷电聚合物，形成了某种类型的“随机螺旋”结构，其中它们的内能已经最小化，它们的相对能函低于聚合电解质。
就物理上而言，离子相互作用(荷电)要强得多，涉及比其他相互作用例如氢键、范德华力和疏水性相互作用更多的能力。因此前者对分子定向的相对影响更大，在很多情况下会掩盖所涉及的其他类型的力的影响。
具有N-乙酰葡糖胺和葡糖胺残基的混合的壳聚糖聚合物理论上是中性聚合物，但是在大多数实际和生物学相关情况下，它是质子化的，因此葡聚糖中葡糖胺的pKa值是约6.8。但是，与具有不变荷电基团的聚合电解质相反，壳聚糖聚合物的电荷密度可以改变，这直接取决于水溶液的pH。实际上，当pH是约6以上时，大多数市售和未修饰的壳聚糖在水溶液中是不溶的，在该pH以上时它们会从水溶液中沉淀出来。沉淀是能量驱动的，因为壳聚糖分子在其分子骨架上需要大量电荷以形成能量上有利的溶剂化态。如果这不能实现，分子将从溶液中沉淀出来，形成更稳定的沉淀。在沉淀中，壳聚糖链集中在一起，这使得可以通过壳聚糖分子之间或分子内的相互作用实现能量优化。
为了增强壳聚糖溶液的粘性，可以使用化学交联。在该反应中，壳聚糖链连接在一起，形成更大的网样凝聚物。在该反应期间，粘性成功地增强，溶液的结构变得更像凝胶。描述了很多的交联方法可以用于溶液中的壳聚糖，它们的共同点是，将壳聚糖溶于酸性水相。在低pH，典型地是4-5下发生交联反应。使用低pH暗示，壳聚糖链是其质子化形式，因此，当交联时它们是“伸长”形式。然后，所得到的交联凝胶是在技术上巨大结构的质子化和伸长的壳聚糖链。当将这种巨网引入中性或碱性条件下时，一般会丧失其电荷，断裂，最后沉淀。这在某种程度上正是所期望的，因为当将标准壳聚糖(脱乙酰度约80-95％)引入pH 6以上时，它们会沉淀。本身的交联产生了甚至更大的电解质结构，从能量的观点来看，这甚至更需要在水溶液中将其稳定。这是因为，正电荷在链之间的连接点更紧密地在一起，因此甚至更难以用水分子溶剂化来稳定。因此，当以较差的能量优化方法，例如升高pH来改变溶液条件时，它们甚至比个体链更易于沉淀。通过交联，巨大的凝胶结构已经锁定在了伸长和能量不利的状态，物理上不允许重排成螺旋和能成为能量上更有利的构象而产生高稳定性的系统的其他构象。
通过将交联的壳聚糖凝胶块置于pH大于7或甚至更高值，即pH7-14下，很容易实验证明在酸性条件下形成的壳聚糖凝胶的沉淀。当将这样的块状物置于较高pH的缓冲液中时，该块状物的表面立即变白，形成薄层的沉淀，随着持续的分散，该块状物变得越来越白，直至完全沉淀。
但是，令人惊奇地，我们已经发现，交联壳聚糖凝胶巨大结构的这种断裂可以通过使用特定脱乙酰度的低脱乙酰化的壳聚糖，并以能量较低的强制构象交联壳聚糖链来克服。根据该方法制备的凝胶可以用1M氢氧化钠处理而不会形成沉淀。当用1M NaOH处理时，相应的非交联凝胶将会沉淀。
通过使用高溶解性的这些特别的壳聚糖，在交联反应期间pH可以升得更高。这样做的优点很多。首先，壳聚糖链的质子化变弱，该壳聚糖聚合物在pH 8以上时几乎是中性的，这使得可以在溶液中形成强制性更小和更随机的螺旋样网状结构。当壳聚糖在该条件下进行交联时，所得到的凝胶结构是通过柔性更高的各壳聚糖链产生的，这使得当条件改变时它们更易于转变成能量上更有利的巨大结构。其次，就实质上增加葡糖胺残基上的氨基的反应性而言，使用更高的pH是可行的。这使得可以更有效的偶合，并能使用浓度低得多的交联试剂来达到规定程度的交联。另一个好处是，副反应保持在低水平。与在低pH下，由标准级壳聚糖(脱乙酰度80-95％)制备的壳聚糖凝胶相比，这些交联的凝胶具有若干优点。它们不会在生理条件下沉淀的事实意味着，它们更易受导致凝胶快速降解的降解酶的影响，并且具有本说明书所述的其他性质。
发明简述
因此，本发明提供一种可交联的壳聚糖组合物，包含脱乙酰度30-75％的壳聚糖，其中壳聚糖随机脱乙酰化的，和交联剂，其中基于交联剂中官能团的数量和壳聚糖中易接近的氨基的数量，交联剂和壳聚糖的摩尔比是0.2∶1或更小。
本发明能在生理pH下形成交联的、粘弹性的壳聚糖水凝胶，而无须使用其他增溶剂，例如磷酸甘油。
本发明的一个目的是由壳聚糖提供一种粘弹性的凝胶，其可以在生理pH下递送而不会沉淀。
本发明的一个目的是提供一种粘弹性的凝胶，通过化学交联已经得到了一定物理强度，这使得它可以进一步处理成更小的、各自分离的凝胶片段，例如碎凝胶。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，它可以通过细注射器针头递送，典型地是用于注射，例如用于接种。
本发明的另一个目的是提供碎的粘弹性的壳聚糖水凝胶，其暴露出较大的表面积，因此当在体内使用时，易用于酶和侵入的细胞。
本发明的另一个目的是提供快速降解的粘弹性的壳聚糖水凝胶。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性、低毒性的壳聚糖水凝胶，通过使用低浓度的交联剂，优选低毒性或无毒性的试剂，减小或完全避免了不希望有的免疫或毒理性反应。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，其允许在制备期间共价或非共价地掺入抗原和免疫原。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，其具有固有的佐剂性质。
本发明的另一个目的是提供生物可降解的，粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于免疫用途。
本发明的另一个目的是提供一种载体，用于递送抗原和免疫原，以进行免疫。本发明提供一种免疫试剂，包含本文所述的壳聚糖水凝胶和抗原，其中抗原任选与壳聚糖共价结合。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，其使得可以共价掺入导致免疫应答的分子。所述分子可以是低或高分子量，例如，小分子例如肽类、脂类、类固醇和抗生素，或者大分子，例如蛋白质、基因片段、微-RNA、糖类聚合物和合成型聚合物。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，包含一种以上的致免疫物质。该凝胶可以制备成包含两种或更多的低和/或高分子量的抗原分子或抗原的混合物。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，其允许共价或非共价地掺入其他试剂，例如防腐剂，和其他聚合物。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，通过用阴离子聚合物包衣可以进一步改变其释放性质。通过依次使用阳离子和阴离子聚合物，可以构成多层包衣的粘弹性的凝胶结构。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于佐剂免疫疗法，以非特异性地增强免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种制剂，通过在粘弹性的壳聚糖水凝胶掺入生物活性剂或抗原(例如，变应原)，给予所述生物活性剂或抗原的持续释放。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于组织填充，单独使用或与固体珠一起使用。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于治疗例如，尿失禁(UI)和膀胱输尿管反流(VUR)。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用作填充剂。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，作为细胞培养支架。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于向宿主生物体提供活细胞。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于口服、鼻、皮下、粘膜下、舌下、角膜、直肠、阴道和肌内药物递送。本发明提供一种药物组合物，包含如本文所述的壳聚糖水凝胶和药物活性成分。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，允许掺入和释放药物，例如用于如上文所述的病灶癌症治疗。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，允许在制造药物期间共价或非共价地掺入药物。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用作伤口愈合装置。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于粘性手术。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用于美容用途。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用作润滑剂。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用作胶。
本发明的另一个目的是提供一种粘弹性的壳聚糖水凝胶，用作钻孔或维护液。
现在，参考附图来描述本发明，其中图1显示的是皮下注射本发明的粘弹性壳聚糖凝胶和对照凝胶24小时后，小鼠注射位点的组织切片。
发明详述
本发明一般涉及由壳聚糖制备的水凝胶，意欲，例如用于人或兽医学。更具体地，本发明的目的是如前文所述应用的具有粘弹性的壳聚糖水凝胶。因此，本发明提供一种组合物，包含壳聚糖或不同脱乙酰度的壳聚糖的组合物，所述壳聚糖不会在生理条件下沉淀，同时暴露出较大表面积，因此易于进一步进行生物学处理。与现有技术的壳聚糖溶液相比，本发明的粘弹性的水凝胶的表面积要大数个数量级。与现有技术的壳聚糖溶液(Vaccine 11，2085-2094，2007)相比，当皮下注射于小鼠时，本发明的粘弹性水凝胶的这种特征使得细胞渗透更快，免疫应答更迅速。这使得使用较低剂量的免疫原成为可能。
这可以通过提供可交联的壳聚糖组合物来实现，该组合物包含脱乙酰度30-75％的壳聚糖，其中壳聚糖随机脱乙酰化的，和交联剂，其中基于交联剂中官能团的数量和壳聚糖中易接近的氨基的数量，交联剂和壳聚糖的摩尔比是0.2∶1或更小。制备本发明的壳聚糖水凝胶，包括提供该可交联的壳聚糖组合物的水溶液，将该组合物交联，分离所得到的壳聚糖水凝胶。本发明也提供通过该方法可得到的水凝胶。
壳聚糖的溶解性取决于若干因素，包括内在例如链长、脱乙酰度、链内乙酰基分布，也取决于外部条件例如离子强度、pH、温度和溶剂。已经做了很多尝试来制备医用壳聚糖生理溶液和凝胶，但是通常大多数都结果较差。大多数市售的壳聚糖的脱乙酰度超过80％，当制备溶液和凝胶时，需要低pH以溶解该聚合物，典型地使用乙酸或盐酸的酸性溶液。升高这些溶液的pH的尝试会导致当pH超过约6时，壳聚糖聚合物沉淀。这个问题可以通过使用水溶性更大的壳聚糖衍生物或者使用添加剂例如磷酸甘油来克服。我们已经发现，低脱乙酰度例如50％的壳聚糖可以用于在生理条件下制备水凝胶，可以制备的壳聚糖浓度高达若干百分比。低脱乙酰度的壳聚糖市售的很有限，但是在文献中描述了这些壳聚糖的制备。制备低脱乙酰度的壳聚糖的一种方法是在酸性条件下将壳聚糖重新乙酰化，然后脱乙酰。另一种途径是在强碱和较冷的条件下由置于溶液中的甲壳质开始脱乙酰。低脱乙酰度例如50％的壳聚糖并不仅仅比脱乙酰度较高的壳聚糖更易溶解，它们也更快速和更容易被水解酶分解，其中该水解酶需要N-乙酰基识别分解位点。将壳聚糖凝胶和溶液升至生理pH水平的较不明显但是同样重要的优点是，聚合链中葡糖胺残基的反应性伴随性增强。在某些情况下，这可以用于抑制不希望有的副反应并减小潜在的交联剂的影响，因此它们的浓度可以保持在比产生氨基反应性增强的效果时低得多，而这种效果会产生更有效的偶合。这种情况的一个实例是当在酸性条件下通过使用大量过量的方酸二乙酯交联壳聚糖时。在pH约4.75下进行该反应，在两个反应位点之一水解约50％的所加试剂，得到方酸取代的壳聚糖链，其不会进一步交联。当在pH 7以上进行相同反应时，反应会增强数个级别，抑制了竞争性的副反应，产生单纯且有效的反应，最少化了实现期望的交联网状结构所需的试剂。当该壳聚糖凝胶结构意欲用于免疫用途时，这是最重要的。这是出于几个理由。首先，对交联剂总是有发生不希望有的免疫反应的风险，其次，降解动力学改变的风险，再次，这些交联剂一般是高反应性的，如果不完全消耗会导致毒性副反应，因此将这些试剂的水平保持在尽可能低是非常重要的。我们优选使用低毒性的交联试剂，使用不会去除某些基团的交联剂，其中所述基团在粘弹性的水凝胶的生物学应用前必须除去。FDA确认了方酸二丁酯可以用作局部免疫调节剂，在Ames试验中不会诱变。另一类常用的交联剂是基于超氧化物化学的反应性物质。二环氧甘油醚常用于各种交联反应，其中它们与羧酸、醇盐和胺反应。当二环氧甘油醚或类似衍生物已经用于壳聚糖的交联目的时，所使用的交联剂与壳聚糖的氨基官能团为适当高比例。这在Journal ofBiomedical Materials Research Part A，2005，75A，3，742-753Eur.J.Pharm.Biopharm.2004，57：，19-34，US 5,770,712，WO 02/40070中有说明。我们也根据文献试验了其他交联方法。戊二醛交联产生了有色水凝胶，该水凝胶当遇到碱性介质时沉淀。本发明的粘弹性的水凝胶易于用，例如阴离子聚合物来包衣，以改变生物学处理速率。当本发明的粘弹性的水凝胶透析过碱性介质时，凝胶的表面保持澄清，而现有技术的凝胶透析则使壳聚糖沉淀，可见到不透明的凝胶表面。非交联和交联水凝胶之间沉淀有引人注目的差异。令人惊奇地，这些凝胶能用1MNaOH处理而不沉淀。
粘弹性的凝胶的结构可以通过所使用的壳聚糖溶液浓度和交联剂的量来影响。我们优选较高浓度的壳聚糖和较低浓度的交联剂，以得到所期望性质的凝胶。在本文中，交联分子具有至少两个反应位点，它们是亲电子的，设计在中性或微碱性条件下易与胺类反应。当交联剂具有两个反应位点时，它是双功能的，因此可以与不同壳聚糖链中的两个氨基，例如两个葡糖胺单元反应。有很多市售的具有该性质的交联剂，有时反应基团之间的距离通过“间隔分子”来增大。该间隔子通常是脂肪族链或聚醚构造例如聚或寡乙二醇。优选地，交联剂是双、三或四功能的，尽管优选双或三功能，最优选双功能的。我们优选使用双功能的交联剂，其易于在中性到弱碱性的条件下以高收率反应，并且其中交联分子高度消耗。我们也优选，交联分子不会形成使用前必须除去的副产物。很多交联剂被设计用于在反应时除去离去基团。在这些情况下，我们优选除去无毒性组分的交联剂。这些交联功能的典型例子是反应性的酯、Michael受体和环氧化物。优选的交联分子是方酸的酯类衍生物、丙烯酰胺的二环氧化物和衍生物。最优选的是方酸二乙酯(3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮)和与其结构密切相关的类似物。其他优选的交联剂是1，4-丁二醇二环氧甘油醚、丙烯酰胺的衍生物及与它们结构密切相关的类似物。
同样重要的是减少交联剂的量，并产生有效且清洁的偶合反应，如果有副产物的话也只产生一点。我们优选使用的壳聚糖中交联剂与氨基官能团的数量的摩尔比较低。我们优选0.2∶1或更小的摩尔比，更优选使用0.16∶1或更小的摩尔比，最优选使用0.1∶1或更小的摩尔比。所述摩尔比是基于交联剂和壳聚糖上可交联基团的数量。就交联剂而言，它取决于功能性(双、三或四功能等)，而对于壳聚糖则取决于氨基的易接近性(仅脱乙酰的氨基是反应性的)。很明显，可用氨基的数量是由壳聚糖的脱乙酰度决定的。
我们优选壳聚糖的脱乙酰度小于75％，更优选脱乙酰度小于70％，甚至更优选脱乙酰度小于65％，甚至更优选脱乙酰度小于60％，最优选脱乙酰度小于55％。甲壳质完全不溶于水溶液，当脱乙酰度为30％或更大时，会变得一定程度可溶。我们优选脱乙酰度大于35％，优选脱乙酰度大于40％，最优选脱乙酰度大于45％。壳聚糖的溶解性也取决于参数例如分子量、链内乙酰基的分布和平衡离子。壳聚糖本身是多元分散系，即，包含不同链长的混合物。市售壳聚糖的特征在于它们的粘性和平均分子量是给定的。当在25℃的温度下使用具有以20rpm旋转的梭的旋转粘度计，测定1％乙酸水溶液中的1％w/v溶液时，我们优选粘性高达15,000mPas，优选2-10,000mPas，更优选5-2,000mPas，最优选10-1,000mPas。溶液的粘性指示壳聚糖平均分子量，应当理解，壳聚糖是具有不同链长的分子分布的聚合物。我们优选使用的壳聚糖溶液浓度为3％或更小。更优选使用2％或更小的浓度。我们优选浓度大于0.3％(w/w)。
壳聚糖的脱乙酰模式对于其性质也是重要的。本发明的壳聚糖必须是随机脱乙酰的。也就是说，避免使用大块的壳聚糖类聚合物，因为这些物质具有变得难溶的趋势。相反，本发明的壳聚糖具有随机模式的乙酰化和脱乙酰化的单糖单元。确定单糖性质的一种方法是用NMR确定最近邻频率，并与统计模型获得的频率进行比较，参见WO 03/011912。
市售壳聚糖典型地具有非随机的块状结构。其原因在于，甲壳质是从甲壳动物的外壳中以固相方法分离的，这些方法中，外壳在整个过程中都保持不溶，用强碱处理外壳，得到了部分脱乙酰的壳聚糖。但是，由于甲壳质最初是甲壳动物外壳的形式，碱的氢氧根离子优先作用于外壳表面上的单糖单元；相对厚的外壳中心内的单糖单元不会遇到氢氧根离子，因此保持N-乙酰基取代的模式。
为了避免这些甲壳质类块状物，应当在溶液中处理甲壳质/壳聚糖多糖链。这使得多糖链能进入溶液，丧失外壳结构。这能产生随机脱乙酰模式。这可以通过在小心控制的条件下在溶液中处理甲壳质，或者通过使甲壳质完全脱乙酰化，然后在溶液中重乙酰化以得到需要的脱乙酰度来实现。参见T.Sannan等人，Makromol.Chem.177，3589-3600，1976，X.F.Guo等人，Journal of Carbohydrate Chemistry 2002，21，149-61和K.M.Varum等人，Carbohydrate Polymers 25，1994，65-70。本发明的壳聚糖优选可以通过在溶液相中将壳聚糖乙酰化和/或脱乙酰化以提供随机脱乙酰模式来得到。
当进行低脱乙酰化壳聚糖的交联时，我们优选反应条件为pH大于6且壳聚糖不沉淀。甚至更优选pH大于6.5，最优选pH大于7.0。同时优选不会通过水解或消去反应较大程度地破坏交联剂的pH。所述反应的典型条件是碱性条件，我们优选pH小于10，更优选pH小于9.5，甚至更优选pH小于9.0。优选地，存在的水为97-99.7％。也可以使用其他溶剂，例如乙醇，比如以0.2％(v/v)。在交联反应中使用的交联剂的浓度优选是0.01-0.2％(v/v)，更特别地约0.02％(v/v)。
本发明的粘弹性的水凝胶是以块状物得到的，其可以分离而无须进一步处理。然后用本领域已知的常规技术处理该水凝胶，以得到更小的块或片段。所得到的“碎胶”可以通过细针头注射。如实施例16所述，该凝胶的粘性可以用流变仪来测定。
现在，通过但不限于下列实施例来解释本发明。
实施例
除非另有说明，在实施例中使用下列物质：
低度N乙酰化的壳聚糖基本上是根据下列文献的原理制备的：Sannan T，Kurita K，Iwakura Y.S tudies on Chitin，1.DieMakromolekulare Chemie 1975；0：1191-5，Sannan T，Kurita K，IwakuraY.Studies on Chitin，2.Makromol.Chem.177，3589-3600，1976，Guo X，Kikuch，Matahira Y，Sakai K，Ogawa K.Water soluble chitinof low degree of deacetylation.Journal of Carbohydrate Chemistry2002；21：149-61和WO 03/011912。
实施例1
将壳聚糖(1.11g，N-脱乙酰度50％，MW 145kD)悬浮于70mL蒸馏水中，滴加2M HCl(aq)以溶解壳聚糖。用1M氢氧化钠将该溶液的pH调节至7.4。用蒸馏水调节体积至100mL。加入3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(122μL的20％(v/v)乙醇溶液)，将该溶液搅拌3小时。将该溶液的pH调节至8.3，体积调节至111mL。将该溶液放置在40℃的加热箱中3天。固化的凝胶指定为1-1。重复该方法，但不加入3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮。该凝胶指定为1-2。
实施例2
将壳聚糖(0.50g，N-脱乙酰度72％，MW 145kD)悬浮于35mL蒸馏水，滴加2M HCl(aq)以溶解壳聚糖。用1M氢氧化钠将该溶液的pH调节至6.2。用蒸馏水调节体积至50mL。该凝胶指定为2-1。向20mL的上述溶液中加入3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(40μL的12％(v/v)乙醇溶液)，将该溶液剧烈搅拌10分钟。调节该溶液的pH至7.5。将该溶液放置在40℃的加热箱中3天。固化的凝胶指定为2-2。
实施例3
在100℃下，壳聚糖(0.50g，N-脱乙酰度72％，MW 145kD)与戊二醛(6g)在50mL 1M HOAc(aq)中交联。反应条件如J.Control.Release111(2006)所述。
实施例4
将实施例1-4的各1g凝胶用1M NaOH(aq)处理。凝胶1-2，2-1，和3(对比)的壳聚糖沉淀，而交联凝胶1-1和2-2(本发明)保持澄清。
实施例5
将盐酸壳聚糖(0.50g，N-脱乙酰度55％，MW 145kD)溶于45mL水中。用稀氢氧化钠将该溶液的pH调节至7.3。加入3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(102μL的12％(v/v)乙醇溶液)，将该溶液搅拌3小时。调节该溶液的pH至8.3，调节体积至50mL。将较多的猫变应原，Fel d1(5.9mg)加入到3g的上述溶液中，将该混合物转移到5mL玻璃瓶中，在40℃下放置6天。机械处理所得到的凝胶，转移到1mL注射器中。
实施例6
将透明质酸(50mg)溶于MES缓冲液(20mL，20mM，pH 6.5)中。向该透明质酸溶液中加入实施例5的粘弹性水凝胶(4mL)，放置在定轨振荡板上90分钟。将该包衣的凝胶以2,300rpm离心2x10分钟，用PBS缓冲液洗涤，并转移到注射器中。该透明质酸包衣的壳聚糖凝胶可以冻干并再水合，得到粘弹性的凝胶。当把实施例5的水凝胶加入到不含透明质酸的PBS缓冲液中时，该丝状片段会变得发白和胶粘，不易分离，因此不能再水合。
实施例7
将盐酸壳聚糖(0.30g，N-脱乙酰度55％，MW 145kD)溶于25mL水中。用稀氢氧化钠将该溶液的pH调节至8.3，体积调节至3.0g。加入3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(61μL的12％(v/v)乙醇溶液)，将该溶液搅拌3小时，然后在40℃下放置6天。向该溶液中加入6mg Feld 1，并搅拌该混合物。然后将该混合物转移到1mL注射器中。
实施例8(对比)
将盐酸壳聚糖(0.90g，N-脱乙酰度81％，MW 145kD)悬浮于27g蒸馏水中。该溶液的pH是3.6。加入PBS(2.0ml，25mM，pH 7.4)。用稀氢氧化钠调节pH至5.8，调节体积至60mL。将2.27mg Fel d 1与1.1mL的上述溶液混合，并转移到1mL注射器中。
实施例9
用100μL实施例5、7和8的溶液给数组的BALB/c小鼠在颈部皮下注射。然后1、7和21天后，在不同时间点处死小鼠。通过吸入CO2来处死小鼠。收集注射位点的皮肤，置于冰上的histocon中，然后在丙酮浴中冷冻该皮肤样品。在组织切片前将该冷冻的皮肤活组织检查物保持在-80℃下。然后分析组织切片的细胞渗透。该组织检查表明在注射实施例5和7的凝胶1天后，细胞已经大量的渗透。实施例8的凝胶的组织检查显示，在细胞表面覆盖了镜片状的凝胶，但是凝胶中没有细胞。在凝胶5和7中，24小时后细胞已经渗透到整个物质中。7天后，实施例5和7的凝胶中壳聚糖的量减少。2周后，即第21天时，几乎没有注射物质的踪迹，相反，实施例8的凝胶显示的细胞迁移要慢得多，同时降解也慢得多。
图1显示了分别用实施例5的粘弹性的壳聚糖凝胶(图1(a))和实施例8的参照壳聚糖(图1(b))皮下注射24小时后，小鼠注射位点的组织切片。结果表明，与参照凝胶相比，免疫细胞更迅速且更大程度地渗透到本发明的凝胶中。甚至在3周后，参照壳聚糖仍然没有完全被渗透，与本发明的凝胶相比，观察到参照壳聚糖凝胶的降解速度更缓慢。
实施例10
用100μL实施例5、7和8的溶液给数组的BALB/c小鼠在颈部皮下注射。在首次注射后9周后，即第64天，给予加强注射。然后在注射后1、2、3、9和10周从尾部动脉抽取血样。通过ELISA测定Fel d 1-特异性血清IgG1和IgE的水平。所有凝胶都引发了IgG1-抗体应答。
实施例11
将壳聚糖(2.05g，N-脱乙酰度50％，MW 145kD)悬浮于160mL的蒸馏水中，加入2M HCl(aq)，直至壳聚糖溶解。通过滴加1M NaOH(aq)将pH调节至7.9。用蒸馏水调节体积至200mL。向50mL的上述溶液中滴加1，4-丁二醇二环氧甘油醚(166μL的5％(v/v)乙醇溶液)。在室温下剧烈搅拌该混合物10分钟，然后放置在加热箱(50℃)中过夜。
实施例12
将壳聚糖(2.25g，N-脱乙酰度55％，MW 145kD)悬浮于130mL的蒸馏水中，加入2M盐酸水溶液，直至壳聚糖溶解。用1M氢氧化钠将pH调节至6.75，并调节体积至160mL。向50mL的上述溶液中加入3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(120μl，12％乙醇溶液)，将该溶液在室温下搅拌2小时。将双氯芬酸(773mg)溶于25mL的蒸馏水，并加入到上述溶液中。用1M氢氧化钠将该溶液的pH调节至8.1，声处理该溶液1小时，然后加热至40℃过夜。将所得到的凝胶(1g)与透明质酸(4g，0.25％，在蒸馏水中)混合。将该凝胶置于配有截留分子量为2000Da的Spectra/Por过滤器并充满PBS缓冲液的Franz cell中。在2小时后释放出38％的双氯芬酸，5小时后释放出60％，24小时后则为72％。
实施例13
用放射性75Se标记的rFel d 1重复实施例5的方法。基本上如以前Der p 2(Febs J 2005；272：3449-60)所述，但是用Sel-标记的rFeld 1的构造、制备和精制条件(Chembiochem 2006；7：1976-81)，用原位标记Sel-标记的rFel d 1中的硒代半胱氨酸残基来进行75Se标记的rFel d 1的制备。
实施例14
如以前(Febs J 2005；272：3449-60，Methods Enzymol 1981；77：64-80)所述，进行与壳聚糖偶合或吸附到氢氧化铝上的100μg放射性标记的[75Se]rFel d 1(2μCi)的体内示踪。简言之，用壳聚糖-[75Se]rFel d 1或alum-[75Se]rFel d 1给小鼠(n＝2/组)s.c.注射，24小时或1周后杀死。冷冻小鼠并处理以进行带切片放射自显影术。将切片(60μm)压到X-光片(Structurix，Agfa，Mortsel，Belgium)上并用D19(Kodak，Rochester，USA)产生显影。
结果：24小时后，放射性已经代谢，在例如肝和脾中检测到放射性。模式与氢氧化铝类似。分别1和2周后仅可以检测到痕量的放射性。
实施例15
壳聚糖(3.6g，N-脱乙酰度52％，)悬浮于250mL的蒸馏水中，加入2M HCl(aq)，直至壳聚糖溶解。通过滴加1M NaOH(aq)将pH调节至7.0。用蒸馏水调节体积至300mL。该溶液指定为溶液X(1.2％壳聚糖)。向100mL的溶液X中加入50mL的水，该溶液指定为溶液Y(0.8％壳聚糖)。分别将16mL的溶液X和溶液Y加入到2个烧杯中。根据下表，分别加入不同量的3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(10％(v/v)乙醇溶液)。
X-1    20μL
X-2    59μL
X-3    118μL
Y-1    29μL
Y-2    88μL
Y-3    176μL
在室温下剧烈搅拌该混合物10分钟，然后将各4g的溶液转移到Petri培养皿(d＝35mm)中，密封，并放置到加热箱(40℃)中4天。
从Petri培养皿中取出直径6mm，高2.65±0.55mm的圆柱体，用配有100N测压计的Instron 3345压成凝胶盘。对样品进行1mm/分钟的压缩。
应当注意的是，基于0.8％壳聚糖溶液(Y-1，Y-2，Y-3)的凝胶在技术上更难以处理，因为与基于1.2％壳聚糖溶液(X-1，X-2，X-3)的凝胶相比，它们刚性结构较弱，因此分析精密度降低。尽管这是对比分析数据时需要考虑的问题，但是对凝胶并没有不利的影响(的确，刚性结构较弱会使凝胶更易粉碎)。基于1.2％凝胶(X-1，X-2，X-3)的测定值的分析数据表明，当交联剂的量从2％增加到12％(用交联剂和单糖单元的比计算)时平均E-系数从4.7增加到14.1Mpa。
实施例16
壳聚糖(4g，N-脱乙酰度55％，)悬浮于350mL的蒸馏水中，加入2M HCl(aq)，直至壳聚糖溶解。通过滴加1M NaOH(aq)将pH调节至7.0。用蒸馏水调节体积至400mL。向包含50mL壳聚糖溶液的两个不同的烧瓶中，滴加两种不同体积的3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(60(样品1)和185μL(样品2)的12％(v/v)乙醇溶液)。在室温下剧烈搅拌该混合物5分钟，然后将其中8mL转移到塑料注射器(10mL)中。密封注射器并放置在加热箱(40℃)中72小时。然后通过硅管(d＝3mm)对它们进行压缩，将所形成的凝胶转移到新注射器(5mL注射器)中。在测量前，将注射器在4℃下储藏。
为进行流变学研究，使用Bohlin Gemini VOR装置，用于测定40mm直径的圆锥平板几何学和锥度为4度的单元。所有的测量都在25℃下进行。
在振动剪切实验中研究储存和丢失系数G′和G″。这些流变学参数分别反应固体和液体的粘弹性。
这两种凝胶样品都在牵拉扫描测定中显示了粘弹性的软固体的性质，G′＞G″，即弹性组分大于液体对应物。在稳定的线性区域内，样品1的G′(1Hz)为约450Pa，相角为约1°。对于样品2，相应的数据为G′约900Pa，相角为1°。
在相同的制品上进行的第二类的振动测定是恒定变形0.5的频率扫描。获得了下列观察：样品2的凝胶具有更高的凝胶强度，弹性系数G′大于样品1的凝胶，这两种样品在0.1-20Hz的研究范围内，显示了明显频率非依赖性的弹性系数。
可以在凝胶样品的碎片上进行可再现的粘弹性测定。这两种凝胶样品在其破碎状态下显示了基本相同的粘弹性。与样品1相比，凝胶样品2的凝胶强度增强。
实施例17
将壳聚糖(1g，N-脱乙酰度55％)悬浮于80mL的蒸馏水中，加入2MHCl(aq)，直至壳聚糖溶解。通过滴加1M NaOH(aq)将pH调节至6.8。用蒸馏水调节体积至100mL。搅拌下将PEG1600(2.5g，40％，溶于水中)和3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(183μL的1％(v/v)乙醇溶液)滴加到7.5的该壳聚糖溶液中。将该溶液放置在40℃的加热箱中3天，得到透明的粘弹性凝胶。
实施例18
将壳聚糖(1.5g，N-脱乙酰度55％)悬浮于80mL的蒸馏水中，加入2M HCl(aq)，直至壳聚糖溶解。通过滴加1M NaOH(aq)将pH调节至6.5。用蒸馏水调节体积至100mL。将溶于23g水的尼泊金甲酯(0.2g)和尼泊金丙酯(0.03g)加入到67g的该壳聚糖溶液中，并在室温下搅拌18小时。向上述溶液中滴加3，4-乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(24.6μL的11％(v/v)的乙醇溶液)。如实施例17所述，将该溶液放置在加热箱中。

Claims (13)

1.可共价交联的壳聚糖组合物，包含脱乙酰度30-75％的壳聚糖，其中壳聚糖是随机脱乙酰化的，和选自方酸的酯类、二环氧化物或戊二醛的交联剂，其中基于交联剂中官能团的数量和壳聚糖中脱乙酰化的氨基的数量，交联剂和壳聚糖的摩尔比是0.2∶1或更小。
2.如权利要求1要求保护的可共价交联的壳聚糖组合物，其中所述壳聚糖的脱乙酰度为35-55％。
3.如权利要求1或2要求保护的可共价交联的壳聚糖组合物，其中在交联前，所述壳聚糖中重量平均分子量是10-500kDa。
4.一种制备壳聚糖水凝胶的方法，包括提供如前述任一权利要求要求保护的可共价交联的壳聚糖组合物的水溶液，将该组合物交联并分离所得到的壳聚糖水凝胶。
5.如权利要求4要求保护的方法，其中所述交联是在6-10的pH下进行的。
6.通过权利要求4或5的方法可以得到的壳聚糖水凝胶。
7.权利要求6要求保护的的壳聚糖水凝胶，其为碎凝胶形式。
8.如权利要求6要求保护的壳聚糖水凝胶，用于疫苗中，用于药物递送，用于组织填充，用于伤口愈合装置，用于矫形术，用作生物材料，用于治疗尿失禁或膀胱输尿管反流，用于粘性手术，用于为宿主生物体提供活细胞，用作美容品，用作填充剂，用作增稠剂，用作食品工业中的添加剂，用作胶，用作润滑剂或者用作钻孔维护液。
9.如权利要求8要求保护的壳聚糖水凝胶，其中所述生物材料是细胞培养支架或有活力细胞的包囊。
10.如权利要求7要求保护的壳聚糖水凝胶，用于疫苗中，用于药物递送，用于组织填充，用于伤口愈合装置，用于矫形术，用作生物材料，用于治疗尿失禁或膀胱输尿管反流，用于粘性手术，用于为宿主生物体提供活细胞，用作美容品，用作填充剂，用作增稠剂，用作食品工业中的添加剂，用作胶，用作润滑剂或者用作钻孔维护液。
11.如权利要求10要求保护的壳聚糖水凝胶，其中所述生物材料是细胞培养支架或有活力细胞的包囊。
12.一种药物组合物，包含如权利要求6或7要求保护的壳聚糖水凝胶和药学活性成分。
13.一种免疫剂，包含如权利要求6或7要求保护的壳聚糖水凝胶和抗原，其中所述抗原任选与壳聚糖共价结合。
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