CN110935008B - 一种关节腔注射治疗骨关节炎的tn14003温敏型凝胶及其制备方法 - Google Patents
一种关节腔注射治疗骨关节炎的tn14003温敏型凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶及其制备方法,属于骨关节炎治疗技术领域。该方法首先将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,得到壳聚糖溶液;再将β‑甘油磷酸钠以PBS液溶解,得到β‑甘油磷酸钠溶液;在冰浴下,将β‑甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到壳聚糖溶液中,充分搅拌均匀,并采用NaOH调节pH,得到壳聚糖/β‑甘油磷酸钠溶液;将TN14003粉末添加到壳聚糖/β‑甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β‑甘油磷酸钠混合液。本发明方法制备的温敏型凝胶内部可形成稳定、均匀的三维网络空间结构,TN14003可均匀分布在网络结构的孔洞内,可长效、恒定释放药物,满足了单次注射后可长效维持治疗作用的效果。
Description
技术领域
本发明属于骨关节炎治疗技术领域,具体涉及一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶及其制备方法。
背景技术
近年来,随着世界人口老龄化加速及体育运动兴盛,导致全身关节尤其是膝关节骨关节炎发病率日益剧增。膝关节骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一类以软骨退变伴随滑膜组织炎症为主要特征的慢性退变性疾病。由于发病原因的复杂及软骨退变的不可逆性,膝关节OA的治疗一直充满挑战。
传统的给药途径有口服非甾体类消炎镇痛药或关节腔注射透明质酸钠及糖皮质激素等。口服给药常经过胃肠代谢,且由于“首过效应”的影响,使得药物到达靶器官处已难以维持治疗所需浓度。而关节腔注射透明质酸钠或糖皮质激素往往单次应用后不能达到治疗剂量,需要反复多次给药,给患者带来沉重的精神、生理创伤及经济负担;同时传统的关节腔注射药物并不能起到抑制关节软骨退变的作用。因此,OA一旦发生,传统的给药方式已难以逆转,仅仅在于缓解临床症状。
我们前期实验研究表明,基质细胞衍生因子1(SDF-1)/趋化因子受体4(CXCR4)信号通路启动后能介导关节软骨退变,启动及加速OA发展。TN14003为高效的CXCR4拮抗剂,可靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路形成,抑制软骨细胞分泌基质金属蛋白酶并延缓软骨细胞外基质降解,可有效延缓关节软骨退变,我们前期的动物实验是在Duncan-Hartley豚鼠背部置入皮下泵将TN14003长期泵入体内起到治疗OA的作用。该方法虽然证实了TN14003的良好效果,但这种皮下泵入的方式不适用于临床应用及推广,且单次给药不能满足OA治疗的需求,而反复给药除了加剧患者经济及精神、生理负担外,成倍积累的药物毒副作用也限制了该药的推广应用。目前,TN14003的应用是将其溶于PBS液后体内给药,该制备药物方式单一,药物在动物体内衰退较快,需反复多次给药才能达到药物治疗效果。但成倍给药给动物带来的损伤往往难以估计,阻碍该药物的临床推广。因此如何克服现有技术的不足是目前骨关节炎治疗技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对当前膝关节OA传统给药途径不能满足长效治疗作用的不足,提供一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶及其制备方法,该TN14003温敏型凝胶为一种关节腔注射缓释制剂,能为临床获得安全、高效的关节腔内靶向递药系统。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,包括如下步骤:
步骤(1),将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,得到壳聚糖溶液;
步骤(2),将β-甘油磷酸钠以PBS液溶解,得到β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(3),在冰浴下,将步骤(2)得到的β-甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到的壳聚糖溶液中,充分搅拌均匀,并采用NaOH调节pH,得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(4),将TN14003添加到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液。
进一步,优选的是,TN14003的添加量为0.8-1.2mg/ml。
进一步,优选的是,TN14003的添加量为1mg/ml。
在使用时,按照实际应用目标的需要接受的药量对添加量做相应的调整。
进一步,优选的是,所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2-2.4%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为55-57%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为4.5-5.5:1,采用0.018-0.022mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。
进一步,优选的是,所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.2%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为56%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为5:1,采用0.02mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。
进一步,优选的是,所述的TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液在37℃下形成TN14003温敏型凝胶。
本发明同时提供上述关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法制得的TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液。
本发明同时提供上述关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法制得的TN14003温敏型凝胶。
本发明为获得单次药物注射后发挥长效治疗作用,最大化降低药物毒副作用,本申请发明以壳聚糖及β-甘油磷酸钠为原料制备了具有温度敏感效应的可供关节腔注射的TN14003凝胶,结果发现,该凝胶在室温下为液态,便于注射操作,当注射到动物体内且温度升高至37℃时液态可迅速转变为半固体凝胶状。经扫描电镜观察后发现该凝胶内部形成了具有均匀孔隙且相互连接紧密而有序的三维网络结构,TN14003均匀地分布在各个孔隙内,经体外缓释实验表明制备的凝胶可长效、恒定释放TN14003。将携载TN14003的凝胶溶液关节腔注射到滇南小耳猪膝关节中,结果发现TN14003温敏型凝胶较单独TN14003注射具有更好的延缓关节软骨退变及抑制滑膜组织炎症的效果,且作用时间更长。
本发明与现有技术相比,其有益效果为:
1.本方法基于壳聚糖与β-甘油磷酸钠制备具有温度敏感特性的凝胶制剂,该制剂在室温下为液态,便于注射,注射到动物体内37℃环境下可迅速转变为半固体凝胶状,发挥缓释药效的同时还能避免药物浓度过高引起毒性反应。
2.本方法可将TN14003携载于凝胶内注射到关节腔,既保持TN14003抑制软骨退变的作用,又能发挥壳聚糖凝胶本身发挥润滑关节的效果。
3.本方法制备的温敏型凝胶内部可形成稳定、均匀的三维网络空间结构,TN14003可均匀分布在网络结构的孔洞内,可长效、恒定释放药物,满足了单次注射后可长效维持治疗作用的效果。
本研究结果皆表明在相同时间内TN14003温敏型凝胶较单独使用TN14003具有更好的抑制软骨退变及抑制滑膜炎症效果;同时TN14003温敏型凝胶较单独使用TN14003具有更长的作用时效。
附图说明
图1空白凝胶电镜图像;
图2携载TN14003后的凝胶电镜图像;
图3TN14003在温敏型凝胶及PBS液内的释放曲线;
图4TN14003温敏型凝胶注射前后注射部位未见异常变化;其中,A为注射前;B为注射后;
图5膝关节腔大体观察;
其中,A1:1月A组,B1:1月B组,C1:1月C组,D1:1月D组,A2:2月A组,B2:2月B组,C2:2月C组,D2:2月D组,A3:3月A组,B3:3月B组,C3:3月C组,D3:3月D组
图6膝关节软骨HE染色;
其中,A1:1月A组,B1:1月B组,C1:1月C组,D1:1月D组,A2:2月A组,B2:2月B组,C2:2月C组,D2:2月D组,A3:3月A组,B3:3月B组,C3:3月C组,D3:3月D组
图7膝关节软骨番红O染色;
其中,A1:1月A组,B1:1月B组,C1:1月C组,D1:1月D组,A2:2月A组,B2:2月B组,C2:2月C组,D2:2月D组,A3:3月A组,B3:3月B组,C3:3月C组,D3:3月D组;
图8膝关节软骨ColⅡ免疫组化染色;
其中,A1:1月A组,B1:1月B组,C1:1月C组,D1:1月D组,A2:2月A组,B2:2月B组,C2:2月C组,D2:2月D组,A3:3月A组,B3:3月B组,C3:3月C组,D3:3月D组;
图9四组滑膜组织内SDF-1含量;
图10四组滑膜组织内IL-1β含量;
图11四组软骨内MMP-3 mRNA含量;
图12四组软骨内MMP-13 mRNA含量;
图13四组软骨内ColⅡ mRNA含量;
图14四组软骨内ACAN mRNA含量;
图15四组软骨内ColⅡ蛋白含量电泳图;
图16四组软骨内ColⅡ蛋白含量直方图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者,均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,包括如下步骤:
步骤(1),将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,得到壳聚糖溶液;
步骤(2),将β-甘油磷酸钠以PBS液溶解,得到β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(3),在冰浴下,将步骤(2)得到的β-甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到的壳聚糖溶液中,充分搅拌均匀,并采用NaOH调节pH,得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(4),将TN14003添加到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液。
TN14003的添加量为1.2mg/ml。
所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.4%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为57%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为5.5:1,采用0.018-0.022mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。
所述的TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液在37℃下形成TN14003温敏型凝胶。
实施例2
一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,包括如下步骤:
步骤(1),将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,得到壳聚糖溶液;
步骤(2),将β-甘油磷酸钠以PBS液溶解,得到β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(3),在冰浴下,将步骤(2)得到的β-甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到的壳聚糖溶液中,充分搅拌均匀,并采用NaOH调节pH,得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(4),将TN14003添加到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液。
TN14003的添加量为0.8mg/ml。
所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为55%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为4.5:1,采用0.018mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。
所述的TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液在37℃下形成TN14003温敏型凝胶。
实施例3
一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,包括如下步骤:
步骤(1),将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,得到壳聚糖溶液;
步骤(2),将β-甘油磷酸钠以PBS液溶解,得到β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(3),在冰浴下,将步骤(2)得到的β-甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到的壳聚糖溶液中,充分搅拌均匀,并采用NaOH调节pH,得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(4),将TN14003添加到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液。
TN14003的添加量为1mg/ml。
所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.2%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为56%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为5:1,采用0.02mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。
所述的TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液在37℃下形成TN14003温敏型凝胶。
应用实例
(1)原料的准备
壳聚糖(壳聚糖,美国Sigma-Aldrich);β-甘油磷酸钠(β-甘油磷酸钠,美国Sigma-Aldrich);TN14003冻干粉(北京中科亚光生物科技有限公司)、磷酸盐缓冲液(美国Hyclone)、盐酸(烟台三和化学试剂有限公司)、氢氧化钠(烟台三和化学试剂有限公司)。
(2)温敏型凝胶配制
天平称取适量壳聚糖粉末并以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,获得壳聚糖溶液。称取适量的β-甘油磷酸钠粉末并以PBS液溶解后获得β-甘油磷酸钠溶液。在冰浴下将β-甘油磷酸钠溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中充分搅拌均匀后即制备成为空白温敏型凝胶溶液。
(3)温敏型凝胶初始胶凝温度测定
取2ml制备好的空白温敏型凝胶溶液加入到5ml EP管内并放入初始温度为20℃的恒温水浴箱,保持EP管下部装有凝胶溶液的部分低于水面至少2cm,每隔5min上调水浴箱温度1℃,观察EP管内空白凝胶溶液相变情况。使用倒置法确定溶液转变为凝胶,即将EP管倒置于桌面至少10min,当溶液不再流动说明空白凝胶溶液完全转变为凝胶,此时水浴箱内的温度即胶凝所需最低温度。
(4)影响成胶温度的因素观察
①pH值对成胶温度的影响
取质量浓度为2.0%的壳聚糖溶液,以壳聚糖与β-甘油磷酸钠体积比为7:1的比例滴入的β-甘油磷酸钠溶液,冰浴条件下充分搅拌后制备成为空白温敏型凝胶溶液,分为6份,每份均2ml。使用氢氧化钠调节每份凝胶溶液的pH值,使其pH值分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6。将6份凝胶溶液置入水浴锅内,观察凝胶形成情况及记录成胶温度,实验重复3次。结果发现当体系内pH值调节为6.6及6.8时,观察不到溶液成胶:当pH值上升到7.0时,溶液可转变为凝胶,成胶温度为37.6℃;当pH值调节为7.2时,溶液的成胶温度为37.2℃;当pH值升至7.4时,32℃时便转变为凝胶;pH值再次上调至7.6时,溶液不成胶,而直接出现白色絮状沉淀(见表1)。
表1 pH值对成胶温度的影响
pH值 | 6.6 | 6.8 | 7.0 | 7.2 | 7.4 | 7.6 |
成胶温度/℃ | 不成胶 | 不成胶 | 37.6 | 37.2 | 32.0 | 沉淀 |
②壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例对成胶温度的影响
取浓度为2.2%的壳聚糖溶液5份,分别滴加不同比例的质量浓度为56%β-甘油磷酸钠溶液,使每份混合液内壳聚糖与β-甘油磷酸钠体积比分别为8:1、7:1、6:1、5:1、4:1,NaOH调节混合液pH为7.0,在冰浴条件下充分搅拌后,将5份混合液置入恒温水浴箱内,观察凝胶形成情况及成胶温度,实验重复3次。结果发现当壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例为8:1时,成胶温度为34.5℃,溶液内杂质较多,且溶液较粘稠;当壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例为7:1时,成胶温度为35℃;当壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例为6:1时,成胶温度为36.8℃;当壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例为5:1时,成胶温度为37.3℃;当壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例为4:1时,成胶温度为44℃,说明壳聚糖与β-甘油磷酸钠最佳比例为5:1(见表2)。
表2壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例对成胶温度的影响
壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例 | 8:1 | 7:1 | 6:1 | 5:1 | 4:1 |
成胶温度/℃ | 34.5 | 35 | 36.8 | 37.3 | 44 |
③壳聚糖浓度对成胶温度的影响
分别称取180mg、200mg、220mg、240mg的壳聚糖粉末,加入一定量0.1mol/L的稀盐酸配制为浓度为1.8%、2.0%、2.2%、2.4%的壳聚糖溶液,在各自壳聚糖溶液内分别加入相同比例的质量浓度为56%β-甘油磷酸钠溶液,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为5:1,用NaOH将pH值调节为7.0,将各组混合液在冰浴条件下充分搅拌均匀后,置入恒温水浴箱内,观察凝胶形成情况及记录成胶温度,实验重复3次。结果发现当壳聚糖浓度为1.8%时,溶液较稀疏,体系不形成凝胶;当壳聚糖浓度为2.0%时,溶液在37.5℃时转变为凝胶;当壳聚糖浓度为2.2%时,溶液在37℃时成胶;当壳聚糖浓度为2.4%时,溶液在35℃时可形成凝胶,但溶液过于粘稠,流动性较差,表明壳聚糖的最佳浓度为2.2%时,溶液在37℃时成胶(见表3)。
表3壳聚糖浓度对成胶温度的影响
壳聚糖浓度/% | 1.8 | 2.0 | 2.2 | 2.4 |
成胶温度/℃ | 不成胶 | 37.5 | 37.0 | 35.0 |
(5)正交设计优化壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型凝胶制备方法
为了更加科学、准确地反映各种因素对凝胶成胶的影响及制备出更稳定的温度敏感型凝胶,我们采用正交实验对各影响因素进行筛选,以优化凝胶制备的方法。本实验期望制备出关节腔内注射后可在接近体温(37℃)的温度条件下凝胶形成的复合凝胶制剂,因此我们以37℃为预期标准温度对正交实验结果进行筛选,结果各个因素水平极值偏离37℃越小越优先选取。按照正交设计的原则考察pH值、壳聚糖与β-甘油磷酸钠比例及壳聚糖浓度对凝胶溶液成胶特性的影响。每个因素选3个水平,按照正交实验表L9(33)核对安排实验,每个处方各做3次实验,以成胶温度为评价指标,因素水平见表4。从正交分析结果中可看到,本实验三个因素的R值排列顺序为C>A>B,说明壳聚糖浓度对37℃凝胶形成影响最大。而各因素水平分析结果为:A1>A2>A3;B:B3>B2>B1;C:C2>C1>C3,表明最佳制备处方为A1B3C2,即pH值为7.0,壳聚糖与β-甘油磷酸钠体积比为5:1,壳聚糖浓度为2.2%(表5)。
表4成胶影响因素
表5正交实验结果
(5)TN14003温敏型凝胶结构特征
以优化后的方法配制壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液在37℃下形成空白温敏凝胶,将TN14003粉末添加到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液在37℃下形成空白温敏凝胶获得载药温敏凝胶,将两组凝胶样本置于液氮中冷冻5min;将预冻好的两组样本装入5ml离心管内,并以锡箔纸覆盖管口;在覆盖管口的锡箔纸表面打几个小孔后将离心管放于超低温冷冻干燥机内冻干48h;取出冻干后的样本,将其切成小块后用导电胶粘到扫描支架上;对样本小块真空喷金300s后放于电子显微镜下观察凝胶内部结构。扫描电镜显示无论空白凝胶还是载药凝胶都具有稳定的网络构架,孔隙排列均匀、规则。扫描电镜可见携载药物后并未影响凝胶的网络结构,能看到药物均匀分布于孔洞内,为药物在凝胶内缓慢释放提供了可能(见图1、图2)。
(6)TN14003凝胶体外缓释性能①TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶制备:以最佳工艺条件制备TN14003温敏型凝胶溶液(TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液,TN14003的浓度为1mg/ml),将其充分混匀后备用;
②TN14003溶液制备:室温下将1mgTN14003冻干粉溶解于PBS液内备用,制备成为1mg/ml TN14003纯溶液。
③分别将TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液及TN14003纯溶液注入透析袋中,透析袋封口;
④将透析袋置入装有25ml PBS液的恒温振荡器内,调整温度至37℃,观察待TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液成胶后以60r/min转速匀速振荡;
⑤分别于第1至14天内每天定点取5ml PBS液,同时补充相应溶剂的PB S液(每批样本取3个样,即实验重复3次);
⑥收集所有取出的溶出介质过0.45μm水系滤器后转入液相瓶内备HPLC检测用;
⑦样品手收集完毕后,使用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测溶出介质内TN14003的浓度并计算不同时间点两组样品内TN14003的累计释放率(表6);HPLC条件见表7。
色谱参数
柱子: thermo synchronis 250*4.6mm,4.6um
流动相: A:0.05%三氟乙酸,2%乙腈
B:0.05%三氟乙酸,90%乙腈
流速: 1ml/min
柱温: 25℃
分析时间: 20min
洗脱模式: 梯度
流动相配制
(1)A相:分别量取250μL三氟乙酸、10mL色谱级乙腈于500mL容量瓶中,用超纯水定容至刻度线,摇晃后充分混匀。将配制好的溶液经0.22μm滤器过滤后转移至500mL无菌蓝盖瓶内,在超声仪内以35000HZ、100%功率、20℃下超声30min后使用;
(2)B相:分别量取250μl三氟乙酸、450mL色谱级乙腈于500mL容量瓶中,用超纯水定容至刻度线,摇晃后充分混匀。将配制好的溶液经0.22μm滤器过滤后转移至500mL无菌蓝盖瓶内,超声仪内以35000HZ、100%功率、20℃下超声30min后使用;
表6壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶及TN14003纯溶液对TN14003的累积释放率
表7 HPLC设置条件
⑧绘制时间-药物释放率曲线,对壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶内及单纯药物溶液相同时间释放的TN14003含量进行比较,平行实验重复三次。
实验结果发现壳聚糖/β-甘油磷酸钠组的TN14003仅在24h释放相对较快,释放了17%,随后便进入缓慢释放期,直到第14天才释放70%,之后便缓慢进入平台期;而TN14003纯溶液组在24h便释放到40%,随后第2、3、4天则分别释放了50%、62%及81%,之后进入平台期,释放曲线见图3。
(7)TN14003温敏型凝胶关节腔注射抑制滇南小耳猪膝关节软骨退变研究
①选取36只经前期造模建立的右膝关节骨关节炎成年滇南小耳猪作为研究对象。将猪平均分为A、B、C、D四组:TN14003温敏型凝胶组(A组)、TN14003组(B组)、空白凝胶组(C组)及空白对照(D组)。TN14003凝胶组给予右膝关节腔注射2ml TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液,TN14003组给予右膝关节腔注射2ml TN14003溶液,空白凝胶组给予2ml壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液,空白对照组不给予任何处理,各组常规饲养。
②每组进行相应处理后观察猪的全身情况,包括精神、饮食、毛色、大小便、活动情况及注射部位局部表现。结果发现所有动物在关节腔注射后精神、饮食、毛色、大小便及活动情况较注射前无明显改变,注射部位未出现明显肿胀、发红、破溃、感染等征象(图4)。
③每组在注射后1月、2月及3月时各时间点随机抽取3只猪处死,暴露膝关节腔并依次观察滑膜充血、水肿情况、股骨髁及胫骨平台颜色、质地,以及软骨表面有无粗糙、划痕或缺损。结果发现A组及B组注射后1月关节腔内无明显滑膜充血表现,股骨髁表面光滑,无明显软骨退变及损伤表现;注射后2月,A组软骨平滑,无明显滑膜充血表现,而B组股骨髁软骨表面虽无明显退变及损伤表现,但软骨周围覆盖大量充血滑膜组织;注射后3月时A组软骨依旧保持平滑,仅颜色部分变暗,提示轻度退变,而B组股骨髁软骨颜色变暗,滑车沟表面软骨明显破坏。C组注射后1月时关节腔内未见明显充血的滑膜组织,股骨内外髁无明显破坏,股骨滑车沟表面软骨颜色变暗;注射后2月时股骨髁及滑车沟软骨表面有少量充血滑膜覆盖,滑车沟表面有轻度软骨破坏,但股骨髁软骨无明显改变;注射后3月时可见充血滑膜组织覆盖于软骨表面,股骨内外髁及滑车沟表面可见部分软骨颜色变暗及划痕。D组注射后1月时滑膜组织充血,股骨内髁负重面软骨表层部分缺失,软骨下骨未完全暴露;注射后2月时滑膜充血,除股骨内髁负重面明显软骨缺损外,股骨滑车沟也可见软骨缺失;注射后3月时股骨内外髁及股骨滑车沟皆可见大面积软骨破坏,软骨下骨外露,充血的滑膜爬行覆盖在股骨髁及滑车沟表面(图5)。
④分别在饲养至注射后1月、2月及3月时,每个组在每个时间点随机抽取3只猪,采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射处死,同法暴露膝关节腔后取股骨内髁及内侧胫骨平台负重面软骨组织(包含表层软骨及部分软骨下骨),放入4%多聚甲醛中保存以进行组织学染色(HE染色、番红O染色及ColⅡ免疫组化染色)。
1.HE染色结果发现:A组与B组注射后1月时软骨表面光滑,细胞排列正常,染色均匀,潮线完整,软骨下骨结构正常;注射后2月时A组软骨表面依旧光滑,细胞排列整齐,染色均匀,B组软骨表面轻度粗糙,细胞数量增加,染色不均匀,排列稍紊乱;注射后3月时A组软骨表面轻度粗糙,细胞数量增加,潮线及软骨下骨完整,B组软骨表面明显粗糙,细胞数量减少。C组注射后1月时软骨表面光滑,细胞排列正常,染色均匀,潮线完整,软骨下骨结构正常;注射后2月时软骨表面粗糙,细胞数量增加,染色不均匀,排列稍紊乱;注射后3月时软骨表面部分缺失,细胞数量减少,潮线不完整。D组1月软骨表面轻度粗糙,软骨细胞排列相对正常,染色均匀,潮线完整,软骨下骨结构正常;2月时软骨表面粗糙,细胞排列紊乱,染色不均匀,细胞数量增加,潮线完整,软骨下骨结构正常;注射后3月时软骨表面大面积缺损,软骨细胞数量明显减少,潮线破坏,软骨下骨外露(图6)。
2.番红O染色显示:A组与B组注射后1月时软骨对番红亲和较高,软骨表面光滑,细胞排列正常;注射后2月时A组软骨表面依旧光滑,对番红亲和力高,细胞排列整齐,而B组软骨表面轻度粗糙,对番红亲和力降低,细胞数量增加,排列稍紊乱;注射后3月时A组软骨表面轻度粗糙,对番红亲和力仍高,细胞数量增加,B组软骨表面明显粗糙,对番红亲和力稍降低,细胞数量减少。C组注射后1月时软骨对番红亲和力较高,表面光滑,软骨细胞排列正常;注射后2月时软骨表面粗糙,对番红亲和力降低,软骨细胞数量增加,排列稍紊乱;注射后3月时软骨对番红亲和力明显降低,软骨表面部分缺失,细胞数量减少。D组1月时软骨对番红亲和力高,软骨表面轻度粗糙,软骨细胞排列相对正常;2月时软骨对番红亲和力稍降低,软骨表面粗糙,细胞排列紊乱,细胞数量增加;3月时软骨对番红亲和力明显降低,软骨表面明显缺损,软骨细胞数量显著减少(图7)。
3.ColⅡ免疫组化染色结果发现:注射后1月时A、B、C组软骨表面光滑,A、B组ColⅡ染色明显较其它两组深,D组软骨表面轻度粗糙。注射后2月时A、B两组ColⅡ染色仍较深,而C、D组软骨表面粗糙,ColⅡ染色变淡。注射后3月时,A组软骨表面轻度粗糙,ColⅡ染色在四组中最深,B组软骨表面粗糙,ColⅡ染色较2月时明显减弱,C组软骨表面更加粗糙,而D组软骨表面出现明显缺损,C、D两组ColⅡ染色进一步减弱。
⑤分别在饲养至注射后1月、2月及3月时,每个组每个时间点随机抽取3只猪,切取下股骨内髁周围的滑膜组织,ELSIA实验检测IL-1β及SDF-1含量,结果发现:
1.随着时间增加,四组滑膜组织内SDF-1含量均发生变化。A组与B组SDF-1含量随时间增加逐渐下降;到3月时都降到最低,此时A组内SDF-1含量在四组中最低。C组与D组内SDF-1含量都随时间增加逐渐增加,到3月含量达最高,此时D组SDF-1含量在四组内最高;
2.随观察时间延长,四组滑膜组织内IL-1β含量均发生变化。A组与B组内IL-1β含量随时间增加逐渐下降,第3月时A组内IL-1β含量在四组中最低。C组与D组内IL-1β含量随时间延长逐渐增加,3月时含量上升至最高,此时D组IL-1β含量在四组内最高(图8)。
⑥分别在饲养至注射后1月、2月及3月时,每个组在每个时间点随机抽取3只猪,采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射处死,取关节软骨周围滑膜组织ELISA检测SDF-1及IL-1β含量后发现:
1.随着时间增加,四组滑膜组织内SDF-1含量均发生变化。空白组及空白凝胶组SDF-1含量都随时间增加逐渐增加,到3月含量达最高,此时空白组SDF-1含量在四组内最高;TN4003组及TN4003凝胶组SDF-1含量随时间增加逐渐下降;到3月时都降到最低,而TN14003凝胶组内SDF-1含量在四组中最低(图9);
2.随观察时间增加,四组滑膜组织内IL-1β含量均发生变化。空白组及空白凝胶组IL-1β含量随时间增加逐渐增加,3月时含量上升至最高,而空白组IL-1β含量在四组内最高。TN4003组及TN4003凝胶组IL-1β含量随时间增加逐渐下降,第3月时,TN14003凝胶组内IL-1β含量在四组中最低(图10);
⑥分别在饲养至注射后1月、2月及3月时,每个组在每个时间点随机抽取3只猪,采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射处死,同法暴露膝关节腔后取股骨内髁及内侧胫骨平台表层软骨并分为两组,一组放入放入干燥管内用于后续western blot检测,一组置于RNAstore保存液中用于后续qRT-PCR检测。结果发现:
1.随时间延长,A组与B组内MMP-3mRNA含量逐渐减少,3月时降至最低,此时两组比较无明显差异(P>0.05)。C组与D组内MMP-3mRNA含量逐渐上升,3月时升至最高,此时两组间无明显差异(P>0.05)(图11);
2.随时间延长,A组与B组内MMP-13mRNA含量逐渐下降,3月时达最低,此时A组内MMP-13mRNA含量在四组内最低(P<0.05)。C组与D组MMP-13mRNA含量逐渐增加,到3月时升至最高,此时两组内MMP-13mRNA含量比较无差异(P>0.05)(图12);
3.随时间延长,A组与B组内ColⅡ mRNA含量则逐渐增加,3月时含量最高,此时,A组内ColⅡ mRNA含量在四组内最高(P<0.05)。C组与D组内ColⅡ mRNA含量随时间延长逐渐减少,3月时降至最低,此时D组内ColⅡ mRNA含量在四组内最低(图13);
4.随观察时间延长,A组与B组内ACAN mRNA含量则逐渐增加,3月时上升至最高,此时A组内ACAN mRNA含量在四组内最高(P<0.05)。C组与D组内ACAN mRNA含量逐渐降低,3月时降至最低,此时C组内ACAN mRNA含量在四组内最低(P<0.05)(图14);
5.随观察时间延长,A组与B组内ColⅡ蛋白含量逐渐增加,3月时上升至最高,其中A组内ColⅡ蛋白含量在四组内最高(P<0.05)。C组与D组ColⅡ蛋白含量逐渐减少,3月时降至最低,其中D组含量在四组中最低(P<0.05)(图15、16)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤(1),将壳聚糖以0.1mol/L的稀盐酸充分搅拌溶解,得到壳聚糖溶液;
步骤(2),将β-甘油磷酸钠以PBS液溶解,得到β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(3),在冰浴下,将步骤(2)得到的β-甘油磷酸钠溶液逐滴滴加到步骤(1)得到的壳聚糖溶液中,充分搅拌均匀,并采用NaOH调节pH,得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液;
步骤(4),将TN14003添加到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液中搅拌均匀后得到TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液;
TN14003的添加量为0.8-1.2mg/ml;
所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2-2.4%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为55-57%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为4.5-5.5:1,采用0.018-0.022 mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0;
该凝胶在室温下为液态,当进入到体内且温度升高至37℃时液态迅速转变为半固体凝胶状。
2.根据权利要求1所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,其特征在于,TN14003的添加量为1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,其特征在于,所述的壳聚糖溶液的质量浓度为2.2%,β-甘油磷酸钠溶液质量浓度为56%,壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液体积比为5:1,采用0.02 mol/l的NaOH溶液调节pH至7.0。
4.根据权利要求1所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法,其特征在于,所述的TN14003壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液在37℃下形成TN14003温敏型凝胶。
5.权利要求1~4任意一项所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法制得的TN14003/壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合液。
6.权利要求1-4任一项所述的关节腔注射治疗骨关节炎的TN14003温敏型凝胶的制备方法制得的TN14003温敏型凝胶。
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