DE69816996T2

DE69816996T2 - Temperaturgeregelte, ph-abhängige bildung von ionischen polysaccharidgelen

Info

Publication number: DE69816996T2
Application number: DE69816996T
Authority: DE
Inventors: Abdellatif Chenite; Cyril Chaput; Christèle COMBES; Fayrouz Jalal; Amine Selmani
Original assignee: Biosyntech Canada Inc
Current assignee: Piramal Healthcare Canada Ltd
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2018-04-07
Also published as: DK1003567T3; NO20000593L; CA2212300A1; NO330580B1; PT1003567E; ES2205471T3; DE69816996D1; JP2001513367A; WO1999007416A1; NO20000593D0; US6344488B1; ATE246524T1; AU724878B2; IL134368A; EP1003567A1; IL134368A0; EP1003567B1; NZ502919A; AU6915098A; JP3634748B2

Description

HINDERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die temperaturgeregelte, pH-abhängige Bildung von ionischen Polysaccharidgelen, beispielsweise wässrigen Chitosan/Organophosphat-Systemen, und Verfahren zu deren Herstellung.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Chitosan ist ein im Handel erhältliches, preiswertes Polymer, bei dem es sich um ein Derivat von Chetin oder Poly(N-acetyl-glucosamin)materialien handelt. Chitosan ist hauptsächlich aus D-Glucosamin-Einheiten zusammengesetzt, die durch katalysierte N-Deacetylierung von Chetin erzeugt werden, bei dem es sich um ein unlösliches Biopolymer handelt, das aus den harten Schalen von Meerestieren (Fischen, Krustentieren, Shrimps, Krabben...) extrahiert oder mit Hilfe natürlicher Organismen (Zygomyceten, Pilzen...) synthetisiert wird. Chitosan soll über gute viskoelastische Eigenschaften verfügen und besitzt eine adäquate Gewebekompatibilität und Bioabbaubarkeit, wodurch es für bioaktive und resorbierbare Implantate ideal geeignet ist. Auch von Poly-D-glucosamin-Ketten weiß man, dass sie gegebenenfalls eine große Anzahl von Proteoglycanmolekülen anlagern und zusammen mit fasrigen Kollagenen unter Bildung von wässrigen Gelen co-existieren. Es wird angenommen, dass es die Aufgabe der Proteoglycane innerhalb des Gels ist, Wasser zurückzuhalten und für eine geeignete Viskoelastizität Sorge zu tragen. Von den sich ergebenden extrazellulären Matrizes wird erwartet, dass sie kompatible Umgebungen für Zellproliferation und Gewebebildung, insbesondere für Haut-, Ligament-, Knochen- und Knorpelzellen, bieten. Dies hat zur Folge, dass Chitosan für die gerüstbildenden Materialien oder Trägermaterialien von bioengenierten künstlichen Geweben von großem Interesse ist.
Chitin und teilweise acetylierte Chitosanderivate sind zudem auf ihre Eignung für therapeutische Substanzen oder implantierbare Materialien hin umfangreich untersucht worden. Die Biokompatibilität von Materialien auf Chitosanbasis wurde insbesondere für Blut, Wunden und Knochen evaluiert. Für verschiedene Chitosanmaterialien wurden auch die immunologischen und genotoxischen Aktivitäten sowie die stimulierenden Effekte auf die Macrophagenbildung untersucht.
Chitosan und die Derivate davon sind für Wirkstofffreisetzungssysteme durch Gele (Ohya Y. et al. (1993) J. Micro-encapsulation, 10(1): 1–9) umfangreich untersucht worden. Es wurde vorgeschlagen, die Peptidfreisetzung mit Chitosan nasal durchzuführen. Kationische kolloidale Wirkstoffträger aus Chitosan-Polycaprolacton-Systemen wurden ebenfalls vorgeschlagen. Zudem wurden wundheilende und rekonstruktive Vorrichtungen aus Chitosanmaterialien für offene oder die Hornhaut betreffende Wunden, periodontale Gewebe und Haut vorgeschlagen. Chitosan wurde auch speziell bei Knochen und der harten Hirnhaut sowie als blutstillendes Mittel untersucht.
Der Einschluss von lebenden biologischen Materialien (Zellen, Enzymen etc.) wurde für unterschiedliche Chitosanprodukte untersucht. In fast allen Fällen wurden die lebenden Zellen jedoch in Alginat/Chitosan-Mikrokügelchen eingekapselt. Es wurde auch vorgeschlagen, Chondrocyten (Knorpelzellen) in Calciumalginat/Chitosan-Kügelchen einzukapseln. Es wurde auch die Gelbildung aus Chitosan durch Polyphosphate für einkapselnde Zellen wie neurale oder muskuloskeletale Gewebe empfohlen. Chitosan wurde im allgemeinen in einem Säure/Wasser-Medium mit Zellsuspensionen beladen. Die erhaltene Mischung wurde in gepufferte Pentanatriumtripolyphosphate getropft, um zellbeladene Chitosan-Kügelchen und -kapseln zu erhalten. Der Einschluss von neuralen Zellen in Polyphosphat-gelierte Chitosan-Kügelchen führte zu einer guten Lebensfähigkeit, jedoch zu einer niedrigen Proliferationsrate (Zielinski B. A. et al. (1994) Biomaterials, 15(13): 1049–1056). Es wurden keine großen oder spezifischen dreidimensional geformten Materialien vorgeschlagen (Zielinski B. A. et al. (1994) Biomaterials, 15(13): 1049–1056). Polysaccharidkapseln wurden vorgeschlagen zum Einschließen von physiologisch aktiven Zellen, wie Langerhans Islets (US-Patent Nr. 4,391,909). Eine Chitosan/Hydrochlorid-Cisplatin-Mischung wurde vernetzt und als Wirkstoff-Freisetzungssystem vorgeschlagen.
Chitosanderivate sind einer Vielzahl von Trägern und Wirkstoffformulierungen einverleibt worden. Es wurde auch vorgeschlagen, Chitosanmaterialien als wundfüllende Materialien oder kontrazeptive Produkte einzusetzen (US-Patente Nr. 4,956,351 und Nr. 4,474,769). Auch wurde von dem Einsatz von Chitosan-Gelen als Träger für immobilisierende und einkapselnde lebende Biomaterialien, wie Zellen, Bakterien und Pilzen berichtet (US-Patent Nr. 4,647,536). Auch wurde der Einsatz von ophtalmischen Wirkstofffreisetzungssystemen aus Chitosan für die in situ Gelbildung und Ausbildung vorgeschlagen (US-Patent Nr. 5,422,116).
Im US-Patent Nr. 4,659,700 wird die Herstellung von Chitosan-Gelen aus Glycerol/Säure/Wasser-Systemen als bioabbaubare Träger für die Wirkstofffreisetzung beschrieben. Es wird berichtet, dass die resultierenden Chitosan-Gele verhältnismäßig stabil bleiben und ihre dreidimensionale Form für lange Zeiträume und über weite Temperaturbereiche, insbesondere zwischen 4 und 40°C beibehalten. Gele und gelartige Materialien wurden hergestellt, indem 1,0–4,0% G/V Chitosan in Säure-Wasser-Glycerol-Lösungen gelöst wurde, in denen Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure und vorzugsweise 10–90% Glycerolanteile eingesetzt wurden, und in dem mit flüssigen Basen, beispielsweise Natrium-, Ammonium- und Kaliumhydroxyden oder Ammoniakdämpfen, neutralisiert wurde. Der pH-Wert der resultierenden Chitosan-Glycerol-Gel-Materialien beträgt etwa 7,0. Nach dem Neutralisieren wandeln sich die resultierenden Mischungen beim Stehen in Gele um, wobei diese Gele offensichtlich aus der Wechselwirkung von Chitosan, Glycerol und Wasser resultieren. Es wurde berichtet, dass kein freies Glycerol oder Wasser vorhanden war. Es ist jedoch zu betonen, dass derartige dreidimensional geformte Chitosan-Glycerol-Gele nur dann auftreten, wenn die Lösung zuvor mit einer Base neutralisiert wird. Einteilige dreidimensionale Gele können ebenso wie gelartige Membranen leicht geformt werden. Die Rolle des Glycerolbestandteils und der Chitosan-Glycerol-Wechselwirkungen wird nicht erläutert.
Im US-Patent 5,587,175 wird die in situ Bildung von Gelen mit ionischen Polysacchariden beschrieben. Es wird beschrieben, dass eine Zusammensetzung als medizinische Vorrichtung für die Wirkstofffreisetzung, die Anwendung eines diagnostischen Mittels oder die Verhinderung von postoperativen Adhäsionen eingesetzt werden kann, das aus einem wässrigen flüssigen Träger zusammengesetzt ist, der in der Lage ist, in situ zu gelieren. Die Zusammensetzung umfasst mindestens ein ionisches Polysaccharid, mindestens ein filmbildendes Polymer und ein Medikament oder einen Wirkstoff, Wasser und gewünschtenfalls ein Gegenion, das in der Lage ist, das ionische Polysaccharid zu gelieren (US-Patent Nr. 5,587,175). Die Gelbildung wird jedoch durch Wechselwirkung zwischen dem ionischen Polysaccharid und dem filmbildenden Polymer oder durch die durch Gegenionen induzierte Vernetzung des ionischen Polysaccharids hervorgerufen. Andere in situ Gelbildungen basieren auf einer Polyoxyalkylenzusammensetzung (US-Patent Nr. 4,185,618) oder einer Polyoxyalkylen/Polysaccharid-Mischung (US-Patent Nr. 5,126,141) oder einer Alginat/Kationen-Mischung in situ (US-Patente Nr. 4,185,618 und Nr. 5,266,326).
Es wäre daher ausgesprochen wünschenswert, eine durch Temperatur geregelte, pH-abhängige Bildung erhaltenes Polysaccharidgel zur Verfügung zu haben, das zum Einkapseln von Zellen und Zellmaterialien eingesetzt werden kann, wobei deren biologische Aktivität erhalten bleibt.
Es wäre ausgesprochen wünschenswert, ein derartiges Polysaccharidgel zur Verfügung zu haben, das seinen festen oder gelartigen Zustand bei der physiologischen Temperatur oder 37°C beibehält.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein durch eine Temperatur geregelte, pH-abhängige Bildung erhaltenes Polysaccharidgel bereitzustellen, das zum Einkapseln von Zellen und Zellmaterial eingesetzt werden kann, wobei deren biologische Aktivität jedoch erhalten bleibt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Polysaccharidgels, das seinen festen oder gelartigen Zustand bei der physiologischen Temperatur oder bei 37°C beibehält.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines derartigen Polysaccharidgels.
Erfindungsgemäß wird ein Gel auf Polysaccharidbasis bereitgestellt, das umfasst:

a) 0,1 bis 5,0 Gew.-% Chitosan oder eines Chitosanderivates und
b) 1,0 bis 20 Gew.-% eines Salzes eines Polyols oder eines Zuckers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem dibasischen Mono-Phosphatsalz, Mono-Sulfatsalz und einem Mono-Carbonsäuresalz eines Polyols oder Zuckers,

Bei dem Salz kann es sich um eines der folgenden oder irgendeine der folgenden Kombinationen handeln:

a) ein dibasisches Mono-Phosphatsalz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerol- einschließlich Glycerol-2-phosphat, sn-Glycerol-3-phosphat- und L-Glycerol-3-phosphat-Salzen,
b) ein dibasisches Mono-Phophatsalz, bei dem das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Histidinol, Acetol, Diethylstilbestrol, Indol-Glycerol, Sorbitol, Ribit, Xylitol, Arabinitol, Erythritol, Inositol, Mannitol, Glucit und eine Mischung davon,
c) ein dibasisches Mono-Phophatsalz, wobei der Zucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fructose, Galactose, Ribose, Glucose, Xyluose, Rhamnulose, Sorbose, Erythrulose, Deoxy-ribose, Ketose, Mannose, Arabinose, Fuculose, Fructopyranose, Ketoglucose, Sedoheptulose, Trehalose, Tagatose, Sucrose, Allose, Threose, Xyluose, Hexose, Methylthio-ribose, Methylthio-deoxyribulose und eine Mischung davon,
d) ein dibasisches Mono-Phosphatsalz, wobei das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Palmitoyl-glycerol, Linoleoyl-glycerol, Oleoyl-glycerol, Arachidonoyl-glycerol und eine Mischung davon,
e) ein Glycerophosphat-Salz, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dinatrium-glycerophosphat, Dikaliumglycerophosphat, Calcium-glycerophosphat, Barium-glycerophosphat und Strontium-glycerophosphat.

Ein bevorzugtes Gel gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chitosan-β-glycerophosphat, Chitosan-α-glycerophosphat, Chitosan-glucose-1-glycerophosphat und Chitosan-fructose-6-glycerophosphat.
Die Feststoffpartikel oder die wasserlöslichen Additive können in das Polysaccharidgel vor der Gelbildung inkorporiert werden.
Die Wirkstoffe, Polypeptide oder nicht-lebenden pharmazeutischen Agenzien können vor der Gelbildung in das Polysaccharidgel inkorporiert werden.
Die lebenden Mikroorganismen, Pflanzenzellen, Tierzellen und Humanzellen können in dieses Polysaccharidgel vor der Gelbildung eingekapselt werden.
Das Gel kann in situ subkutan, intraperitoneal, intramuskulär oder in biologischen Bindegeweben, Knochendefekten, Brüchen, künstlichen Hohlräumen, Körperbahnen oder -hohlräumen im Augen-Blindsack oder in festen Tumoren gebildet werden.
Das erfindungsgemäße Gel kann als Träger zur Abgabe von pharmazeutischen Agenzien in situ eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Polysaccharidgellösung bereitgestellt, das folgende Stufen aufweist:

a) Lösen von Chitosan oder eines Chitosanderivates in einer sauren, wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von 2,0–5,0, um eine wässrige Polysaccharidzusammensetzung mit einer Konzentration von 0,1–5,0 Gew.-% an Chitosan oder an einem Chitosanderivat zu erhalten,
b) Lösen 1,0–20 Gew.-% eines Salzes eines Polyols oder eines Zuckers, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem dibasischen Mono-Phosphatsalz, einem Mono-Sulfatsalz und einem Mono-Carbonsäuresalz, in der wässrigen Polysaccharid-Zusammensetzung von Stufe a), um eine Lösung eines Polysaccharidgels zu erhalten, in der das Polysaccharidgel eine Konzentration von 0,1–5,0 Gew.-% an Chitosan oder an einem Chitosanderivat und eine Konzentration von 1,0–20 Gew.-% eines Salzes eines Polyols oder eines Zuckers besitzt und einen pH-Wert von 6,4–7,4 aufweist.

Dieses Verfahren kann ferner eine Stufe c) nach der Stufe b) aufweisen:

c) Erhitzen der Lösung des Polysaccharidgels auf eine Verfestigungstemperatur von 20°C–80°C, bis ein Polysaccharidgel gebildet ist.

Ein pharmazeutisches Agenz kann der Polysaccharidgellösung der Stufe b) zugegeben werden.
Das Verfahren kann ferner nach der Stufe b) eine Stufe i) aufweisen:

i) Dispensieren der Lösung des Polysaccharidgels zur Gelbildung in einer gewünschten Aufnahme, entweder in einer Form oder innerhalb eines Gewebes, eines Organs oder einer Körperhöhle.

Die wässrige, saure Lösung kann aus organischen oder anorganischen Säuren hergestellt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Essigsäure, Ascorbinsäure, Salicylsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Propionsäure, Ameisensäure und einer Mischung davon.
Die Polysaccharidgellösung kann in einer stabilen ungelierten flüssigen Form bei einer Temperatur von etwa 0°C – etwa 20°C aufbewahrt werden.
Die Verfestigungstemperatur reicht von etwa 37°C bis etwa 60°C, vorzugsweise etwa 37°C.
Das Molekulargewicht des Chitosans reicht von etwa 10.000 bis etwa 2.000.000.
Das Polysaccharidgel ist durch Einstellen des pH-Wertes dieser Polysaccharidgellösung thermoirreversibel, wenn der pH-Wert dieser Polysaccharidgellösung > 6,9 ist, oder thermoreversibel, wenn der pH-Wert dieser Polysaccharidgellösung < 6,9 ist.
Die festen partikulären Additive können der Lösung des Polysaccharidgels in der Stufe b) zugegeben werden.
Die Lösung des Polysaccharidgels kann in einen Tierkörper oder in einen Humankörper durch Injektion oder durch endoskopische Verabreichung eingeführt werden und bildet in situ bei einer Temperatur von etwa 37°C ein Gel.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des Polysaccharidgels zur Herstellung biokompatibler abbaubarer Materialien zur Anwendung in der Kosmetik, der Pharmakologie, der Medizin und/oder der Chirurgie.
Das Gel kann als Ganzes oder als Komponente in implantierbare Vorrichtungen oder Implantate zur Reparatur, Rekonstruktion und/oder zum Ersatz von Geweben und/oder Organen entweder bei Tieren oder Menschen inkorporiert werden.
Das Gel kann als solches oder als Komponente von implantierbaren, transdermalen oder dermatologischen Wirkstofffreisetzungssystemen eingesetzt werden.
Das Gel kann als Ganzes oder als eine Komponente von ophtalmologischen Implantaten oder Wirkstofffreisetzungssystemen eingesetzt werden.
Das Gel kann zur Herstellung zellbeladener künstlicher Matrizen zur Anwendung für das Engineering und die Kultur von bio-enginierten Hybridmaterialien und Gewebeequivalenten eingesetzt werden.
Die beladenen Zellen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Chondrocyten (Gelenkknorpel), Fibrochondrocyten (Meniskus), Ligamentfibroblasten (Ligament), Hautfibroblasten (Haut), Tenocyten (Sehnen), Myofibroblasten (Muskel), mesenchymalen Stammzellen und Keratinocyten (Haut).
Das zellbeladene Gel und die abgeleiteten Produkte können für die Kultur und das Engineering von künstlichem Gelenkknorpel und Knorpelgeweben und -Organen entweder für chirurgische oder Labortestanwendungen dienen.
Das zellbeladene Gel und die abgeleiteten Produkte können für die Verarbeitung und das Engineering von lebenden künstlichen Substituten für Ligamente, Sehnen, Haut, Knochenmuskeln und jeglichen metabolischen Organen, entweder für chirurgische oder für Labortestanwendungen, dienen.
Das zellbeladene Gel und die abgeleiteten Produkte können zur Anwendung als lebende Substitute zum Ersatz von Gelenkknorpeln, Fibroknorpeln, kartilaginären Organen, Ligamenten, Sehnen, Knochengeweben oder Haut dienen.
Das zellbeladene Hydrogel dient für die Gelbildung bzw. Gelierung in situ, um eine ektopische Bildung von fibroknorpelähnlichen oder knorpelähnlichen Geweben zu induzieren.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines beladenen Polysaccharidgels zur Anwendung als injizierbare und implantierbare Gelbiomaterialien, die als Halter, Träger, wiederherstellende Vorrichtungen oder Substitute für die in situ Bildung von knochenähnlichen, fibroknorpelähnlichen oder knorpelähnlichen Geweben an einer physiologischen Stelle eines Tieres oder eines Menschen wirken.
Die Lösung des Polysaccharidgels kann zur Herstellung eines abgeleiteten Gels oder Hydrogels dienen, indem

1) mindestens ein komplementäres Polymer in die Lösung des Polysaccharidgels eingeführt oder dort gelöst wird und
2) zugelassen wird, dass das Polysaccharid und das komplementäre Polymer für eine so große Zeitspanne bei einer Temperatur von 20°C–60°C aufeinander wechselwirken, dass ein klares dreidimensionales Gel erhalten wird.

Bei dem komplementären Polymer handelt es sich um ein nicht-ionisches wasserlöslichen Polysaccharid oder eine Hydroxyalkylcellulose.
Die für die vorliegende Erfindung verwendeten, nachstehend aufgeführten Ausdrücke und Begriffe haben folgende Bedeutung.
Der Ausdruck „Lösung eines Polysaccharidgels" bzw. „Polysaccharidgellösung" bezeichnet eine Polysaccharidlösung in einer stabilen nicht-gelierten flüssigen Form bei einer Temperatur von etwa 0 °C bis etwa 15°C, die gelieren kann oder in einen Gelzustand überführt werden kann, wenn sie auf die Gelbildungstemperatur erhitzt wird.
Der Ausdruck „Gelbildungstemperatur" bezeichnet jede Temperatur von etwa 20°C bis etwa 80°C, vorzugsweise zwischen 37°C bis etwa 60°C und insbesondere bevorzugt von etwa der physiologischen Temperatur oder 37°C.
Der Ausdruck „Salze von Polyolen oder Zuckern" bezeichnet dibasische Mono-Phosphatsalze, Mono-Sulfatsalze und Mono-Carbonsäuresalze von Polyofen oder Zuckern.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung unterschiedlicher gelierter Materialien, wobei diese Materialien entweder geformt sind (individuell angefertigte Formen, Röhren, Membranen, Filme...) oder dazu bestimmt sind, innerhalb einer biologischen Umgebung in situ gebildet zu weren (Ausfüllen von Gewebedefekten).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die wässrige Lösung des Chitosan-Organophosphats einen pH-Wert oberhalb des pKa-Wertes des Chitosans und geht bei thermischer Stimulierung in ein festes Gel über. Dieses Polysaccharidgel kann als Träger für Wirkstoffe oder als ein Freisetzungssystem bzw. Abgabesystem von nicht-lebenden rapeutika, als substituierende Materialien für Gewebe und Organe sowie als einkapselnde Mittel für lebende Zellen oder Mikroorganismen Anwendung finden. Chitosan/Organophosphat-Gelmatrizen werden bei einer Temperatur zwischen 30°C–60°C schnell gebildet. Wässrige Chitosan/Organophosphat-Systeme dienen zur Anwendung als injizierbare Füllmaterialien, zur Injektion und zur Gelbildung in situ, zum Ausfüllen und Reparieren von Gewebedefekten.
Salze auf Basis von Glycerol-2-phosphat, Glycerol-3-phosphat und Glycerol-1-phosphat sind die erfindungsgemäß bevorzugten Salze.
Chitosan/Polyol- oder Zucker-Phosphat- und Chitosan/Polyol- oder Zucker-Sulfat-Gele können für chirurgische Rekonstruktions- und Regenerationsmaßnahmen sowie für Wirkstofffreisetzungs- bzw. Wirkstoffabgabezwecke Anwendung finden. Es werden thermisch reversible oder irreversible, biozersetzbare polymere Gele mit biologisch gut bekannten und kompatiblen Komponenten für einen weiten Bereich von medizinischen/biotechnologischen Anwendungen bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Auftreten des temperaturgeregelten Übergangs von Sol in ein Gel (Gelbildung) in Abhängigkeit von dem pH-Wert der wässrigen Chitosan/Glycerophosphat-Lösung gekennzeichnet durch die Chitosankonzentration (Gew.-%), die Glycerophosphat-Konzentration (Gew.-%) und den pH-Wert der wässrigen Chitosan/Glycerophosphat-Lösung,
2 zeigt das Sol/Gel-Diagramm für die Chitosan/Glycerophosphat-Systeme, dargestellt als Verhältnis zwischen dem Molgehalt an Glycerophosphat und dem Verhältnis des Molgehalts an Glycerophosphat zum Molgehalt an Glucosamineinheiten,
3 zeigt den durch Hitze induzierten und durch rheologische Messung der Modul- und Viskositätsparameter verfolgten Übergang von dem Sol auf das Gel (Gelbildung) gegenüber der Temperatur,
4 zeigt die Mikrostrukturen der in vitro gebildeten Chitosan/Glycerophosphat-Gele, beobachtet mittels der Rasterelektronenmikroskopie von Gelproben, die bei –30°C während eines Zeitraums von 8 h gefriergetrocknet wurden und
5 zeigt Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen, die injiziert wurden in Kaninchen, subkutan und intra-artikulär in Beine und subkutan am Torso und bei der Körpertemperatur in situ in ein Gel übergingen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Chitosan wird in sauren, wässrigen Lösungen gelöst, um klare, wässrige Chitosanlösungen mit pH-Werten im Bereich von 4,3 bis 5,6 zu erhalten. Die Chitosanlösungen können durch Filtrieren und durch Dampfautoklavieren sterilisiert werden und bei einer niedrigen positiven Temperatur (4°C) aufbewahrt werden.
Die Organophosphatkomponente wird der Chitosanlösung vorzugsweise bei einer niedrigen Temperatur (4°C) zugegeben. Dann wird die wässrige Chitosan/Organophosphat-Mischung thermisch durch einen endothermalen Mechanismus innerhalb eines Temperaturbereiches von 30°C–60°C in ein Gel überführt. Die resultierenden Chitosan/Organophosphat-Gele, sobald sie einmal erhalten wurden, sind beim Erhitzen bis zu 180°C (im Autoclaven) stabil, insbesondere in Zellkulturmedien. Die Bioeinkapselung innerhalb von Chitosan/Organophosphat-Gelen wird durch Inkorporieren der lebenden Zellen in die nicht gelierte wässrige Chitosan/Organophosphat-Lösung bei einer niedrigen Temperatur (4°C) durchgeführt. Dann wird die Temperatur der erhaltenen Mischung aus Chitosan/Organophosphat/Zellen auf 37°C erhöht und dort gehalten, wobei die Gelbildung in ~1 h erfolgt. Organosulfat- oder Monocarbonsäuresalze von Polyolen oder Zuckern spielen eine ähnliche Rolle wie Organophosphate.
Chitosan und die Derivate davon stellen verhältnismäßig preiswerte und im Handel erhältliche Materialien sowie eine attraktive Gruppe von biokompatiblen und abbaubaren Polymeren dar. Ihre Eigenschaften im festen Zustand oder in gelöster Form kann durch Veränderung ihrer chemischen Zusammensetzung und/oder physiko-chemische Charakteristika modifiziert werden. Es hat sich gezeigt, dass der Deacetylierungsgrad und das Molekulargewicht die Eigenschaften der Lösung, der enzymatischen Abbaubarkeit und der biologischen Aktivität stark beeinflussen. Beispielsweise sind chemische Modifizierungen vorgeschlagen worden, um Chitosanketten zu neutralisieren oder zu modifizieren, indem Carbonsäure-, Acetat-, Glutaminsäure, Carboxymethyl- oder Sulfatgruppen inkorporiert werden. Die chemische Vernetzung (Anhydrid, Glutaraldehyd, Glutamat-Succinimid-PEG...) der Chitosan-Makromoleküle erzeugt kovalente Bindungen, wodurch verzweigte oder gepfropfte Netzwerke entstehen.
Die physikalische Gelbildung von Chitosan und den Derivaten davon kann mit Hilfe verschiedener Techniken durchgeführt werden:

a) Neutralisierung (NaOH, KOH, NH₄OH...), wodurch eine Wasserstoffbindung zwischen den Chitosanketten induziert wird,
b) ionische Komplexierung mit divalenten Anionen (Borat, Molybdat, Polyphosphat, Sulfatsalzen und sulfatierten Makromolekülen...), wodurch reine elektrostatische Wechselwirkungen hervorgerufen werden,
c) Komplexierung mit anionischen grenzflächenaktiven Mitteln (Natriumalkylsulfat...), wodurch elektrostatische Wechselwirkungen und hydrophobe Wechselwirkungen von Grenzfläche zu Grenzfläche induziert werden.

Erfindungsgemäß wird ein neuer Gelbildungsmechanismus vorgeschlagen, bei dem die Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkungen und hydrophobe Chitosan/Chitosan- Wechselwirkungen kombiniert werden. Dieser Mechanismus kann lediglich durch komplexe Wechselwirkungen zwischen Chitosan-Makromolekülen, Wassermolekülen und dibasischen Monophosphatsalzen von Polyolen oder Zuckern bewirkt werden.
Zur Verbesserung der Geleigenschaften werden den Zusammensetzungen häufig Polyole zugefügt. Sorbitol und Mannitol werden üblicherweise als den Tonus verstärkende Mittel eingesetzt. Glycerol und Polyethylenglycol werden als Weichmacher vorgeschlagen. Polyole (-ol: Glycerol, Sorbitol...) und Zucker (-ose: Fructose, Glucose, Galactose...) werden als thermal stabilisierende Mittel für Proteine in Lösungen eingesetzt (Back J. F. et al. (1979) Biochemistry, 18(23): 5191– 5196). In Abhängigkeit von den ausgewählten Molekülen wird die Struktur von Wasser ausgebildet oder gebrochen, werden Wasserstoffbindungen, elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen und vorhandene endo-thermische Übergänge erzeugt (Back J. F. et al. (1979) Biochemistry, 18(23): 5191–5196). Polyole und Zucker stabilisieren Proteine gegenüber einer Hitzedenaturierung aufgrund ihrer strukturierenden Wirkung auf Wasser und der Verstärkung der hydrophoben Wechselwirkungen.
Das Dinatrium- oder Calciumsalz von Beta-Glycerophosphat oder das Dinatrium- oder Calciumsalz von Glycerol-2-phosphat stellt ein in den biologischen Wissenschaften gut studiertes Molekül dar. Es wird als Substrat für alkalische Phosphatase (AL) angesehen. Glycerophosphat wird als Supplement für ein Zellkulturmedium zum Kultivieren von aus muskulo-skeletalen Geweben isolierten Zellen häufig eingesetzt und induziert oder hält die Synthese von spezifischen Matrixkomponenten aufrecht, wenn es an Knochen/Knorpelzellen in einer Kultur abgegeben wird (Chung C. -H. et al. (1992) Calcif. Tissue Int., 51: 305–311; Bellows C. G. et al. (1992) Bone and Mineral, 17: 15–29). Die Gelbildung des Chitosans wird mit Glycerophosphat jeglicher Reinheit und jeden Grades erfolgen, während für die Einkapselung von lebenden biologischen Materialien Zellkultur-getestetes Glycerophosphat erforderlich ist. Das Dinatrium- oder Calciumsalz von alpha-Glycerophosphat und das Dinatrium- oder Calciumsalz von Glycerol-3-phosphat stellen ein organisches Salz von biologischer Bedeutung dar (Chung C. -H. et al. (1992) Calcif. Tissue Int., 51: 305–311). Glycerophosphatsalze werden durch Präzipitieren aus Glycerophosphorsäuren erhalten, die wiederum durch die Hydrolyse von Lecithin, einem wohlbekannten biologischen Molekül, und Phosphatiden von Eiern, Sojabohnen und Fischen erhalten werden. Glycerophosphorsäuren liegen in zwei isomeren Strukturen, der alpha und der beta, vor, wobei die beta-Glycerophosphorsäure optisch inaktiv ist, während die alpha-Glycerophosphorsäure optisch aktiv ist.
Glycerophosphorsäure ist eine physiologisch aktive Verbindung, die in den Katabolismus von Kohlenhydraten eingreift. Es wurde ferner gefunden, dass Glycerophosphatdehydrogenase in Nervengeweben aktiv ist, während Glycerophosphat die Abbaugeschwindigkeit von Methylenblau durch Nerven von Meerschweinchen erhöht. Alpha-Glycerophosphat steht mit Brenztraubensäure über Oxydations-Reduktions-Reaktionen zur Herstellung von Milchsäure in frischen Muskelextrakten in Wechselwirkung. Glycerophosphorsäure ist derzeit in Form der Dinatrium-, Calcium-, Magnesium-, Dikalium-, Strontium- und Bariumsalze im Handel erhältlich und besitzt einen verhältnismäßig starken basischen Charakter. Sowohl die alpha- als auch die beta-Glycerophosphatsalze stellen preisgünstige, leicht erhältliche Quellen von dibasischen organischen Mono-Phosphatsalzen dar, zu denen Dipolyol- und Zucker-Phosphatsalze gehören.
Die Solubilisierung von Chitosan in wässrigen Lösungen macht die Protonierung der Amingruppen der Chitosanketten erforderlich. Dies wird mit sauren wässrigen Lösungen mit einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 erreicht. Sobald das Chitosan solubilisiert ist, verbleibt es bis zu einem pH-Wert von 6,2 löslich. Die Neutralisierung von sauren Chitosanlösungen durch Alkalien führt zu einer Zunahme des pH-Wertes sowie zu einer Deprotonierung der Amingruppen. Die Neutralisierung von sauren Chitosanlösungen zu einem pH-Wert oberhalb des pKa-Wertes von Chitosan bei etwa 6,3–6,4 führt zu OH-HN und O-HN zwischen Ketten und Wasser-Chitosan-Wasserstoff-Bindungen, wodurch ein hydriertes dreidimensionales Netzwerk, ein Chitosan-Gel, induziert wird. Bei einem pH-Wert oberhalb von 6,3–6,4 ergeben Chitosanlösungen bei einem normalen Temperaturbereich (0°C–60°C) systematische Chitosan-Gele. Das Vermischen eines Organophosphats mit wässrigen Chitosanlösungen führt jedoch zu einer Zunahme des pH-Wertes der Chitosan-Organophosphat-Lösungen, die für längere Zeitintervalle selbst bei einem pH-Wert oberhalb von 6, 5 und bis zu 7,2 ihre ungelierte und flüssige Form beibehalten. Diese wässrigen neo-neutralen Chitosan-Organophophat-Lösungen (pH 6,5–7,2) gelieren, wenn sie durch eine adäquate Temperatur stimuliert werden. Die Zeit für die Gelbildung wird durch die Temperatur geregelt. So benötigt eine Chitosan-Organophophat-Lösung, die bei 37°C und etwa 30 min geliert, nur etwa 2 min bei 60°C um ein Gel zu bilden.
Es wurde angenommen, dass der Mechanismus der Gelbildung bzw. der Gelierung sowie die Gel-Charakteristika für alle Chitosan-Organophosphat-Systeme ähnlich sind. Somit kann die Gelbildung von Chitosan/β-Glycerophosphat-Lösungen, die ausführlicher untersucht wurden, als typisches Beispiel angesehen werden. Die Ergebnisse, welche die pH-Abhängigkeit und die Temperaturabhängigkeit für die Gelbildung für Chitosan/β-Glycerophosphat-Lösungen anzeigen, sind in den in den 1 und 2 gezeigten Sol-Gel-Diagrammen zusammengefasst. Zusätzlich zu der Gelstärke zeigen die in der 3 dargestellten rheologischen Experimente zweifelsfrei, dass die Gelbildung von Chitosan/β-Glycerophosphat-Lösungen beim Erhitzen erfolgt. Die Änderungen hinsichtlich des Moduls, die bei etwa 60°C auftreten, sind für den Sol zu Gel Übergang und für die Gelbildung symptomatisch. Diese Temperatur für die Gelbildung hängt somit von den Eigenschaften der Lösung und der Erhitzungsrate (Energie der erforderlichen Aktivierung) ab.
Die poröse Struktur der Chitosan/β-Glycerophosphat-Gele wurde mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie unter Beweis gestellt, man vergleiche 4. Die Gele besitzen eine typische Mikrostruktur mit Kammern von etwa 100 μm und Poren von etwa 10 μm. Ihre Mikrostruktur unterscheidet sich von derjenigen, die für Chitosan-Gele beobachtet wurde, welche durch einfache Neutralisierung erhalten wurden, wobei eine lamellenartige Architektur beobachtet wurde.
Eine weitere wichtige Eigenschaft stellt die Injizierbarkeit und die in vivo Gelbildung der Chitosan/β-Glycerophosphat-Lösungen dar. Typische Injektionen und Gele sind in den 5A und 5B gezeigt. Der schwarze Pfeil in der 5 zeigt auf das Gel, das in situ an der intraartikulären Kniegelenkszone zwischen den kollateralen Ligament und der Patellarsehne gebildet wird. Das andere Gel wird subkutan zwischen der Haut und Beinmuskeln gebildet. Der schwarze Pfeil in der 5B zeigt auf die Gele, die subkutan in situ im Torsobereich gebildet werden.
Bei Chitosan/Organophosphat-Gelen beteiligen sich die Organophosphat-Anionen an der Vernetzung der Chitosanmakromolekülketten, jedoch nicht auf die gleiche Weise wie der reinen ionischen Vernetzung, die während der Gelbildung von Chitosan mit Hilfe von anorganischen divalenten Anionen, beispielsweise Sulfat, Oxalat, Phosphat oder Polyphosphat (Pyrophosphate, Metaphosphate und Tripolyphosphate) stattfindet. Eine wässrige Chitosanlösung geht in Anwesenheit von divalenten anorganischen Anionen und unabhängig von dem pH-Wert der Lösung augenblicklich in ein Gel über. Außerdem beeinflusst die Erhöhung der Temperatur die Gelbildung bei dieser Art von Systemen nachteilig. Im Gegensatz dazu hängt die Gelbildung einer Chitosan/Organophosphat-Lösung sowohl von dem endgültigen pH-Wert der Chitosan/Organophosphat-Lösung als auch der Temperatur ab. Jegliche Chitosan/Organophosphat-Lösung kann unabhängig von der herrschenden Temperatur nicht in ein Gel überführt werden, so lange der pH-Wert dieser Lösung niedriger als 6,45 bleibt. Zudem kann jede Chitosan/Organophosphat-Lösung mit einem pH-Wert oberhalb von 6,45 bei 20°C hergestellt werden, ohne dass sie unmittelbar in ein Gel überführt wird. Zudem kann sie für einen langen Zeitraum bei 4°C gelagert werden, ohne dass sie in ein Gel übergeht. Bei 37°C können lediglich die Chitosan/Organophosphat-Lösungen mit einem pH-Wert von > 6,9 mehr oder weniger schnell in ein Gel überführt werden. Es wird angenommen, dass die Anwesenheit von Organophosphat-Molekülen in Chitosanlösungen die elektrostatischen Wechselwirkungen, die hydrophoben Wechselwirkungen und die Wasserstoffbindungen der Chitosanketten direkt beeinflusst. Die hauptsächlichen Wechselwirkungen, die bei der Bildung von Chitosan/Organophosphat-Gelen eine Rolle spielen, sind somit folgende:
1) Wasserstoffbindung zwischen den Ketten von Chitosan/Chitosan (CHITOSAN-CHITOSAN), 2) elektrostatische Chitosan/Organophosphat-Anziehungen zwischen den Ammoniumgruppen der Macromolekülketten und der Phosphatgruppe der Organophosphatmoleküle (CHITOSAN-PHOSPOHAT) und 3) hydrophobe Chitosan-Chitosanwechsel-Wirkungen, die durch die strukturierende Wirkung der Polyol- oder Zuckerteile auf Wassermoleküle induziert werden. Die strukturierende Wirkung der Polyolteile auf Wasser reduziert die Chitosan-Wasser-Wechselwirkungen und verstärkt somit die Chitosan-Chitosan-Wechselwirkungen. Der nicht zu vernachlässigende Aspekt einer solchen Gelbildung stammt im wesentlichen von der späteren Polyol-wasserinduzierten hydrophoben Chitosananziehungen, die sich bei zunehmender Temperatur verstärken (temperaturgeregelte Gelbildung). Bei niedrigen Temperaturen schützen die starken Chitosan-Wasser-Wechselwirkungen die hydrierten Chitosanmakromolekülen vor einer Aggregation. Die Entfernung dieses Schutzes von Wassermolekülen beim Erhitzen favorisiert und verstärkt die Chitosan-Chitosanwechselwirkungen und induziert somit die Assoziation der Makromoleküle. Diese Gelbildung würde jedoch niemals stattfinden, falls die beiden ersten Anziehungen (CHITOSAN-CHITOSAN und CHITOSAN-PHOSPHAT) innerhalb der Chitosan-Organophosphatlösung keinesfalls auftreten. Dies erklärt die ph-Abhängigkeit, welche immer noch die Temperatur geregelte Gelbildung von Chitosan-Organophosphat-Systemen steuert. Obwohl derartige elektrostatische Chitosan-Phosphatanziehungen vorhanden sind, können die Phosphatgruppen aufgrund ihrer nicht-kompatiblen störenden Hinderung nicht das einzige Vernetzungsmittel der Chitosanketten darstellen. Dies unterscheidet diesen Gelbildungsmechanismus markant von dem der reinen ionischen Gelbildung von Chitosan mit Hilfe von divalenten Phosphat- und Polyphosphatanionen. Eine rein ionische Vernetzung würde nicht temperaturgeregelt sein oder nicht durch die Temperatur stimuliert werden.
Diese Art der temperaturgeregelten ph-abhängigen Gelbildung wird spezifisch durch dibasische organische Monophosphatsalze in Chitosanlösungen induziert, kann jedoch auch durch andere organische Salze wie Monophosphatsalze von Polyolen oder Zuckern, wie Polyolsulfat oder Zuckersulfat, oder durch Monocarbonsäuresalze von Polyolen oder Zuckern induziert werden. So wird erfindungsgemäß angenommen, dass eine Chitosan/Glukose-1-sulfat-Lösung auf die gleiche Weise geliert wie dies eine Chitosan/Glukose-1-phosphat-Lösung tut.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung einer wässrigen Chitosan/Organophosphat-Lösung, die bei einer niedrigen Temperatur (4°C) hergestellt und bei physiologischen Temperaturen in dreidimensionale stabile Chitosan/Organophosphat-Gele überführt werden kann. Darin eingeschlossen sind nicht-toxische biokompatible Komponenten im Tier- oder Humanbereich, wobei beide Komponenten und Verfahren gegenüber lebenden biologischen Materialien über eine niedrige Toxizität verfügen und die zelluläre Lebensfähigkeit konservieren. Das Gel verfügt auch über gute mechanische Eigenschaften sowie Handhabungseigenschaften während langer Zeitspannen bei der physiologischen Temperatur und in physiologischen wässrigen Medien, welche Aminosäuren, Ionen und Proteine enthalten. Es ist sowohl möglich Chitosanderivate auszuwählen, als auch Chitosan/Organophosphat-Gele zu verarbeiten, wobei N,O-Substituenten des Chitosans eingeschlossen sind.
Der Ausdruck „Organophosphate (Salz)" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Unterlagen dibasische Monophosphatsalze von Polyolen oder Zuckern ohne Einschränkung. Dazu zählen beispielsweise dibasische Polyol-Phosphatsalze und dibasische Zucker-Phosphatsalze. Der hier verwendete Ausdruck Organosulfate (Salz) bezeichnet Monosulphatsalze von Polyolen oder Zuckern, beispielsweise Polyol-Sulfatsalze und Zucker-Sulfatsalze. Die bevorzugten Organophosphatsalze können ausgewählt sein unter dibasischen Monophosphatsalzen von Glycerol einschließlich Glycerol-2-phosphat-, sn-Glycerol-3-phosphat- und 1-Glycerol-3-phosphat-Salzen (alpha-Glycerophosphat und beta-Glycerophosphat), dibasischen Monosulfatsalzen von Histidinol, Acetol, Diethylstilbestrol, Indol-Glycerol, Sorbitol, Ribit, Xylitol, Arabinito, Erythritol, Inositol, Mannitol, Glucit, Palmitoyl-Glycerol, Linoleoyl-Glycerol, Oleoyl-Glycerol und Arachidonoyl-Glycerol und dibasischen Monophosphatsalzen von Fructose, Galactose, Ribose, Glucose, Xylose, Rhamnulose, Sorbose, Erythrulose, Deoxyribose, Ketose, Mannose, Arabinose, Fuculose, Fructopyranose, Ketoglucose, Sedoheptulose, Trehalose, Tagatose, Sucrose, Allose, Threose, Xylulose, Hexose, Methylthioribose und Methylthiodeoxyribulose. Weitere interessante Mono-Salze (Sulfat, Carboxylat) können von den gleichen Polyolen und Zuckern abgeleitet sein.
Der Ausdruck „Glycerophosphat oder Glycerophosphat" bezeichnet hier sowohl alpha-Gglycerophosphat- als auch beta-Glycerophosphatisomere. Alpha-Glycerophosphat bezieht sich unzweideutig auf Glycero-3-phosphat (alle optischen Eniantiomere), während sich beta-Glycerophosphat in ähnlicher Weise auf Glycerol-2-phosphat bezieht.
Der Ausdruck „dreidimensional" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Unterlagen die Tatsache, dass die polymere Lösung gleichzeitig in ein Gel übergeht und die Kontur der Form annimmt, in welche die Lösung ursprünglich gegossen wurde. Gele können in Glas- oder Kunststoff-Becher, -Schalen, -Röhren oder zwischen zwei Platten hergestellt werden, um jegliche gewünschte Form zu erhalten.
Der Ausdruck „in situ Gelbildung" bezeichnet hier die Bildung von Chitosan/Organophosphat-Gelen durch Injizieren der flüssigen Chitosan/Glycerophosphat-Lösung in das Innere von spezifischen Stellen bei Säugetieren und bei Menschen, beispielsweise jegliche Gewebe (Muskel, Knochen, Ligamente, Knorpel) und Organe. Die in situ Gelbildung erlaubt die vollständige und präzise Ausfüllung der Gewebedefekte oder der Körperräume bzw. Körperhohlräume. Die Gelbildung der Chitosan/Organophosphat-Mischung wird durch die physiologische Temperatur induziert.
Der Ausdruck „endothermale Gelbildung" bezeichnet hier den thermalen Mechanismus der Chitosan/Organophosphat-Lösung, welche die Lösung in die Lage versetzt, bei der gewünschten Temperatur beim Stehen zu gelieren. Die Induzierung der Sol zu Gel Übergänge von Chitosan/Organophosphatsystemen macht eine Energiezufuhr, beispielsweise durch die Temperatur erforderlich.
Der Ausdruck „Zellen oder zelluläre Materialien" bezeichnet hier lebende biologische Materialien (beispielsweise isolierte Zellen, Zelldispersionen, Zellaggregate, Zellspheroide und Zellen, die an festen partikelförmigen Mikrospären anhaften), welche innerhalb der Chitosan/Organophosphat-Gele eingekapselt sind.
Der Ausdruck „in situ Bildung" bezeichnet hier das Verfahren zur Einbringung der ungelierten flüssigen Chitosan/Organophosphat-Lösung an eine Körperstelle (beispielsweise Bindegewebe, Körperbahnen, artikuläre Hohlräume, Frakturen, Knochendefekte ...) und die Induzierung sowie Sicherstellung einer vollständigen Überführung der Polysaccharidlösung in ein Gel an der gewünschten Körperstelle bei der physiologischen Temperatur.
Bildung der Chitosan/Organophosphat-Gele
Bei dem hier gewählten Organophosphatsalz handelte es sich um das Glycerophosphat. Ähnliche Ergebnisse können jedoch mit anderen dibasischen Monophosphatsalzen von Polyolen und Zuckern erhalten werden. Chitosan in Pulverform wird in einer wässrigen sauren Lösung gelöst, bis eine klare Lösung erhalten wird. Der Anteil an Chitosan variiert von 0,5 bis 5,0% G/V, vorzugsweise von 1,0 bis 3,0% G/V. Der ph-Wert der wässrigen Chitosanlösung beträgt 4,5 bis 5,5. Die wässrigen Chitosanlösungen können entweder durch Filtrieren mit sterilen in-line-Filtern (0,22 μm) oder durch Dampfautoclavieren (120°C) sterilisiert werden. Eine Sterilisierung der Chitosan/Glycerophosphat-Gele kann aufgrund der Viskosität nicht durch Filtern oder aufgrund der thermischen Sensitivität nicht durch Dampfautoclavieren vorgenommen werden, kann jedoch mit Hilfe der Bestrahlung mit gamma-Strahlen oder durch striktes steriles Arbeiten erreicht werden. Die frisch hergestellten wässrigen Chitosanlösungen werden vorzugsweise bei einer niedrigen positiven Temperatur (4°C) gelagert. In eine feine Pulverform überführtes Glycerophosphat wird zu der wässrigen Chitosanlösung hinzugegeben und darin gelöst, und zwar bei einer Temperatur von 4 bis 15°C, vorzugsweise bei 10°C. Sobald eine klare homogene wässrige Chitosan/Glycerosphat-Lösung mit einem ph-Wert von 6,5 bis 7,2 erhalten wird, wird diese Lösung in das gewünschte Aufnahmegefäß gegossen und bei der geeigneten Temperatur gehalten, damit es gelieren kann. Auch in Form einer wässrigen Lösung vorliegendes Glycerophosphat kann eingesetzt werden.
Die Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen führen je nach ihrem endgültigen ph-Wert entweder zu einem thermisch reversiblen oder irreversiblen Gel. Reversible Gele entstehen aus Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen mit einem ph-Wert von 6,5 bis 6,9, während irreversible Gele aus Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen mit einem ph-Wert von mehr als 6,9 entstehen. Die Art der Säure, die für die sauren Chitosanlösungen Anwendung findet, beeinflusst den Sol- Gelübergang des Chitosan/Glycerophosphat-Systems nicht wesentlich. Der endgültige ph-Wert innerhalb der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung hängt von dem ph-Wert der Wasser/Säurelösung sowie den Chitosan- und Glycerophosphat-Konzentrationen ab. Da es sich bei dem Chitosan und dem Glycerophosphat um zwei alkalische Komponenten handelt, neigen sie dazu, den ph-Wert der sauren Lösung, in der sie gelöst sind, zu erhöhen. Die Konzentrationen an Chitosan und Glycerophosphat können ausbalanciert werden, um den geeigneten ph-Wert der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung zu erhalten, wobei die Löslichkeitssgrenze beider Komponenten und insbesondere diejenige des Chitosans berücksichtigt wird.
Monolitische dreidimensionale Gele
Bei dem hier ausgewählten Organophosphatsalz handelt es sich um das Glycerophosphat. Ähnliche Ergebnisse können jedoch auch mit anderen dibasischen Monophosphatsalzen, Monosulfatsalzen und Monocarboxylatsalzen von Polyolen oder von Zuckern erhalten werden. Das Aufnahmegefäß bzw. die Form, das bzw. die mit der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung gefüllt ist, wird auf eine Temperatur von 30 bis 60°C, vorzugsweise 37°C, erhitzt. Die Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung bei 37°C kann innerhalb eines üblichen Zellkulturinkubators erfolgen. Die Lösung wird bei der gewünschten Temperatur gehalten, bis sie nach einer Zeitspanne in ein Gel übergeht, wobei diese Zeitspanne von einigen Tagen bis einer Woche (bei 30°C) reicht oder wenige Minuten (bei 60°C) beträgt. Bei 37 °C erfolgt die Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung in etwa einer Stunde. Sobald ein dreidimensionales Chitosan/Glycerophosphat-Gel gebildet ist, wird dieses Gel entformt und in destilliertem Wasser gewaschen. Die Chitosan/Glycerophosphat-Gele bleiben stabil und behalten ihre dreidimensionale Form bei, selbst bei einer hohen Temperatur von 120°C (im Autoclaven).
In situ Bildung der Gele
Bei dem hier eingesetzten Organophosphatsalz handelt es sich um das Glycerophosphat. Ähnliche Ergebnisse können jedoch mit anderen dibasischen Monophosphatsalzen, Monosulfatsalzen oder Monocarboxylatsalzen von Polyolen oder Zuckern erhalten werden. Die in situ Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung kann durch Dispergieren der Lösung mit Hilfe einer Injektionsspritze durchgeführt werden. Erforderlichenfalls kann die Lösung prägeliert (Initiieren der thermischen Gelbildung) werden, indem die Spritze und die Chitosan/Glycerophosphat-Lösung bei der gewünschten Temperatur, idealerweise bei 37°C, gehalten werden, bis die ersten Zeichen der Gelbildung auftreten. Die ready-to-gel Chitosan/Glycerophosphat-Mischung wird dann derart verabreicht, dass sie Gewebedefekte oder Hohlräume ausfüllt und der Gelierungsprozeß (bei 37°C) vollständig abläuft. Die Injektion von Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen wird jedoch durch die Viskosität der Lösungen limitiert, welche die Injizierbarkeit und die Extrudierbarkeit der Lösungen begrenzt. Eine Nadel der Größe 20 und niedriger stellt ein ideales Material für die Injektion einer derartigen Gellösung dar. Die Körperhohlräume und die Gewebedefekte stellen die Empfänger bzw. Aufnehmer für die Lösung dar. Die flüssigen Materialien verbleiben jedoch in einer offenen wässrigen Umgebung. Die Anschmiegsamkeit und die Fähigkeit sich auszubreiten der Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen hängt von den Eigenschaften der Lösung und des Materials ab. Eine erhöhte Viskosität führt zu der in situ Bildung von kompakteren und weniger anschmiegsameren Gelen.
Einkapselung von lebenden biologischen Materialien mit Chitosan/Glycerophosphat-Gelen
Das hier eingesetzte Organophosphatsalz war das Glycerophosphat. Ähnliche Ergebnisse können jedoch mit anderen dibasischen Monophosphatsalzen, Monosulfatsalzen und Monocarboxylatsalzen von Polyolen oder Zuckern erhalten werden. Die lebenden Zellen oder Zellmaterialien wurden gemäß üblichen Zellkulturtechniken hergestellt. Die Zellen oder Zellmaterialien wurden bei niedrigen positiven Temperaturen von 4 bis 20°, idealerweise bei 20°C in die wässrigen Chitosan/Glycerophosphat-Lösung inkorporiert und homogenisiert. Die mit den Chitosan/Glycerophosphat-Mischungen beladenen Zellen oder Zellmaterialien wurden in die gewünschten Schalen oder Vertiefungen gegossen und bei 37°C inkubiert. Es wurde so wenig wie möglich oder zusätzliches Zellkulturmedium zu den Schalen oder Vertiefungen, welche die mit den Chitosan/Glycerophosphat-Materialien beladenen Zellen oder Zellmaterialien enthielten, gegeben, so dass die lebenden eingekapselten biologischen Materialien am Leben und metabolisch aktiv gehalten wurden. Das Zellkulturmedium wurde alle zwei Tage nach der Bildung der Chitosan/Glycerophosphat-Gele erneuert.
Die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der Lösung und des Gels wird möglicherweise durch eine abnormale Osmolarität reduziert. Die Chitosan/Glycerophosphat-Systeme besitzen in Abhängigkeit von der ionischen Glycerophosphatkomponente sich verändernde Osmolaritäten. Wenn die Konzentration der Glycerophosphatsalze am größten ist, dann ist die Osmolarität der Lösung die höchste und die Gefahr für die Zelllebensfähigkeit ist am ausgeprägtesten. Eine ideale Osmolarität für die Bioeinkapselung würde etwa 270 bis 340 mOsmol/kg betragen. Die Injektion und die in situ Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Materialien, die mit lebenden Zellen oder Zellmaterialien beladen sind, kann auf ähnliche Weise durchgeführt werden. Die Zellen oder Zellmaterialien werden bei einer niedrigen positiven Temperatur in die wässrigen Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen vor der Injektion und der Gelbildung eingebracht. Es existiert eine direkte Beziehung zwischen dem Gehalt an Dinatriumsalz von Glycerol-2-phosphat und der Osmolarität. Um derartige Probleme mit der Osmolarität zu reduzieren, kann der endgültige ph-Wert des Chitosan/Glycerophosphats auf den gewünschten Wert eingestellt werden, während der Glycerophosphatgehalt so niedrig wie möglich gehalten wird. Es muß jedoch eine niedrige Grenze für den Glyerophosphatgehalt erreicht werden, um die Temperatur geregelte ph-abhängige Gelbildung durchführen zu können.
Therapeutische Verwendung und andere Verwendungen der Gele auf Chitosanbasis
Ein zuvor beschriebenes Chitosan/Organophosphat-Gel oder Organosulfat-Gel stellt ein ideales Material für ein Wirkstofffreisetzungssystems bzw. Wirkstoffabgabesystem dar. Ein solcher gelartiger, sich in situ bildender Träger, in dem ein Feststoffteilchen oder ein wasserlösliches Additiv vor der Gelbildung inkorporiert wurde, kann topisch, sowie direkt an die zu behandelnde oder zu untersuchende Körperstelle verabreicht werden. Antibakterielle Mittel, antifungale Mittel, steroidale oder nicht-steroidale antiinflammatorische Mittel, Antikrebsmittel, Antifibrosismittel, antivirale Mittel, Antiglucomamittel, miotische und anticholinergische Mittel, antipsychotische Mittel, Antihistaminika und Dekongestionsmittel, Anästhetika und antiparasitäre Mittel können in die Zusammensetzung und das Gel einverleibt sein. In ähnlicher Weise können Polypeptide und nicht lebende pharmazeutische Mittel in die Zusammensetzung oder das Gel für restorative, rekonstruktive oder regenerative Zwecke inkorporiert sein.
Lebende Mikroorganismen, Pflanzenzellen, Tierzellen und Humanzellen können auf identische Weise in das Polysaccharidgel durch Einführung vor der Gelbildung eingeschlossen sein. Die mit Zellen oder Mikroorganismen beladenen Gele können in biotechnologischen Anwendungen in der Medizin oder in anderen industriellen Bereichen Verwendung finden. In situ bildende Gele auf Chitosanbasis können subkutan, intramuskulär, intraperitoneal oder innerhalb biologischer Bindegewebe, Knochendefekten, Brüchen, artikulären Hohlräumen, Körperbahnen und -hohlräumen, Augenblindsack, Gefäßsystem von Festtumoren etc. gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele, welche zur Erläuterung der Erfindung, jedoch nicht zu deren Beschränkung dienen, näher beschrieben.
Beispiel I
Typische Gelbildung bei einem Chitosan/Organophosphat-System
Versuch 1:
Es wurde ein typischer Versuch durchgeführt, in dem 0,2 g Chitosan in 10 ml einer wässrigen Essigsäurelösung (0,1 m) gelöst wurde. Der ph-Wert der Essigsäurelösung wurde zuvor durch Zutropfen einer Kaliumhydroxidlösung (1 m) auf 4,0 eingestellt. Die so erhaltene 2 (G/V) Chitosanlösung besaß einen ph-Wert von etwa 5,6. Dann wurden 0,800 g Dinatriumsalzglycerophosphat-Pentahydrat hinzugegeben und bei 10°C in der Chitosanlösung gelöst. Der ph-Wert der resultierenden homogenen flüssigen Mischung nahm den Wert 7 an. Diese Mischung wurde in eine gläserne Scintillationsampulle gegeben und 2 h bei 37°C in einem Inkubator aufbewahrt. Diese Zeit reichte für die Durchführung der Block-Gelbildung aus. Das resultierende Block-Gel wurde in ein Bad aus destilliertem Wasser, das erneuert wurde, eingetaucht, um überschüssiges Glycerophosphat zu entfernen.
Ein ähnliches Ergebnis wurde in dem Fall erhalten, in dem das Dinatriumsalz von Glycerophosphat (oder Dinatriumsalz von Glycerol-2-phosphat) durch das Dinatriumsalz von alpha-Glycerophosphat (oder das Dinatriumsalz von Glyerol-3-phosphat) ersetzt wurde.
Versuch 2:
Eine homogenisierte Chitosan/Glycerophosphat-Lösung wurde wie im Versuch 1 hergestellt und in eine duale Gussform für ein Gel mit Glasplatten mit 1,6 mm Abstand zur Herstellung eines Gel-Sandwiches gegeben. Das System wurde bei 37°C in einem Ofen aufbewahrt. Die Ausbildung einer Gel-Membran wurde innerhalb von 2 h erzielt. Die Membran wurde aus der Gel-Guß-Form entformt.
Versuch 3:
0,110 g gerauchtes Silica in fester Partikelform (AEROSIL) wurde in einer Lösung dispergiert, die hergestellt wurde, indem 0,200 g Chitosan in 10 ml einer wässrigen Essigsäurelösung gelöst wurden. 0,800 g des Dinatriumsalzes von Glycerophosphat-Pentahydrat wurden in die Chitosan-Silicadispersion gegeben. Die erhaltene Zusammensetzung wurde in eine gläserne Scintillationsampulle in einem bei 37°C gehaltenen Wasserbad gegeben. Die Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Komponente wurde innerhalb von 2 h beobachtet. Das Chitosan/Glycerophosphat-Gel enthält die dispergierten festen Silicapartikel.
Versuch 4:
0,200 g Chitosan wurden wie im Beispiel 1 in einer Essigsäurelösung gelöst. 1,239 g Dinatriumsalz von Glucose-1-phosphat-Tetrahydrat wurden hinzugegeben und gelöst, um eine klare Chitosan/glucose-1-phosphat-Lösung zu erhalten. Diese Chitosan/glucose-1-phosphat-Lösung wurde in eine gläserne Scintillationsampulle gegeben und bei 37 °C gehalten. Der Sol zu Gel Übergang erfolgt bei 37°C innerhalb von 3 h. Das resultierende Masse-Gel wurde in ein Bad aus destilliertem Wasser, das erneuert wurde, gegeben, um überschüssiges Glucosephosphatsalz zu entfernen.
Der Versuch wurde wie im Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch die 1,239 g an Glucose-1-phosphatsalz durch 0,100 g Dinatriumsalz von Fructose-6-phosphat-Dihydrat ersetzt wurden.
Beispiel II
Wirkung der Zusammensetzung auf den pH-Wert der Lösung und das Auftreten der Gelbildung
Eine saure Mutterlösung wurde aus Wasser/Essigsäure für alle Versuche hergestellt. Der pH-Wert dieser sauren Mutterlösung wurde auf 4,0 eingestellt. Chitosanpulver mit einem hohen Molekulargewicht (M. W. 2.000.000) wurde zu einem Volumen der sauren Mutterlösung gegeben und darin gelöst, so dass Chitosanlösungen mit Chitosananteilen von 0,5 bis 2,0% G/V (Tabelle 1) erhalten wurden. In der Tabelle I sind die gemessenen pH-Werte für die unterschiedlichen Proben aufgeführt.
Tabelle 1 Wässrige Chitosanlösungen und pH-Werte
Glycerophosphat wurde zu den Chitosanlösungen gegeben und induzierte eine Zunahme des pH-Wertes. In der Tabelle 2 ist die Auswirkung der Glycerophosphatkonzentration auf verschiedene Chitosanlösungen aufgeführt. Die Konzentration an Glycerophosphat reicht von 0,065 bis 0,300 mol/l. Die Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen in Glasampullen wurden bei einer Temperatur von 60°C und 37°C gehalten. Eine gleichförmige und in der Masse stattfindende Gelbildung wurde bei 60°C innerhalb von 30 min und bei 37°C innerhalb von 6 h festgestellt (Tabelle II und 1). Die Chitosan- und beta-Glycerophosphat-Komponenten beeinflussen einzeln die Zunahme des pH-Wertes innerhalb der wässrigen Lösungen und beeinflussen folglich den Übergang vom Sol zum Gel. Ebenso wie die gelösten Materialien beeinflusst auch der anfängliche pH-Wert der Wasser/Essigsäure-Mutterlösung den Übergang vom Sol zum Gel. Dieser mögliche Effekt scheint jedoch durch die Gegenwirkung der Chitosanlöslichkeit, welche vom dem pH-Wert der Lösung abhängt, limitiert zu sein.
Tabelle 2 Gelbildung von Chitosan/Glycerophosphat-Zusammensetzungen
Beispiel III
Thermische Reversibilität der Gelbildung von Chitosan/Glycerophosphat-Systemen
Eine erste Chitosan/Glycerophosphat-Lösung wurde aus 10 ml der Wasser/Essigsäure-Mutterlösung mit einem pH-Wert von 4,0 hergestellt, indem 0,200 g Chitosan und 0,800 g Dinatriumsalz von Glycerophosphat-Pentahydrat hinzugegeben und gelöst wurden. Die resultierende Chitosan-Glycerophosphat-Lösung besaß einen pH-Wert von etwa 7,0 und wurde auf 60°C erhitzt, wobei sie schnell gelierte. Das Chitosan/Glycerophosphat-Gel wird auf eine Temperatur von etwa 0–4°C gekühlt. Es wird jedoch kein Übergang mit der Zeit beobachtet, und das Gel bleibt bei 4°C stabil. Dieses Chitosan/Glycerophosphat-Gel ist thermoirreversibel.
Eine zweite Chitosan/Glycerophosphat-Lösung wurde aus 10 ml der Wasser/Essigsäure-Mutterlösung mit einem pH-Wert von 4,0 hergestellt, indem 0,100 g Chitosan und 0,800 g Dinatriumsalz von Glycerophosphat-Pentahydrat hinzugegeben und gelöst wurden. Die Chitosan/Glycerophosphat-Lösung besaß einen pH-Wert von etwa 6,78 und wurde zur Gelbildung auf 60°C erhitzt. Das resultierende Chitosan/Glycerophosphat-Gel wird dann auf eine Temperatur von etwa 0 °C–4°C gekühlt, und ein Übergang vom Gel zum Sol wird nach einer Zeitspanne beobachtet. Das Gel verwandelt sich bei niedrigen positiven Temperaturen, beispielsweise bei 4°C zurück in eine flüssige Lösung. Wird diese Lösung erneut auf 60°C erhitzt, dann tritt der umgekehrte Mechanismus (Übergang vom Sol zum Gel) erneut auf und es bildet sich erneut ein Gel. Der Übergang vom Sol zum Gel zum Sol ist zwischen Temperaturen von 4°C und 60°C reproduzierbar. Dieses Chitosan/Glycerophosphat-Gel ist thermoreversibel. Der thermoreversible Übergang des Chitosan/Glycerophosphat-Systems vom Sol zum Gel hängt vorwiegend von dem pH-Wert der Chitosan/Glycerophosphat-Lösung ab. Ein Beispiel für einen pH-Wert und die beobachtete Umkehrbarkeit ist in der Tabelle 3 aufgeführt. Die experimentellen Beobachtungen bei den Chitosan/Glycerophosphat-Systemen habe gezeigt, dass die thermische Reversibilität bzw. Umkehrbarkeit des Sol- zum Gel-Mechanismus sich bei einem pH-Wert der Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen in der Nähe von 6,9 ändert. Eine reversible Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen tritt dann auf, wenn der pH-Wert zwischen 6,5 und 6,9 liegt. Ein ähnliches Ergebnis wurde mit anderen dibasischen Monophosphatsalzen von Polyolen oder Zuckern, wie Glucose-1-phosphatsalzen beobachtet.
Tabelle 3 Wirkung des pH-Wertes auf die Sol- zu Gel-Reversibilität für eine 2,0% G/V Chitosankonzentration
Beispiel IV
In situ Gelbildung der Chitosan/Glycerophosphat-Materialien
Erwachsene, weiße New-Zealand-Kaninchen wurden durch intravenöse Administration von Natriumpentosorbital (1 ml/kg) anästhetisiert und unter Anästhetika für 3 h gehalten. Nach 3 h wurden die Tiere durch eine anästhetische Überdosis getötet und die Versuche wurden post-mortem weitergeführt. Das Tier wurde auf den Rücken liegend gehalten, und es wurden lokalisierte Zonen bei den Oberschenkeln und im Rumpfbereich rasiert. Die Haut wurde incisiert, um die subkutanen Fasermembranen und den Muskel des Schenkels freizulegen.
Zwei zuvor hergestellte Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen wurden in Injektionsspritzen gegeben und bei einer niedrigen Temperatur (4°C –10°C) gehalten: Die Lösung I enthielt 2,7% G/V Chitosan mit niedrigem Molekulargewicht und 9,0% G/V Glycerophosphat, während die Lösung II 2,5% Chitosan mit mittlerem Molekulargewicht und 9,0% G/V Glycerophosphat enthielt. Die Spritzen wurden mit Nadeln der Größe 21 ausgestattet. Die Chitosan/Glycerophosphat-Lösungen wurden nicht bei sterilen Bedingungen hergestellt oder gehalten, da die Tierexperimente innerhalb einer Zeitspanne von etwa 4–5 h durchgeführt wurden. Ein Volumen (a) von 1,0–1,5 ml der Lösung I wurde subkutan in die Fasermembranen injiziert, während ein zweites Volumen (b) von 2,0 ml der Lösung I durch die Kniegelenkskapseln in den artikulären Hohlraum injiziert wurde. Ein Volumen (c) von 1,0 ml der Lösung II wurde subkutan im Torsobereich injiziert. Alle Injektionsstellen wurden erforderlichenfalls mit den excisierten Geweben bedeckt. Für die in situ Gelbildung wurde ein Zeitraum von 3 h gewährt. Dann wurden die Stellen erneut geöffnet oder excisiert, und die in situ gebildeten Gele wurden gesammelt.
Tabelle 4 Injektionen und in situ Bildung von Gelen
Beispiel V
Einkapselung von Säugetierzellen
Eine wässrige 2,5% G/V Chitosanlösung wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. 1,98 g der Chitosanlösung wurden mit 0,18 g Dinatriumsalz von beta-Glycerophosphat, 04 ml Dubelcco Modified Eagle Medium F12, in dem tierische Chondrocyten dispergiert waren, und 0,2 ml Dubelcco Modified Eagle Medium F12 vermischt. Die Chondrocyten wurden aus Knorpeloberflächen von Kälberschultern isoliert und aus primären Monoschichtkulturen gesammelt. Dubelcco Modified Eagle Medium F12 weist Dexamethason, Ascorbinsäure und 10% fötales bovines Serum auf. Alle Chitosanlösungen, Chitosan/Glycerol-2-phosphat-Lösungen und Verfahren waren steril. Sobald die Chondrocyten enthaltende Chitosan/Glycerol-2-phosphat-Dispersion geformt wird, wird sie in einen Inkubator bei 37°C gegeben, bis die Gelbildung stattfindet. Die Gelbildung des Chitosan/Glycerol-2-phosphat-Systems wird innerhalb von 2 h beobachtet. Mit diesen mit Chondrocyten beladenen Chitosan/Glycerol-2-phosphat-Gelen durchgeführte Lebensfähigkeitstests zeigen einen Bereich von 10%–70% an lebenden Chondrocyten. Die Einkapselung von Mikroorganismen, Pflanzenzellen, Tierzellen oder Humanzellen in Chitosan/Glycerol-2-phosphat-Gelen kann durchgeführt werden, wobei sich die Eigenschaften in Abhängigkeit von der erwarteten Lebensfähigkeit verändern.
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung beschrieben wurde, versteht es sich, dass die Erfindung weitere Modifikationen umfassen kann. Die Anmeldung soll jegliche Variationen, Verwendungen und Adaptionen der Erfindung umfassen, welche im allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, wozu auch Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung zählen, die sich bei einer bekannten oder üblichen Praxis auf dem Gebiet, auf welches sich die Erfindung bezieht, ergeben und die auf die wesentlichen, zuvor erläuterten Merkmale beziehen und sich aus dem Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche ergeben.

Claims

Gel auf Polysaccharidbasis umfassend: a) 0,1 bis 5,0 Gew.-% Chitosan oder eines Chitosanderivats und b) 1,0 bis 20 Gew.-% eines Salzes eines Polyols oder eines Zuckers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem dibasischen Mono-Phosphatsalz, einem Mono-Sulfatsalz und einem Mono-Carbonsäuresalz eines Polyols oder Zuckers, wobei das Gel innerhalb eines Temperaturbereiches von 20°C–70°C induziert wird und stabil ist sowie in der Lage ist, innerhalb eines Gewebes, eines Organs oder von Hohlräumen eines Tieres oder eines Menschen in situ gebildet zu werden und/oder zu gelieren.
Gel nach Anspruch 1, bei dem das Salz ein dibasisches Monophosphatsalz von Glycerol einschließlich, Glycerol-2-phosphat-, sn-Glycerol-3-phosphat- und L-Glycerol-3-phosphat-Salzen darstellt.
Gel nach Anspruch 1, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-Phosphatsalz darstellt und das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Histidinol, Acetol, Diethylstilbestrol, Indol-glycerol, Sorbitol, Ribit, Xylitol, Arabinitol, Erythritol, Inositol, Mannitol, Glucit und einer Mischung davon.
Gel nach Anspruch 1, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-Phosphatsalz darstellt und der Zucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fructose, Galactose, Ribose, Glucose, Xylose, Rhamnulose, Sorbose, Erythrulose, Deoxy-ribose, Ketose, Mannose, Arabinose, Fuculose, Fructopyranose, Ketoglucose, Sedoheptulose, Trehalose, Tagatose, Sucrose, Allose, Threose, Xylose, Hexose, Methylthio-ribose, Methylthio-deoxy-ribulose und einer Mischung davon.
Gel nach Anspruch 1, bei dem das Salz ein dibasisches Monophosphatsalz darstellt und das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Palmitoyl-glycerol, Linoleoyl-glycerol, Oleoyl-glycerol, Arachidonoyl-glycerol und einer Mischung davon.
Gel nach Anspruch 1, bei dem die Gelzusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chitosan-β-glycerophosphat, Chitosan-α-glycerophosphat, Chitosan-glucose-1-glycerophosphat und Chitosan-fructose-6-glycerophosphat,
Gel nach Anspruch 1, bei dem dem Polysaccharidgel vor der Gelierung feste partikuläre oder wasserlösliche Additive einverleibt werden.
Gel nach Anspruch 1, bei dem dem Polysaccharidgel vor der Gelierung Arzneimittel, Polypeptide oder nicht-lebende, pharmazeutische Agenzien einverleibt werden.
Gel nach Anspruch 1, bei dem lebende Microorganismen, Pflanzenzellen, Tierzellen oder Humanzellen innerhalb des Polysaccharidgels vor der Gelierung eingekapselt werden.
Gel nach Anspruch 1, bei dem das Gel subkutan, intraperitoneal, intramuskulär oder innerhalb von biologischen verbindenden Geweben, Knochendefekten, Frakturen, Knorpelhohlräumen, Körperleitungen und -hohlräumen, Augen-Blindsack oder festen Tumoren in situ gebildet wird.
Gel nach Anspruch 10, bei dem das Gel ein Träger ist, der ein pharmazeutisches Agenz zur Abgabe dieses pharmazeutischen Agenz in situ enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Lösung eines Polysaccharidgels nach Anspruch 1 mit folgenden Stufen: a) Lösen von Chitosan oder eines Chitosanderivates in einer sauren, wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von 2,0–5,0, um eine wässrige Polysaccharidzusammensetzung mit einer Konzentration von 0,1–5,0 Gew.-% an Chitosan oder an einem Chitosanderivat zu erhalten, b) Lösen 1,0–20 Gew.-% eines Salzes eines Polyols oder eines Zuckers, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem dibasischen Mono-Phosphatsalz, einem Mono-Sulfatsalz und einem Mono-Carbonsäuresalz in der wässrigen Polysaccharid-Zusammensetzung von Stufe a), um eine Lösung eines Polysaccharidgels zu erhalten, in der das Polysaccharidgel eine Konzentration von 0,1–5,0 Gew.-% an Chitosan oder an einem Chitosanderivat und eine Konzentration von 1,0–20 Gew.-% eines Salzes eines Polyols oder eines Zuckers besitzt und einen pH-Wert von 6,4–7,4 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, das nach der Stufe b) weiterhin eine Stufe c) aufweist: c) Erhitzen der Lösung des Polysaccharidgels auf eine Verfestigungstemperatur von 20–80°C, bis ein Polysaccharidgel gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem ein pharmazeutisches Agenz zu der Lösung des Polysaccharidgels von Stufe b) hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, das nach der Stufe b) weiterhin eine Stufe i) aufweist: i) Dispensieren der Lösung des Polysaccharidgels zur Gelierung in einer gewünschten Aufnahme, entweder in einer Form oder innerhalb eines Gewebes, eines Organs oder einer Körperhöhle.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem die wässrige, saure Lösung hergestellt wird aus organischen oder anorganischen Säuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Essigsäure, Ascorbinsäure, Salicylsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Propionsäure, Ameisensäure und einer Mischung davon.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-Phosphatsalz von Glycerol ist, wobei das Glycerol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend Glycerol-2-phosphat-, sn-Glycerol-3-phospat- und L-Glycerol-3-phophatsalzen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Glycerophophatsalz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dinatriumglycerophosphat, Dikalium-glycerophosphat, Calcium-glycerophosphat, Barium-glycerophosphat und Strontium-glycerophosphat.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-Phosphatsalz eines Polyols ist und das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Histidinol, Acetol, Diethylstilbestrol, Indolglycerol, Sorbitol, Ribit, Xylitol, Arabinitol, Erythritol, Inositol, Mannitol, Glucitol und einer Mischung davon.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-Phosphatsalz eines Zuckers ist und der Zucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fructose, Galactose, Ribose, Glucose, Xylose, Rhamnulose, Sorbose, Erythrulose, Deoxyribose, Ketose, Mannose, Arabinose, Fuculose, Fructopyranose, Ketoglucose, Sedoheptulose, Trehalose, Tagatose, Sucrose, Allose, Threose, Xylose, Hexose, Methylthio-ribose, Methyl-deoxy-ribulose und einer Mischung davon.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-phosphatsalz eines Polyols ist und das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Palmitoyl-glycerol, Linoleoyl-glycerol, Arachidonoyl-glycerol und einer Mischung davon.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Salz ein dibasisches Mono-Phosphatsalz ist und das Phosphat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dinatriumphosphat, Dikaliumphosphat, Calciumphosphat, Bariumphosphat und Strontiumphosphat.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Lösung des Polysaccharidgels in stabiler ungelierter flüssiger Form bei einer Temperatur von 0°C–20°C gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Verfestigungstemperatur bei 37°C–60°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Verfestigungstemperatur bei etwa 37°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Molekulargewicht des Chitosans von 10.000–2.000.000 reicht.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem das Polysaccharidgel durch Einstellen des pH-Werts des Polysaccharidgels thermoirreversibel oder thermoreversibel ist.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Polysaccharidgel thermoirreversibel ist, wenn der pH-Wert der Lösung des Polysaccharidgels > 6,9 ist.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Polysaccharidgel thermoreversibel ist, wenn der pH-Wert der Lösung des Polysaccharidgels < 6,9 ist.
Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, bei dem die festpartikulären Additive zu der Lösung des Polysaccharidgels von Stufe b) hinzugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Lösung des Polysaccharidgels durch Injektion oder endoskopische Verabreichung in einen Tierkörper oder in einen Humankörper eingeführt wird und in situ bei einer Temperatur von etwa 37°C geliert wird.
Verwendung des Polysaccharidgels nach Anspruch 1 zur Herstellung biokompatibler abbaubarer Materialien zur Verwendung in Kosmetika, in der Pharmakologie, in der Medizin und/oder in der Chirurgie.
Verwendung nach Anspruch 32, bei dem das Gel als Ganzes oder als eine Komponente in implantierbare Vorrichtungen oder in Implantate zur Verwendung bei der Wiederherstellung, der Rekonstruktion und/oder dem Ersatz von Geweben und/oder Organen entweder bei Tieren oder bei Menschen inkorporiert wird.
Verwendung nach Anspruch 32, bei dem das Gel als Ganzes oder als eine Komponente von implantierbaren, transdermalen oder dermatologischen Wirkstoffabgabesystemen eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 32, bei dem das Gel als Ganzes oder als eine Komponente von ophthamologischen Implantaten oder Wirkstoffabgabesystemen eingesetzt wird.
Verwendung des Gels nach Anspruch 32 zur Herstellung von zellbeladenen künstlichen Matrizen zur Anwendung für das Engineering und die Kultur von bioenginierten Hybridmaterialien und Gewebeäquivalenten.
Verwendung nach Anspruch 36, bei dem die beladenen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Chondrocyten (Gelenkknorpel), Fibrochondrocyten (Meniskus), Ligamentfibroblasten (Ligament), Hautfibroblasten (Haut), Tenocyten (Sehnen), Myofibroblasten (Muskel), mesenchymalen Stammzellen und Keratinocyten (Haut).
Verwendung nach Anspruch 37, bei dem das zellbeladene Gel und die abgeleiteten Produkte für die Kultur und das Engineering von künstlichem Gelenkknorpel und Knorpelgeweben und -Organen, entweder für chirurgische oder Labortestanwendungen bestimmt sind.
Verwendung nach Anspruch 37, bei dem das zellbeladene Gel und die abgeleiteten Produkte für die Verarbeitung und das Engineering von lebenden, künstlichen Substituten für Ligamente, Sehnen, Haut, Knochenmuskeln und jeglichen metabolischen Organen, entweder für chirurgische oder für Labortestanwendungen, bestimmt sind.
Verwendung nach Anspruch 37, bei dem das zellbeladene Gel und die abgeleiteten Produkte zur Anwendung als lebende Substitute zum Ersatz von Gelenkknorpeln, Fibroknorpeln, kartilaginären Organen, Ligamenten, Sehnen, Knochengeweben oder Haut dienen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 38–40, bei dem das zellbeladene Hydrogel für die Gelierung in situ zur Induzierung einer ektopischen Bildung von fibroknorpelähnlichen oder knorpelähnlichen Geweben bestimmt ist.
Verwendung des in einem der Ansprüche 1–6 beschriebenen beladenen Polysaccharidgels zur Verwendung als injizierbare oder implantierbare Gel-biomaterialien, die als Halter, Träger, wiederherstellende Vorrichtungen oder Substitute für die In-situ-Bildung von knochenähnlichen, fibroknorpelähnlichen oder knorpelähnlichen Geweben an einer physiologischen Stelle eines Tieres oder eines Menschen wirken.
Verfahren zur Herstellung der Lösung des Polysaccharidgels, die nach Anspruch 12 erhältlich ist, zur Herstellung eines abgeleiteten Gels oder eines Hydrogels, in dem 1) mindestens ein komplementäres Polymer in die Lösung des Polysaccharidgels eingeführt oder dort gelöst wird und 2) zugelassen wird, dass das Polysaccharid und das komplementäre Polymer für eine so große Zeitspanne bei einer Temperatur von 20°C–60°C aufeinander wechselwirken, dass ein klares dreidimensionales Gel erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 43, bei dem das komplementäre Polymer ein nicht-ionisches wasserlösliches Polysaccharid oder eine Hydroxyalkylcellulose ist.