CN111481659A - Ⅱ型胶原和透明质酸复合凝胶液及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，其特征在于，该复合凝胶液包括II型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，所述平衡物质包括NaH2PO4‑Na2HPO4体系、Tris‑HCl体系、Tris‑马来酸体系或HEPES体系，以及包括NaCl和/或KCl；该复合凝胶液的pH为6.5‑7.5。本发明还提供了含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的制备方法。本申请提供的复合凝胶液在生理pH值范围内，II型胶原和透明质酸能够以任意比例互溶，而且体系稳定，长时间放置也不会出现沉淀或变性；而且该复合凝胶液的渗透压和张力均适于生理体系。本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的制备方法非常简单，成本低廉，易于大规模生产。

Description

Ⅱ型胶原和透明质酸复合凝胶液及制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种含胶原和透明质酸的复合凝胶液及该复合凝胶液的制备方法，以及该复合凝胶液在制备软骨损伤修复用的药物中的用途。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是世界上最常见的中老年人慢性顽疾，发病率高，且有提早发病的趋势并随年龄增长而增高。引发OA的病因复杂多样，通常采用一 般性的临床处置、药物和手术等疗法，目前尚无有效的临床控制手段。软骨组织主要 成份是丰富的细胞外基质，主要由Ⅱ型胶原形成固态纤维网络，液态的透明质酸 (Hyaluronic acid，HA)填充其间，二相系统形成软骨陷窝，保护生长在其中的软骨 细胞发挥正常的生物学功能。OA病理状态下，大量软骨基质损失，软骨细胞缺乏保 护而失活，表型丢失逐渐形成纤维化软骨，进而丧失关节功能。
临床上最常用的透明质酸钠注射剂于1974年开始作为粘性补充剂，用于临床骨关节炎治疗，具有增加关节液粘稠性、保护关节软骨及润滑等作用，对各类型骨关节 炎及各类骨科术后均有一定的辅助治疗效果，至今仍广泛应用。由于HA仅为软骨 基质的单一成份，作用有限。随后的研究是制备更有效的复合粘性补充剂，其中Ⅱ型 胶原与HA是最理想的仿生软骨基质复合材料。但是，由于这两种物质本身的性质 限制了Ⅱ型胶原与HA复合剂的研究进展：HA在体内以酸的形式存在，而现有提取 方法由于工艺上的限制只能得到HA的盐类产品；胶原与HA二者带相反电荷，在 液体状态下极易形成聚合物而产生沉淀。现有专利与文献报道的方法包括将二者在 使用前分开保存，使用时再混合在一起，如CN201310099817.4所述；但是这种方法 仍然没有解决二者混合时产生沉淀的问题。CN200910041033.X报道采用电化学处理 的方法去除HA中的钠盐，之后再将透析后的HA溶液与胶原溶液混合，从而获得 含有HA溶液与胶原的溶液；但是这种方法耗时长、生产成本高。
关节软骨细胞表型分子调控与关节功能密切相关，在延缓或逆转骨关节炎进程中使软骨组织再生、软骨细胞具备旺盛分泌与活性功能是治疗的关键。软骨缺血、缺 氧的生理组织结构特征使其对损伤的反应与修复严重依赖于局部软骨细胞的应答与 代谢活动。如果仿生粘性补充剂含有具有促进软骨细胞活性的药物或生长因子，这 将更有效促进损伤软骨修复、更有效地防治OA。
发明内容
针对现有技术中存在的主要问题，本发明提供一种II型胶原和透明质酸相溶并保持活性的复合凝胶液，该复合凝胶液制备简单，成本低，体系稳定，能够直接应用
因此，一方面，本发明提供了一种含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，其 特征在于，该复合凝胶液包括II型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，所述平衡物 质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以 及包括NaCl和/或KCl；该复合凝胶液的pH为6.5-7.5。
另一方面，本发明提供了所述复合凝胶液在制备软骨损伤修复用的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了一种制备含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的方法，其中，该方法包括以下步骤：
a.配制平衡物质：向水中加入NaH2PO4-Na2HPO4体系的物质、Tris-HCl体系的 物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；
b.向所述平衡物质中加入Ⅱ型胶原和透明质酸，获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，该复合凝胶液的pH为6.5-7.5。
本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，在生理pH值范围内，II 型胶原和透明质酸能够以任意比例互溶，而且体系稳定，长时间放置也不会出现沉 淀；而且，在优选的实施方式中，该复合凝胶液的渗透压和张力均适于生理体系。
本发明优选实施方式提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液可以直接用于治疗骨关节炎。
本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的制备方法非常简单，成本低廉，易于大规模生产。
附图说明
图1：实施例1制备的II型胶原及Sigma公司提供的II型胶原的SDS-PAGE电 泳图谱；
图2：实施例1制备的II型胶原的特征性吸收峰；
图3A：对比例1制备的混合液的特征性吸收峰；图3B：实施例2制备的凝胶 液与的特征性吸收峰；
图4A：对比例2制备的混合液的特征性吸收峰；图4B：实施例3制备的凝胶 液的特征性吸收峰；
图5A：对比例3制备的混合液的特征性吸收峰；图5B：实施例4制备的凝胶 液的特征性吸收峰；
图6A为对照细胞的形态；图6B为加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝胶液孵 育的细胞形态；图6C为加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝胶液孵育的细胞集落形 态；图6D为加入SAC孵育的细胞形态；图6E为加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合 凝胶液以及SAC孵育的细胞形态；图6F为加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝胶液 以及SAC孵育的细胞集落形态。
图7A：为对照组、添加SAC孵育组、添加CII孵育组以及添加CII和SAC孵育 组的ACAN的mRNA表达；图7B为对照组、添加SAC孵育组、添加CII孵育组 以及添加CII和SAC孵育组的SOX9的mRNA表达；图7C为对照组、添加SAC 孵育组、添加CII孵育组以及添加CII和SAC孵育组的SRC的mRNA表达；图7D 为对照组、添加SAC孵育组、添加CII孵育组以及添加CII和SAC孵育组的MMP- 13的mRNA表达。
具体实施方式
本发明提供了一种含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，其特征在于，该复 合凝胶液包括II型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，所述平衡物质包括NaH2PO4- Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及包括NaCl和/ 或KCl；该复合凝胶液的pH为6.5-7.5。
为了获得等渗，优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。
在本发明提供的复合凝胶液中，II型胶原和透明质酸能够以任意比例互溶，因此，它们的重量比例没有特别的限制。
为了更加接近软骨组织中II型胶原和透明质酸的组成，优选地，II型胶原和透 明质酸的重量比没有为1-10：10-1；更优选为1-5：5-1。
II型胶原和透明质酸的浓度没有特别限制，但为了有效补充II型胶原和透明质酸，优选地，II型胶原的浓度为0.1-8mg/ml，优选为1-5mg/ml；透明质酸的浓度为 0.1-80mg/ml，更优选为0.5-20mg/ml，最优选为1-5mg/ml。
为了提供更接近体内生理体系的复合凝胶液，在本发明的一个优选实施方式中，所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系和NaCl；其中，在所述复合凝胶液中， NaH2PO4的浓度为0.04-0.7重量％、Na2HPO4的浓度为0.1-0.9重量％、NaCl的浓度 为0.3-0.8重量％；优选地，NaH2PO4的浓度为0.08-0.5重量％、NaH2PO4的浓度为 0.3-0.8重量％、NaCl的浓度为0.4-0.5重量％。这种优选的实施方式提供的复合凝 胶液可以直接用于体内，例如用于治疗骨关节炎。
为了进一步提高本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的稳定性，其中，所述平衡物质还含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80中的一种或几种。
在一种优选的实施方式中，所述平衡物质含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；优 选地，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量％，优选为1-5重量％；所述1,3丙二醇的浓 度为0.5-3ml/ml，优选为0.5-2ml/ml；所述吐温80的浓度为0.1-1ml/ml，优选为0.1- 0.5ml/ml。
申请人发现，在本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，平衡物 质不仅能够提供生理环境下的pH值，具有增溶与助溶作用，有助于使II型胶原与 HA以任意比例互溶；同时能有效维持液体等张及渗透压，非常适于生理体系的直接 应用参照。
为了进一步提高修复软骨组织的效果，本申请发明人对大量的中药成分进行了研究，并意外发现丹参提取物加入到上述的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液， 能够在保护、改善软骨细胞生长微环境的同时，具有刺激细胞生理代谢分泌活动，调 控信号通路活性促进软骨细胞再生，从而能进一步提高修复效果。
因此，本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液还含有丹参提取物。
为了进一步提高修复效果，所述丹参提取物中活性成分的含量为50-98重量％，优选为60-90重量％。
为了进一步提高修复效果，所述活性成分的浓度为3-200μg/ml，优选为7-100 μg/ml，更优选为10-50μg/ml。
为了进一步保持丹参有效成分的活性以及使药物进行缓释，所述丹参提取物以微囊的形式存在于所述复合凝胶液中。微囊可以用现有技术制备，优选地，以壳聚 糖、明胶、海藻酸盐及甲基纤维素等水溶性材料为囊材进行包裹制备微囊，其中囊心 为丹参提取物。微囊可以克服丹参水溶性有效成份容易吸潮活性下降的问题，并起 到缓释作用。
优选地，所述丹参提取物为水溶性提取物。
本发明还提供所述的复合凝胶液在制备软骨损伤修复的药物中的用途。
本发明还提供一种用于治疗软骨损伤修复用的药物，该药物包括本发明提供的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液。所述药物根据实际情况需要还可以包括其 它成分，例如抗生素。
本发明还提供所述的复合凝胶液可以作为注射剂，或作为组织工程植入材料使用。
本发明还提供一种制备含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的方法，其中， 该方法包括以下步骤：
a.配制平衡物质：向水中加入NaH2PO4-Na2HPO4体系的物质、Tris-HCl体系的 物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；
b.向所述平衡物质中加入Ⅱ型胶原和透明质酸，获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，该复合凝胶液的pH为6.5-7.5。
优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。
在一种优选的实施方式中，制备的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液中II型胶原和透明质酸的重量比没有特别限制，优选为1-10：10-1；更优选为1-5：5-1。
在一种优选的实施方式中，在制备的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液中，II型胶原的浓度为0.1-8mg/ml，优选为1-5mg/ml；透明质酸的浓度为0.1-80mg/ml， 优选为1-5mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中，所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系和NaCl；并且在制备的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液中，NaH2PO4的浓度为 0.04-0.7重量％、Na2HPO4的浓度为0.1-0.9重量％、NaCl的浓度为0.3-0.8重量％； 优选地，NaH2PO4的浓度为0.08-0.5重量％、NaH2PO4的浓度为0.3-0.8重量％、 NaCl的浓度为0.4-0.5重量％。
在本发明的一个优选实施方式中，所述平衡物质还含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80中的一种或几种。
在一种优选的实施方式中，在制备的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液中，所述平衡物质含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；优选地，所述葡萄糖的浓度为0.1- 10重量％，优选为1-5重量％；所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3ml/ml，优选为0.5- 2ml/ml；所述吐温80的浓度为0.1-1ml/ml，优选为0.1-0.5ml/ml。
在一种优选的实施方式中，本发明的制备含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的方法还包括向步骤b中获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液中加入包裹 丹参提取物的微囊。
所述微囊可以采用本领域已知的技术制备，优选地，采用喷雾干燥法包裹制备 微囊；优选采用壳聚糖为囊材。
II型胶原和透明质酸都可以商购获得。
实施例
实施例1：II型胶原蛋白的制备及物理化学性能检测
1.前处理：从猪关节中切取透明软骨，生理盐水洗涤，75％乙醇脱脂30分 钟，生理盐水洗涤后包封，经Co60消毒。余下步骤在无菌条件下进行。
2.制备高纯度的Ⅱ型胶原溶液：透明软骨中加入适量预冷的0.01M EDTA，于 匀浆机中捣碎，离心收集沉淀，然后用10倍体积的4M、pH 7.5的盐酸胍搅拌过 夜去除蛋白多糖；充分水洗，离心后取沉淀，加入0.5M醋酸酶解液，其中，软骨 与胃蛋白酶的重量比为50:1，此过程在4℃以下进行，搅拌24小时。高速离心收 取上清液为Ⅱ型胶原溶液，沉淀可以重复此步骤继续提取胶原。上清液加入1/10体 积的0.15M EDTA终止酶解。
3.纯化：按体积1:1加入胶原溶液及10％NaCl盐析，静置过夜。离心获取沉 淀，用0.5M醋酸溶解，去离子水中透析至pH 5，得到高纯度的Ⅱ型胶原溶液(6.5 mg/ml以上)。
4.标准对照产品：Sigma II型胶原产品C9301，称取0.6mg，加入0.5M乙酸 120μl缓慢震荡使其溶解，配置成5mg/ml溶液。取10μl加入平衡液中备用。
5.Ⅱ型胶原蛋白质量检测(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录B杂蛋 白检测方法)：采用Tris-甘氨酸不连续分离系统，配制6％分离胶、5％浓缩胶。 取浓度为6.5mg/ml的Ⅱ型胶原溶液及Sigma标准对照液，各10μl，加入90μl双蒸 水稀释后，按比例加入2 xLoading buffer混匀，沸水浴10min；12000xg，5min离 心取上清液15μl进行SDS-PAGE电泳。条件：60V，20min；120V，1h 25min (仪器型号：Bio-Rad，PowerPac Universal)，用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶 进行染色，扫描凝胶成像(Umax，PowerLook，2100XL-USB)，得到高纯度特征 性Ⅱ型胶原条带。图1中左一道为分子量标准物，左二道为本申请制备的II型胶原；右一道为sigma的II型胶原。
6.取2μl样品，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)扫描，波长 200nm-800nm，II型胶原特征峰217、230nm读数分别为1.938和1.504(图2)， 符合II型胶原蛋白特征要求。
上述制备的II型胶原用于制备本申请的复合凝胶液。
实施例2：本申请复合凝胶液的制备(pH 6.5)
a.配制平衡物质(90ml)：在去离子水中加入NaH2PO40.402g，Na2HPO40.474 g，NaCl0.42g，葡萄糖0.1g，1,3丙二醇0.5ml，吐温80 0.1ml，pH 6.5。
b.量取10mg/ml的Ⅱ型胶原液10ml。
c.HA 10mg溶于a配制的平衡物质20ml中，HA浓度2mg/ml。
d.混合步骤a、b、c，获得含有II型胶原和HA的复合凝胶液100ml，该凝胶 液的pH6.5，NaH2PO4的浓度约为0.402重量％；Na2HPO4的浓度约为0.474重量％， NaCl的浓度约为0.42重量％，葡萄糖的浓度约为0.1重量％，1,3丙二醇的浓度为0.5 ml/ml，吐温80的浓度为0.1ml/ml，Ⅱ型胶原的浓度为1mg/ml，HA浓度为0.1 mg/ml。
实施例3：本申请复合凝胶液的制备(pH 7)
a.配制平衡物质(70ml)：在去离子水中加入NaH2PO40.322g，Na2HPO4 0.566 g，NaCl 0.44g，葡萄糖5g，1,3丙二醇1.5ml，吐温80 0.5ml。
b.量取10mg/ml的Ⅱ型胶原液30ml。
c.HA 200mg溶于a配制的平衡液20ml中，HA浓度10mg/ml。
d.混合步骤a、b、c，获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液100ml，该 凝胶液的pH为7，NaH2PO4的浓度约为0.322重量％，Na2HPO4的浓度约为0.566 重量％，NaCl的浓度约为0.44重量％，葡萄糖的浓度约为5重量％，1,3丙二醇的 浓度为1.5ml/ml，吐温80的浓度为0.5ml/ml。透明质酸的浓度为2mg/ml，Ⅱ型胶 原的浓度为3mg/ml。
实施例4：本申请复合凝胶液的制备(pH 7.5)
a.配制平衡物质(50ml)：在去离子水中加入NaH2PO4 0.08g，Na2HPO4 0.849g，NaCl 0.45g，葡萄糖10g，1,3丙二醇3ml，吐温80 1ml，pH 7.5。
b.量取10mg/ml的Ⅱ型胶原液50ml。
c.HA 400mg溶于a配制的平衡液20ml中，HA浓度20mg/ml。
d.混合步骤a、b、c，获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液100ml，该 凝胶液的pH 7.5，NaH2PO4的浓度约为0.08重量％，Na2HPO4的浓度约为0.849重 量％，NaCl的浓度为约0.45重量％，葡萄糖的浓度约为10重量％，1,3丙二醇的浓 度约为3ml/ml，吐温80的浓度为1ml/ml，透明质酸的浓度为4mg/ml，Ⅱ型胶原 的浓度为5mg/ml。
实施例5：本申请复合凝胶液的制备(pH 7)
a.配制平衡物质(70ml)：在去离子水中加入NaH2PO40.322g，Na2HPO4
0.566g，KCl 0.44g。
b.量取10mg/ml的Ⅱ型胶原液30ml。
c.混合步骤a、b、c，获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液100ml，该 凝胶液的pH为7，NaH2PO4的浓度约为0.322重量％，Na2HPO4的浓度约为0.566 重量％，KCl的浓度约为0.44重量％，葡萄糖的浓度约为5重量％，1,3丙二醇的浓 度为1.5ml/ml，吐温80的浓度为0.5ml/ml。透明质酸的浓度为2mg/ml，Ⅱ型胶原 的浓度为3mg/ml。
对比例1：制备低浓度的胶原和HA的混合液
a.用实施例1方法制备的Ⅱ型胶原溶液，浓度为2mg/ml。
b.用去离子水配制HA溶液，浓度为0.2mg/ml。
c.以1:1混合步骤a与b配制的溶液，即按照混合后终浓度透明质酸为0.1 mg/ml，Ⅱ型胶原的浓度为1mg/ml添加，获得含有II型胶原和透明质酸的混合液 (有沉淀生成)，该混合液的pH6.21。
对比例2：制备中等浓度的胶原和HA的混合液
a.用实施例1方法制备的高浓度Ⅱ型胶原溶液，浓度为6mg/ml。
b.用去离子水配制HA溶液，浓度为4mg/ml。
c.以1:1混合步骤a与b配制的溶液，即按照混合后终浓度透明质酸为 2mg/ml，Ⅱ型胶原的浓度为3mg/ml添加，获得含有II型胶原和透明质酸的混合液 (有沉淀生成)，该混合液的pH6.28。
对比例3：制备高浓度的胶原和HA的混合液(pH 7.5)
a.用实施例1方法制备的高浓度Ⅱ型胶原溶液，浓度为10mg/ml。
b.用去离子水配制HA溶液，浓度为8mg/ml。
c.以1:1混合步骤a与b配制的溶液，即按照混合后终浓度透明质酸为 4mg/ml，Ⅱ型胶原的浓度为5mg/ml添加，获得含有II型胶原和透明质酸的混合液 (有沉淀生成)，该混合液的pH6.15。
物理性能测试1：II型胶原与HA相容性实验(pH 6.5)
a.实施例2配制的凝胶液及对比例1配制的混合液，分别于4℃，12000x g， 10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测 仪(Nanodrop2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对Ⅱ型胶原特征峰217nm、 230nm进行读数，发现对比例1配制的混合液上清液中特征峰217nm显著下降， 230nm基本消失(图3A)；而本发明复合凝胶液离心前后特征峰无显著变化(图 3B)。
b.羟脯氨酸法测定胶原浓度(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录A 胶原蛋白检测方法)：按照南京建成羟脯胺酸检测试剂盒(A030-2-1)说明书操 作。吸取a处理的两种样品的离心上清液0.25ml，加入试剂盒中的水解液0.5ml混 匀，沸水浴水解20min；调节pH至6.0-6.8，按操作步骤离心后取上清液，于波长 550nm下检测吸光度，并于标准品进行比较，计算出Ⅱ型胶原蛋白含量(表1)。
c.葡萄糖醛酸法测定透明质酸钠含量(参照中国医药行业标准YY0308-2004 附录A方法)：吸取a处理的两种样品的离心上清液、葡萄糖醛酸标准液各200μl 置冰水浴中，缓慢加入预冷的0.025M四硼酸钠硫酸1ml摇匀，沸水浴中煮沸20 min后取出冷却至室温，加入预冷的0.1％咔唑乙醇溶液40μl，充分摇匀后置于室 温2h。用分光光度计测定550nm处各标准管与样品管的吸光度。利用标准曲线计 算出样品管中葡萄糖醛酸含量，并根据公式换算样品中透明质酸钠质量浓度(表 1)。
d.通过II型胶原及HA的浓度测定，结果如表1所示：对比例1配制的混合 液离心后与离心前比较，HA与II型胶原的浓度均有显著下降；而实施例2制备的 凝胶液离心前后HA与II型胶原的浓度均无显著性差异，表明：在本发明制备的凝 胶液中，HA与II型胶原相溶性好。
表1
Figure BDA0002475543360000101
注：**有显著性差异
物理性能测试2：II型胶原与HA相容性实验(pH 7)
a.实施例3和实施例5配制的凝胶液及对比例2配制的混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核 酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对Ⅱ型胶原特征 峰217nm、230nm进行读数，发现对比例2配制的混合液上清液中特征峰217nm 显著下降，230nm基本消失(图4A)；而实施例3配制的复合凝胶液离心前后特 征峰无显著变化(图4B)。
b.余下步骤与性能测试1中b-d相同，结果如表2所示：在本发明制备的凝胶 液中，HA与II型胶原浓度较高时，相溶性仍然很好。
表2
Figure BDA0002475543360000102
Figure BDA0002475543360000111
注：**有显著性差异
物理性能测试3：II型胶原与HA相容性实验(pH 7.5)
a.实施例4配制的凝胶液及对比例3配制的高浓度混合液，分别于4℃， 12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核 酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对Ⅱ型胶原特征 峰217nm、230nm进行读数，发现混合液上清液中特征峰217nm显著下降， 230nm基本消失(图5A)；而本发明复合凝胶液离心前后特征峰无显著变化(图 5B)。
余下步骤与性能测试1中b-d相同，结果表明：在本发明制备的凝胶液中，HA 与II型胶原浓度很高时，相溶性仍然很好(表3)。
表3
Figure BDA0002475543360000112
注：**有显著性差异
物理性能测试4：II型胶原与HA复合凝胶液存放稳定性检测
实施例3配制的复合凝胶液(pH 7)常温存放18周后，同样用羟脯氨酸法测定 胶原的浓度、葡萄糖醛酸法测定透明质酸钠含量。结果如表4所示：放置18周后， 复合凝胶液中的II型胶原与HA的含量与pH均无变化，表明本发明的复合凝胶液 具有良好的稳定性。
表4
Figure BDA0002475543360000121
生物性能测试5：本发明制备的凝胶液对衰老软骨细胞表型的影响
a.实施例3制备的复合凝胶液(pH 7)加入24孔培养板中，每孔0.3ml，于 37℃培养箱中干燥2天成膜。添加DMEM-F12培养基1ml平衡备用。
b.第6代去分化的大鼠软骨细胞表型调控实验：原代分离10天龄大鼠软骨 细胞连续传到第6代(P6)用于实验。P6软骨细胞接种于经过步骤a处理的24孔板 中，细胞接种密度每孔为5万，加入含有10％血清和1％双抗的DMEM-F12培养 基，丹参提取物用PBS溶解，按照丹酚酸B(活性成分(Salviaactive components,SAC)) 有效浓度为20μg/ml的量添加。该组记为第一组，为添加实施例3制备的复合凝胶 液与SAC的组(CII+SAC)。
另设一组，不加入SAC，其它条件与第一组的相同。该组记为第二组，为添加 实施例3制备的复合凝胶液的组(CII)。
另设一组，P6软骨细胞直接接种于24孔板(24孔板未经步骤a处理)中，细 胞接种密度每孔为5万，加入含有10％血清和1％双抗的DMEM-F12培养基， SAC用PBS溶解，按照丹酚酸B有效浓度为20μg/ml的量添加。该组记为第三组， 为添加SAC的组(SAC)。
另设一组，P6软骨细胞直接接种于24孔板(24孔板未经步骤a处理)中，细 胞接种密度每孔为5万，加入含有10％血清和1％双抗的DMEM-F12培养基。该 组记为第四组，为对照组(CON)。
四组样品于37℃，5％CO2条件下培养24小时，相差显微镜下观察拍照。
图6A为对照细胞的形态，细胞呈现长三角形和长梭型，正常生长；图6B为加 入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝胶液孵育的细胞形态，细胞呈现长三角形和长梭 型，细胞长得很密集，生长旺盛；并且，加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝胶液孵 育的细胞局部出现生长集落，如图6C所示；图6D为加入SAC孵育的细胞形态,细 胞呈现长三角形和长梭型，正常生长；图6E为加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝 胶液以及SAC孵育的细胞形态,细胞呈现长三角形和长梭型，细胞长得很密集，生 长旺盛；并且，加入实施例3制备的Ⅱ型胶原复合凝胶液以及SAC孵育的细胞，局 部出现大型生长集落，如图6F所示。
c.荧光定量qPCR分析，收集b步骤获得的细胞培养样品，分析测试因子为： ACAN、SOX9、SRC及细胞凋亡通路关键因子基质金属蛋白酶-13，同时以GAPDH 检测作为内参基因进行表达量差异分析。结果显示，①对于软骨细胞重要表型基因 ACAN表达，与对照组相比，第一组、第二组和第三组中均有显著上调，差异有显 著性，其中第一组显示最佳效果(图7A)。②对于软骨生长重要转录调控基因SOX9 的表达，与对照组相比，第一组、第二组和第三组中均有显著上调，差异显著，其中 第一组显示最佳效果(图7B)。③对于有效的维持或诱导软骨细胞表型的SRC激 酶的表达，与对照组相比，第一组、第二组和第三组中均有统计学显著上调，其中第 一组显示最佳效果(图7C)。④对于关节软骨降解重要靶向降解酶-基质金属蛋白 酶-13(MMP-13)的表达，与对照组相比，第一组、第二组和第三组中均有统计学显 著下调，其中第一组显示最佳效果(图7D)，表明本发明制备的复合凝胶液与SAC 具有改善软骨细胞生长微环境，抑制软骨基质降解、保护软骨细胞代谢平衡等多重 调节作用。

Claims (10)

1.一种含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，其特征在于，该复合凝胶液包括II型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及包括NaCl和/或KCl；该复合凝胶液的pH为6.5-7.5；优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。
2.根据权利要求1所述的复合凝胶液，其中，II型胶原和透明质酸的重量比为1-10：10-1；优选地II型胶原的浓度为0.1-8mg/ml，透明质酸的浓度为0.1-80mg/ml。
3.根据权利要求1所述的复合凝胶液，其中，所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系和NaCl；其中，在复合凝胶液中，NaH2PO4的浓度为0.04-0.7重量％、Na2HPO4的浓度为0.1-0.9重量％、NaCl的浓度为0.3-0.8重量％；优选地，NaH2PO4的浓度为0.08-0.5重量％、NaH2PO4的浓度为0.3-0.8重量％、NaCl的浓度为0.4-0.5重量％。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的复合凝胶液，其中，所述平衡物质还含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的复合凝胶液，其中，所述平衡物质含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；优选地，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量％，所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3ml/ml，所述吐温80的浓度为0.1-1ml/ml。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的复合凝胶液，其中，所述复合凝胶液还丹参提取物；优选地，所述丹参提取物中活性成分的含量为50-98重量％。
7.根据权利要求6所述的复合凝胶液，其中，所述活性成分的浓度为7-100μg/ml。
8.根据权利要求6所述的复合凝胶液，其中，所述丹参提取物以微胶囊的形式存在于所述复合凝胶液中。
9.权利要求3-8中任意一项所述的复合凝胶液在制备软骨损伤修复用的药物中的用途。
10.一种制备权利要求1所述的含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液的方法，其中，该方法包括以下步骤：
a.配制平衡物质：向水中加入NaH2PO4-Na2HPO4体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；
b.向所述平衡物质中加入Ⅱ型胶原和透明质酸，获得含有II型胶原和透明质酸的复合凝胶液，该复合凝胶液的pH为6.5-7.5；优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。
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