KR101545506B1 - 키토산 조성물 - Google Patents

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매츠 앤더슨
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Abstract

본 발명은, 30 내지 75%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산 및 가교결합제를 포함하는 가교결합성 키토산 조성물로서, 상기 키토산은 랜덤하게 탈아세틸화되고 상기 가교결합제 대 키토산의 몰 비는, 가교결합제 중의 작용기의 수 및 키토산 중의 접근가능한 아미노기의 수를 기준으로 하여, 0.2 : 1 이하인 가교결합성 키토산 조성물을 제공하고자 하는 것이다. 본 발명은 또한 그로부터 형성된 키토산 하이드로겔 및 그의 용도를 제공한다.

Description

키토산 조성물{CHITOSAN COMPOSITION}
본 발명은 키토산 조성물, 특히 저 탈아세틸화도를 가지며 6 내지 9의 pH 범위에서 공유적으로 가교결합되는 키토산으로부터 제조된 키토산 겔에 관한 것이다.
본 발명은 생체적합성 다당류 겔 조성물, 특히 약물분배, 조직 증감술(tissue augmentation), 세포배양, 생존세포의 엔캡슐화(encapsulation of viable cells), 미용 목적, 정형외과적 용도, 생체적합물질, 상처치유기구, 식품산업의 농후화제 및 첨가제로서의 용도, 아교, 윤활제, 구멍뚫기- 및 수리용 유체(drilling and servicing fluids)로서의 용도를 위한, 백신 중의 키토산 조성물에 관한 것이다. 상기 겔은 저 탈아세틸화도를 갖는 공유적으로 가교결합된 키토산 겔에 의해서 제조된다. 특정한 탈아세틸화도의 키토산을 선택하고 유효한 가교결합 조건을 사용함으로써 흥미있고 예기치 않은 생물학적 및 물리적 특성을 갖는 겔을 얻을 수 있다. 이것은 다른 가교결합된 키토산 하이드로겔과는 달리 전형적인 가교결합 프로토콜을 사용하여 표준 키토산으로부터 제조된다. 본 발명에 따른 겔은 매우 낮은 독성을 갖도록 제조될 수 있으며 신속하게 분해될 수 있다. 상기 겔의 또 다른 두드러진 특징은 중성 및 알칼리성 조건에 적용시키는 경우에도 침전하지 않는다는 것이다. 그것들은 또한 광범위한 적용에 유용한 예를 들어 주사가능한 이른바 "분쇄된 겔"로의 추가적인 기계 가공을 허용하는 강도(剛度; rigidity)를 갖는다.
하이드로겔은 물이 분산 매질인 콜로이드성 겔로서 정의될 수 있다. 하이드로겔은 많은 분야에서 광범위하게 사용되며 몇몇 분야에서는 수 십억 달러 규모의 산업이 되었다. 전형적으로, 하이드로겔은 수용성 중합체로부터 제조되며, 상기 중합체는 중성의 공급원으로부터 단리되거나 합성 또는 중성 중합체의 화학적 변형에 의해서 얻어질 수 있다. 이들 중합체는 그들의 물리적 생물학적 특성에 따라 선택되며 원하는 제품 특성에 따라 단독으로 또는 조합으로 사용된다. 일부 중합체는 의학적 특성을 갖고 그것이 의학적 용도에 적합하게 하며, 다른 것들은 식품산업, 기계적 가공 및 제조업에서 윤활제, 구멍뚫기- 및 수리용 유체로서, 미용, 생체적합물질 적용, 생물공학에서 세포골격(cell scaffold) 등으로서 사용된다. 다른 적용은 상이한 품질의 중합체를 요구하며 다수의 기술적 적용은 염가로 구입할 수 있는 조질의 벌크(bulk) 품질을 기본으로 하는데 반해, 흔히 고가인 고도로 정제된 품질이 의학적 적용에 요구된다. 종종 점도와 같은 중합체 용액의 물리적 특성들은 이익의 주된 요인인데 반하여, 다른 적용에 있어서는 생물학적 및 독물학적 특성들이 목적하는 적용에서의 그의 기능을 위해 보다 중요시된다.
일부 중합체는 겔이 단독으로 또는 고체 비드(bead)와 함께 사용되는 조직 증감술 조성물에서의 목적에 부응하기 위해서 사용된다. 상처치유, 약물분배, 백신 매개체와 같은 다른 용도에 있어서 상이한 특성들을 갖는 다른 중합체들은 의학적 요구를 충족할 것을 요구한다. 일반적으로, 점성, 항균활성, 점착력 또는 수 흡수력/유지력과 같은 특성들이 고려되어야 할 제반 특성들이다. 수 유지력은 및 팽윤은 전형적으로는 농후화제 또는 용해도 증강제 및 다른 제제의 안정화제 중의 어느 하나로서 사용되는 식품 적용에서 매우 중시된다. 의학적 적용에서는 합성 및 천연 중합체인 다양한 중합체들이 존재한다. 많은 적용에 있어서는 원치 않는 부작용 없이 중합체들이 분해되어 제거되는 것이 중요하다. 항상 생체분해성이 요구되는 것은 아니지만, 염증, 면역반응 또는 물질의 거부와 같은 부반응을 피하기 위해서 양호한 생체적합성이 중요하다. 천연의 무독성 다당류는 유익한 생물학적 및 의학적 특성들과 함께 탁월한 물리적 특성을 가지며 통상 염가로 고순도의 것을 입수할 수 있으므로 상기 무독성 다당류를 의학적 제품에 사용하는 것은 놀라운 일이 아니다. 통상적으로 사용되는 다당류는 예를 들어 셀룰로즈, 알긴산염, 키토산, 히알루론산, 전분 또는 그들의 유도체이다.
의학분야에서는 겔 및 연고가 예를 들어 약물의 분배, 용도로 또는 감염을 방지하는 항균 장벽을 제공할 목적으로 사용된다. 하이드로겔은 종종 상응 용해도 및 생물학적 특성들을 가지며, 결론적으로 거대한 세트의 제품에서 발견된다. 히알루론산, 셀룰로즈의 유도체 등과 같은 겔 형성 다당류는 유익한 산업영역이 되었다. 히알루론산은 생리학적 pH에서 저농도 수용액 중에 사용될 때 자발적으로 하이드로겔을 형성하므로 그와 같은 것으로서 형성될 수 있는 중합체의 예이다. 셀룰로즈와 같은 다른 중합체는 그와 같은 것으로 사용될 수 없으며, 원하는 특성들을 얻기 위해서는 화학적으로 변형시켜야 한다. 다당류로부터 하이드로겔을 제조하는 경우 전형적인 프로토콜은 낮은 농도, 흔히 0.5 내지 3%(w/w)의 수용액 중에서의 중합체의 용해와 관련된다. 보다 높은 점도가 요구되는 경우 이것은 용해도가 허용한다면 용액에 보다 많은 중합체를 첨가하거나 또는 중합체를 가교결합시키는 것 중의 어느 하나에 의해서 달성될 수 있다. 가교결합은 보다 높은 분자량 및 결과적으로 보다 높은 점도의 중합체를 제공한다. 가교결합은 공유, 이온 및 소수성 방법을 사용한 다양한 방식으로 수행될 수 있으며, 수많은 접근법이 이용될 수 있다. 일반적으로, 상기 가교결합반응의 제품이 의학적 용도로 의도되는 경우 링커(linker) 쪽으로 면역반응을 도입할 위험이 있으며 그것이 또한 생체분해성을 손상시킬 수 있으므로 가능한 한 낮은 가교결합수준을 유지하는 것이 바람직하다.
면역 및 알레르기. 면역 시스템은 선천성 면역 및 후천성 면역으로 분류될 수 있다. 선천성 또는 비특이적 면역은 감염 또는 백신접종에 의해서 면역되지 않는 종에 의해 밝혀진 고유 저항이다. 후천성 또는 획득된 면역은 자극받은 항원에 대해 변경된 반응이 있으며 항원 특이적 면역학적 기억을 생성하는 유형의 면역이다. 면역은 획득된 감염 또는 백신접종의 결과인 능동면역일 수 있거나 또는 항체의 전달로부터 획득된 수동면역일 수 있다. 항체를 갖는 수동 백신접종은 몇몇 결점을 가진다: 이물질(foreign substance)의 주입은 주입된 항체에 대한 면역반응을 야기할 수 있다. 단일 클론의 항체는 다량으로 주입되어야 하며, 이것은 치료단가를 크게 상승시킨다. 치료는 그의 기능을 유지하도록 지속되어야 한다. 가장 흔하게는 항체 형성 및 면역학적 기억을 유도하는 능동 백신접종이 바람직하다. 대부분의 천연 면역원은 5 kDa를 상회하는 분자량을 가지는 단백질이다. 면역성 분자일지라도 원하는 수준의 면역을 발생시킬 수 없다. 면역반응의 강도를 증가시키기 위해서 면역원은 보강제와 결합된다. 보강제은 보강제에 대한 원치 않는 항체를 발생시키지 않으면서 면역반응을 증강시키는 제제이다. 면역원이 여전히 허용가능한 면역반응을 발생시킬 수 없는 경우에는 보다 더 면역성인 캐리어에 콘쥬게이트될 수 있다. 0.1 내지 2 kDa 범위의 분자량을 갖는 작은 분자는 너무 작아서 면역 시스템에 의해서 인식될 수 없어서 면역접종(immunisation)에서 그와 같은 것으로서 사용하는 것을 곤란하게 한다. 이것을 우회하는 한 가지 방법은 그것들을 보다 큰 캐리어 분자에 공유적으로 결합시키는 것이다. 백신접종은 경구, 경비, 피하, 점막하, 설하, 또는 근육내일 수 있다.
T 및 NK 세포에 의한 이물세포의 인식 및 파괴는 세포-매개 면역(TH1 면역반응)으로 명명된다. 체액성 면역은 B-세포(TH2 면역반응)와 관련된다. 수산화알루미늄은 TH2 세포를 선택적으로 활성화하는 것으로 보고되었는데 반해, 프로인트 완전 면역 보강제(Freund's complete adjuvant) TH1 세포를 활성화한다. 키토산은 체액성 및 세포-매개된 면역반응을 둘 다 증강시키는 것으로 밝혀졌다(참조: Vaccine 3,379-384, 1985).
선천성 면역 시스템은 우선 노출의 필요없이 넓은 스펙트럼의 병원균를 인식한다. 선천성 면역을 담당하는 주세포, 단핵세포/대식세포 및 호중구세포는 미생물 병원균를 포식하고(phagocytose) 선천성, 염증성 및 후천성 면역반응을 일으킨다. 톨-유사 수용체(Toll-like receptor)(TLR)는 광범위한 미생물의 인식과 관련된 타입 I 경막 단백질(type I transmembrane protein)의 족이다. 그들은 후천성 면역 시스템에서 중심 역할을 하며, TLR은 패턴 인식 수용체(PRR)의 유형이며, 집합적으로 병원균 특이적 분자양상(pathogen-associated molecular patterens)(PAMP)으로 지칭되는, 병원균에 의해서 폭넓게 공유되지만 숙주분자와는 구별될 수 있는 분자들을 인식한다. 대식세포 수용체는 양상-인식 수용체인 것으로도 고려된다. 대식세포 만노스(mannose) 수용체는 만노스, 프럭토스, N-아세틸글루코사민 및 글루코스의 인식을 가능하게 하는 위치인 탄소 C3 및 C4에 적도상으로 배치된 하이드록실 기를 갖는 육탄당을 인식한다(참조: Curr. Opin. Immunol. 10, 50-55, 1998).
알레르기는 산업국가에서 인구의 대략 1/4 내지 1/3을 앓고 있는 매우 흔한 질환이며, 예를 들어 5,000만명 이상의 미국인들이 알레르기 질환을 앓고 있다. 오늘날 가장 흔히 사용되는 치료전략은 항히스타민의 경구섭취 또는 국소용 코로티코스테로이드에 의해서 알레르기의 작동자 메카니즘을 타겟팅하는 것이다. 항히스타민 및 코르티코스테로이드 치료는 알레르기 징후를 경감시키는데 효과적일 수 있지만, 그것들의 사용은 전신을 약학 제품에 노출시키는 것을 유발하며, 그것들은 불쾌하거나 또는 심지어 유해한 부작용을 초래할 수 있다. 알레르겐-특이 면역요법은 일반적으로 행해지고 있는, 알레르기의 근본적 원인을 타겟팅하여 장기-지속 징후 경감을 제공하는 유일한 치료법이다. 따라서 그것은 알레르기성 질병의 유일한 근치적(根治的) 치료법으로서 고려될 수 있다. 이러한 치료법은 피하 주사 또는 설하적으로 제공될 수 있다. 알레르겐 추출물을 피하 주사함으로써 수행되는 경우 익히 입증된 효과를 갖는데 반해, 설하 알레르겐-특이 면역요법은 덜 입증되어 있다.
천식, 비염과 같은 알레르기 질병은 다른 무해 환경 항원, 즉 알레르겐에 대한 부적절한 면역반응에 의해서 유발된다. 가장 통상적인 형태는 알레르겐-특이 IgE에 의해서 특징지워 지는 면역글로불린(Ig) E-매개된 알레르기이다. 종래, IgE-매개된 알레르기를 치료하는 2가지의 전략, 즉 약리학적 요법 및 알레르겐-특이 면역요법이 존재한다. 약리학적 치료는 특히 알레르기성 천식 및 습진의 경우에 국소용 코르티코스테로이드를 사용한 치료를 포함한다. 그러나 알레르기성 천식 환자의 10 내지 20%는 스테로이드 치료에 반응하지 않는다. 다른 통상적인 항알레르기 약물은 IgE-매개된 알레르기의 작동자 메카니즘을 타겟팅하며, 예를 들어 항히스타민, 항류코트리엔 및 크로몬이다. IgE-매개된 알레르기의 치료요법, 즉 징후의 장기-지속 경감을 제공하는 유일한 근치적 치료법은 알레르겐 특이 면역요법(ASIT)이다. 약물치료와는 반대로 ASIT는 또한 기도 염증을 경감시키고 만성 천식으로의 발전을 방지하는 것으로 밝혀졌다[참조: J Allergy Clin Immunol. 1998 102(4 Pt 1), 558-62]. 치료는 알레르겐-특이 무반응을 유도하기 위해서 알레르겐의 반복 투여에 기초한다. 현재, 중성 공급원으로부터 제조되고 수산화알루미늄(알룸)에 흡수된 알레르겐 추출물이 ASIT에 통용된다. 알룸은 알레르겐의 방출을 지연시키고 보강제로서 작용한다. 그러나, 알레르겐 추출물 및 알룸의 사용과 관련된 몇몇 결점이 존재한다. 저 알레르겐을 사용하여 다수 주사하는 경우 3 내지 5년의 기간이 요구된다. 추출물에 대한 새로운 민감화 및 불리한 부작용의 유도와 같은 문제를 해결하기 위해서 재조합 알레르겐이 ASIT에 사용하기 위해 제안되었다(Adv Immunol. 2004;82:105-53, Nat Rev Immunol. 2006 Oct;6(10):761-71). 재조합 알레르겐은 ASIT에 대한 보다 안전하고 보다 효율적인 프로토콜을 달성하고자 하는 목표를 갖는 상이한 방식으로 변형될 수 있다. 그와 같은 신규한 전략의 예는, 이른바 하이퍼알레르겐, 즉 감소된 IgE 결합력을 갖지만 T-세포 활성이 유지된 알레르겐을 생성하는 것이거나 또는 알레르겐-유도된 펩티드를 사용한 백신접종 또는 CpG 모티프(motif)를 함유하는 면역촉진 올리고누클레오티드와 같은 면역조절제에 대한 알레르겐의 커플링이다(참조: Nat Rev Immunol. 2006 Oct; 6(10):761-71, Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14(6):718-27). 알룸은 주사부위에서 육아종을 유발하고 Th2 반응을 주로 자극하는 것으로 알려져 있다. 결론적으로, ASIT에 대한 또 다른 보강제가 필요하다.
보강제는 면역반응을 유도하는 항원의 능력을 증강시키는 물질이다. 인간 백신에 대한 신규한 보강제를 개발하려는 광대한 노력이 진행되었지만 유일하게 폭넓게 사용된 보강제는 여전히 수산화알루미늄이다. 알루미늄 보강제는 뉴런 사멸을 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 신규한 백신의 효능을 최대로 하기 위해서는 신규한 보강제의 개발이 바람직하다. 이상적인 보강제는 기능적으로 활성인 항체의 장기-지속 발현을 제공하고, 세포-매개된 면역을 유도하며, 항원에 대해 고도로 특이적인 면역-반응을 갖는 기억 T 및 B 림프구의 생산을 향상시켜야 한다. 항원으로 중간 방어 및 미래의 도전에 대한 보호를 둘 다 제공하여야 한다. 또한 생체분해성, 무독성이어야 하며, 보강제 자체로 향하는 면역반응을 일으키지 않아야 한다.
백신접종은 장기-지속 효과, 신속한 항체 생성 및 항체 역가(antibody titre)를 부여하여야 한다.
보강제로서의 키틴 및 키토산의 사용은 미국특허 제4,372,883호 및 제4,814,169호에 언급되어 있다. 용액, 분산, 분말 및 미세구 형태의 백신에서의 키토산의 사용은 미국특허 제5,554,388호, 제5,744,166호 및 국제공개공보 제WO 98/42374호에 기술되어 있다. 키토산의 가교결합은 면역반응을 TH2로부터 혼합된 TH1/TH2 반응으로 스위칭한다. 면역접종용 항원과 혼합된 키토산 용액을 사용하는 경우 키토산은 프로인트 불완전 보강제와 동등하고 수산화알루미늄에 비해 우수한 것으로 나타난다(참조: Vaccine 11, 2085-2094, 2007).
약물 분배. 약물 분배는 매우 집중적인 연구영역이며, 오늘날 막대한 돈이 저분자 약물, 유전자 및 백신과 같은 약학적 활성성분을 분배하고, 보다 특히 그와 동시에 원치 않는 부작용을 최소화하는 신규하고 개선된 제형을 찾는데 소비되고 있다. 신규하고 개선된 제형에서는 오래된 약물이 새로운 것이 된다.
키토산의 물리적 및 생물학적 특성들은 약학적 활성성분들의 분배용으로 및 예를 들어 백신, 유전자 조각 및 마이크로-RNA에 대한 분배 매개체로서 매우 적합하게 만든다. 유용하고 중요한 키토산의 특징은, 모든 생체조직에 결합한다는 것, 점막점착 특성을 가진다는 것, 분해성이라는 것 및 세포들 사이의 단단한 결합을 개방한다는 것이다. 이들 특성을 이용함으로써 점막 멤브레인에 비해 약물 분배가 현저히 개선될 수 있다. 오늘날 키토산 기술에 기초한 약물 제형은 예를 들어 백신 캐리어, 약물 방출 하이드로겔, 멤브레인, 거즈 등과 같은 상이한 목적으로 개발 중이다. 키토산은 예를 들어 결장 분배(colon delivery)(참조: H. Tozaki, et al, J. Pharm, Sci., 86, 1016-1021, 1997) 및 인슐린의 비내 분배(미국특허 제5,744,166호)에서 유용한 것으로 밝혀졌다. 키토산은 또한 유전자 분배에서 캐리어로서 사용되었다(참조: MacLaughlin, et. al, J. Controlled Release, 56, 259-272, 1998).
일부 제형들은 서방성으로, 다른 것들은 보다 속방성으로 설계된다. 키토산의 하이드로겔이 사용되는 경우 가교결합이 없는 겔은 용해하는 경향이 있으므로 가교결합이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 가교결합을 이용하는 또 다른 이점은 상이한 가교결합도를 사용함으로써 겔로부터의 방출속도가 변경될 수 있다는 점이다. 키토산은 예를 들어 경구, 경피, 피하, 볼, 설하, 경비, 직장, 질 및 점막내 투여를 위한 신규 제형의 개발용으로 사용될 수 있다.
통상적인 전신성 경로에 의해서 미변형 형태로 투여되는 다수의 약물은 유효농도로 타겟 기관에 도달하지 못하거나 또는 용이한 대사(facile metabolism)에 기인하여 시간에 비해 비효율적이다. 약물 분배 시스템(DDS)의 사용에 의해서 이들 문제점을 극복할 수 있다.
암 치료약은 종종 짧은 플라스마 반감기 및/또는 현저한 부작용에 의해 특징지워질 수 있다. 이들 문제점을 감소시키는 접근법은 국소 투여, 즉 화학요법제를 함유하는 DDS의 이식/주사를 통한 암의 부위에 국소 약물 분배를 통해서 일 수 있다. 전신 투여와 비교하여, 부작용의 정도는 감소하고 약물의 전체 효과는 증가하게 된다.
암의 국소 치료요법용 DDS를 개발할 때 몇몇 기술적 인자들, 즉 생체적합성, 생체분해성(중요성은 질병, 적용부위 및 투여횟수에 의존함), 멸균도/멸균, 약물 및 약학적 부형제와의 적합성, 투여의 용이성(주사기를 통한 투여가 바람직함), 용량, 약물 적재, 용량 위치, 약물의 방출속도 조절능력 및 환자 수용성에 관한 유연성뿐만 아니라 조절 장애(regulatory hurdle), CoG(상품의 가격) 및 IPR이 고려되어야 한다.
약물을 갖는 DDS의 주사에 의해서 종양 부위에서 다량의 적재 약물의 국소화가 일어나며, 따라서 암 치료요법을 개선시키고 화학요법의 유해한 비특이적 부작용을 감소시킨다.
조직 증감술. 조직 증감술은 의학 및 미용 목적으로 사용될 수 있다. 의학 적용은 예를 들어 조직의 개선된 기능을 얻기 위한 조직의 증감술이다. 벌킹제(bulking agent)의 주사에 의해서 강화될 수 있는 조직의 예는 성대, 식도, 요도 또는 직장이다. 미용수술의 영역에서는 연질 조직 증감술은 흉터 및 주름과 같은 결함을 교정하고 입술이나 유방을 확장하는데 사용될 수 있다. 비-생체분해성 및 생체분해성 둘 다의 각종 상이한 물질들은 연질조직을 수리 또는 증감시키는데 사용되었다. 영구적인 연질 조직 증감술에 사용된 물질들의 예는 실리콘, 고레-텟스(Gore-Tex) 및 ePTFE이다. 생체분해성 물질들의 예는 콜라겐, 자가 지방, 가교결합된 히알루론산 및 합성 중합체이다.
실리콘은 영구적인 연질 조직 증감술용으로 가장 빈번하게 사용되는 물질 중의 하나이다. 주사가능한 액체 실리콘에 대한 유해 반응은 육아 종성 반응, 염증성 반응 및 드리프팅(drifting)을 포함한다. 이들 반응은 초기 치료 후 수년만에 일어날 수 있다. 또한 주사가능한 실리콘은 영구적인 충전제이어서 그 물질이 대사되지 않고 치료에도 불구하고 그 반응이 지속될 수 있으므로 상기 병발증(complication)은 심각한 문제가 될 수 있다.
콜라겐은 미용 적용을 위한 및 예를 들어 요실금용 벌킹제로서 가장 빈번하게 사용되는 주사가능한 물질 중의 하나이다. 그러나, 콜라겐은 몇몇 결점을 갖는다. 그것은 신속하게 분해하며 인구의 대략 3%는 주사 전에 일정 기간에 걸쳐서 알레르기 시험을 필요로 하는 지연된 과민성을 나타낸다. 또한, 소 유래의 콜라겐은 바이러스 질병을 전염시킬 수 있다.
자가 지방 주사는 익히 공지되어 있다. 이들 물질 또한 단점을 가진다. 일부 환자에 있어서 안면선(facial line) 및 주름에 주사된 지방은 시력의 손상 및 색증을 유발하였다. 또한 자가 지방은 신체에 의해 용이하게 흡수되었다.
가교결합된 히알루론산 생성물은 미용 치료용 및 예를 들어 요실금(UI) 및 방광요관역류(VUR)의 치료용 벌킹제로서 사용된다.
벌킹제의 설계에 있어서 통상적인 접근법은 생물학적으로 분해가능한 캐리어에 분산된 구상의 비-생체분해성 물질을 사용하는 것이다. 이들의 예는 베타-글라칸 겔 중의 탄소-코팅된 비드, 카르복시메틸 셀룰로즈 중의 하이드록시아파타이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 입자 및 폴리(락틱-코-글리콜 산)(PLGA) 미세구를 포함한다. 입자 주사시의 한 가지 리스크는 뇌 및 폐와 같은 먼 기관으로의 잠재적인 입자 이동이다.
기존의 물질들은 최적이 아니어서 조직 증감술 적용을 위한 신규 물질, 얇은 바늘을 통해서 주사될 수 있고, 생체적합성, 무독성이며 조직 내에서 적당한 체류시간을 가질 수 있는 물질에 대한 지속적인 연구가 있다.
연질 조직 증감술용 키토산 겔은 문헌(참조: 국제공개공보 제WO 97/04012호, 유럽특허 제1 333 869호)에 기술되어 있다.
키토산 겔은 또한 세포의 배양에서 및 예를 들어 문헌[Biomaterials. 2000; 21(21):2165-61, J Biomed Mater Res A. 2007; 83(2):521-9, 및 Biochimie. 2006;88(5); 551-64]에 기술된 바와 같이 연골조직공학(catilage tissue engineering)에 사용되는 생존세포의 도입을 위해 사용되었다.
미용분야에서 키토산은 예를 들어 스킨 크림(참조: US 20060210513, US 20040043963)에 및 면도에 의해 유발된 피부 자극을 감소시키기 위해(참조: 미국특허 제6,719,961호) 사용되었다.
키토산은 또한 윤활제로서 사용될 수 있다(참조: Nature. 2003, 425:163-165). 농후화제로서의 키토산의 사용은 예를 들어 문헌[Environ Sci Technol. (2002) 36(16):3446-54 및 Nanotechnology (2006) 17 3718-3723]에 기술되어 있다. 그것은 또한 야교로서[참조: Biomacromolecules. 1(2):252-8 (2000) 및 Fertil Steril, 84, 75-81 (2005)] 및 식이보조제(dietary supplement)로서[참조: 미국특허 제5,098,733호, 제5,976,550호, 제6,238,720호 및 제6,428,806호] 사용되었다.
의학적 적용 이외에, 점탄성 키토산 하이드로겔이 의가소성, 전단담화(shear thinning) 키토산-함유 유체로서 사용될 수 있으며, 상기 유체의 열적 안정성을 증강시키는 방법이 예를 들어 미국특허 제6,258,755호에 기술되어 있다.
키틴은 지구상에서 가장 풍부한 다당류인 셀룰로즈에 가깝다. 그것은 경질 구조 및, 강화봉(reinforcement bar)의 기능을 갖는 강력한 물질에서 발견된다. 그것은 칼슘 염, 일부 단백질 및 지질과 함께 갑각류 및 절지동물과 같은 해양 유기체의 외골격을 강화시킨다. 그것은 또한 일부 박테리아 및 해면의 세포벽에서 발견되며 경질의 조개껍질 및 곤충의 날개를 강화시킨다. 상업적으로, 키틴은 어류 산업의 폐기물인 갑각류 껍질로부터 분리된다. 키토산은 1,4-베타-결합된 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 잔기로 구성된 선형 다당류이다. 키틴 자체는 수 불용성이어서 그의 사용이 크게 제한된다. 그러나 강 알칼리로 키틴을 처리하는 경우 예를 들어 필름, 스폰지, 비드, 하이드로겔, 멤브레인과 같은 다수의 상이한 형태로 가공될 수 있는 부분적으로 탈아세틸화되고 수용성인 유도체 키토산을 제공한다. 염기 형태의 키토산, 특히 고분자량 및/또는 높은 N-탈아세틸화도의 것은 물속에서 실질적으로 불용성이지만, 일염기산을 갖는 그의 염은 수용성인 경향을 띤다. 글루코사민 잔기의 평균 pKa는 약 6.8이며 중합체는 예를 들어 HCl, 아세트산 및 글리콜산과 수용성 염을 형성한다. 키토산의 용해도는 쇄 길이, 탈아세틸화도, 쇄 내부의 아세틸 기 분포와 같은 내재 인자 뿐만 아니라 이온강도, pH, 온도 및 용매와 외부 조건 등의 몇몇 인자에 의존한다. 문헌으로부터 약 50%의 아세틸화도가 용해도에 최적이라는 것이 알려져 있다. 산성 환경 중에서 겔 및 수용액을 제조하는 경우 특정 키토산의 용해도에 의해 결정되는 실제적인 한계가 있으며, 그것은 그의 분자량 및 N-탈아세틸화도에 의존한다. 그러나, 수성 매질 중에서의 키토산의 양은 액체 매질의 중량을 기준으로 전형적으로는 1 내지 10중량%, 바람직하게는 1 내지 5중량%의 범위이며, 그 양은 저분자량 키토산이 사용되는 경우에는 그 범위의 높은 쪽으로 향하는 경향이 있다[참조: Carbohydr. Polym. 25, 65-70, 1994].
양이온 및 친수성이면서 생체분해성, 무독성 및 항균성인 키토산의 고유특성들은 약학 제형에서 매력적으로 만든다. 그러나 생리학적 조건에서의 그의 불량한 용해도는 그의 실용적 사용을 제한한다. 과학자들은, 생리학적 pH에서 우월한 용해도 특성을 갖는 화학적으로 변형된 키토산 유도체 예를 들어 황산염화된 키토산, N-카르복시메틸 키토산, O-카르복시메틸 키토산 및 N,O-카르복시메틸 키토산을 제조함으로써 용해도의 결점을 비켜갔다[참조: Int J Biol Macromol. (4), 177-80, 1994, Carbohydr Res. 302(1-2):7-12, 1997)].
키토산에 화학적 치환체를 도입하면 생물학적 특성이 변할 것이며 예를 들어 분해속도가 변하고 생체적합성 및 독성에 부정적인 영향을 주는 기가 도입될 우려가 있을 것이다. 이러한 문제는 용해도 증강제로서 글리세로포스페이트가 사용되고 따라서 키토산 구조의 변형없이 생리학적 pH에서 키토산 하이드로겔의 제조를 허용하는 미국특허 제6,344,488호에서 주목되었다.
키토산 용액은 산성 조건하에서, 전형적으로는 쉬프(Shiff) 염기 형성에 적합한 pH(pH4-5)에서 가교결합하여 하이드로겔을 형성할 수 있다. 상이한 구조 및 반응성을 갖는 수많은 가교결합제가 사용되었다. 액체 키토산으로부터 겔을 형성하기 위해서 몇몇 가교결합제, 예를 들어 히알루론산 및 콘드로틴 설페이트와 같은 글리코사미노글리칸(참조: Ann. Pharm. Fr. 58 47-53, 2000), 글루타르알데히드(참조: Ind. Eng. Chem. Res. 36: 3631-3638, 1997), 글리옥살(참조: 미국특허 제5,489,401호), 디에틸 스쿠아레이트(참조: Macromolecules 31:1695-1601, 1998), 예를 들어 디글리시딜 에테르와 같은 디에폭사이드(참조: 미국특허 제5,770,712호), 트리폴리포스페이트(참조: J Appl Polym Sci 74: 1093-1107, 1999), 제니핀(참조: J Polym Sci A: Polym Chem 38: 2804-2814, 2000, Biomaterials. 23:181-191, 2002), 포름알데히드(참조: J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 38, 474, 2000, Bull. Mater. Sci., 29, 233-238, 2006))가 사용되었다. 하이드로겔이 원하는 생성물인 경우 키토산 및 그의 유도체는 용액 속에 유지되어 그의 침전을 방지하는 것이 필수적이다. 가교결합된 키토산 하이드로겔의 pH를 생리학적으로 허용가능한 수준으로 조정하려는 시도는 침전 및 제한된 용도의 불용성 물질을 결과한다. 독성을 이유로 하여 그리고 또한 높은 가교결합도는 키토산의 거동을 완전히 변경시킬 수 있기 때문에 가교결합도를 가능한 한 낮게 유지시키는 것이 바람직하다(참조: EurJ Pharm Biopharm. 2004, 57(1):19-34, Review).
특정한 그룹의 하이드로겔은 점성인 동시에 탄성 특성을 나타내는 겔인 점탄성 겔이다. 점탄성 겔은 적용된 전단응력의 영향하에서 변형되고 유동하게 될 것이지만, 응력이 제거되는 경우 액체는 특정의 변형으로부터 천천히 복원될 것이다. 이것은 예를 들어 안과학, 조직 증감술 및 미용수술에서 사용된다. 겔의 점탄성은 분쇄된 겔의 제조를 비롯한 기계 가공을 허용한다. 히알루론산의 점탄성 겔은 예를 들어 눈수술, 주름필링(wrinkle filling) 또는 요실금의 치료에 사용된다.
키토산, 천연 다가 전해질. 수성 환경 중에서의 다가 전해질의 3차원 배향은 그의 성질/화학적 조성, 크기, 농도 및 전하밀도, 즉 전하의 수 및 그의 하전된 그룹들 사이의 거리에 의존하게 된다. 용액 중의 다가 전해질의 공간 상호작용은 엔탈피에 의해 조절되며 분자는 가장 적합한 저 에너지 상태에 적응하려 할 것이다. 이러한 에너지 최소화 공정은 분자내(동일 분자내) 또는 분자간(분자들 사이) 중의 어느 하나인 상이한 유형의 상호작용과 관련된다. 분자내 상호작용의 예는 수소결합, 소수성 상호작용 및 중합체 상의 하전된 그룹들 사이의 상호작용이다. 전형적인 분자간 상호작용은 용매 상호작용 다른 분자들과의 상호작용이다. 관련된 상호작용의 유형과는 무관하게, 이들 상호작용의 구동력(driving force)은 다가 전해질의 에너지적으로 선호될 수 있는 정합을 찾는 것이다.
다가 전해질이 동일한 유형의 전하, 예를 들어 양전하를 갖는 하전된 그룹을 함유하는 경우 그 그룹은 서로 반발하게 된다. 그의 내부 에너지를 감소시키기 위해서 다가 전해질 분자는 그의 내부 전하들을 가능한 한 많이 분리시키려 들 것이며, 이것은 신장된 중합체 쇄를 유도하게 된다. 이들 신장된 중합체는 더 많은 "공간 수요"일 뿐만 아니라 원자들 사이의 속박된 연결들에 포함된 상대적으로 높은 상태의 에너지를 갖는다.
다른 한편으로, 다가 전해질이 반대 부호의 전하들을 함유하는 경우 그것들이 서로 끌어당겨서 상이한 3차원 배향의 중합체를 생성하는 내부 염 브릿지를 형성한다. 즉, 중합체의 상이한 부분들은 서로 더 근접하게 된다. 전하를 갖지 않는 중합체에서는 이온 상호작용이 없으며, 결론적으로, 그의 3차원 배향은 안정화 수소결합을 형성하는 능력 및, 분자 내부 및 주위 분자 및 매체와의 소수성 상호작용에 의존한다. 다가 전해질과는 달리, 매우 에너지적 반발력을 갖지 않는 미하전 중합체들은 그들의 내부 에너지가 최소화되고 그들의 상대 에너지량이 다가 전해질 보다 낮은 일종의 "랜덤 코일" 구조를 형성한다.
물리학적으로, 이온 상호작용(전하)이 훨씬 강하며 수소결합, 반 데르 발스 힘 및 소수성 상호작용과 같은 다른 상호작용 보다 많은 에너지를 포함한다. 따라서 분자 배향에 대한 전자의 상대 영향이 크며 다수의 경우에 있어서 다른 유형의 관련된 힘의 영향을 압도한다.
N-아세틸-글루코사민 및 글루코사민 잔기들의 혼합물을 갖는 키토산 중합체는 이론적으로는 천연 중합체일 수 있지만, 가장 실제적으로 및 생물학적으로 적합한 상황에서는 키토산 중의 글루코사민에 대한 pH 값이 대략 6.8이므로 양성자가 부가될 수 있다. 그러나, 영구적으로 하전된 그룹을 지니는 다가 전해질과는 달리 키토산 중합체의 전하밀도는 변할 수 있으며 수용액의 pH에 직접 의존한다. 실제적으로, 가장 상업적으로 입수가능한 변형되지 않은 키토산은, pH가 6을 상회하고 상기 6을 상회하는 pH에서 수용액으로부터 침전되는 경우에는 불용성이다. 키토산 분자는 분자골격에 에너지적으로 선호될 수 있는 상태의 용매화(solvatisation)를 형성하는 다수의 전하들을 필요로 하므로 침전이 왕성하게 일어날 수 있다. 침전시에 있어서, 분자 상호작용에 의해서 및 키토산 분자들 내부에서 에너지 최적화를 허용하면서 키토산 쇄가 도출되었다.
키토산 용액의 점도를 증가시키기 위해서 화학적 가교결합이 사용될 수 있다. 그러한 반응에서 키토산 쇄들은 서로 연결되어 집합체(aggreate)와 같은 커다란 네트워크를 형성한다. 그와 같은 반동동안 점도가 연속적으로 증가하고 용액은 그의 구조에 있어서 더욱 겔-유사 형태로 된다. 용액 중의 키토산에 대해 기술된 다수의 가교결합 공정이 있으며, 그것들은 키토산이 산성의 수상 속에 용해되고 가교결합 반응이 낮은 pH에서, 전형적으로는 4-5의 pH에서 일어나는 것이 통상적이다. 사용된 낮은 pH는 키토산 쇄가 양성자화된 형태임을 의미하며 결론적으로 가교결합될 때 신장된 형태로 존재한다. 이어서 생성되는 가교결합된 겔은 기술적으로는 마크로 구조의 양성자화된 및 신장된 키토산 쇄이다. 상기 마크로 네트워크가 중성 또는 알칼리성 조건으로 유도되는 경우 점진적으로 그의 전하를 잃고, 붕괴하고, 종국적으로는 침전하게 된다. 이것은, 표준 키토산(대략 80 내지 95%의 탈아세틸화도)이 6 초과의 pH로 될 때 그것들이 침전하므로 일정 정도 예상된다. 가교결합 자체는 에너지 관점에서 수용액 중에서 안정화하려는 훨씬 많은 요구가 있는 훨씬 큰 전해질 구조를 생성하였다. 이것은 쇄들 사이의 접점에서 양전하들이 서로 더 근접하게 되었고 따라서 물 분자들을 용매화하면서 안정화하는 것이 훨씬 더 곤란하게 된다. 결론적으로, 용액 조건이 덜 에너지적 최적 방식으로 변하는 경우, 예를 들어 pH가 상승하는 경우 개별적인 쇄들 보다 훨씬 많이 침전하는 경향이 있다. 가교결합할지라도 마크로 겔 구조는, 코일에 대한 재배열, 및 보다 높은 시스템의 안정성을 결과하는 보다 에너지적으로 선호된 정합에 기여할 수 있는 다른 정합을 허용하지 않는 신장된 및 왕성하게 선호되지 않는 상태로 폐쇄되었다.
산성 조건에서 형성된 키토산 겔의 침전은 7을 상회하는 pH 또는 훨씬 높은 pH, 즉 pH 4-14에 가교결합된 키토산 겔 한 덩어리를 적용시킴으로써 실험적으로 용이하게 확인된다. 상기 덩어리를 보다 높은 pH의 완충액에 배치하자마자 그 덩어리의 표면은 침전물의 박층에 의해서 희끄무레해지며, 확산이 진행됨에 따라 그 덩어리는 그것이 충분히 침전될 때까지 점점더 희끄무레해진다.
그러나 놀랍게도 본 발명자들은 에너지적으로 덜 속박된 정합의 키토산 쇄인 특정한 탈아세틸화도 및 가교결합도의 저탈아세틸화된 키토산을 사용함으로써 상기 가교결합된 키토산 겔 마크로 구조의 붕괴가 회피될 수 있음을 밝혀냈다. 이러한 과정에 따라 생성된 겔은 침전 형성 없이 1M 수산화나트륨으로 처리될 수 있다. 상응하는 비가교결합 겔은 1M NaOH로 처리하는 경우 침전한다.
보다 높은 용해도의 상기 특정한 키토산을 사용함으로써, 가교결합 반응동안 pH가 훨씬 높을 수 있다. 이것을 하는 이점은 막대하다. 첫째, 키토산 쇄의 양성자화가 낮아지며 키토산 중합체는 용액 중에서 덜 속박된 및 더 랜덤한 코일 유사 네트워크의 형성을 허용하는 8 초과의 pH에서 거의 중성이다. 이러한 상태에서 키토산이 가교결합에 적용되는 경우 생성되는 겔 구조는 보다 높은 유연성의 개별적인 키토산 쇄에 의해서 강화되며, 이것은 조건이 변할 때 보다 에너지적으로 선호된 마크로 구조로 훨씬 더 용이하게 재조직되게 한다. 둘째, 보다 높은 pH를 사용하는 능력이 글루코사민 잔기 상의 아미노 기의 실질적으로 증가된 반응성의 관점에서 유리하다. 이것은 훨씬 더 효율적으로 커플링하게 만들며 정의된 가교결합도에 이르기 위해 훨씬 낮은 농도의 가교결합제의 사용을 가능하게 한다. 또 다른 이점은 부반응을 낮게 유지한다는 점이다. 이들 가교결합된 겔은 낮은 pH에서 및 표준 등급 키토산(80 내지 95%의 탈아세틸화도)으로부터 제조된 키토산 겔과 비교하여 몇몇 이점을 가진다. 생리학적 조건에서 침전하지 않는다는 사실은 그것들이 보다 분해효소에 근접할 수 있음을 의미하며, 이는 겔의 신속한 분해 뿐만 아니라 본원 명세서에 기재된 다른 특성들을 유도해 낸다.
발명의 간단한 설명
따라서, 본 발명은, 30 내지 75%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산 및 가교결합제를 포함하는 가교결합성 키토산 조성물로서, 상기 키토산은 랜덤하게 탈아세틸화되고 상기 가교결합제 대 키토산의 몰 비는, 가교결합제 중의 작용기의 수 및 키토산 중의 접근가능한 아미노기의 수를 기준으로 하여, 0.2 : 1 이하인 가교결합성 키토산 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 다른 용해도 증강제 예를 들어 글리세롤포스페이트를 사용하지 않으면서 생리학적 pH에서 가교결합된 점탄성 키토산 하이드로겔의 형성을 가능하게 한다.
본 발명의 목표는 침전 없이 생리학적 pH로 분배될 수 있는 키토산으로부터 점탄성 겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 화학적 가교결합에 의해서 보다 작은, 개별적으로 분리된 겔 조각 예를 들어 분쇄된 겔로의 추가적인 가공을 허용하는 물리적 강도가 제공되는 점탄성 겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미세한 주사기 침, 전형적으로는 주사용, 예를 들어 백신접종용으로 사용되는 침을 통해 분배될 수 있는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 넓은 표면 영역을 노출하고 결과적으로 생체내 사용시 효소 및 침입세포에 용이하게 사용될 수 있는 분쇄된 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신속하게 분해하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 저농도의 가교결합제, 바람직하게는 저독성 및 무독성의 제제를 사용함으로써 저독성의 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하고 원치 않는 면역학적 또는 독물학적 반응을 최소화하거나 또는 완전히 방지하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 공유적으로 또는 비공유적으로, 그의 제조동안 항원 및 면역원의 도입을 허용하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고유한 보강제 특성을 갖는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역학적 용도를 위한 생체분해성, 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역접종용으로 의도된 항원 및 면역원의 분배를 위한 매개체를 제공하는 것이다. 본 발명은 본원에서 기술된 키토산 하이드로겔 및 항원을 포함하는 면역학적 제제를 제공하되, 상기 항원은 키토산에 임의로 공유결합된다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역학적 반응을 결과하는 분자들의 공유 도입을 허용하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다. 상기 분자들은 저분자량 또는 고분자량 중의 어느 하나 일 수 있으며, 예를 들어 펩티드, 지질, 스테로이드 및 항생물질(antibiotics)과 같은 소분자이거나 또는 단백질, 유전자 조각, 마이크로-RNA, 탄수화물 중합체 및 합성 중합체와 같은 대분자이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하나 초과의 면역성 물질을 함유하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다. 상기 겔은 둘 이상의 항원 분자 또는 저분자량 및/또는 고분자량 항원들의 혼합물을 함유하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다른 제제 예를 들어 보존제, 및 기타 중합체성 물질을 공유적으로 또는 비공유적으로 도입하는 것을 허용하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 음이온계 중합체로 코팅함으로써 추가적으로 변경될 수 있는 방출 특성을 갖는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다. 양이온계 및 음이온계 중합체를 연속적으로 사용함으로써 다층 코팅된 점탄성 겔 구조가 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역반응을 비특이적으로 부양(boost)하기 위해서 보강제 면역요법에 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 점탄성 키토산 하이드로겔에 이들을 도입함으로써 도입된 생체활성 제제 또는 항원(예: 알레르겐)의 서방성을 부여하는 제형을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단독으로 또는 고체 비드와 함께 조직 증감술에 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예를 들어 요실금(UI) 및 방광요관역류(VUR)의 치료용 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벌킹제로서 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포배양골격(cell culture scaffold)으로서 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 숙주 유기체에 생체 세포를 제공하는데 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 경구, 경비, 피하, 점막하, 설하, 각막, 직장, 질 및 근육내 약물 분배를 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다. 본 발명은 본원에서 기술된 키토산 하이드로겔 및 약학적으로 활성 성분을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 예를 들어 위에서 기술한 국소적 암 치료요법을 위한 약물의 도입 및 방출을 허용하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 공유적으로 또는 비공유적으로, 그의 제조 동안 약물의 도입을 허용하는 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상처치유기구로서 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 점탄물 사용 수술(viscosurgery)을 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미용용 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 윤활제로서 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아교로서 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 구멍뚫기- 및 수리용 유체로서 사용하기 위한 점탄성 키토산 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하여 기술되며, 상기 도면의 도 1은 본 발명의 점탄성 키토산 겔 및 대조 겔로 피하 주사 후 24시간 경과한 마우스의 주사부위로부터의 조직학적 단면을 도시한 것이다.
발명의 상세한 기술
본 발명은 일반적으로 예를 들어 인간의학(human medicine) 또는 수의학(veterinary medicine)에서 사용하기 위한 것으로 의도된 키토산으로부터 제조된 하이드로겔에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 상기 기재에 따라 사용하기 위한 점탄성을 갖는 키토산 하이드로겔을 겨냥한 것이다. 따라서 본 발명에 따라 생리학적 조건하에서 침전되지 않는 동시에 넓은 표면적을 노출함으로써 생물학적 가공을 추가적으로 촉진시키는, 키토산, 또는 상이한 탈아세틸화도의 키토산들의 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 선행기술에 따르는 키토산 용액과 비교하여, 본 발명에 따르는 점탄성 하이드로겔의 표면적은 수 배 크다. 본 발명의 점탄성 하이드로겔의 특징은 마우스에 피하 주사될 때 종래기술에 따른 키토산 용액에 비해서 보다 빠른 세포침윤 및 보다 신속한 면역반응을 일으킨다는 점이다(참조: Vaccine 11, 2085-2094, 2007). 이것은 저용량의 면역원의 사용가능성을 열어준다.
이것은 30 내지 75%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산 및 가교결합제를 포함하는 가교결합가능한 키토산 조성물을 제공함으로써 달성되며, 상기 키토산은 랜덤하게 탈아세틸화되고 상기 가교결합제 대 키토산의 몰 비는, 가교결합제 중의 작용기의 수 및 키토산 중의 접근가능한 아미노기의 수를 기준으로 하여, 0.2 : 1 이하이다. 본 발명의 키토산 하이드로겔은 수용액 중에 가교결합가능한 키토산 조성물을 제공하고, 상기 조성물을 가교결합시키고 생성된 키토산 하이드로겔을 단리시킴으로써 제조된다. 본 발명은 또한 상기 공정에 의해 수득될 수 있는 하이드로겔을 제공한다.
키토산의 용해도는 쇄 길이, 탈아세틸화도, 쇄 내부의 아세틸 기 분포와 같은 내재 인자 뿐만 아니라 이온강도, pH, 온도 및 용매와 외부 조건 등의 몇몇 인자에 의존한다. 생리학적 키토산 용액 및 겔을 약용으로 제조하려는 수많은 시도가 있어 왔지만 대부분 불량한 것으로 되었다. 대부분의 상업적 키토산은 80%를 초과하는 탈아세틸화도를 가지며 용액 및 겔이 제조되는 경우 낮은 pH는 중합체를 용해시킬 것이 요구되며, 전형적으로는 아세트산 또는 염산의 산성용액이 사용된다. 상기 용액들의 pH를 상승시키고자 시도하는 경우 pH가 대략 6을 초과할 때 키토산 중합체의 침전을 야기한다. 보다 수용성 키토산 유도체의 사용 또는 글리세로포스페이트와 같은 첨가제를 사용함으로써 상기 문제점을 비켜갈 수 있다. 본 발명자들은 저 탈아세틸화도 예를 들어 50%의 탈아세틸화도의 키토산이 생리학적 조건에서 하이드로겔의 제조용으로 사용될 수 있으며 수 %까지의 키토산 농가가 가능할 수 있음을 밝혀냈다. 저 아세틸화도의 키토산의 상업적 이용성은 제한되지만 그러한 키토산의 제조는 문헌에 기술되어 있다. 저 탈아세틸화도의 키토산을 제조하는 한 가지 방법은 산성 조건하에서 재아세틸화시킨 다음 탈아세틸화시키는 것이다. 또 다른 접근법은 강알칼리성 및 냉각 조건하의 용액으로 취한 키틴으로부터 탈아세틸화를 시작하는 것이다. 저 탈아세틸화도 예를 들어 50%의 탈아세틸화도의 키토산은 고 탈아세틸화도의 키토산 보다 더 가용성이지는 않으며, 그것들은 또한 분열부위의 인식을 위해 N-아세틸 기를 필요로 하는 가수분해효소에 의해 보다 빠르고 보다 용이하게 분열된다. 키토산 겔 및 용액을 생리학적 pH 수준으로 만드는 것의 덜 명백하지만 중요한 이점은 중합체 쇄에서 글루코사민 잔기의 반응성이 부수적으로 증가한다는 점이다. 그것들의 농도는 보다 효율적인 커플링을 제공하는 아미노기의 증가된 반응성의 효과로서 훨씬 낮게 유지될 수 있으므로 특정 상황하에서는 원치않는 부반응을 억제하고 잠재적인 가교결합제의 영향을 최소화할 수 있다. 키토산이 산성 조건하에서 과량의 디에틸 스쿠아레이트의 사용에 의해서 가교결합되는 경우가 그의 일례이다. 약 4.75의 pH에서 수행되는 상기 반응에서 부가된 시약의 거의 50%가 그의 2개의 반응성 부위 중의 하나에서 가수분해되어 추가적으로 가교결합되지 않는 스쿠아르산 치환된 키토산 쇄를 제공한다. 동일 반응이 7 초과의 pH에서 수행되는 경우 반응성이 몇 배 규모로 증가하고 경쟁 부반응이 억제되어 최소 시약으로 깨긋하고 효율적인 반응을 유도함으로써 원하는 가교결합 네트워크를 달성할 수 있다. 이것은 키토산 겔 구조가 면역학적 용도로 의도되는 경우에 가장 중요하다. 이에 대한 몇 가지 이유가 존재한다. 첫째, 그 링커(linker)에 대하여 원치않는 부반응에 대한 리스크가 존재하며, 둘째, 변경된 분해 동력학에 대한 리스크가 있으며, 셋째, 그와 같은 가교결합제는 일반적으로 고도로 반응성이어서 충분히 소비되지 않는 경우 독성 부반응을 유발할 수 있으며, 따라서 이들 제제를 가능한 한 낮은 수준으로 유지하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 저독성의 가교결합 시약을 사용하는 것 및, 점탄성 하이드로겔의 생물학적 사용 전에 제거되어야 하는 그룹을 제거하지 않은 가교결합제를 사용하는 것을 선호한다. 디부틸 스쿠아레이트는 국소 면역조절제로서의 용도로 FDA에 의해서 승인되었고 AME 평가에서 돌연변이 유발률이 높지 않은 것으로 나타났다. 통상적으로 사용되는 또 다른 그룹의 가교결합제는 에폭사이드 화학을 기본으로 하는 반응성 종이다. 디글리시딜 에테르는 카르복실산, 알콕사이드 및 아민과 반응하는 각종 가교결합 반응용으로 자주 사용된다. 디글리시딜 에테르 또는 유사 유도체가 키토산의 가교결합용으로 사용되었을 때에는 상당히 높은 가교결합제 대 키토산 아미노 작용의 비가 사용되었다. 이것은 문헌[Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2005, 75A, 3, 742-753 Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004, 57:, 19-34, 미국특허 제5,770,712, 국제공개공보 제WO 02/40070호]에 기술되어 있다. 본 발명자들은 상기 문헌에 따라 다른 가교결합방법을 시도하였다. 글루타르알데히드 가교결합은 예를 들어 알칼리성 매질에 적용하는 경우 침전한 착색 하이드로겔를 생성하였다. 본 발명에 따르는 점탄성 하이드로겔은 생물학적 가공 속도를 변경시키기 위해서 예를 들어 음이온계 중합체로 용이하게 코팅될 수 있다. 본 발명에 따른 점탄성 하이드로겔을 알칼리성 매질에 대해 투석하는 경우 겔의 표면은 청정상태(clear)를 유지하는데 반하여, 종래기술에 따른 겔의 투석은 불투명한 겔 표면으로 보이는 키토산의 침전을 제공한다. 비가교결합 하이드로겔과 가교결합 하이드로겔 사이에는 침전에 있어서 현저한 차이가 존재한다. 놀랍게도, 이들 겔은 침전 없이 1M NaOH로 처리할 수 있다.
점탄성 겔의 구조는 사용된 키토산 용액의 농도 및 가교결합 시약의 양에 의해 영향받는다. 본 발명자들은 원하는 성질의 겔을 달성하기 위해서 놓은 키토산 농도 및 낮은 가교결합제 농도를 갖는 것을 선호한다. 이와 관련하여 가교결합분자는 중성 또는 약알칼리성 조건에서 아민과 용이하게 반응하도록 설계된 친전자체인 2개 이상의 반응부위를 갖는다. 가교결합제가 2개의 반응부위를 가질 때 그것은 이작용성이며 따라서 2개의 아미노기 예를 들어 상이한 케토산 쇄에서 2개의 글루코사민 단위와 반응할 수 있다. 이러한 성질의 다수의 상업적으로 이용될 수 있는 가교결합 시약이 존재하며, 때로 반응성 기들 사이의 거리는 스페이서 분자(spacer molecule)에 의해서 증가되었다. 이러한 스페이서는 종종 지방족 쇄, 또는 폴리- 또는 올리고에틸렌 글리콜과 같은 폴리에테르 구성체이다. 바람직하게는, 가교결합제는 이작용성, 삼작용성 또는 사작용성이되, 이작용성 또는 삼작용성이 바람직하고, 이작용성이 가장 바람직하다. 본 발명자들은 중성 내지 약알칼리성 조건하에서 고수율 반응으로 용이하게 반응하며 가교결합 분자가 높은 정도로 소비되는 이작용성 가교결합제를 사용하는 것을 선호한다. 또한 본 발명자들은 가교결합 분자가 사용하기 전에 제거시켜야 하는 부산물을 형성하지 않는 것을 선호한다. 다수의 가교결합제는 반응시 이탈기를 제거하도록 설계된다. 이 경우에 있어서 본 발명자들은 무독성 성분을 제거하는 가교결합제를 선호한다. 이러한 가교결합 작용기들의 전형적인 예는 반응성 에스테르, 마이클 수용체(Michael acceptor) 및 에폭사이드이다. 바람직한 가교결합 분자는 스쿠아르산의 에스테르 유도체, 디에폭사이드 및 아크릴아미드의 유도체이다. 가장 바람직하게는 디에틸 스쿠아레이트(3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온) 및 그의 구조적으로 근접하게 관련된 유사체이다. 다른 바람직한 가교결합제는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르, 아크릴아미드의 유도체 및 그들의 구조적으로 근접하게 관련된 유사체이다.
또한, 가교결합 시약의 양을 최소화하고 효율적이고 깨끗한 반응을 얻어서 부산물이 존재할지라도 적은 양만 발생시키는 것이 중요하다. 본 발명자들은 가교결합제 대 키토산 중의 아미노 작용기의 수의 낮은 몰 비를 선호한다. 본 발명자들은 0.2 : 1 이하, 보다 바람직하게는 0.16 : 1 이하, 가장 바람직하게는 0.1 : 1 이하의 비를 사용하는 것을 선호한다. 상기 몰 비는 가교결합제 및 키토산 상에서 가교결합에 이용될 수 있는 기의 수를 기준으로 한다. 가교결합제의 경우 작용성(이작용성, 삼작용성 등) 및 아미노기의 접근성에 대한 키토산에 의존하게 된다(탈아세틸화된 아미노기만이 반응성으로 될 것이다.) 분명하게는, 이용가능한 아미노기의 수는 키토산의 탈아세틸화도에 의해서 결정될 것이다.
본 발명자들은 75% 미만, 보다 바람직하게는 70% 미만, 더욱 바람직하게는 65% 미만, 더더욱 바람직하게는 60% 미만, 가장 바람직하게는 55% 미만의 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 선호한다. 키틴은 완전히 수 불용성이고 탈아세틸화도가 30% 이상인 경우에는 어느 정도 가용성으로 된다. 본 발명자들은 35% 초과, 바람직하게는 40% 초과, 가장 바람직하게는 45% 초과의 탈아세틸화도를 갖는 것을 선호한다. 또한 키토산의 가용성은 분자량, 쇄 내부의 아세틸기의 분포 및 짝이온과 같은 파라미터에 의존한다. 키토산은 다분산성이다. 즉 상이한 쇄 길이들의 혼합물을 함유한다. 상업적으로 키토산은 그들의 점도에 의해서 특징지워지며 평균분자량이 주어진다. 본 발명자들은 20rpm으로 스핀들 회전하는 회전 점도계를 사용하여 25℃의 온도에서 1% 수성 아세트산의 1% w/v 용액으로 측정하였을 때 15,000 mPas 이하, 바람직하게는 2 내지 10,000 mPas, 보다 바람직하게는 5 내지 2,000 mPas, 가장 바람직하게는 10 내지 1,000 mPas의 점도를 갖는 것을 선호한다. 용액의 점도는 키토산의 평균분자량의 표지이며, 그것은 키토산이 가변적인 쇄 길이의 분자들의 분포를 갖는 중합체 물질인 것으로 이해된다. 본 발명자들은 3% 이하의 농도를 갖는 키토산 용액을 사용하는 것을 선호한다. 2% 이사의 농도를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명자들은 0.3%(w/w) 초과의 농도를 갖는 것을 선호한다.
키토산의 탈아세틸화의 패턴은 그의 특성들에 있어서도 중요하다. 본 발명의 키토산은 랜덤하게 탈아세틸화되어야 한다. 즉, 상기 물질들은 덜 가용성 경향을 가지는 것이므로 커다란 블록의 키틴-유사 중합체가 방지되는 것이다. 대신에, 본 발명의 키토산은 랜덤한 패턴의 아세틸화된 및 탈아세틸화된 단당류 단위를 갖는다. 단당류의 성질을 결정하는 한 가지 방식은 NMR을 사용한 최인접물빈도들(nearst-neighbour frequencies)를 측정하고 통계적 모델로 얻은 빈도들을 비교한다(참조: 국제공개공보 제WO 03/011912호)
상업적으로 구입가능한 키토산은 전형적으로는 비-랜덤한 블록 구조를 갖는다. 그 이유는 키틴이 갑각류 껍질로부터 고상공정으로 단리되기 때문이다. 공정 전반에 걸쳐서 껍질이 용해되지 않은 상태로 남아 있는 상기 공정에 있어서, 껍질은 강알칼리로 처리되어 부분적으로 탈아세틸화된 키토산을 제공한다. 그러나, 초기에 키틴은 갑각류 껍질의 형태이기 때문에 알칼리의 수산화물 이온이 껍질의 표면에서 단당류 단위에 우세적으로 작용하는 경향이 있으며, 비교적 두꺼운 껍질의 중심 내부의 단당류 단위들은 수산화물 이온이 관측되지 않는 경향이 있으며 따라서 N-아세틸 치환 패턴을 유지한다.
이러한 키틴 유사 블록을 피하기 위해서 키틴/키토산 다당류 쇄는 용액 속에서 처리되어야 한다. 이것은 다당류 쇄가 용액으로 도입되게 하고 껍질의 구조는 소실된다. 이것은 랜덤한 탈아세틸화 패턴을 가능하게 한다. 이것은 주의하여 조절된 조건하의 용액 중에서 키틴을 처리하거나 또는 키틴을 충분히 탈아세틸화시킨 다음 용액 중에서 재아세틸화시켜서 필요한 탈아세틸화도를 제공함으로써 달성될 수 있다[참조: T. Sannan et al. Makromol. Chem. 177, 3589-3600, 1976, X.F. Guo et al. Journal of Carbohydrate Chemistry 2002, 21, 149-61 및 K.M. Varum et al. Carbohydrate Polymers 25, 1994, 65-70]. 본 발명의 키토산은 바람직하게는 키토산을 용액 상에서 아세틸화시키고/시키거나 탈아세틸화시켜서 랜덤한 탈아세틸화 패턴을 제공함으로써 얻을 수 있다.
저 아세틸화된 키토산의 가교가 수행되는 경우 본 발명자들은 pH가 6 초과이고 키토산이 침전하지 않는 반응조건을 갖는 것을 선호한다. 6.5 초과의 pH를 사용하는 것이 더욱 바람직하며 7.0 초과의 pH을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 가교결합 시약을, 가수분해에 의해서 또는 제거반응을 통해서 실질적인 정도로 파괴하지 않은 pH를 사용하는 것을 선호한다. 상기 반응에 대한 전형적인 조건은 알칼리성 조건이며 본 발명자들은 10 미만의 pH, 보다 바람직하게는 9.5 미만의 pH, 더더욱 바람직하게는 9.0 미만의 pH를 사용하는 것을 선호한다. 바람직하게는, 물은 97 내지 99.7%로 존재한다. 추가적인 용매 가령 에탄올이 예를 들어 0.2%(v/v)로 사용될 수도 있다. 가교결합반응에 사용된 가교결합제의 농도는 바람직하게는 0.01 내지 0.2%(v/v), 보다 특히 약 0.02%(v/v)이다.
본 발명에 따르는 점탄성 하이드로겔은 추가적인 처리없이 단리될 수 있는 블록으로서 수득될 수 있다. 이어서 당해 분야에 알려진 통상적인 기법을 이용하여 하이드로겔을 가공하여 보다 작은 블록 또는 조각을 제공한다. 이와 같이 생성된 "분쇄된 겔"은 미세한 침을 통해서 주사될 수 있다. 겔의 점도는 하기 실시예 16에 기재된 레오미터(rheometer)를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해서 예시되지만, 그에 의해서 제한되지는 않는다.
실시예
별도의 언급이 없는 한 실시예에서는 하기 물질들이 사용되었다.
저 N-탈아세틸화도의 키토산을 본질적으로 하기 문헌에 개설된 원리에 따라 제조하였다: Sannan T, Kurita K, Iwakura Y. Studies on Chitin,1. Die Makromolekulare Chemie 1975;0:1191-5, Sannan T, Kurita K, Iwakura Y. Studies on Chitin, 2. Makromol. Chem. 177, 3589-3600, 1976, Guo X, Kikuch, Matahira Y, Sakai K, Water soluble chitin of low degree of deacetylation. Journal of Carbohydrate Chemistry 2002;21:149-61 및 국제공개공보 제WO 03/011912호.
실시예 1
키토산(1.11g, 50%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 70ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을 적가하여 키토산을 용해시켰다. 용액의 pH를 1M 수산화나트륨을 사용하여 7.4로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 100ml로 조정하였다. 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 20%(v/v) 용액 122㎕)를 첨가하고 용액을 3시간동안 교반하였다. 용액의 pH를 8.3으로 조정하고 부피를 111ml로 조정하였다. 용액을 40℃에서 3일동안 가열 캐비넷 속에 위치시켰다. 고화된 겔을 1-1로 명명하였다. 그 과정을 반복하였으되 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온는 첨가하지 않았다. 이러한 겔을 1-2로 명명하였다.
실시예 2
키토산(0.50g, 72%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 35ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을 적가하여 키토산을 용해시켰다. 용액의 pH를 1M 수산화나트륨을 사용하여 6.2로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 50ml로 조정하였다. 이 겔을 2-1로 명명하였다. 상기 용액의 20ml에 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 12%(v/v) 용액 40㎕)를 첨가하고 용액을 10분동안 격렬히 교반하였다. 용액의 pH를 7.5로 조정하였다. 용액을 40℃에서 3일동안 가열 캐비넷 속에 위치시켰다. 고화된 겔을 2-2로 명명하였다.
실시예 3
키토산(0.50g, 72%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을, 100℃에서 50ml 1M HOAc(aq) 속에서 글루타르알데히드(6g)과 가교결합시켰다. 반응조건은 문헌[J. Control. Release 111 (2006), 281-289]에 기술된 것과 동일하게 하였다.
실시예 4
실시예 1 내지 4에 따르는 각각의 겔 1g을 1M NaOH(aq)에 적용시켰다. 겔 1-2, 2-1 및 3(대조용)의 키토산은 침전하였는데 반해, 가교결합된 겔 1-1 및 2-1(본 발명)은 청정상태를 유지하였다.
실시예 5
키토산 하이드로클로라이드(0.50g, 55%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 45ml의 물 속에 용해시켰다. 희석된 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.3으로 조정하였다. 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 12%(v/v) 용액 102㎕)를 첨가하고 용액을 3시간동안 교반하였다. 용액의 pH를 8.3으로 조정하고 부피를 50ml로 조정하였다. 고양이 알레르겐인 Fel d l(5.9mg)을 상기 용액 3g에 첨가하고 혼합물을 5ml 용적의 유리병에 옮기고 40℃에서 6시간동안 방치하였다. 생성된 겔을 기계가공하고 1ml 용적의 시린지(syringe)로 옮겼다.
실시예 6
히알루론산(50mg)을 MES 완충액(20ml, 20mM, pH6.5) 속에 용해시켰다. 실시예 5에 따르는 점탄성 하이드로겔(4ml)를 히알루론산 용액에 첨가하고, 이를 오비탈 쉐이커 보드(orbital shaker board) 위에서 90분동안 위치시켰다. 코팅된 겔을 2×10분동안 2,300rpm으로 원심분리하고, PBS 완충액으로 세척하고 시린지로 옮겼다. 이러한 히알루론산 코팅된 키토산 겔을 동결건조시키고 재수화시켜서 점탄성 겔을 수득할 수 있었다. 실시예 5에 따르는 하이드로겔을 히알루론산의 부재하에 PBS 완충액에 첨가하고 실-유사(thread-like) 조각들이 희끄무레하고 끈적거리게 되어 용이하게 단리될 수 없었으며, 따라서 재수화될 수 없었다.
실시예 7
키토산 하이드로클로라이드(0.30g, 55%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 25ml의 물 속에 용해시켰다. 희석된 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 8.3으로 조정하고 부피를 3.0g으로 조정하였다. 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 12%(v/v) 용액 61㎕)를 첨가하고 용액을 3시간동안 교반하고 혼합물을 40℃에서 6일동안 방치하였다. 이러한 용액에 6mg의 Fel d l을 첨가하고 혼합물을 교반하였다. 이어서 혼합물을 1ml 용적의 시린지에 옮겼다.
실시예 8(대조)
키토산 하이드로클로라이드(0.90g, 81%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 27g의 증류수 속에 현탁시켰다. 용액의 pH는 3.6이었다. PBS(2.0ml, 25mM, pH7.4)를 첨가하였다. 희석된 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.8로 조정하고 부피를 60ml로 조정하였다. 2.27mg의 Fel d l을 1.1ml의 상기 용액과 혼합하고 이를 1ml 용적으로 시린지로 옮겼다.
실시예 9
실시예 5, 7 및 8에 따른 용액 100㎕를 BALB/c 마우스의 군의 목 부분에 피하 주사하였다. 이어서 마우스를, 1일, 7일 및 21일 후 상이한 시점에서 희생시켰다. 마우스는 CO2의 흡입에 의해서 희생되었다. 주사부위의 피부를 수집하고 이를 얼음 위의 원조직에 위치시키고 이어서 피부 샘플을 아세톤 욕 속에서 동결시켰다. 동결된 피부를 -80℃로 유지한 다음, 조직 절개(histological section)를 실시하였다. 이어서 조직 절편을 세포 침윤에 대해 분석하였다. 조직학적 검사는 실시예 5 및 7에 따른 겔에 대한 주사후 1일만에 이미 세포의 커다란 침윤을 나타내었다. 실시예 8에 따르는 겔의 조직학적 검사는 겔의 표면에는 세포로 덮혔으되 겔의 안쪽에는 세포를 갖지 않는 렌즈 형상의 겔을 나타내었다. 겔 5 및 7에서 세포는 24시간 후에 전체 물질을 침윤하였다. 7일 후 실시예 5 및 7에 대한 키토산의 양이 감소되었다. 2주 경과한, 21일에는 주사된 물질의 표시가 거의 없었는데 반하여, 실시예 8의 겔은 세포의 훨씬 느린 정착(colonisation) 및 또한 훨씬 느린 분해를 나타내었다.
도 1은, 실시예 5의 점탄성 키토산 겔(도 1(a)) 및 실시예 8의 참조 키토산(도 1(b))로 피하 주사한 후 24시간 경과한 다음 마우스의 주사부위로부터의 조직절편을 도시한 것이다. 그 결과는 본 발명의 겔이 참조 겔 보다 빠르고 큰 정도로 면역 세포에 의해서 침윤됨을 보여준다. 참조 키토산은 3주 후에도 완전히 침윤되지 않았으며, 참조 키토산 겔은 본 발명의 겔에 비해서 느린 분해속도가 관측되었다.
실시예 10
실시예 5, 7 및 8에 따른 겔 100㎕를 BALB/c 마우스의 군의 목 부분에 피하 주사하였다. 최초 주사후 9주 경과한 64일에 추가 주사를 실시하였다. 이어서 주사후 1주, 2주, 3주, 9주 및 10주 경과한 시점에서 꼬리 동맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. Fel d 1-특이적 혈청 IgG1 및 IgE의 수준을 ELISA로 측정하였다. 모든 겔들은 IgG1-항체반응을 일으켰다.
실시예 11
키토산(2.05g, 50%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 160ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을, 키토산이 용해될 때까지 첨가하였다. 1M NaOH(aq)을 적가하여 pH를 7.9로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 100ml로 조정하였다. 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(에탄올 중의 5%(v/v) 용액 166㎕)를 상기 용액 50ml에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 10분동안 격렬히 교반한 다음, 가열 캐비넷(50℃) 속에 밤새 위치시켰다.
실시예 12
키토산(2.25g, 55%의 N-탈아세틸화도, MW 145kD)을 130ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M 수성 염산을, 키토산이 용해될 때까지 첨가하였다. 1M 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.75로 조정하고 부피를 160ml로 조정하였다. 상기 용액 50ml에 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(120㎕, 에탄올 중의 12% 용액)를 첨가하고 용액을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 디클로페낙(diclofenac)(773mg)을 25ml의 증류수 속에 용해시키고, 이를 상기 용액에 첨가하였다. 1M 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 8.1로 조정하고 용액을 1시간동안 초음파 처리한 다음, 40℃로 밤새 가열하였다. 생성되는 겔(1g)을 히알루론산(4g, 증류수 중의 0.25%)과 혼합하였다. 겔을, 2,000Da의 분획분자량(molecular weight cut-off)를 갖는 스펙트라/포르 필터(Spectra/Por filter)를 구비한 프란쯔 세포(Franz cell)에 위치시키고 PBS 완충액을 충전시켰다. 2시간 후에는 디클로페낙의 38%, 5시간 후에는 60% 및 24시간 후에는 72%를 방출하였다.
실시예 13
방사 75Se-레벨링된 rFel d l을 사용하여 실시예 5에 따른 공정을 반복하였다. 75Se-레벨링된 rFel d l의 생성은 Der p 2에 대해 실질적으로 종래 문헌[참조: Febs J 2005;272:3449-60]에 기술된 바대로 자체 공지된 것과 동일하되 Sel-태그된 rFel d 1에 대한 구성, 생성 및 정제 조건으로[참조: Chembiochem 2006;7:1976-81] l-태그된 rFel d 1 중의 셀레노시스테인 잔기의 레벨링을 사용하여 수행하였다.
실시예 14
생체내에서 키토산에 커플링되거나 또는 수산화알루미늄에 흡착된 100㎍의 방사 레벨링된 [75Se]rFel d 1(2μCi)의 추적을 종래 문헌[참조: Febs J 2005;272:3449-60, Methods Enzymol 1981;77:64-80]에 기술된 바대로 수행하였다. 간략히 말하면, 마우스(n=2/그룹)에 키토산-[75Se]rFel d 1 또는 알룸-[75Se]rFel d 1을 피하 주사하고 24시간 또는 1주후에 치사시켰다. 마우스를 동결시키고 테이프 섹션 방사능사진촬용용으로 가공하였다. 그 섹션(60㎛)을 X선 필름(제조원: Structurix Agfa, Mortsel, Belgium)에 대해 압축하고 D19(제조원: Kodak, Rochester, USA)을 사용하여 현상하였다.
결과: 24시간 후에 방사능이 물질대사로 변화하였으며, 예를 들어 간 및 비장에서 검출되었다. 패턴은 수산화알루미늄과 유사하였다. 1주 및 2주 후에 각각 방사능의 흔적량이 검출되었다.
실시예 15
키토산(3.6g, 52%의 N-탈아세틸화도)을 250ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을, 키토산이 용해될 때까지 첨가하였다. 1M NaOH(aq)을 적가하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 300ml로 조정하였다. 이 용액을 용액 X(1.2% 키토산)로 명명하였다. 용액 X 100ml에 50ml의 물을 첨가하고, 이 용액을 용액 Y(0.8% 키토산)로 명명하였다. 16ml의 용액 X 및 용액 Y 각각을 각각의 용액을 위한 2개의 비이커에 첨가하였다. 각각에 상이한 양의 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 10%(v/v) 용액)을 하기 목록에 따라 첨가하였다.
X-1 20㎕
X-2 59㎕
X-3 118㎕
Y-1 29㎕
Y-2 88㎕
Y-3 176㎕
혼합물을 실온에서 10분동안 격렬히 교반한 다음,각각의 용액 4g을 페트리 접시(d=35mm)로 옮기고, 밀봉하고 가열 캐비넷(40℃)에 4일동안 위치시켰다.
직경 6mm 및 높이 2.65±0.55mm의 실린더를 페트리 접시로부터 뽑아 내었으며, 100N 부하 세포가 구비된 인스트론 3345를 사용하여 겔 디스크를 압착하였다. 샘플을 1mm/min 압착에 적용시켰다.
0.8% 키토산 용액(Y-1, Y-2, Y-3)에 기초한 겔은 그들의 덜 강성인 구조에 기인하여 취급하기가 기술적으로 더 곤란하고 따라서 1.2% 키토산 용액(X-1, X-2, X-3)에 비해서 분석 정밀도가 떨어진다고 언급되어야 한다. 이것은 분석 데이터를 비교할 때에는 고려되어야 하지만 겔은 악영향을 받지 않는다(실제로, 덜 강성인 구조는 겔의 분쇄를 용이하게 할 수 있다). 1.2% 겔(X-1, X-2, X-3)의 측정에 기초한 분석 데이터는 가교결합제의 양이 2%에서 12%(가교결합제와 단당류 사이의 비로서 계산됨)로 증가할 때 평균 E-모듈러스가 4.7MPa에서 14.1MPa로 증가하였음을 나타내었다.
실시예 16
키토산(4g, 55%의 N-탈아세틸화도)을 350ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을, 키토산이 용해될 때까지 첨가하였다. 1M NaOH(aq)을 적가하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 400ml로 조정하였다. 2개의 상이한 부피의 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 12%(v/v) 용액 60㎕(샘플 1) 및 185㎕(샘플 2))를 50ml의 키토산 용액을 함유하는 2개의 상이한 비이커에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 5분동안 격렬히 교반한 다음, 8ml를 플라스틱 시린지(10ml)로 옮겼다. 시린지를 밀봉하고 가열 캐비넷(40℃)에 72시간동안 위치시켰다. 이어서 형성된 겔을 실리콘 관(d=3mm)을 통해 압착시켜서 새로운 관(5ml 시린지)로 옮겼다. 측정 전에 시린지를 4℃에서 보관하였다.
유변학적 조사를 위해서, 세포 측정용으로 보린 게미니 VOR 기구(Bohlin Gemini VOR)를 사용하였고, 40mm 직경의 원추-원판형 형상 및 4°의 원추각을 갖는 것으로 측정되었다. 모든 측정은 25℃에서 수행되었다.
저장 및 손실 모듈러스 G' 및 G"는 진동 전단 실험으로 조사되었다. 유변학적 파라미터는 각각 고체 및 액체 점탄성을 반영한다.
두 겔 샘플은 G'>G"를 사용한 변형률 변화 측정(strain sweep measurement)에서 점탄성 연질 고체의 특성을 보여주었다. 즉, 탄성 성분이 그의 액체 대응성분보다 많았다. 안정한 선형 영역 내에서 G'(1Hz)는 샘플 1에 대해 약 1°의 상각(phase angle)으로 대략 450Pa이었다. 샘플 2에 있어서 대응하는 데이터는 G' 약 900Pa 및 1°의 상각이었다.
동일 제제에 대해 행해진 제 2 유형의 진동 측정은 0.5의 일정한 변형에 대해 진동수 변화가 있었다. 하기 관측들이 수행되었다: 샘플 2 겔은 높은 겔 강도, 샘플 1 보다 증가된 탄성 모듈러스 G'를 나타내었고, 두 샘플은 0.1 내지 20Hz의 조사범위에서 명백한 진동수 독립 탄성 모듈러스를 보여준다.
겔 샘플의 파열된 버젼에 재현가능한 점탄성 측정을 행할 수 있다. 2개의 겔 샘플은 본질적으로 그들의 파열된 상태에서 동일한 점탄성을 나타낸다. 겔 샘플 2는 샘플 1에 비해 증가된 겔 강도를 나타낸다.
실시예 17
키토산(1g, 55%의 N-탈아세틸화도)을 80ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을, 키토산이 용해될 때까지 첨가하였다. 1M NaOH(aq)을 적가하여 pH를 6.8로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 100ml로 조정하였다. PEG1600(2.5g, 물 속에 용해된 40%) 및 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 1%(v/v) 용액 183㎕)를 교반하에 7.5g의 키토산 용액에 적가하였다. 용액을 40℃의 가열 캐비넷에 위치시켜서 투명한 점탄성 겔을 제공하였다.
실시예 18
키토산(1.5g, 55%의 N-탈아세틸화도)을 80ml의 증류수 속에 현탁시키고 2M HCl(aq)을, 키토산이 용해될 때까지 첨가하였다. 1M NaOH(aq)을 적가하여 pH를 6.5로 조정하였다. 증류수를 사용하여 부피를 100ml로 조정하였다. 물 23g 중에 용해된 메타긴(Metagin)(0.2g) 및 프로파긴(0.03g)을 67g의 키토산 용액에 첨가하고 실온에서 18시간동안 교반하였다. 3,4-디에톡시-3-사이클로부텐-1,2-디온(에탄올 중의 11%(v/v) 용액 24.6㎕)를 상기 용액에 적가하였다. 용액을 실시예 17에 기술된 바대로 가열 캐비넷에 위치시켰다.

Claims (13)

  1. 30 내지 75%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산 및 가교결합제를 포함하는 가교결합성 키토산 조성물로서, 상기 키토산은 랜덤하게 탈아세틸화되고, 상기 가교결합제 대 키토산의 몰 비는, 가교결합제 중의 작용기의 수 및 키토산 중의 탈아세틸화된 아미노기의 수를 기준으로 하여, 0.2 : 1 이하이고,
    여기서 상기 가교결합제가 이작용성이며, 에스테르, 마이클 수용체(Michael acceptor), 에폭사이드 및 그들의 조합물로부터 선택된 작용기를 갖는,
    가교결합성 키토산 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    키토산이 35 내지 55%의 탈아세틸화도를 갖는 가교결합성 키토산 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    가교결합 전에 키토산이 10 내지 500kDa의 중량평균분자량을 갖는 가교결합성 키토산 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 가교결합성 키토산 조성물을 수용액 중에 제공하는 단계,
    상기 조성물을 가교결합시키는 단계 및
    생성된 키토산 하이드로겔을 단리시키는 단계를 포함하는,
    키토산 하이드로겔을 제조하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    가교결합이 6 내지 10의 pH에서 수행되는 방법.
  8. 제 6 항의 방법에 의해서 얻을 수 있는 키토산 하이드로겔.
  9. 제 8 항에 있어서,
    분쇄된 겔의 형태인 키토산 하이드로겔.
  10. 제 8 항에 있어서,
    백신, 세포배양골격(cell culture scaffold), 생체적합물질, 미용물(cosmestic), 벌킹제(bulking agent), 농후화제, 식품산업의 첨가제, 아교, 윤활제, 또는 구멍뚫기 수리용 유체(drilling servicing fluids)로서; 또는
    약물 분배, 조직 증감술(tissue augmentation), 상처치유기구(wound healing device), 정형외과술, 점탄물 사용 수술(viscosurgery)에, 또는 숙주 유기체에 생체 세포를 제공하는 데에; 또는
    생존세포의 엔캡슐화(encapsulation of viable cells)를 위해, 또는 요실금 또는 방광요관역류의 치료를 위해;
    사용하기 위한, 키토산 하이드로겔.
  11. 제 8 항에 따른 키토산 하이드로겔 및 약학적 활성성분을 포함하는 약학 조성물.
  12. 제 8 항에 따르는 키토산 하이드로겔 및 항원을 포함하는 면역학적 제제.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 항원이 키토산에 공유결합되는 면역학적 제제.
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