CN111529692A - 一种稳定的胶原体系及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定的胶原体系，其特征在于，该胶原体系包括：胶原和平衡物质；其中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种，胶原体系的pH为6‑8；或者所述平衡物质包括NaH2PO4‑Na2HPO4体系、Tris‑HCl体系、Tris‑马来酸体系或HEPES体系，以及NaCl或KCl，胶原体系的pH为6‑8；优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2‑0.9重量％。本发明还提供了一种稳定的胶原体系的制备方法及其用途。本发明提供的胶原体系稳定，长时间放置也不会出现沉淀；且在一种实施方式中，该体系处于生理pH值范围内，有利于胶原发挥其功效，促进组织再生修复；在一种优选的实施方式中，该体系的渗透压和张力均适于生理体系。本发明提供的稳定的胶原体系的制备方法非常简单，成本低廉，易于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种稳定的胶原体系及其制备方法，以及该体系在制备创伤修复的药物中的用途，或者所述体系复合物用于皮肤损伤的化妆品。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质中最主要的结构蛋白，并具有很强的生物活性，具有参与和促进细胞增殖、迁移与分化等生物学功能。其中Ⅰ型胶原纤维粗大并具有较强硬度，成为细胞和组织的支撑结构成份，而较为纤细的Ⅲ型胶原则交织形成弹性与韧性，对皮肤组织等尤为重要。研究结果显示，由于皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成与分泌显著下降引起(皮肤)衰老，证明各种细胞外基质蛋白的正常分泌及其互作，才能有效发挥支撑器官、保护机体的功能作用。
胶原蛋白在体内理化条件下发挥其固有的生物学作用。而外源补充胶原蛋白对于修复和营养缺乏的组织难以达到预期效果，如许多产品中都添加有胶原蛋白用以皮肤修护，但效果非常有限。起因很可能是由于体内外胶原蛋白在理化特性上的差异。除了蛋白分子的有效基团及其完整性外，蛋白所处的理化环境直接影响其作用的发挥。胶原蛋白的等电点在pH7.4左右，而在接近中性时的溶液中胶原蛋白变得不稳定，容易析出。为了获得较好的溶解度，现有的产品中的胶原蛋白都采用偏酸性(pH 4-6)溶液。然而，酸性溶液偏离了细胞代谢最适的环中性pH环境，从而降低了补充胶原蛋白与体内生理环境的相容性及分子整合性，很难有效发挥作用。因此，如何使胶原稳定溶解于中性环境中，从而能够在中性条件下使用胶原，是急需解决的一个问题。
发明内容
针对现有技术中存在的主要问题，本发明提供一种稳定的中性环境的胶原体系。
因此，一方面，本发明提供了一种稳定的胶原体系，其特征在于，该胶原体系包括：胶原和平衡物质；其中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种，胶原体系的pH为6-8；或者所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及NaCl或KCl，胶原体系的pH为6-8；优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。
另一方面，本发明还提供了所述的稳定的胶原体系用作注射剂、创伤敷料、组织工程植入材料、或作为化妆品。
另一方面，本发明还提供了一种制备稳定的胶原体系的方法，其中，该方法包括以下步骤：
a.配制平衡物质：向水中加入葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种；或者，向水中加入NaH2PO4-Na2HPO4体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；
b.向所述平衡物质中加入胶原，混合均匀，获得所述稳定的胶原体系，该稳定的胶原体系的pH为6-8。
本发明提供的稳定的胶原体系，体系稳定，长时间放置也不会出现沉淀；且该体系处于生理pH值范围内，有利于胶原发挥其功效；在一种优选的实施方式中，该体系的渗透压和张力均适于生理体系。
本申请的发明人首次发现处于生理pH值范围内的胶原体系比处于酸性条件的胶原体系具有更好的生物功效：pH 7的I型胶原体系促进细胞增殖分化的正向表型基因Col1-α1的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著下调Col1-α1的表达；pH 7的I型胶原体系促进为皮肤提供弹性与韧性、缓解皮肤老化的基因Col3-α1的表达；而pH5的I型胶原体系则反向显著下调Col3-α1的表达；pH 7的I型胶原体系显著下调活化损伤炎症基因和引起的细胞凋亡关键因子iNOS的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著上调iNOS的表达；pH 7的I型胶原体系促进活化能增加氧自由基的清除能力的关键因子过氧化氢酶的基因的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著下调过氧化氢酶的基因的表达；pH 7的I型胶原体系和pH 5的I型胶原体系均显著下调阻断炎症因子IFN-1(干扰素I)的表达；pH 7的I型胶原体系显著下调参与细胞表面受体的剪切，释放凋亡配体以及使趋化因子/细胞介素失活，使细胞产生破坏的MMP-1的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著上调MMP-1的表达。
本发明提供的稳定的胶原体系的制备方法非常简单，成本低廉，易于大规模生产。
附图说明
图1实施例1制备的I型胶原及Sigma公司提供的I型胶原的SDS-PAGE电泳图谱；
图2为实施例2制备的II型胶原及Sigma公司提供的II型胶原的SDS-PAGE电泳图谱；
图3A为I型胶原体系(浓度为3mg/ml)在0周的特征性吸收峰，3B为I型胶原体系存放36周的特征性吸收峰；
图4A为II型胶原体系(浓度为3mg/ml)在0周的特征性吸收峰，4B为II型胶原体系存放20周的特征性吸收峰；
图5A上为添加I型胶原(pH 5)孵育组、下为添加I型胶原(pH 7)孵育组Col1-α1的mRNA表达；图5B上为添加I型胶原(pH 5)孵育组、下为添加I型胶原(pH 7)孵育组Col3-α1的mRNA表达；图5C上为添加I型胶原(pH 5)孵育组、下为添加I型胶原(pH 7)孵育组iNOS的mRNA表达；图5D上为添加I型胶原(pH 5)孵育组、下为添加I型胶原(pH 7)孵育组过氧化氢酶的mRNA表达；图5E上为添加I型胶原(pH 5)孵育组、下为添加I型胶原(pH 7)孵育组INF-1的mRNA表达；图5F上为添加I型胶原(pH 5)孵育组、下为添加I型胶原(pH 7)孵育组MMP1的mRNA表达。
具体实施方式
本发明提供了一种稳定的胶原体系，其特征在于，该胶原体系包括：胶原和平衡物质；其中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种，胶原体系的pH为6-8；或者所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及NaCl或KCl，胶原体系的pH为6-8；优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％，以便使渗透压和张力均适于生理体系。
为了实现更好的稳定效果，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种；以及包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系，或HEPES体系，与NaCl或KCl，胶原体系的pH为6-8。
在胶原体系的pH为6-8的实施方式中，胶原的生物活性更好。
为了更适于生理环境，尤其是使用体内使用，优选地，所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系。
为了获得更好的稳定效果，在一种优选的实施方式中，NaH2PO4的浓度为0.04-0.7重量％、Na2HPO4的浓度为0.1-0.9重量％，NaCl或KCl的浓度为0.3-0.8重量％。
为了进一步获得更好的稳定效果，在一种优选的实施方式中，NaH2PO4的浓度为0.08-0.64重量％、NaH2PO4的浓度为0.2-0.8重量％，NaCl或KCl的浓度为0.4-0.5重量％。
为了进一步获得更好的稳定效果，在一种优选的实施方式中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80；并且优选地，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量％，所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3mg/ml，所述吐温80的浓度为0.1-1mg/ml。
所述胶原可以为各种类型的胶原，例如I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原；优选地，所述胶原为I型胶原或者II型胶原。
为了获得更好的胶原的生物活性，在一种优选的实施方式中，所述I型胶原或者II型胶原的浓度为0.1-8mg/ml；优选地，所述I型胶原或者II型胶原的浓度为1-5mg/ml。
本发明提供的稳定的胶原体系在处于生理pH时具有更好的生物功效：pH 7的I型胶原体系促进细胞增殖分化的正向表型基因Col1-α1的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著下调Col1-α1的表达；pH 7的I型胶原体系促进为皮肤提供弹性与韧性、缓解皮肤老化的基因Col3的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著下调Col3的表达；pH 7的I型胶原体系显著下调活化损伤炎症基因和引起的细胞凋亡关键因子iNOS的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著上调iNOS的表达；pH 7的I型胶原体系促进活化能增加氧自由基的清除能力的关键因子过氧化氢酶的基因的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著下调过氧化氢酶的基因的表达；pH 7的I型胶原体系和pH 5的I型胶原体系均显著下调阻断炎症因子IFN-1(干扰素I)的表达；pH 7的I型胶原体系显著下调参与细胞表面受体的剪切，释放凋亡配体以及使趋化因子/细胞介素失活，使细胞产生破坏的MMP-1的表达；而pH 5的I型胶原体系则反向显著上调MMP-1的表达。
本申请提供的稳定的胶原体系可以外用，涂敷于皮肤表面，用于皮肤损伤修复，美容等。
本申请提供的稳定的胶原体系也可以用作注射剂，或作为组织工程植入材料。
根据需要，本发明提供稳定的胶原体系可以与其它各种有效成分配合使用，例如透明质酸、小分子肽，生长因子、中药成分(例如，丹参提取物等)。
优选地，所述稳定的胶原体系还含有凝胶基质辅料；优选地，所述凝胶基质辅料的浓度为0.1-3重量％。
所述凝胶基质包括但不限于纤维素衍生物、卡波姆、海藻酸盐、西黄蓍胶和明胶中的一种或几种。
本发明还提供了一种制备稳定的胶原体系的方法，其中，该方法包括以下步骤：
a.配制平衡物质：向水中加入葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种；或者，向水中加入NaH2PO4-Na2HPO4体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；
b.向所述平衡物质中加入胶原，混合均匀，获得所述稳定的胶原体系，该稳定的胶原体系的pH为6-8。
I型胶原和II型胶原可以商购获得。
实施例1：I型胶原蛋白的制备及物理化学性能检测
前处理：牛筋腱切碎，清洗，生理盐水洗涤后包封，经Co60消毒。余下步骤在无菌条件下进行。
制备高纯度的Ⅰ型胶原溶液：牛筋腱碎中加入0.5M醋酸适量，并加入胃蛋白酶(20g牛筋腱加入1克胃蛋白酶)，于6℃酶解24-48小时，15mmol/L EDTA终止酶解。离心收取上清液为I型胶原溶液，此过程在4℃进行。
纯化：按体积1:1加入胶原溶液及10％NaCl盐析，静置过夜。离心获取沉淀，用0.5M醋酸溶解，去离子水中透析至pH 5，得到高纯度的I型胶原溶液(≧10mg/ml)。
标准对照产品：Sigma I型胶原产品C9301，称取0.6mg，加入0.5M乙酸120μL缓慢震荡使其溶解，配置成5mg/ml溶液。取10μL加入平衡液中备用。
I型胶原蛋白质量检测(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录B杂蛋白检测方法)：采用Tris-甘氨酸不连续分离系统，配制6％分离胶、5％浓缩胶。取浓度为10mg/ml的I型胶原溶液及Sigma标准对照液，各10μl，加入90μL双蒸水稀释后，按比例加入2x Loadingbuffer混匀，沸水浴10min；12000x g，5min离心取上清液15μL进行SDS-PAGE电泳。条件：60V，20min；120V，1h 25min(仪器型号：Bio-Rad，PowerPac Universal)，用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶进行染色，扫描凝胶成像(Umax，PowerLook，2100 XL-USB)，得到高纯度特征性I型胶原条带，如图1所示，左一道为分子量标准物，左二道为本申请制备的I型胶原；右一道为sigma的I型胶原。
取2μL样品，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)扫描，波长200nm-800nm，胶原特征峰217、230nm读数分别为1.592和1.397，符合Ⅰ型胶原蛋白特征要求。
实施例2：II型胶原蛋白的制备及物理化学性能检测
1.前处理：从猪关节中切取透明软骨，生理盐水洗涤，75％乙醇脱脂30分钟，生理盐水洗涤后包封，经Co60消毒。余下步骤在无菌条件下进行。
2.制备高纯度的Ⅱ型胶原溶液：透明软骨中加入适量预冷的0.01M EDTA，于匀浆机中捣碎，离心收集沉淀，然后用10倍体积的4M、pH 7.5的盐酸胍搅拌过夜去除蛋白多糖；充分水洗，离心后取沉淀，加入0.5M醋酸酶解液，其中，软骨与胃蛋白酶的重量比为50:1，此过程在4℃以下进行，搅拌24小时。高速离心收取上清液为Ⅱ型胶原溶液，沉淀可以重复此步骤继续提取胶原。上清液加入1/10体积的0.15M EDTA终止酶解。
3.纯化：按体积1:1加入胶原溶液及10％NaCl盐析，静置过夜。离心获取沉淀，用0.5M醋酸溶解，去离子水中透析至pH 5，得到高纯度的Ⅱ型胶原溶液(6.5mg/ml以上)。
4.标准对照产品：Sigma II型胶原产品C9301，称取0.6mg，加入0.5M乙酸120μl缓慢震荡使其溶解，配置成5mg/ml溶液。取10μl加入平衡液中备用。
5.Ⅱ型胶原蛋白质量检测(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录B杂蛋白检测方法)：采用Tris-甘氨酸不连续分离系统，配制6％分离胶、5％浓缩胶。取浓度为6.5mg/ml的Ⅱ型胶原溶液及Sigma标准对照液，各10μl，加入90μl双蒸水稀释后，按比例加入2xLoading buffer混匀，沸水浴10min；12000x g，5min离心取上清液15μl进行SDS-PAGE电泳。条件：60V，20min；120V，1h 25min(仪器型号：Bio-Rad，PowerPac Universal)，用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶进行染色，扫描凝胶成像(Umax，PowerLook，2100 XL-USB)，得到高纯度特征性Ⅱ型胶原条带，如图2所示，左一道为分子量标准物，左二道为本申请制备的II型胶原；右一道为sigma的II型胶原。
6.取2μl样品，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)扫描，波长200nm-800nm，II型胶原特征峰217、230nm读数分别为1.938和1.504，符合II型胶原蛋白特征要求。
采用实施例1制备的I型胶原和实施例2制备的II型胶原进行后续实验。
采用第一种平衡物质配制稳定的胶原体系：
实施例3：低浓度I型胶原体系的制备(pH 6)
a.配制平衡物质(90ml)：在去离子水中加入葡萄糖0.5g，1,3丙二醇0.5ml，吐温800.1ml，用0.2M NaOH(约0.16mg)调至pH 6。
b.量取10mg/ml I型胶原液10ml。
c.混合步骤a、b，获得含有Ⅰ型胶原的体系100ml，葡萄糖的浓度约为0.5重量％，1,3丙二醇的浓度为0.5ml/ml，吐温80的浓度为0.1ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为1mg/ml。
实施例4：中浓度I型胶原体系的制备(pH7)
a.配制平衡物质(70ml)：在去离子水中加入葡萄糖2g，1,3丙二醇1.5ml，吐温800.5ml，用0.2M NaOH(约0.28mg)调至pH 7。
b.量取10mg/ml I型胶原液30ml。
c.混合步骤a、b，获得含有Ⅰ型胶原的体系100ml，葡萄糖的浓度约为2重量％，1,3丙二醇的浓度为1.5ml/ml，吐温80的浓度为0.5ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为3mg/ml。
实施例5：高浓度I型胶原体系的制备(pH 8)
a.配制平衡物质(50ml)：在去离子水中加入葡萄糖5g，1,3丙二醇3ml，吐温800.98ml，用0.2M NaOH(约0.4mg)调至pH 8。
b.量取10mg/ml I型胶原液50ml。
c.混合步骤a、b，获得含有Ⅰ型胶原的体系100ml，葡萄糖的浓度约为5重量％，1,3丙二醇的浓度为3ml/ml，吐温80的浓度为0.98ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为5mg/ml。
实施例6：各种浓度的I型胶原体系的制备(pH7)和3mg/ml II型胶原体系的制备(pH7)
按实施例4方法配制平衡物质，采用10mg/ml I型胶原液或者10mg/ml II型胶原液，相应配制1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的I型胶原体系和浓度为3mg/ml的II型胶原体系。
性能测试1：胶原体系长期存放稳定性实验(pH 7)
将实施例6制备的各种浓度的I型胶原体系和II型胶原体系存放在8℃冰箱中，分别于4℃，定期作胶原特征峰扫描检测胶原特征变化。样品于12000xg，10min离心，吸取上清液备用。
分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对胶原特征峰217、230nm进行读数，发现新制备及长期存放后的Ⅰ型、II型胶原离心后特征峰均无显著变化。图3A为I型胶原体系(浓度为3mg/ml)在0周的特征性吸收峰，3B为I型胶原体系存放36周的特征性吸收峰；图4A为II型胶原体系(浓度为3mg/ml)在0周的特征性吸收峰，4B为II型胶原体系存放20周的特征性吸收峰。
定期用羟脯氨酸法测定胶原的浓度，(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录A胶原蛋白检测方法)：按照南京建成羟脯胺酸检测试剂盒(A030-2-1)说明书操作。吸取a处理的两种样品的离心上清液0.25ml，加入试剂盒中的水解液0.5ml混匀，沸水浴水解20min；调节pH至6.5，按操作步骤离心后取上清液，于波长550nm下检测吸光度，并于标准品进行比较，计算出胶原蛋白含量。
I型胶原分别在1、7、22、36周后检测，结果显示放置36周后I型胶原的pH为7，含量与pH均无明显变化，表明本发明胶原体系具有良好的稳定性(表1)。
表1
Ⅱ型胶原分别在0、5、20周检测，Ⅱ型胶原的pH为7，含量与pH均无明显变化，表明本发明胶原体系具有良好的稳定性(表2)。
表2
性能测试2：本发明胶原体系对表皮细胞表型的影响
I型胶原包被培养板：
实验组：将实施例4制备的I型胶体系(pH 7)加入24孔培养板中，每孔0.3ml，于37℃培养箱中干燥2天成膜。临用前添加DMEM-F12培养基1ml平衡备用。
对照组：将实施例3制备的I型胶原凝胶液在去离子水中透析到pH为5，其余步骤同实验组。
荧光定量qPCR检测，测试6种基因，分别为Col1-α1、Col3-α1、iNOS、过氧化氢酶)INF-1与MMP1：同时以GAPDH检测作为内参基因进行表达量差异分析。结果显示：1、促进细胞增殖分化的正向表型基因Col1-α1的表达：与对照组相比，I型胶原pH 7组表达显著上调；而pH 5组则反向显著下调；两种胶原与对照组比较差异均有显著性(图5A)；2、为皮肤提供弹性与韧性、缓解皮肤老化的基因Col3的表达：与对照组相比，I型胶原pH 7组表达显著上调；而pH 5组则反向显著下调；两种胶原与对照组比较差异均有显著性(图5B)；3、活化损伤炎症基因和引起的细胞凋亡关键因子iNOS的表达：在加入生长调控因素后随着代谢活性的增加而呈现显著下调趋势，与对照组相比，I型胶原pH 7组表达显著下调；而pH 5组则反向显著上调；两种胶原与对照组比较差异均有显著性(图5C)；4、活化能增加氧自由基的清除能力的关键因子过氧化氢酶的基因表达的表达：与对照组相比，I型胶原pH 7组表达显著上调；而pH 5组则反向显著下调；两种胶原与对照组比较差异均有显著性(图5D)；5、阻断炎症因子IFN-1(干扰素I)的表达，与对照组相比，I型胶原pH 7组、pH 5组均表达显著下调；两种胶原与对照组比较差异均有显著性(图5E)；6、参与细胞表面受体的剪切，释放凋亡配体以及使趋化因子/细胞介素失活，使细胞产生破坏的MMP-1的表达：I型胶原pH 7组表达显著下调；而pH 5组则反向显著上调；两种胶原与对照组比较差异均有显著性(图5F)。
以下采用第二种平衡物质(缓冲液加盐)配制胶原体系
实施例7：低浓度I型胶原体系的制备(pH 6)
a.配制平衡物质(95ml)：在去离子水中加入NaH2PO4 0.643g，Na2HPO4 0.189g；NaCl 0.47g，葡萄糖0.1g，1,3丙二醇0.5ml，吐温80 0.1ml。
b.量取10mg/ml I型胶原液5ml。
c.混合步骤a、b，获得含有Ⅰ型胶原的体系100ml，该体系的pH 6，NaH2PO4的浓度约为0.643重量％，Na2HPO4的浓度约为0.189重量％，NaCl的浓度约为0.47重量％，葡萄糖的浓度约为0.1重量％，1,3丙二醇的浓度为0.5ml/ml，吐温80的浓度为0.1ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为1mg/ml。
实施例8：中等浓度I型胶原体系的制备(pH7)
a.配制平衡(70ml)物质：在去离子水中加入NaH2PO4 0.322g，Na2HPO4 0.566g，NaCl 0.45g，葡萄糖2g，1,3丙二醇1.5ml，吐温80 0.5ml。
b.量取10mg/ml的Ⅰ型胶原液30ml。
c.混合步骤a、b，获得含有Ⅰ型胶原的体系100ml，该体系的pH为7，NaH2PO4的浓度约为0.322重量％；Na2HPO4的浓度约为0.566重量％，NaCl的浓度约为0.44重量％，葡萄糖的浓度约为5重量％，1,3丙二醇的浓度为1.5ml/ml，吐温80的浓度为0.5ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为3mg/ml。
实施例9：高浓度I型胶原体系制备(pH 8)
a.配制平衡物质(50ml)：在去离子水中加入NaH2PO4的浓度为0.04g；Na2HPO40.897g；NaCl 0.42g，葡萄糖4g，1,3丙二醇3ml，吐温80 1ml。
b.量取10mg/ml的Ⅰ型胶原液50ml。
c.混合步骤a、b，获得含有Ⅰ型胶原的体系100ml，该体系的pH为8，NaH2PO4的浓度约为0.04重量％；Na2HPO4的浓度约为0.897重量％；NaCl的浓度约为0.42重量％，葡萄糖的浓度约为4重量％，1,3丙二醇的浓度为3ml/ml，吐温80的浓度为1ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为5mg/ml。
实施例10：中等浓度II型胶原体系的制备(pH7)
a.配制平衡(70ml)物质：在去离子水中加入NaH2PO4 0.322g，Na2HPO4 0.566g，NaCl 0.45g，葡萄糖2g，1,3丙二醇1.5ml，吐温80 0.5ml。
b.量取10mg/ml的II型胶原液30ml。
c.混合步骤a、b，获得含有II型胶原的体系100ml，该体系的pH为7，NaH2PO4的浓度约为0.322重量％；Na2HPO4的浓度约为0.566重量％，NaCl的浓度约为0.44重量％，葡萄糖的浓度约为5重量％，1,3丙二醇的浓度为1.5ml/ml，吐温80的浓度为0.5ml/ml，II型胶原的浓度为3mg/ml。
对比例1：制备低浓度的胶原混合液
用实施例1方法制备Ⅰ型胶原溶液，用PBS配制浓度为0.5mg/ml，获得Ⅰ型胶原混合液(有沉淀生成)，pH 6。
对比例2：制备中等浓度的胶原混合液
用实施例1方法制备Ⅰ型胶原溶液，用PBS配制浓度为3mg/ml，获得Ⅰ型胶原混合液(有沉淀生成)pH 7。
对比例3：制备高浓度的胶原混合液
用实施例1方法制备Ⅰ型胶原溶液，用PBS配制浓度为5mg/ml，获得Ⅰ型胶原混合液(有沉淀生成)，pH 8。
性能测试3：Ⅰ型胶原体系稳定性实验(pH 6)
a.实施例7配制的胶原体系及对比例1配制的低浓度混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对Ⅰ型胶原特征峰230nm进行读数，发现混合液上清液中230nm特征峰基本消失；而本发明胶原体系离心前后特征峰无显著变化。
b.羟脯氨酸法测定胶原浓度(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录A胶原蛋白检测方法)：按照南京建成羟脯胺酸检测试剂盒(A030-2-1)说明书操作。吸取a处理的两种样品的离心上清液0.25ml，加入试剂盒中的水解液0.5ml混匀，沸水浴水解20min；调节pH至6.5，按操作步骤离心后取上清液，于波长550nm下检测吸光度，并于标准品进行比较，计算出I型胶原蛋白含量(表3)。
c.通过特征峰扫描及羟脯氨酸法测定胶原浓度，结果显示混合液组离心后与离心前比较，胶原浓度有显著下降；而本发明的胶原体系离心前后胶原浓度均无显著性差异，表明本发明胶原体系(pH 6)有良好的稳定性。
表3
注：**有显著性差异
性能测试4：Ⅰ型胶原体系稳定性实验(pH 7)
a.实施例8配制的胶原体系及对比例2配制的中浓度混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对I型胶原特征峰230nm进行读数，发现混合液上清液中特征峰230nm基本消失；而本发明胶原体系离心前后特征峰无显著变化。
余下步骤与性能测试3中b、c相同，结果表明本发明胶原体系(pH 7)有良好的稳定性(表4)。
表4
注：**有显著性差异
性能测试5：Ⅰ型胶原体系稳定性实验(pH 8)
a.实施例9配制的胶原体系及对比例3配制的高浓度混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对I型胶原特征峰230nm进行读数，发现混合液上清液中特征峰230nm基本消失；而本发明胶原体系离心前后特征峰无显著变化。
余下步骤与性能测试3中b、c相同，结果表明本发明胶原体系(pH 8)有良好的稳定性及促进相溶的作用(表5)。
表5
注：**有显著性差异
性能测试6：Ⅰ型胶原体系和II型胶原体系长期存放稳定性检测
制备4组胶原体系，配制方法、平衡物质组份同实施例8：使得其中Ⅰ型胶原的浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml，pH 7。
制备的各种浓度Ⅰ型胶原体系以及实施例10制备的II型胶原体系存放在8℃冰箱中，Ⅰ型胶原体系在1、5、10、20周后，同样用羟脯氨酸法测定胶原的浓度，结果显示放置20周后Ⅰ型胶原的含量均无明显变化，表明本发明胶原体系具有良好的稳定性(表6)。
表6
Ⅱ型胶原体系分别在0、5、20周检测，结果显示放置20周后II型胶原的含量均无明显变化，表明本发明胶原体系具有良好的稳定性(表7)。
表7
Claims (10)
1.一种稳定的胶原体系，其特征在于，该胶原体系包括：胶原和平衡物质；其中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种，胶原体系的pH为6-8；或者所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及NaCl或KCl，胶原体系的pH为6-8；优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。
2.根据权利要求1所述的稳定的胶原体系，其中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种；以及包括NaH2PO4-Na2HPO4体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系，或HEPES体系，与NaCl或KCl，胶原体系的pH为6-8。
3.根据权利要求1所述的稳定的胶原体系，其中，所述平衡物质包括NaH2PO4-Na2HPO4体系。
4.根据权利要求3所述的稳定的复合物，其中，NaH2PO4的浓度为0.04-0.7重量％、Na2HPO4的浓度为0.1-0.9重量％，NaCl或KCl的浓度为0.3-0.8重量％。
5.根据权利要求4所述的稳定的胶原体系，其中，NaH2PO4的浓度为0.08-0.64重量％、NaH2PO4的浓度为0.2-0.8重量％，NaCl或KCl的浓度为0.4-0.5重量％。
6.根据权利要求1所述的稳定的胶原体系，其中，所述平衡物质包括葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80；优选地，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量％，所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3mg/ml，所述吐温80的浓度为0.1-1mg/ml。
7.根据权利要求1所述的稳定的胶原体系，其中，所述胶原为I型胶原或者II型胶原；优选地，所述I型胶原或者II型胶原的浓度为0.1-8mg/ml；优选地，所述I型胶原或者II型胶原的浓度为1-5mg/ml。
8.根据权利要求1所述的稳定的胶原体系，其中，该胶原体系还含有凝胶基质辅料；优选地，所述凝胶基质辅料的浓度0.1-3重量％。
9.权利要求1-8中任意一项所述的稳定的胶原体系用作注射剂、创伤敷料、组织工程植入材料、或作为化妆品。
10.一种制备稳定的胶原体系的方法，其中，该方法包括以下步骤：
a.配制平衡物质：向水中加入葡萄糖、1,3丙二醇，和吐温80中的至少两种；或者，向水中加入NaH2PO4-Na2HPO4体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；
b.向所述平衡物质中加入胶原，混合均匀，获得所述稳定的胶原体系，该稳定的胶原体系的pH为6-8。
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