CN106540270A - 紫杉醇与全反式维甲酸共运输白蛋白纳米药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及紫杉醇与全反式维甲酸共运输白蛋白纳米药物，具体是利用白蛋白为载体，通过蛋白质中二硫键的还原‑氧化过程，使白蛋白自交联形成纳米粒子，并负载紫杉醇和全反式维甲酸，形成两种药物共运输的纳米药物颗粒。该纳米药物颗粒可以在杀死肿瘤细胞的同时抑制癌症的转移，并抑制肿瘤细胞的干性，从而提高转移性癌症的治疗效果。

Description

紫杉醇与全反式维甲酸共运输白蛋白纳米药物
技术领域
本发明涉及一种可以用于抑制肿瘤生长和转移的白蛋白纳米药物，属于生物医药技术领域。
背景技术
肿瘤转移是导致癌证病人死亡的主要原因之一，因此在临床上迫切需要一种能够针对癌症转移的治疗药物和手段。紫杉醇(PTX)类药物已成为目前临床上治疗转移性乳腺癌的最有效和应用最广泛的药物，但单独的紫杉醇在水中的溶解度低，需要一些助溶剂来改善其溶解性，但是这会在不同程度上引起人的过敏反应，而是FAD批准的用于治疗转移性乳腺癌的白蛋白结合的纳米药物，相对于单独的紫杉醇药物，具有更好的疗效和更低的副作用。虽然如此，的效率仍然较低(有报道显示约为33％)。
一些研究表明紫杉醇的治疗会增加肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。此外，紫杉醇对肿瘤干细胞的作用较低，因而在使用紫杉醇类药物的治疗过程中，在减少肿瘤细胞整体数量时，肿瘤干细胞的比率会同时增加。研究显示肿瘤干细胞与肿瘤发展、肿瘤细胞的迁移及侵袭密切相关。这些因素可能是Abraxane的临床效果有所局限性的原因。
全反式维甲酸(ATRA)是一种可以促使细胞分化的低毒性药物。全反式维甲酸可以诱导肿瘤干细胞的分化，使肿瘤对具有细胞毒性的化疗药物更加敏感，从而可以使得肿瘤的治疗效果得到一定程度的提高。同时，全反式维甲酸可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，表现出一定的抗肿瘤转移能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫杉醇和全反式维甲酸的共运输的白蛋白纳米药物，用于转移性癌症的治疗。
具体地，本发明的第一个方面提供一种白蛋白纳米颗粒，其同时负载紫杉醇和全反式维甲酸。
人血清白蛋白是作为一种具有很好生物相容性的药物载体，由于蛋白结构中具有疏水结构域，因而可以负载疏水性药物紫杉醇和全反式维甲酸。其他物种的白蛋白如牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、猪血清白蛋白与人血清白蛋白在结构和功能上具有高度的同源性，因此本领域技术人员知晓，它们都可以用来制备紫杉醇和全反式维甲酸共运输纳米药物颗粒的载体。因此，在优选的实施方案中，所述白蛋白选自由牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、猪血清白蛋白与人血清白蛋白组成的组。
在优选的实施方案中，所述白蛋白选自人血清白蛋白和牛血清白蛋白。
在优选的实施方案中，所述白蛋白选自人血清白蛋白。
在优选的实施方案中，所述白蛋白纳米颗粒的粒径在40纳米至300纳米范围之间。
在优选的实施方案中，所述白蛋白纳米颗粒的粒径在70纳米至200纳米范围之间。
在优选的实施方案中，所述紫杉醇和全反式维甲酸的药物质量总和为所述白蛋白纳米颗粒的1％至50％。
在优选的实施方案中，所述紫杉醇和全反式维甲酸的质量比在1:0.5至1:20的范围内。
在优选的实施方案中，所述白蛋白纳米颗粒可以通过静脉内途径给药。
本发明的第二个方面提供本发明第一方面所述的白蛋白纳米颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症。
在优选的实施方案中，所述治疗癌症包括：
1)抑制癌症的生长和/或转移；
2)降低肿瘤细胞的干性，所述降低肿瘤细胞的干性优选通过降低肿瘤细胞的干性基因的表达水平来实现；
3)抑制肿瘤细胞耐药性；和/或
4)抑制基质金属蛋白酶的活性。
本发明的第三个方面提供制备本发明第一方面所述的白蛋白纳米颗粒的方法，所述方法依次包括以下步骤：
1)向白蛋白溶液中加入还原剂；
2)加入紫杉醇和全反式维甲酸；
3)将步骤2)得到产物置于氧化环境中并透析，得到同时负载紫杉醇和全反式维甲酸的白蛋白纳米颗粒。
其中，还原剂用来还原打开蛋白分子内的二硫键，使白蛋白的疏水结构域更加的暴露使其更加有利于对疏水药物的负载，并在氧化重组二硫键的过程中形成分子间二硫键以形成蛋白质纳米颗粒。因此，含巯基的半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基乙醇、二硫苏糖醇等，或含膦的三(2-羧乙基)膦等、以及硼氢化钠等无机还原剂试剂均可用于本发明的方法。因此，在优选的实施方案中，所述还原剂选自由以下各项组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基乙醇、硼氢化钠、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其任意组合。
在优选的实施方案中，所述还原剂是谷胱甘肽。
在优选的实施方案中，所述透析的过程可以除掉未被包载进纳米颗粒的药物、溶解药物的溶剂(DMSO或其它有机溶剂)以及过量还原剂。
在优选的实施方案中，所述氧化环境包括空气自然氧化或加入氧化剂，加入氧化剂可以加速氧化，并且所述氧化剂优选选自氧气或过氧化氢。
在优选的实施方案中，所述方法还包括通过离心和/或超滤方法收集，和/或经过真空干燥或冷冻干燥制备干粉的步骤。所述干粉方便纳米颗粒的储存和运输，并且干粉可以经过溶剂重新分散后使用。
本发明首次将紫杉醇和全反式维甲酸通过白蛋白为载体以共运输的方式制备其纳米药物颗粒用于转移性癌症的治疗。
所制备的白蛋白负载的紫杉醇和全反式维甲酸共运输纳米药物具有抑制基质金属蛋白酶活性的功能，这一功能对抑制肿瘤转移具有作用。
所制备的白蛋白负载的紫杉醇和全反式维甲酸共运输纳米药物可以降低肿瘤细胞的迁移、侵染的功能，这一功能对抑制肿瘤转移具有作用。
所制备的白蛋白负载的紫杉醇和全反式维甲酸共运输纳米药物可以降低肿瘤细胞的干性、或具有抑制肿瘤细胞耐药性的功能，这一功能对抑制肿瘤发展具有作用。
我们对纳米颗粒药物中的紫杉醇和全反式维甲酸两种药物的比例进行了优化，得到了一个具有抑制肿瘤生长和转移双重功效的纳米颗粒药物。
本发明中的制备方法简单，制备过程中未使用任何高毒性的试剂，毒副作用低，具有很好的生物兼容性。制备的纳米颗粒稳定，大小均一，药物可以实现持续缓慢释放。
附图说明
图1采用动态光散射测定几种制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的粒径分布。
图2采用透射电镜测定几种制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的粒径大小和外观形貌。
图3采用动态光散射测定制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的稳定性。
图4紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒中药物的释放。
图5紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的细胞毒性检测。(A)PTX、PTX-NPs、ATRA、ATRA-NPs对细胞增殖的抑制作用；(B)不同比例的PTX和ATRA的联合使用及共运输使用对细胞增殖的抑制作用。
图6紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。(A)紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒及其相应对照组对肿瘤细胞迁移能力的影响；(B)紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒及其相应对照组对肿瘤细胞侵袭能力的影响；(C)A图的定量统计结果；(D)B图的定量统计结果。
图7紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒降低基质金属蛋白酶的活性。
图8紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒降低肿瘤干细胞水平。
图9紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒抑制肿瘤生长：(A)小鼠在治疗过程中肿瘤的体积随时间变化的曲线；(B)各组治疗结束后肿瘤的重量；(C)各组治疗结束后肿瘤的图像；(D)治疗过程中小鼠的体重变化。
图10紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒抑制肿瘤转移。(A)小鼠在治疗结束后肺部的肿瘤结节数量统计结果；(B)小鼠在治疗结束后肺组织图像；(C)小鼠在治疗结束后肺组织的组织病理染色图像。
具体实施方式
本发明通过以白蛋白为载体，制备了一种紫杉醇和全反式维甲酸的共运输纳米药物，用以针对癌症，特别是转移性癌症进行治疗。体外实验结果表明，该共运输纳米药物可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，降低肿瘤细胞的干性基因的表达水平，抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性。体内实验表明该共运输纳米药物可以抑制肿瘤生长的同时抑制肿瘤向肺部的转移。
下面结合实施例对本发明做详细说明，但不仅限于下述实施例。
主要仪器与试剂耗材来源：人血白蛋白购于北京索莱宝科技有限公司，紫杉醇和全反式维甲酸购于上海笛柏化学品技术有限公司，胰消化酶和胎牛血清购于Gibco，DMEM高糖培养基购于HyClone，明胶(来源于猪皮肤，Type A)购于Sigma-Aldrich，MTT购于上海生工生物工程股份有限公司，Matrigel、细胞培养板、Transwell板(24孔，8mm孔径)购于Coring，荧光定量PCR试剂盒购于罗氏，4T1细胞购于上海细胞库，Balb/c裸鼠购于上海斯莱克实验动物实验动物有限公司，其他常规试剂购于国药集团。实施例1：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的制备
将5mg人血清白蛋白溶于2.5mL的双蒸水中，然后加入谷胱甘肽使其终浓度为50mM。混匀后至于37摄氏度温水中水浴10min。将质量比为1:2的紫杉醇和全反式维甲酸溶于DMSO中，使两种药物总的质量浓度为20mg/mL。水浴完成后，在漩涡震荡下向蛋白溶液中缓慢加入100μL 20mg/mL的紫杉醇与全反式维甲酸的混合的DMSO溶液。然后在37摄氏度温水中水浴30min。水浴完成后，将样品转移到截留分子量为14000的透析袋中，然后在PBS中透析12小时，每四小时换一次透析外液(PBS)，每次透析外液的体积为5L。透析完成后即得同时含有紫杉醇和全反式维甲酸的白蛋白纳米药物的PBS悬浊液。测得其粒径为173nm，紫杉醇和全反式维甲酸的载药量分别为4.9％和19％。
实施例2：不同载药量和药物比例的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的制备
采用实施例1的方法，改变其中紫杉醇与全反式维甲酸的投料比例分别为1:0、0:1、1:0.5、1:2、1:4、1:6、1:20，并且将混合药物的DMSO溶液的总质量浓度分别设置为0.5mg/mL、2mg/mL和3mg/mL来制备不同载药量和药物比例的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒。将紫杉醇和全反式维甲酸的投料比例分别为1:0、0:1两种纳米颗粒分别记作PTX-NPs和ATRA-NPs，而紫杉醇和全反式维甲酸的投料比例分别为1:0.5、1:2、1:4、1:6、1:20的则记作PTX/ATRA-NPs。
采用动态光散射仪(Malvern Zetasizer Nano ZS90)测定实施例2制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的粒径分布，如表1所示。结果显示制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的平均粒径分布在40-300nm的范围内，分布系数PDI在0.08-0.25的范围内。图1是采用动态光散射测定紫杉醇和全反式维甲酸的投料比例分别为1:0、0:1、1:2，总药物浓度为2mg/mL的纳米药物颗粒的粒径分布图。除此之外，我们还采用了透射电镜测定了纳米颗粒的粒径与外观形貌，图2所显示的三种纳米颗粒为直径为100-200nm的球形颗粒，分散性比较好，结果基本与动态光散射测定的结果相吻合。
表1
实施例3：纳米颗粒中紫杉醇和全反式维甲酸包封率和载药量的测定
通过高效液相色谱的方法测定了实施例1制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒中紫杉醇和全反式维甲酸包封率和载药量。采用的色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm,5μm)，紫杉醇的检测波长为227nm，全反式维甲酸的检测波长为340nm。流动相的A相为含0.1％三氟乙酸的水，B相为乙腈，流速为1mL/min。0-5min采用55％B相的等度洗脱，5-10min采用55％-80％的线性梯度洗脱。测定的结果如下表2所示。
表2
综合实施例2和实施例3和多种条件的实验结果，我们得出当投料药物的总浓度小于5mg/mL时，药物的载药量比较低；当投料药物的总浓度大于30mg/mL时，得到的纳米颗粒的粒径比较大，且均一性有所下降。因此，投料药物的总浓度为5-30mg/mL是一个相对较好的浓度范围，其中优选15-25mg/mL的浓度。
实施例4：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的稳定性检测
采用动态光散射测定了实施例1制备的紫杉醇和全反式维甲酸纳米药物颗粒的稳定性，如图3所示，该纳米颗粒均可以在含10％血清的DMEM培养基中稳定存在至少一周而保持粒径不发生明显的变化。
实施例5：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒中药物的释放
采用透析的方法来检测紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒中药物的释放。将实施例1制备的2mL的纳米颗粒放入截留分子量为14000的透析袋中，然后放入透析外液(含10％乙醇的PBS)中透析，温度为37摄氏度。在设定的时间点将透析外液换成新鲜的透析外液，原透析外液用于高效液相色谱检测以测定释放出的药物量。高效液相色谱的条件同实施例3。测定结果如图4所示，结果显示纳米颗粒所负载的药物以持续缓慢的方式释放出来。
实施例6：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒的细胞毒性检测
将4T1细胞(购于上海细胞库)以每孔4000个细胞的数量接种于96孔培养板，在37摄氏度，5％CO2条件下的培养箱中培养12h。然后弃掉培养基，加入含不同浓度含不同比例的紫杉醇、全反式维甲酸及其相应的共运输纳米药物颗粒，继续培养72h。然后弃掉培养基，加入含MTT的培养基孵育4h。待孵育完成后，每孔加入100μL细胞裂解液(20％SDS溶于DMF和水1:1混合溶液中，pH＝4.7)并在同样条件下继续孵育4h。然后利用酶标仪(Bio-Rad680microplate reader)测定每孔在490nm的吸光度值并计算细胞活性。结果如图5所示，结果显示通过白蛋白包负的紫杉醇的细胞毒性略微大于单独的紫杉醇，而且紫杉醇-全反式维甲酸共运输纳米药物颗粒的PTX与ATRA的投料质量比例在1:0.5-1:20的范围内时，具有比两种单独药物的简单混合及对应纳米药物颗粒简单混合更好的抑制肿瘤细胞生长的效果，其中PTX与ATRA最优的投料质量比例为1:2。这说明紫杉醇-全反式维甲酸共运输纳米药物颗粒比单独的紫杉醇或者紫杉醇与全反式维甲酸的简单混合会具有更好的治疗优势。
实施例7：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力
将4T1细胞预先用含有紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒且不含血清的培养基培养24小时进行药物预处理。对于迁移能力的检测，将预处理后的4T1细胞以每孔10000个细胞的数量接种于Transwell小室；对于侵袭能力的检测，先在Transwell小室膜的上表面铺上一层Matrigel(购于Coring公司)，再将预处理后的4T1细胞以每孔20000个细胞的数量接种于Transwell小室。在小室下面加入500μL的含10％的血清的培养基诱导细胞向下迁移。培养24小时后，用棉花球将没有穿过小室膜的细胞擦去，穿过小室膜的细胞用0.1％的结晶紫进行染色，最后在用显微镜进行观察和拍照进行定性分析。对于结果的定量分析，将染色后的细胞用10％的乙酸进行脱色10min，在测脱色液的在550nm处的吸收值并进行定量分析。定性和定量的结果分别如图6所示。从图中我们可以看出紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒可以明显抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而显示出其抗肿瘤转移活性。
实施例8：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒降低基质金属蛋白酶的活性
采用明胶酶谱法来检测紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒对基质金属蛋白酶的活性的影响。将4T1细胞以每孔1×106个细胞接种于6孔板，培养12h后将培养基换成含有相应药物但不含血清的培养基并继续培养24h。待培养完成后收集培养液用于明胶酶谱分析其中的基质金属蛋白酶MMPs的活性：40微升样品与上样缓冲液混合(250mM Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)，其中含有10％SDS、0.5％BPB、50％甘油)，然后使用10％的PAGE分离胶(含1mg/mL的明胶)进行凝胶电泳，电泳结束后，将凝胶放置于洗脱液(50mM Tris-HCl缓冲液，其中含有5mM CaCl2，1μMZnCl2，2.5％Triton X-100，pH＝7.6)中振荡洗脱4次，每次15分钟，然后在漂洗液(50mM Tris-HCl缓冲液，其中含有5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH＝7.6)中震荡漂洗2次，每次20min，最后在孵育液(50mM Tris-HCl缓冲液，其中含有5mM CaCl2，1μM ZnCl2，150mM NaCl，0.02％Brij-35，pH＝7.6)中，37摄氏度孵育48h。孵育完成后在染色液(0.05％考马斯亮兰R-250、30％乙醇和10％乙酸)中震荡染色30分钟，然后在脱色液(10％乙酸、5％乙醇、85％水)中脱色1小时。脱色完成后用凝胶成像仪(Tanon1600)拍摄图像。结果如图7所示。从图中我们可以看出紫杉醇-全反式维甲酸共运输纳米药物颗粒实验组相对于其他实验对照组的条带亮度更低，说明共运输紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒可以降低基质金属蛋白酶的活性，从而显示出其抗肿瘤转移能力。
实施例9：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒降低肿瘤干细胞水平
将4T1细胞以每孔接种于1×106个细胞接种于6孔板培养12h，然后将培养基换成含有相应药物但的培养基并继续培养24h。待培养完成后，收集细胞并提取总RNA。再用实时荧光定量PCR试剂盒(480SYBR Green I Master，Roche)检测干性相关基因Sox2、Oct4和Nanog的表达水平的变化，检测方法参照试剂盒的使用说明书。结果如图8所示，从图中我们可以看出紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒明显降低肿瘤干细胞水平。
实施例10：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒抑制肿瘤生长
将4T1细胞以每只3×105个细胞植于雌性裸鼠的右乳房垫下，当肿瘤体积长到100-200mm3的时候将荷瘤小鼠随机分成5组，每组5只。每组分别静脉注射紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒及其相应的对照药物颗粒，即分别为PBS,PTX-NPs,ATRA-NPs,PTX-NPs+ATRA-NPs和PTX/ATRA-NPs五个实验组，紫杉醇和全反式维甲酸的注射剂量为1.5mg/kg和5.4mg/kg，给药频率为每隔一天注射一次。实验结果如图9中的A-D所示，从A图是小鼠在治疗过程中肿瘤的体积随时间变化的曲线，从图中我们可以看出紫杉醇-全反式维甲酸共运输纳米药物颗粒实验组(PTX/ATRA-NPs)的肿瘤生长速度慢与其他实验组，这说明我们制备的紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗纳米药物颗具有更好的抑制肿瘤生长的效果。B和C图的各组治疗结束后肿瘤的重量和拍照结果同样也验证了这一点。D图是治疗过程中小鼠的体重变化，从图中我们可以看出，小鼠的体重在治疗过程中基本维持不变，没有出现体重下降的情况，这说明我们各个组的使用的药物剂量没有出现明显的系统毒性。
实施例11：紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒抑制肿瘤转移
将实施例10治疗结束的小鼠处死后解剖，取出小鼠的肺组织，对转移到小鼠肺部的肿瘤结块进行计数统计和拍照，结果分别如图10中的A、B所示，从图中我们可以看出，紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒明显抑制肿瘤向肺的转移。然后我们对各组的肺部组织切片进行H&E染色，从而观察转移到肺组织内部的肿瘤的生长情况。从图中我们可以看出紫杉醇-全反式维甲酸纳米药物颗粒明显抑制了转移到肺组织内部的肿瘤数量和规模。

Claims (10)

1.一种白蛋白纳米颗粒，其同时负载紫杉醇和全反式维甲酸。
2.根据权利要求1所述的白蛋白纳米颗粒，所述白蛋白选自由牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、猪血清白蛋白与人血清白蛋白组成的组，优选选自人血清白蛋白和牛血清白蛋白，最优选选自人血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的白蛋白纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径在40纳米至300纳米范围之间，优选在70纳米至200纳米范围之间。
4.根据权利要求1所述的白蛋白纳米颗粒，所述紫杉醇和全反式维甲酸的药物质量总和为所述白蛋白纳米颗粒的1％至50％，所述紫杉醇和全反式维甲酸的质量比在1:0.5至1:20的范围内。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的白蛋白纳米颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症，优选所述白蛋白纳米颗粒通过静脉内途径给药。
6.根据权利要求5所述的用途，所述治疗癌症包括：
1)抑制癌症的生长和/或转移；
2)降低肿瘤细胞的干性，所述降低肿瘤细胞的干性优选通过降低肿瘤细胞的干性基因的表达水平来实现；
3)抑制肿瘤细胞耐药性；和/或
4)抑制基质金属蛋白酶的活性。
7.根据权利要求1所述的白蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法依次包括以下步骤：
1)向白蛋白溶液中加入还原剂；
2)加入紫杉醇和全反式维甲酸；
3)将步骤2)得到产物置于氧化环境中并透析，得到同时负载紫杉醇和全反式维甲酸的白蛋白纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的方法，所述还原剂选自由以下各项组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基乙醇、硼氢化钠、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其任意组合。
9.根据权利要求7所述的方法，所述氧化环境包括空气自然氧化或加入氧化剂，所述氧化剂优选选自氧气或过氧化氢。
10.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括通过离心和/或超滤方法收集，和/或经过真空干燥或冷冻干燥制备干粉的步骤。
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