IT201600070911A1

IT201600070911A1 - Composizione comprendente chitosano per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento di incontinenza e/o impotenza in un soggetto sottoposto a prostatectomia

Info

Publication number: IT201600070911A1
Application number: IT102016000070911A
Authority: IT
Inventors: Stefano Geuna; Francesco Porpiglia; Thomas Freier
Original assignee: Univ Degli Studi Di Torino; Thomas Freier
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2018-01-07
Also published as: CA2971272C; US10328096B2; EP3266467B1; CA2971272A1; EP3266467A1; US20180008625A1

Description

“Composizione comprendente chitosano per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di incontinenza e/o impotenza in un soggetto sottoposto a prostatectomia”

TESTO DELLA DESCRIZIONE

Campo dell’invenzione

La presente descrizione si riferisce ad una composizione comprendente chitosano per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di incontinenza e/o impotenza in un soggetto sottoposto a prostatectomia.

Sfondo dell’invenzione

Il cancro della prostata è il cancro più comune tra gli uomini europei e americani. Il trattamento del cancro della prostata comporta comunemente una terapia chirurgica che comprende la prostatectomia radicale. Tuttavia, nonostante il crescente utilizzo di tecniche con conservazione dei nervi, come chirurgia assistita da robot, l’incontinenza urinaria e la disfunzione erettile rimangono le principali conseguenze indesiderate della prostatectomia radicale.

La lesione del nervo cavernoso causata da diversi fattori, tra cui danneggiamento per trazione meccanica al fascio neurovascolare durante la mobilizzazione della prostata, come pure infiammazione post-operatoria del fascio neurovascolare, è la ragione principale della disfunzione erettile post-chirurgica.

Materiali diversi sono stati testati per ridurre il tasso di disfunzione erettile, per migliorare in ultima analisi la qualità della vita dei pazienti.

Per esempio, trapianti di nervo surale sono stati usati come interposizioni a sostituire fasci neurovascolari completamente asportati nei pazienti, il che ha portato, tuttavia, a risultati piuttosto imprevedibili e insoddisfacenti (Scardino e Kim, “Rationale for and results of nerve grafting during radical prostatectomy”, Urology 2001, 57, 1016).

In esperimenti su animali, un gap di nervo cavernoso di ratto di 2 mm è stato colmato con un condotto di poliestere biodegradabile contenente opzionalmente spugna di collagene (Hisasue et al., “Cavernous nerve reconstruction with a biodegradable conduit graft and collagen sponge in the rat”, J Urol 2005 173, 286), o con un foglio in gel di alginato reticolato (Matsuura et al., “Cavernous nerve regeneration by biodegradable alginate gel sponge sheet placement without sutures”, Urology 2006; 68, 1366).

Tuttavia, poiché il fascio neurovascolare umano è composto di una rete eterogenea di fibre nervose e vasi sanguigni, a differenza della struttura simile a cavi del ratto, i risultati non possono essere trasferiti dal modello murino alla situazione clinica.

La chirurgia moderna si concentra sulle tecniche con conservazione dei nervi, il che si traduce in un aumento del ripristino della funzione erettile preservando l’integrità dei fasci neurovascolari.

Sebbene il danneggiamento meccanico al fascio neurovascolare possa venire minimizzato dal chirurgo esperto, l’infiammazione post-chirurgica rimane un problema che deve essere affrontato.

Per esempio, una membrana in poliestere biodegradabile contenente fattore neurotrofico cerebrale e cellule staminali derivate da tessuto adiposo è stata testata in un modello di lesione per schiacciamento di nervo cavernoso di ratto, ed è stato osservato un miglioramento della funzione erettile rispetto al gruppo non contenente le cellule (Piao et al., “Therapeutic effect of adipose-derived stem cells and BDNF-immobilized PLGA membrane in a rat model of cavernous nerve injury”, J Sex Med 2012, 9, 1968).

L’applicazione di fattori di crescita e sostanze antinfiammatorie per preservare e rigenerare il fascio neurovascolare prostatico è stata ulteriormente favorita dall’uso di membrane amnios/corion umane disidratate come fonte di fattori neurotrofici e citochine.

In ambito clinico, ad un mese dall’intervento, circa il 30% dei pazienti ha riacquistato potenza e continenza urinaria nel gruppo trattato e nel gruppo di controllo, mentre a tre mesi, circa il 70% dei pazienti del gruppo trattato era potente e il 95% continente, con numeri leggermente inferiori osservati per il gruppo di controllo (Patel et al., “Dehydrated human amnion/chorion membrane allograft nerve wrap around the prostatic neurovascular bundle accelerates early return to continence and potency following robot-assisted radical prostatectomy: propensity score-matched analysis”, Eur Urol 2015, 67, 977).

Poiché il procedimento di produzione e l’autorizzazione degli enti di controllo e la commercializzazione di un dispositivo medico in combinazione con fattori di crescita e componenti cellulari sono procedimenti impegnativi e costosi, vi è ancora la necessità di soluzioni tecniche semplici, preferibilmente a base di componenti biocompatibili e biodegradabili, che possano supportare efficacemente il ritorno anticipato della continenza e della potenza in pazienti dopo la prostatectomia.

Sintesi dell’invenzione

Lo scopo della presente descrizione è quello di fornire una composizione biocompatibile e biodegradabile, che superi gli inconvenienti sopra riportati.

Lo scopo di cui sopra viene raggiunto grazie all’oggetto richiamato in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono, che si intendono come parte integrante della presente descrizione.

Secondo la presente descrizione, lo scopo di cui sopra viene raggiunto mediante una composizione comprendente chitosano per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di incontinenza e/o impotenza in un soggetto sottoposto a prostatectomia, preferibilmente prostatectomia radicale.

In una o più forme di realizzazione, la composizione comprendente chitosano è destinata a un’applicazione chirurgica, specificamente per essere applicata in contatto con il fascio neurovascolare prostatico del soggetto sottoposto a prostatectomia.

Inoltre, si descrive in questa sede un procedimento per proteggere un fascio neurovascolare prostatico di un soggetto, in cui la composizione comprendente chitosano, preferibilmente in forma di film, viene applicata a contatto con il fascio neurovascolare prostatico del soggetto sottoposto a prostatectomia.

Breve descrizione dei disegni

Una o più forme di realizzazione verranno ora descritte, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, in cui:

- Figura 1: Spettro 1H NMR di chitosano nativo come acquistato;

- Figura 2: Spettro 1H NMR ottenuto da chitosano deacetilato dopo una fase di idrolisi applicata al prodotto commerciale;

- Figura 3: Composizione di chitosano in forma di film solido contenente fori secondo una forma di realizzazione della presente descrizione;

- Figura 4: Valutazione quantitativa di cellule cancerose PC3 e cellule gliali RT4-D6P2T fatte crescere in un mezzo condizionato con prodotti di dissoluzione di un film di chitosano (CTR = controllo);

- Figura 5: Capacità rigenerative di colture dissociate ed espianti ex vivo derivati da gangli somatici e autonomi coltivati su un film di chitosano secondo una forma di realizzazione della presente descrizione;

- Figura 6: Recupero della potenza in pazienti sottoposti a prostatectomia radicale a seguito dell’applicazione di una composizione secondo una forma di realizzazione della presente descrizione.

Descrizione dettagliata

Nella descrizione che segue, numerosi dettagli specifici sono forniti per permettere una comprensione approfondita di forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono venire messe in pratica senza uno o più dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.

Il riferimento in tutta la presente descrizione a “una (aggettivo numerale) forma di realizzazione” o “una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione” indica che una particolare funzione, struttura o caratteristica descritta in relazione alla forma di realizzazione è inclusa in almeno una forma di realizzazione. Così, gli aspetti delle espressioni “in una (aggettivo numerale) forma di realizzazione” o “in una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione” in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutti alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono venire combinati in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione. I titoli qui forniti sono solo per convenienza e non interpretano l’ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.

In una forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda una composizione a base di chitosano per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento dell’impotenza in un soggetto sottoposto a prostatectomia, preferibilmente prostatectomia radicale.

Gli Inventori della presente domanda hanno sorprendentemente scoperto che una composizione a base di chitosano come descritta in questa sede è in grado di migliorare il risultato della prostatectomia radicale, in particolare, ottenendo una più veloce ricomparsa della potenza e un tasso ridotto di disfunzione erettile in un soggetto che ha subito una prostatectomia radicale.

Inoltre, la composizione descritta in questa sede può consentire una più veloce ricomparsa della continenza e un tasso ridotto di incontinenza.

Inoltre, grazie alla biocompatibilità e alle proprietà antimicrobiche ed emostatiche del chitosano, si può anche ottenere una riduzione di infiammazione, infezione e tempo di sanguinamento. La composizione descritta in questa sede ha l’ulteriore vantaggio di ridurre il rischio di infezioni grazie alle proprietà antibatteriche del chitosano.

In una o più forme di realizzazione, una elevata biocompatibilità e una elevata bioattività della composizione si possono ottenere utilizzando chitosano in forma di chitosano nativo.

Nel contesto della presente descrizione, l’espressione “chitosano nativo” si riferisce alla struttura chimica del chitosano, cioè un copolimero di poli(N-acetil-D-glucosammina-co-D-glucosammina) o un omopolimero di poli(D-glucosammina).

Qualsiasi chitosano reticolato o altrimenti modificato chimicamente è considerato un derivato di chitosano, avente proprietà diverse rispetto al chitosano nativo. La reticolazione del chitosano, per via ionica o covalente, può portare al blocco di funzionalità attive del biomateriale, cioè il gruppo amminico.

Nel contesto della presente descrizione l’espressione “chitosano nativo” comprende sia la base di chitosano che il chitosano in forma di sale di chitosano.

In una o più forme di realizzazione, la composizione comprende chitosano, preferibilmente base di chitosano, in una quantità di almeno il 50%, più preferibilmente almeno il 90%, più preferibilmente almeno il 95% in peso (peso/peso) della composizione, rispetto ai componenti non acquosi della composizione.

In una o più forme di realizzazione, la composizione può comprendere chitosano in forma di base e in forma di sale di chitosano. Preferibilmente, la composizione comprende almeno un sale di chitosano in una quantità del 50% o meno, più preferibilmente del 10% o meno, più preferibilmente del 5% o meno in peso (peso/peso) rispetto al peso totale di chitosano.

La presenza di chitosano in forma di sale può consentire una buona adesione della composizione al fascio neurovascolare evitando così un prematuro distacco dal sito dell’impianto. Il sale di chitosano è solubile in un solvente acquoso o in un mezzo fisiologico a pH neutro. Così, il tessuto umido può attaccare chimicamente la superficie del film di chitosano, fornendo un contatto durevole con il fascio neurovascolare prostatico.

In una o più forme di realizzazione, sali di chitosano possono venire ottenuti dalla dissoluzione del chitosano in una soluzione acquosa di uno o più acidi inorganici, come acido cloridrico, e/o acidi organici scelti dal gruppo costituito da acidi organici monobasici o multibasici aventi da 2 a 12 atomi di carbonio ed un primo valore pKa compreso tra 1 e 5, come per esempio acido acetico, acido citrico, acido lattico, acido malico, acido succinico, acido mandelico, acido ossalico, acido tartarico, acido ascorbico, ecc.

In una o più forme di realizzazione, il chitosano può essere presente nella composizione in forma di base di chitosano.

In una o più forme di realizzazione, la composizione è costituita da chitosano, preferibilmente chitosano nativo.

In una o più forme di realizzazione, la composizione comprende chitosano con un grado di acetilazione del 40% o meno, preferibilmente del 20% o meno, più preferibilmente del 10% o meno.

In una o più forme di realizzazione, la composizione comprendente chitosano descritta in questa sede è sostanzialmente priva di composti tossici.

In una o più forme di realizzazione, la composizione comprende glicerolo oltre al chitosano, preferibilmente in una quantità tra l’1 e il 10% in peso, rispetto ai componenti non acquosi della composizione.

La composizione descritta in questa sede è destinata a un’applicazione chirurgica, in particolare a un’applicazione sul fascio neurovascolare prostatico di un soggetto sottoposto a prostatectomia.

La composizione secondo la presente descrizione può essere in qualsiasi forma conveniente per l’applicazione al sito chirurgico, come soluzione, polvere, microsfere, scaglie, tubo, fibre, rete, rivestimento o film.

In una o più forme di realizzazione, la composizione descritta in questa sede è in forma di film, preferibilmente film solido o film gelatinoso.

In una o più forme di realizzazione, la composizione può essere in forma di film bioassorbibile liofilizzata o essiccata con solvente.

In una o più forme di realizzazione, la composizione può essere presente in forma di film flessibile, che può essere continuo o interrotto (per esempio perforato).

Il tempo di biodegradabilità della composizione, per esempio in forma di film, può venire regolato selezionando il grado di acetilazione (DA) del chitosano in esso contenuto. La possibilità di regolare il tempo di biodegradazione permette di evitare la prematura disintegrazione della composizione di chitosano sul sito di impianto.

In una o più forme di realizzazione, la composizione comprendente chitosano descritta in questa sede può inoltre comprendere altri componenti, come per esempio almeno un costituente farmaceuticamente attivo e/o bioattivo.

In una o più forme di realizzazione, costituenti bioattivi possono venire scelti dal gruppo costituito da proteine, peptidi, acidi nucleici, farmaci a basso peso molecolare, come antibiotici o farmaci antinfiammatori, agonisti o antagonisti del sistema immunitario innato, fattori di crescita stimolanti o differenzianti per stimolare o differenziare la crescita di almeno un sottotipo di cellula, e loro miscele.

In una o più forme di realizzazione, la composizione può comprendere inoltre cellule biologiche, come per esempio cellule staminali derivate da tessuto adiposo.

In una o più forme di realizzazione, la composizione può venire applicata sul fascio neurovascolare prostatico di un soggetto mediante spruzzatura o iniezione di una soluzione di chitosano che si può ottenere dalla dissoluzione di chitosano in una soluzione acquosa di uno o più acidi inorganici e/o acidi organici.

In una o più forme di realizzazione, la composizione, per esempio sotto forma di film, può venire applicata sul fascio neurovascolare prostatico di un soggetto.

In una o più forme di realizzazione, la composizione in forma di composizione solida, preferibilmente in forma di film, può avere una superficie liscia, preferibilmente con una rugosità media Radi 1 m (micrometro) o meno, preferibilmente di 0,5 m o meno, più preferibilmente di 0,1 m o meno, come determinato mediante microscopia a forza atomica.

Vantaggiosamente, una superficie liscia può ridurre l’irritazione meccanica sul sito di impianto, riducendo così il rischio di danneggiamento del fascio neurovascolare.

In una o più forme di realizzazione, la composizione di chitosano in forma di film può presentare uno spessore compreso tra 1 e 1000 m, preferibilmente tra 10 e 100 m, più preferibilmente tra 20 e 50 m.

In una o più forme di realizzazione, l’area superficiale della composizione in forma di film può essere compresa nel range tra 1 e 50 cm<2>, preferibilmente tra 5 e 25 cm<2>, più preferibilmente tra 10 e 15 cm<2>.

Tale area superficiale permette di rivestire il fascio neurovascolare prostatico completamente o parzialmente, e, preferibilmente, alcuni dei tessuti circostanti.

In una o più forme di realizzazione, la composizione descritta in questa sede, preferibilmente in forma di film, può avere una capacità di assorbimento d’acqua inferiore al 100%, preferibilmente compreso tra il 25% e l’80% in peso, più preferibilmente tra il 50% e il 75%.

In una o più forme di realizzazione, la composizione di chitosano in forma di film può contenere almeno un foro (apertura), che permette l’assorbimento e la diffusione di liquidi fisiologici e un veloce scambio di liquido attraverso il volume della struttura del film.

L’almeno un foro può avere dimensioni del diametro pari a 1000 m o meno, più preferibilmente 500 m o meno, più preferibilmente 250 m o meno. In una forma di realizzazione preferita, l’almeno un foro può avere dimensioni del diametro di 1 m o più, preferibilmente 10 m o più, più preferibilmente 100 m o più. In una o più forme di realizzazione, le dimensioni del diametro dei fori del film sono comprese tra 100 m e 250 m.

In una o più forme di realizzazione, i fori possono coprire un’area del 50% o meno della superficie del film, più preferibilmente del 10% o meno, più preferibilmente dell’1% o meno.

In una o più forme di realizzazione, una portata preferita di liquidi fisiologici attraverso la composizione di chitosano in forma di film contenente fori è di 0,001 ml/min/cm<2>o più, preferibilmente 0,01 ml/min/cm<2>o più, più preferibilmente 0,1 ml/min/cm<2>o più.

Grazie a questa proprietà, l’accumulo di liquido al disotto della composizione durante l’impianto può essere ridotto o impedito favorendo così la relativa adesione al fascio neurovascolare.

In una o più forme di realizzazione, la composizione è trasparente. Vantaggiosamente, questo può rendere più facile il controllo da parte del medico dell’applicazione al fascio neurovascolare.

In una o più forme di realizzazione, la composizione, una volta applicata al sito chirurgico, può venire suturata.

Vantaggiosamente, questa proprietà permette la fissazione della composizione a base di chitosano al sito chirurgico e ne impedisce il distacco dal fascio neurovascolare.

In una o più forme di realizzazione, la forza di trattenimento della sutura basata su un Prolene USP 6/0 e valutata con un tester meccanico è 0,05 N o più, preferibilmente 0,5 N o più quando misurata allo stato anidro, e 0,01 N o più, preferibilmente 0,1 N o più quando misurata allo stato umido.

Materiali e Procedimenti

Spettroscopia 1H NMR

Il chitosano usato come prodotto di partenza negli esempi seguenti è stato ottenuto in forma di scaglie fini dalla Chitinor (Norvegia).

Il grado di acetilazione (DA) è stato determinato mediante spettroscopia 1H NMR, come descritto in Lavertu et al., “A validated 1H NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan”, J Pharm Biomed Anal 2003, 32, 1149.

Il chitosano è stato analizzato in una miscela di DCl allo 0,25% in D2O ad una concentrazione di chitosano di circa 0,5% (peso/volume).

Gli spettri sono stati registrati usando uno spettrometro Bruker Avance III HD 300. Il DA, calcolato confrontando l’area integrata sotto i picchi associati con H2-H6 della subunità di D-glucosammina con quella del gruppo metile, è stato determinato come pari al 15,9% per il chitosano come acquisito, e pari al 5,5% per il chitosano deacetilato ottenuto come descritto nel seguito.

La Figura 1 mostra uno spettro 1H NMR ottenuto da suddetto chitosano disponibile in commercio.

La Figura 2 mostra un corrispondente spettro 1H NMR ottenuto da chitosano deacetilato dopo una ulteriore fase di idrolisi applicata al prodotto commerciale come descritta nel seguito.

Deacetilazione di chitosano

50 g (grammi) di scaglie di chitosano come ottenute dal fornitore Chitinor sono stati collocati in un contenitore di vetro e sono stati aggiunti 500 g di una soluzione acquosa di idrossido di sodio al 45% (peso/volume).

Il contenitore di vetro è stato accuratamente agitato per miscelare i componenti, e posto in un forno per 2 ore a 80°C. È stato quindi tolto dal forno e sono stati aggiunti 500 ml (millilitri) di acqua distillata.

La miscela è stata filtrata attraverso un vaglio da 250 m. Quindi, il chitosano è stato lavato con acqua distillata fino a che il pH del filtrato non ha raggiunto un valore di circa 6,5, ed è stato essiccato, ottenendo un chitosano avente un DA del 5,5% come determinato mediante spettroscopia 1H NMR (Figura 2).

Preparazione di una composizione di chitosano in forma di film solido

7,5 g di chitosano avente un grado di acetilazione del 5% sono stati disciolti in 500 ml di acido acetico acquoso allo 0,5% (peso/volume) mediante delicata agitazione per 24 h.

144 ml della soluzione di chitosano sono stati versati in uno stampo di forma quadrata, dimensioni 24 24 cm<2>(centimetri quadrati), e lasciati in un ambiente depolverizzato per l’essiccamento a temperatura ambiente.

Il film essiccato è stato posto per 2 ore in un bagno contenente una soluzione di ammoniaca all’1,5% (peso/volume) in metanolo/acqua 90/10 (volume/volume). Il film è stato quindi rimosso dal bagno ed essiccato a temperatura ambiente. Il film risultante ha un contenuto di circa il 100% (peso/peso) di chitosano, rispetto ai componenti non acquosi del film. Il contenuto di acqua rimanente del film è inferiore al 10% (peso/peso).

Un modello definito di fori di circa 160 m di diametro è stato ottenuto facendo ruotare delicatamente un perforatore sul film. Tale modello di fori ricopre un’area di circa l’1% della superficie del film.

La Figura 3 mostra il film perforato risultante. Il film è stato quindi tagliato in campioni di 3 4 cm, collocato in sacchetti di sterilizzazione e sterilizzato con ossido di etilene.

Assorbimento di acqua della composizione comprendente chitosano in forma di film solido

La composizione comprendente chitosano in forma di film, prodotto come sopra descritto, è stata pesata, e quindi posta in acqua distillata per 15 min.

Il peso del film umido ottenuto è stato confrontato con il peso del film secco, ed è stato determinato che l’assorbimento di acqua era pari al 55% in peso.

Portata attraverso la composizione comprendente chitosano in forma di film solido

La composizione comprendente chitosano in forma di film, prodotto come precedentemente descritto, è stata fissata all’apertura inferiore di un tubo avente un diametro di 14 mm e il tubo è stato riempito con 5 ml di tampone fosfato isotonico a pH 7. È stato determinato che la portata per il completo svuotamento del tubo era tra circa 0,6 e 1,6 ml/min/cm<2>.

Forza di trattenimento della sutura della composizione in forma di film solido

La composizione comprendente chitosano in forma di film solido, prodotto come precedentemente descritto, è stata fissata al morsetto inferiore di un tester meccanico (Thümler Z3). Una sutura Prolene USP 6/0 è stata fatta passare attraverso il film e fissata al morsetto superiore del tester meccanico. Una velocità costante di 200 mm/min è stata applicata, e la resistenza alla rottura del film è stata determinata come 1,06 N per campioni di film secco e 0,17 N per campioni di film umido (tampone fosfato isotonico a pH 7).

Valutazione della proliferazione di cellule cancerose La determinazione del grado di proliferazione di una linea cellulare PC3 (derivata da un adenocarcinoma umano) e di una linea di cellule gliali RT4-D6P2T usata come controllo, è stata effettuata con mezzi raccolti dopo 15 giorni dalla dissoluzione del film di chitosano.

La linea cellulare PC3 è stata acquistata dalla ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 20110-2209), e la linea cellulare RT4-D6P2T è stata acquistata dalla ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 20110-2209). RT4-D6P2T sono cellule gliali periferiche di ratto, derivati da schwannoma.

Formulazioni di mezzo condizionato sono state ottenute incubando il mezzo preparato (Mezzo di Eagle Modificato da Dulbecco, DMEM, per la linea cellulare RT4-D6P2T e mezzo DMEM-F12 per la linea cellulare PC3) per 2 settimane a 37°C e 5% di CO2in presenza di film di chitosano (4 film di chitosano per 40 ml di mezzo di coltura). Dopodiché, questo mezzo è stato utilizzato per esperimenti di proliferazione.

Come mezzi di controllo, campioni di DMEM e DMEM-F12, senza film di chitosano, sono stati mantenuti nelle stesse condizioni (2 settimane a 37°C e 5% di CO2), e poi utilizzati per esperimenti di proliferazione.

Formulazioni di Mezzi di Coltura:

DMEM (SIGMA ALDRICH) integrato con 100 unità·ml<-1>di penicillina, 0,1 mg·ml<-1>di streptomicina, piruvato di sodio 1 mM, L-glutammina 2 mM, 2% di siero fetale bovino inattivato mediante calore (FBS, Invitrogen).

DMEM-F12 (SIGMA ALDRICH) integrato con 100 unità·ml<-1>di penicillina, 0,1 mg·ml<-1>di streptomicina, piruvato di sodio 1 mM, L-glutammina 2 mM, 2% di siero fetale bovino inattivato mediante calore (FBS, Invitrogen).

50000 cellule (25000 cellule/ml) sono state piastrate e coltivate in presenza di mezzi condizionati e la loro proliferazione è stata valutata dopo 1, 3 e 6 giorni.

Il numero di cellule è stato valutato utilizzando una camera contaglobuli. Ogni esperimento è stato ripetuto in triplicato (triplicato tecnico), per ridurre al minimo l’errore tecnico, e questo è stato ripetuto in tre esperimenti indipendenti (triplicato biologico), per ottenere la validità statistica. I dati sono mostrati come media ± DS.

Saggio di rigenerazione

Gangli della radice dorsale (DRG) e gangli del nervo vago raccolti da ratti adulti di sesso femminile sono stati mantenuti in mezzo di Leibovitz (Invitrogen, Monza, Italia) per 1 h in condizioni sterili. Le capsule del tessuto connettivo sono state poi meccanicamente ridotte e gli espianti sono stati tagliati a metà.

Successivamente i neuroni sensitivi dissociati da espianti DRG (Fig. 5 AB), e gli espianti totali dai gangli del nervo vago (Fig. 5 CD) sono stati fatti aderire su vetrini coprioggetto rivestiti di matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) e su film di chitosano, e incubati a 37°C per 1 h prima di aggiungere mezzo privo di siero (SFM).

In breve, il mezzo SFM è composto da 50% (volume/volume) di miscela nutriente F12, 50% (volume/volume) di mezzo basale di Eagle (BME), glutammina 2 10<-3>M, 0,5% (volume/volume) 100 miscela antibiotica PSN (tutto Invitrogen, Monza, Italia), 10 mg/ml di sieroalbumina di bovino, putrescina 1 10<-4>M, 0,1 mg/ml di transferrina, 3 10<-8>mg/ml di selenio, 0,005 mg/ml di insulina, vitamina C 3,8 10<-5>M, 7,5 mg/ml di glucosio (tutto Sigma, Milano, Italia) in acqua di grado per coltura. Per valutare la bioattività (potenziale induttivo di sviluppo di neuriti) dei substrati CS, gli espianti sono stati poi mantenuti per tre giorni in SFM a 37°C con il 5% di CO2e sono stati introdotti 150 ng/ml di fattore di crescita nervosa (NGF).

Espianti e colture dissociate sono stati fissati per 15 minuti in paraformaldeide al 4% (PFA, Sigma-Aldrich, Seelze, Germania).

Per analizzare lo sviluppo di neuriti, i campioni sono stati incubati per una notte a 4°C con gli anticorpi primari: anticorpo anti-tubulina III (anticorpo monoclonale di topo 1:1000; n. di catalogo: T8660, Sigma-Aldrich) e anticorpo anti-S100 specifico per cellule di Schwann (1:1000; n. di catalogo: HPA015768, Sigma) facendo seguire l’incubazione di 1 h a temperatura ambiente con anticorpi secondari: rispettivamente IgG anti-topo coniugato con Alexa-Fluor-488 (n. di catalogo: A11029, Life Technologies) e Cy3 anti-coniglio di capra (n. di catalogo: 111-165-003, Li Starfish).

Procedure chirurgiche, applicazione della composizione in forma di film solido e valutazione clinica

Un risultato primario dello studio è stato quello di valutare la fattibilità dell’applicazione intraoperatoria di un film di chitosano prodotto come precedentemente descritto su fasci neurovascolari al termine di una prostatectomia radicale assistita da robot (RARP) con conservazione dei nervi.

I risultati secondari sono stati i seguenti: valutare il precoce recupero della potenza sessuale (a 1, 3 e 6 mesi) e il recupero a lungo termine (12 mesi) dopo RARP con conservazione dei nervi con film di chitosano (il recupero della potenza sessuale è stata definita come il recupero di erezioni spontanee o rapporti sessuali);

eseguire un’analisi per coppie appaiate con pazienti sottoposti a RARP con conservazione dei nervi senza l’utilizzo di un film protettivo di chitosano applicata su fasci neurovascolari.

Popolazione dello studio

Pazienti con una indicazione di RARP con conservazione dei nervi per cancro della prostata sono stati arruolati per lo studio presso il Reparto di Urologia dell’Ospedale San Luigi Gonzaga (Torino, Italia).

Criteri di inclusione

I criteri di inclusione per l’ammissione dei pazienti allo studio erano i seguenti:

età> 18 anni

consenso informato per la partecipazione allo studio diagnosi istologica di cancro della prostata indicazione di RARP con conservazione dei nervi Questionario IIEF5 preoperatorio > 17

Criteri di esclusione

I criteri di esclusione erano i seguenti: controindicazioni a RARP

comorbosità significative (per esempio, fumo, diabete mellito, ipertensione arteriosa)

età> 72 anni

Progetto dello Studio

I pazienti aventi i requisiti secondo i criteri di inclusione di cui sopra sono stati sottoposti alla seguente procedura:

Valutazione dei criteri di inclusione ed esclusione; RARP con conservazione dei nervi e applicazione intraoperatoria di film di chitosano prodotto come precedentemente descritto sui fasci neurovascolari;

Follow-up uro-oncologico in base ai risultati patologici (visite a 1, 3, 6, 12 mesi dopo l’intervento chirurgico);

Follow-up andrologico (visite a 1, 3, 6, 12 mesi dopo l’intervento chirurgico).

Dimensioni del campione di pazienti (solo per l’analisi per coppie appaiate)

Sono stati ammessi allo studio almeno 83 pazienti (72 10-15% per compensare i ritirati).

Statistiche

Le dimensioni del campione, come riportato in precedenza, si basano sull’analisi per coppie appaiate di pazienti sottoposti a RARP con conservazione dei nervi seguita dall’applicazione della composizione di chitosano sul fascio neurovascolare vs. pazienti sottoposti a RARP con conservazione dei nervi senza applicazione della composizione di chitosano sul fascio neurovasculare.

Le dimensioni del campione sono state calcolate sulla base delle differenze tra i due gruppi ottenute dall’analisi della letteratura (Rabbani et al., Factors predicting recovery of erections after radical prostatectomy, J Urol 2000, 164, 1929; Ficarra et al., Systematic review and meta-analysis of studies reporting potency rates after robot-assisted radical prostatectomy, Eur Urol. 2012, 62, 418), che mostrano che il tasso di mantenimento della potenza sessuale dopo RARP con conservazione dei nervi ammonta al 50%, mentre il tasso previsto dopo l’uso di film di chitosano è più del 70%.

Per respingere l’ipotesi nulla di un tasso di mantenimento della potenza sessuale uguale per entrambi i gruppi, 83 pazienti sono stati arruolati nel gruppo di pazienti sottoposti a RARP con conservazione dei nervi seguita dall’applicazione della composizione di chitosano per ottenere una potenza statistica superiore al 70% con un errore accettato di 0,05.

I pazienti nel gruppo di controllo che hanno subito RARP con conservazione dei nervi senza applicazione della composizione di chitosano sono stati retrospettivamente selezionati dalla banca dati istituzionale del Reparto di Urologia.

Tutti i pazienti erano continenti e potenti prima di RARP, come valutato mediante questionari validati:

Questionari IIEF-5, SEAR e EPIC per la potenza come descritti per esempio in Rosen et al., The international index of erectile function (IIEF): a multidimensional scale for assessment of erectile dysfunction, Urology 1997, 49, 822; Zymanski et al., Development and validation of an abbreviated version of the Expanded Prostate Cancer Index Composite Instrument for measuring health-related quality of life among prostate cancer survivors, Urology 2010, 76, 1245.

IPSS e IPSS-QoL per la continenza come descritti in Sarasin et al., Can a urinary tract symptom score predict the development of postoperative urinary retention in patients undergoing lower limb arthroplasty under spinal anaesthesia? A prospective study. Ann R Coll Surg Engl 2007, 89, 192.

La conservazione del fascio nervoso durante RARP è di vitale importanza per potenza e continenza postoperatorie migliorate.

La prostatectomia radicale è stata effettuata utilizzando la tecnica di dissezione intrafasciale (conservazione dei nervi, “nerve-sparing”, NS) uni- o bilaterale.

La dissezione totale con conservazione dei nervi consiste in una dissezione che segue uno schema sulla capsula della prostata, che è mediale o interna alla fascia prostatica sulla superficie anterolaterale e posterolaterale della prostata e anteriore alla fascia prostatica posteriore. La dissezione totale con conservazione dei nervi permette una conservazione completa della fascia prostatica laterale e quindi il mantenimento dei fasci neurovascolari.

La dissezione parziale con conservazione dei nervi (50% NS) consiste in una dissezione che conserva quasi la metà della fascia prostatica laterale. A livello intraoperatorio, il piano destro della dissezione è identificato dalla presenza di una striscia di grasso sopra la prostata.

Un film di chitosano prodotto come sopra descritto avente uno spessore di 30 m, fori con dimensioni di 160 m, e dimensioni di 3 4 cm è stato applicato al termine della fase di ricostruzione della prostatectomia radicale.

Il film è stato immerso in una soluzione fisiologica per consentire il suo inserimento attraverso una porta laparoscopica giustapposta alla parete muscolare dove si trovano i fasci neurovascolari.

Risultati

Tasso di proliferazione delle cellule cancerose

La Figura 4 mostra cellule cancerose PC3 coltivate in un mezzo condizionato con i prodotti di dissoluzione di film di chitosano; il tasso di proliferazione è inferiore, a partire dal terzo giorno di coltura, rispetto al tasso di proliferazione delle stesse cellule coltivate in un mezzo di controllo. La differenza è statisticamente significativa (p <0,05).

Questi risultati dimostrano quindi una attività antiproliferativa dei prodotti di dissoluzione di film di chitosano sulla linea di cellule tumorali PC3.

I prodotti di dissoluzione del film di chitosano non provocano gli stessi effetti sulla popolazione di cellule gliali, RT4-D6P2T; dopo sei giorni di coltura è possibile osservare un significativo aumento del loro tasso di proliferazione, indotto dal mezzo condizionato.

L’aspetto assolutamente innovativo del chitosano è rappresentato dal duplice effetto sulle popolazioni cellulari testate, in cui, da un lato inibisce la proliferazione delle cellule tumorali e, dall’altro, favorisce la crescita delle cellule gliali nervose periferiche, con un forte potenziale rigenerativo.

Rigenerazione dei nervi

La valutazione dell’interazione dei neuroni con la composizione di chitosano descritta in questa sede rappresenta una fase preliminare chiave per stabilire, in vitro, il potenziale per la rigenerazione neurale.

Colture neuronali dissociate di gangli della radice dorsale (DRG) di ratto (Fig. 5 riquadri A, B) ed espianti di gangli di nervo vago (Fig. 5 riquadri C, D) sono modelli utili per valutare l’adattamento neuritico a differenti substrati.

Espianti autonomi e neuroni dissociati di DRG di ratti adulti sono stati coltivati su film di chitosano (Fig. 5, riquadri B, C, D) e su vetro (Fig. 5, riquadro A), come controllo positivo. Dopo tre giorni, un elevato sviluppo di neuriti è stato riscontrato su entrambi i substrati. Un’attenta osservazione ha portato a rilevare una grande crescita ed estensione di neuriti sui film di chitosano, che rappresenta un substrato permissivo per la rigenerazione dei neuriti, come dimostrato dalla colorazione positiva della -tubulina (bianco) e dalla sopravvivenza gliale, colorazione positiva di S100 (grigio).

Valutazione clinica

L’applicazione della composizione comprendente chitosano in forma di film sul fascio neurovascolare di pazienti sottoposti a RARP ha comportato un aumento del recupero della potenza. Al follow-up dopo un mese, la potenza è stata recuperata nel 28,6% dei pazienti con la tecnica con conservazione dei nervi totale bilaterale del gruppo di controllo e nel 41% dei pazienti che sono stati sottoposti alla tecnica con conservazione dei nervi totale bilaterale seguita dall’applicazione della composizione di chitosano in forma di film (Figura 6).

La differenza in termini di recupero viene mantenuta anche tre mesi dopo l’intervento chirurgico; 76,9% dei pazienti che sono stati sottoposti a RARP e all’applicazione del film di chitosano hanno recuperato la potenza sessuale rispetto al 50% dei pazienti del gruppo di controllo (Figura 6).

Risultati simili sono stati ottenuti confrontando i due gruppi che sono stati sottoposti a prostatectomia con conservazione dei nervi parziale bilaterale, con e senza applicazione del film di chitosano.

Inoltre, è stato possibile osservare una riduzione di infiammazione, infezione e tempo di sanguinamento, nella regione di applicazione, per effetto della biocompatibilità e delle proprietà antimicrobiche ed emostatiche del film di chitosano.

Pertanto, la composizione di chitosano descritta in questa sede è in grado di migliorare il recupero della potenza sessuale senza alcun effetto indesiderato e senza prolungare il tempo operatorio.

Naturalmente, fermo restando il principio di base, le forme di realizzazione ed i dettagli di costruzione possono variare, anche in modo significativo, rispetto a quanto è stato illustrato in questa sede a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall’ambito della protezione. L’ambito di protezione di cui sopra è definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione comprendente chitosano per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di incontinenza e/o impotenza in un soggetto sottoposto a prostatectomia.
2. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui la composizione comprende chitosano in una quantità di almeno il 50% in peso rispetto ai componenti non acquosi della composizione.
3. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il chitosano ha un grado di acetilazione del 40% o meno.
4. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la composizione comprende almeno un costituente bioattivo, preferibilmente scelto nel gruppo costituito da proteine, peptidi, acidi nucleici, farmaci e loro miscele.
5. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la composizione è in forma di film, preferibilmente film solido o film gelatinoso.
6. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 5, in cui il film ha uno spessore di 1000 m o meno, preferibilmente tra 10 e 100 m, più preferibilmente tra 20 e 50 m.
7. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui il film contiene almeno un foro.
8. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 7, in cui l’almeno un foro ha dimensioni medie del diametro pari a 1000 m o meno, preferibilmente tra 10 m e 500 m, più preferibilmente tra 100 m e 250 m.
9. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la composizione ha una capacità di assorbimento d’acqua inferiore al 100% in peso.
10. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la composizione è trasparente.