CN112891559A - 促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体及其制备方法和用途。本发明柚皮苷纳米脂质体是经RGD肽和TAT肽共同修饰后制得的柚皮苷脂质体。利用本发明方法制备的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体可明显降低给药浓度，增加细胞对药物的摄取，促进柚皮苷药效的发挥，细胞实验证实，本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在没有出现明显细胞毒性，制剂安全性得到充分保障的前提下，表现出了良好的促进牙髓干细胞增殖作用，并具有出色的促进牙髓干细胞成骨分化能力，从而具备广阔的相关药物制剂研发和临床应用前景。

Description

促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂 质体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
中医药作为我国的民族瑰宝，在治疗各种疾病中具有明显而确实的疗效。传统中药骨碎补归肾、肝经，具有补肾强骨、续伤止痛之功，是骨伤科常用中药之一，用于治疗肾虚腰痛、牙齿松动、筋骨折伤等症，骨碎补根茎中富含黄酮、生物碱、酚类等有效成分，其中柚皮苷是其主要活性成分之一。研究发现，柚皮苷具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗突变、抗过敏、抗溃疡、镇痛、降血压、降血糖等多种活性，且能够降低血胆固醇、减少血栓的形成，改善局部微循环和营养供给，常用于预防和治疗积食、腹胀、咳嗽痰多、痢疾、腹泻以及心脑血管疾病，目前，已有部分学者进行了关于柚皮苷促进成骨作用方面的研究，然而，研究人员发现，由于柚皮苷水溶性较差导致细胞摄取率低下，为了增加细胞摄取，增强药物疗效，通常细胞及动物实验过程中需使用大量的有机溶剂并提高给药浓度，从而大大增加了其细胞毒性，进而给相关的制剂研发和实际临床应用造成了很大的困难和风险，限制了其人体应用。
发明内容
鉴于柚皮苷存在的上述理化特点造成了其临床应用的困难，需要进行剂型研究和制剂研发，本研究团队在多年临床实践的基础上，经反复设计和尝试，获得了一种新的且行之有效的柚皮苷剂型改造方案。利用本发明方法制备的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体，可明显降低给药浓度，增加细胞对药物的摄取，更好地发挥柚皮苷成骨诱导相关作用。进一步地，我们通过后续的细胞实验证实，本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在没有出现明显细胞毒性，制剂安全性得到充分保障的前提下，表现出了良好的促进牙髓干细胞增殖作用，并具有出色的促进牙髓干细胞成骨分化能力，从而具备广阔的临床应用前景。
首先，本发明提供了一种促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体，该柚皮苷纳米脂质体是经RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽)和TAT肽(TAT穿膜肽)共同修饰后制得的柚皮苷脂质体。
进一步地，本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的平均粒径为159.8～ 161.8nm，Zeta电位为-21.2～-20.0mV，载药量为6.75～6.90％。
进一步优选地，本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的平均粒径为160.8nm，Zeta电位为-20.6mV，载药量为6.82％。
此外，本发明还涉及上述多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备骨科术后促骨形成药物中的用途。
以及，上述多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备关节炎症骨缺损促骨修复药物中的用途。
以及，上述多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备颌面外科术后促骨重建药物中的用途。
以及，上述多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备颞下颌关节病治疗药物中的用途。
最后，本发明还提供了上述多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)载柚皮苷纳米脂质体的制备：按照物质的量比为1.2∶1，分别称取柚皮苷0.05-0.5g和相应质量的磷脂酰胆碱置于三角烧瓶中，加入四氢呋喃100ml； 50℃水浴中磁力搅拌3h至溶液澄清，于40℃减压旋干，收集残留物即得柚皮苷 -磷脂酰胆碱结合物；将所得柚皮苷-磷脂酰胆碱结合物溶解在200ml石油醚中，过0.22μm滤膜除去游离的柚皮苷；滤液经减压旋蒸后收集残留物即得柚皮苷- 磷脂酰胆碱纯化物，密封备用；
称取1.5mg柚皮苷-磷脂酰胆碱纯化物、5.5mg卵磷脂EPC、2mg胆固醇和 1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基溶解于2ml无水甲醇中，充分振荡使其完全溶解；再将所得溶液加入至茄形瓶中，经减压旋蒸形成脂质薄膜；然后向茄形瓶中加入5ml PH＝7的PBS溶液轻摇水化，再依次经过400、200、100、 80nm滤膜挤出过滤，即获得载柚皮苷纳米脂质体溶液，置于4℃冰箱中保存备用；
(2)多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的制备：利用磷酸氢二钠溶液调节上述载柚皮苷脂质体溶液PH至6，以0.1mg/ml浓度加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化脂质体表面的羧基基团；再与RGD肽和TAT肽共同孵育4h，RGD肽和TAT肽的浓度均为5mg/ml，然后经过Sephadex-25凝胶柱除去未连接的RGD肽和TAT肽，所得脂质体溶液经超滤离心柱浓缩后，置于4℃冰箱中保存，即得到本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体。
综上，为了克服柚皮苷细胞摄取率低下、有机溶剂用量大、给药浓度大所导致的细胞毒性增加，制剂和临床应用困难。本发明团队设计了一种新的柚皮苷剂型改造方案，利用本发明方法制备的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体可明显降低给药浓度，增加细胞对药物的摄取，促进柚皮苷药效的发挥，细胞实验证实，本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在没有出现明显细胞毒性，制剂安全性得到充分保障的前提下，表现出了良好的促进牙髓干细胞增殖作用，并具有出色的促进牙髓干细胞成骨分化能力，从而具备广阔的相关药物制剂研发和临床应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体粒径分布图。
图2为多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体Zeta电位图。
图3为多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体透射电子显微镜观测图。
图4为MTT实验检测不同浓度柚皮苷原料药对牙髓干细胞增殖的影响。
图5为CCK-8实验检测不同分组的纳米脂质体对牙髓干细胞增殖的影响。
图6为倒置显微镜观察给药第9天时牙髓干细胞形态(A.空白组；B.柚皮苷原料药组；C.RGD&TAT空白纳米脂质体(纳米粒)组；D.柚皮苷纳米脂质体 (纳米粒)组；E.多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组)。
图7为死活染色后激光共聚焦显微镜观察牙髓干细胞活性(A.空白组；B. 柚皮苷原料药组；C.RGD&TAT空白纳米脂质体(纳米粒)组；D.柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组；E.多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组)。
图8为流式细胞仪对各给药组细胞周期的检测结果。
图9为流式细胞仪对各给药组细胞凋亡的检测结果。
图10为利用q-PCR对各给药组VEGF基因表达的检测结果。
图11为茜素红染色评估各给药组牙髓干细胞成骨效果。
图12为ALP染色评估各给药组牙髓干细胞成骨效果。
图13为q-PCR检测各给药组成骨相关ALP基因的表达。
图14为q-PCR检测各给药组成骨相关OCN基因的表达。
图15为q-PCR检测各给药组成骨相关RUNX2基因的表达。
图16为q-PCR检测各给药组成骨相关BSP基因的表达。
图17为q-PCR检测各给药组成骨相关OSX基因的表达。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
在本发明中，若无特别说明，所有的仪器和原料均可从商业途径得到或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：一种促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的制备方法
一、试剂材料与仪器设备
1、试剂材料
柚皮苷、乙腈(色谱纯)(国药集团化学试剂有限公司)；
磷脂酰胆碱、卵磷脂EPC、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇- 羧基(上海舜纳生物有限公司)；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，美国SIGMA公司)；
四氢呋喃、磷酸氢二钠、无水甲醇、石油醚(上海化学试剂厂)。
2、仪器设备
SB20001精密电子天平(上海沪粤明科学仪器有限公司)；
RV-5A旋转蒸发仪(上海一恒科学仪器有限公司)；
LC-16高效液相色谱仪(日本岛津公司)；
L-90K超高速离心机(美国Beckman公司)；
Mastersizer 3000激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)；
JEOL2010透射电子显微镜(日本电子株式会社)。
二、制备方法
(1)载柚皮苷纳米脂质体的制备：按照物质的量比为1.2∶1，分别称取柚皮苷(Nar)0.1g和相应质量的磷脂酰胆碱(PC)置于三角烧瓶中，加入四氢呋喃100ml；50℃水浴中磁力搅拌3h至溶液澄清，于40℃减压旋干，收集残留物即得柚皮苷-磷脂酰胆碱(Nar-PC)结合物；将所得柚皮苷-磷脂酰胆碱结合物溶解在200ml石油醚中，过0.22μm滤膜除去游离的柚皮苷；滤液经减压旋蒸后收集残留物即得柚皮苷-磷脂酰胆碱纯化物，密封备用；
称取1.5mg柚皮苷-磷脂酰胆碱纯化物、5.5mg卵磷脂EPC、2mg胆固醇和 1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG2000-COOH)溶解于 2ml无水甲醇中，充分振荡使其完全溶解；再将所得溶液加入至茄形瓶中，经减压旋蒸形成脂质薄膜；然后向茄形瓶中加入5ml PH＝7的PBS溶液轻摇水化，再依次经过400、200、100、80nm滤膜挤出过滤，即获得载柚皮苷纳米脂质体溶液，置于4℃冰箱中保存；以相同方法制备空载纳米脂质体，作为对照颗粒。
(2)多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的制备：利用磷酸氢二钠溶液调节上述载柚皮苷脂质体溶液PH至6，以0.1mg/ml浓度加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化脂质体表面的羧基基团；再与RGD肽和TAT 肽共同孵育4h，RGD肽和TAT肽的浓度均为5mg/ml，然后经过Sephadex-25 凝胶柱除去未连接的RGD肽和TAT肽，所得脂质体溶液经超滤离心柱浓缩后，置于4℃冰箱中保存，即得到本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体。
三、理化特性检测
(1)纳米脂质体的粒径与Zeta电位检测
室温条件下，以50倍蒸馏水溶解稀释多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体及对照颗粒，加入石英皿中，通过马尔文Mastersizer3000激光粒度仪分别检测样品和对照品的粒径分布与Zeta电位(图1、2)，结果如下表1所示。
表1纳米脂质体的表征
Figure BDA0002940216180000081
(2)测定多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的透射电镜
铜网蘸取少量的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体悬液，以2％磷钨酸负染，干燥后透射电子显微镜观测(日本JEOL2010)(图3)。
(3)HPLC方法检测多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体中柚皮苷的载药量
柚皮苷标准曲线测定：精密称取10mg柚皮苷标准品，至容量瓶中；加入无水甲醇充分溶解并定容配制成1mg/ml柚皮苷储备液，用甲醇逐步稀释，配制成浓度为120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml的柚皮苷溶液。分别吸取以上溶液20μl，过滤后进样高效液相色谱仪检测，测定样品在283nm波长处的吸收峰面积。(流动相为乙腈-水(20:80)，流速设为1.0ml/min，柱温25℃)，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得回归方程y＝88.359x-251.02(R2＝ 0.9994)，表明柚皮苷药物浓度在7.5-120μg/ml与峰面积呈良好的线性关系。
多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体中柚皮苷的载药量测定：取10μl的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体，加入90μl甲醇溶解，离心后取50μl上清液，以流动相乙腈-水(20:80)稀释至1ml，精密吸取20μl溶液进样，测定峰面积，计算柚皮苷的含量。HPLC色谱条件：Zorbax SB-C18反相色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长283nm，柱温25℃。并进一步计算多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体中柚皮苷的载药量，其中柚皮苷载药量＝包封的柚皮苷质量/制备脂质体冻干后总质量×100％。柚皮苷高效液相色谱测定结果显示，出峰时间为5.72分钟，带入柚皮苷浓度与峰面积标准曲线，计算得多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体和柚皮苷纳米脂质体的载药量分别为6.82％和7.01％。
实施例2：多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体对牙髓干细胞增殖的影响
成功制备多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体后，我们进行了细胞体外实验，研究该纳米脂质体对牙髓干细胞成骨分化的影响。首先，利用MTT实验确定柚皮苷原料药对牙髓干细胞成骨分化的有效浓度，然后对比观察多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体对牙髓干细胞增殖的影响，包括倒置显微镜观察每个时间点的形态变化、CCK-8检测干细胞的活性变化、死活染色观察干细胞存活情况、流式检测细胞周期及细胞凋亡，q-PCR检测血管生长因子VEGF的表达。
实验分组为：①空白组；②柚皮苷原料药组；③RGD&TAT空白纳米脂质体(纳米粒)组；④柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组；⑤多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组。
实验结果证实：在相同的柚皮苷浓度下，RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体与未修饰载柚皮苷纳米脂质体、柚皮苷原料药相比可以明显促进牙髓干细胞增殖，同时没有表现出明显的细胞毒性。
(1)MTT实验确定柚皮苷原料药的有效浓度
通过MTT实验我们发现，当柚皮苷原料药浓度为100μg/ml时，牙髓干细胞培养7天后可以观察到对细胞增殖有一些促进作用，所以我们将柚皮苷原料药的有效浓度设定为100μg/ml，但是同时可以观察到柚皮苷原料药对牙髓干细胞增殖的促进作用非常有限(图4)。
(2)CCK-8检测干细胞的活性变化
确定柚皮苷原料药的有效浓度为100μg/ml后，对实验进行分组：①空白组；②柚皮苷原料药组；③RGD&TAT空白纳米脂质体(纳米粒)组；④柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组；⑤多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体(纳米粒)组。再利用CCK-8实验检测不同分组的纳米脂质体对牙髓干细胞增殖的影响，可以观察到培养9天时RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组对牙髓干细胞的增殖促进作用最为明显(图5)。
(3)倒置显微镜观察细胞形态变化及数量
给药后，我们利用倒置显微镜观察给药第9天时的牙髓干细胞形态及数量的变化，我们可以观察到RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组细胞数量最多(图6)。
(4)死活染色观察干细胞存活情况
我们利用细胞死活染色法观察细胞活性，活细胞染色后呈绿色荧光，红色荧光表示为死细胞，染色后用激光共聚焦显微镜观察，相比而言，多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组细胞活性最好，说明该组药物细胞毒性最小(图7)。
(5)流式检测细胞周期
利用流式细胞仪对各给药组细胞的细胞周期进行检测，从结果中我们可以看出，RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组有更多的细胞处于增殖分裂期，其增殖活力更强，说明RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体对牙髓干细胞增殖有更强的促进作用(图8)。
(6)流式检测细胞凋亡
利用流式细胞仪对各给药组细胞的细胞凋亡情况进行检测，结果表明 RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组中凋亡细胞比例最低(图9)。
(7)q-PCR检测血管生长因子VEGF的表达
利用q-PCR在基因水平进行检测，可以发现RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组中VEGF基因的表达最为活跃(图10)。
以上实验结果从细胞水平验证了RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体无明显的细胞毒性，制剂安全性较高，同时验证了与各对照组药物相比，其对牙髓干细胞增殖具有更加显著的促进作用。
实施例3：多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体对牙髓干细胞成骨分化的影响
为了观察RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体对牙髓干细胞成骨分化的影响，进行了成骨检测相关实验，包括茜素红染色、ALP染色、利用q-PCR 检测ALP、OCN、RUNX2、BSP、OSX等成骨基因的表达。这些实验结果表明 RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体较其他实验组有更好地促进牙髓干细胞成骨分化的效果。
(1)茜素红染色评估成骨
茜素红染色实验中可以观察到在给药第14天和21天时，RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组都呈现出最佳的成骨效果(图11)。
(2)ALP染色评估成骨
ALP染色实验中可以观察到在给药第14天时，RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组呈现出最佳的成骨效果(图12)。
(3)q-PCR检测ALP、OCN、RUNX2、BSP、OSX基因的表达
q-PCR检测中，RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体组与其他实验组相比，其与促成骨相关的ALP、OCN、RUNX2、BSP、OSX基因的表达都明显升高(图13-17)，从而在基因水平证明了其对牙髓干细胞具有较强的促成骨能力。
以上细胞实验充分证明了RGD&TAT多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体对牙髓干细胞增殖及成骨分化的促进能力，不仅如此，本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体和相应的制剂方法对解决3D打印支架在骨缺损部位成骨效果欠佳的临床问题也具有重大的启发意义，在本发明基础上，本研究团队将进一步开展多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体与3D打印支架复合促成骨的相关研究和药物开发。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (8)

1.一种促进牙髓干细胞增殖和成骨分化的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体，其特征在于：所述柚皮苷纳米脂质体是经RGD肽和TAT肽共同修饰后制得的柚皮苷脂质体。
2.如权利要求1所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体，其特征在于：所述柚皮苷纳米脂质体的平均粒径为159.8～161.8nm，Zeta电位为-21.2～-20.0mV，载药量为6.75～6.90％。
3.如权利要求2所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体，其特征在于：所述柚皮苷纳米脂质体的平均粒径为160.8nm，Zeta电位为-20.6mV，载药量为6.82％。
4.如权利要求1-3任一项所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备骨科术后促骨形成药物中的用途。
5.如权利要求1-3任一项所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备关节炎症骨缺损促骨修复药物中的用途。
6.如权利要求1-3任一项所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备颌面外科术后促骨重建药物中的用途。
7.如权利要求1-3任一项所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体在制备颞下颌关节病治疗药物中的用途。
8.一种如权利要求1所述的多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)载柚皮苷纳米脂质体的制备：按照物质的量比为1.2∶1，分别称取柚皮苷0.05-0.5g和相应质量的磷脂酰胆碱置于三角烧瓶中，加入四氢呋喃100ml；50℃水浴中磁力搅拌3h至溶液澄清，于40℃减压旋干，收集残留物即得柚皮苷-磷脂酰胆碱结合物；将所得柚皮苷-磷脂酰胆碱结合物溶解在200ml石油醚中，过0.22μm滤膜除去游离的柚皮苷；滤液经减压旋蒸后收集残留物即得柚皮苷-磷脂酰胆碱纯化物，密封备用；
称取1.5mg柚皮苷-磷脂酰胆碱纯化物、5.5mg卵磷脂EPC、2mg胆固醇和1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基溶解于2ml无水甲醇中，充分振荡使其完全溶解；再将所得溶液加入至茄形瓶中，经减压旋蒸形成脂质薄膜；然后向茄形瓶中加入5ml PH＝7的PBS溶液轻摇水化，再依次经过400、200、100、80nm滤膜挤出过滤，即获得载柚皮苷纳米脂质体溶液，置于4℃冰箱中保存备用；
(2)多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体的制备：利用磷酸氢二钠溶液调节上述载柚皮苷脂质体溶液PH至6，以0.1mg/ml浓度加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化脂质体表面的羧基基团；再与RGD肽和TAT肽共同孵育4h，RGD肽和TAT肽的浓度均为5mg/ml，然后经过Sephadex-25凝胶柱除去未连接的RGD肽和TAT肽，所得脂质体溶液经超滤离心柱浓缩后，置于4℃冰箱中保存，即得到本发明多肽共修饰柚皮苷纳米脂质体。
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