CN110200916A - 一种双重酸敏性脂质体、以其为载体的药物及其制备方法 - Google Patents
一种双重酸敏性脂质体、以其为载体的药物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种双重酸敏性脂质体、以其为载体的药物及其制备方法。该双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧基的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，多肽DVar7的氨基酸序列为ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL。以该双重酸敏性脂质体为载体可制备抗癌药物。本发明的双重酸敏性脂质体将酸性pH敏感多肽和pH敏感磷脂联合起来，提高了肿瘤对药物的摄取，延长了药物在肿瘤中的滞留时间，增加了药物的控释和递送效率，与单纯化药、普通脂质体载药、单响应脂质体载药的治疗效果相比，获得了更好的肿瘤抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗药物技术领域，具体涉及一种双重酸敏性脂质体、以其为载体的药物及其制备方法。
背景技术
癌症是目前造成人类死亡的第一大杀手，而肿瘤的转移和侵袭是癌症致死的主要原因。用化疗药物治疗肿瘤存在非常明显的毒副作用，由于临床上常用的化疗药物为弱碱性化疗药，其在肿瘤酸性微环境中容易发生质子化而出现肿瘤耐药。目前，最常用于改善碱性化疗药物肿瘤耐药的方法为脂质体制剂的使用。
脂质体作为一种新型给药系统，具有组织相容性，细胞亲和性，靶向性和缓释性等优点，可包载水溶性和脂溶性药物，由于药物以非共价键结合的方式被包裹，有利于药物的释放，且制备工艺简单适合大量生产。然而脂质体也有一些缺点，如低溶解、物理化学稳定性差、出现药物渗漏等。
pH敏感脂质体通常使用具有pH敏感性的生物高分子材料或具有pH敏感性的磷脂材料制备。pH敏感脂质体可以包载脂溶性药物和水溶性药物，还可以包载蛋白类药物和基因类药物，它可以在降低对正常细胞毒性的同时提高药物靶向性，从而提高治疗效果。
然而pH敏感脂质体及以其作为载体的肿瘤治疗药物的研究还不成熟，尚存在大量研究空白。
发明内容
本发明的目的在于针对于肿瘤酸性微环境，提供给一种pH双重响应的脂质体即双重酸敏性脂质体，并以其装载弱碱性化疗药物； 能够提高现有pH敏感型脂质体的靶向性，使脂质体更多滞留在肿瘤部位，提高肿瘤对包载药物的摄取，延长药物在肿瘤中的滞留时间，同时通过酸性敏感材质对肿瘤酸性微环境的响应，增加药物的控释和递送效率，获得更好的肿瘤抑制效果。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧基的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，所述多肽DVar7的为氨基酸序列为ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLELD(Ala-Cys-Glu-Glu-Gln-Asn-Pro-Trp-Ala-Arg-Tyr-Leu-Glu-Trp-Leu-Phe-Pro-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Leu-Glu-Leu)。
进一步的方案，所述pH性敏感磷脂为DOPE，所述含有羧基的脂质为CHEMS。
进一步的方案，所述多肽DVar7通过DSPE-PEGn连接至磷脂双分子层骨架表面，n为1000~3000。
进一步的方案，n为2000。
一种以所述的双重酸敏性脂质体为载体形成的药物。
进一步的方案，所述双重酸敏性脂质体内部的亲水核心包载有阿霉素。
一种双重酸敏性脂质体的制备方法，所述双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧基的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，所述多肽DVar7的氨基酸序列为ACEEQNOWARYLEWLFPTETLLLEL；所述pH敏感性磷脂为DOPE，所述含有羧酸的脂质为CHEMS；所述多肽DVar7通过DSPE-PEG2000连接至磷脂双分子层骨架表面，包括以下制备步骤：
1） 合成DSPE-PEG2000-DVar7：由线性多肽DVar7与DSPE-PEG2000-MAL偶联合成DSPE-PEG2000-DVar7；
2）制备单酸敏脂质体：将制备单酸敏脂质体的各种材料：包括DOPE、 CHEMS、DSPE-PEG2000，在反应器中用氯仿溶解， 37 ℃水浴条件下，抽真空旋蒸去除溶剂获得脂膜；加入中性缓冲液，37 ℃水浴，涡旋使脂膜脱落，超声，形成均一稳定的脂质体溶液；将脂质体溶液过Sephadex G-50凝胶柱，用缓冲液洗脱，获得单酸敏脂质体；
3） DSPE-PEG2000-DVar7插入至单酸敏脂质体：将步骤2）制备得到的单酸敏脂质体与步骤1）制备的DSPE-PEG2000-DVar7混合，于50~60 ℃水浴中反应0.5~2 h，至脂质体溶液恢复澄清即插入完成，得到双重酸敏性脂质体。
进一步的方案，DOPE、 CHEMS 、DSPE-PEG2000 、DSPE-PEG2000-DVar7的质量比为：60:40:4:2。
一种包载阿霉素的双重酸敏性脂质体的制备方法，所述双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧酸的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，所述多肽DVar7的 氨基酸序列为ACEEQNOWARYLEWLFPTETLLLEL；所述pH敏感磷脂为DOPE，所述含有羧酸的脂质为CHEMS；所述多肽DVar7通过DSPE-PEG2000连接至磷脂双分子层骨架表面，包括以下制备步骤：
1） 合成DSPE-PEG2000-DVar7：由线性多肽DVar7与DSPE-PEG2000-MAL偶联合成DSPE-PEG2000-DVar7；
2） 制备单酸敏脂质体：将制备单酸敏脂质体的各种材料：包括DOPE、 CHEMS DSPE-PEG2000，在反应器中用氯仿溶解， 37 ℃水浴条件下，抽真空旋蒸去除溶剂获得脂膜；加入中性缓冲液，37 ℃水浴，涡旋使脂膜脱落，超声，形成均一稳定的脂质体溶液；将脂质体溶液过Sephadex G-50凝胶柱，用缓冲液洗脱，获得单酸敏脂质体；
3）包载阿霉素：按药脂重量比1:10的比例称取盐酸阿霉素，用超纯水溶解后，加入到单酸敏脂质体溶液中，将混合物置于37 ℃水浴反应，得到包载阿霉素的单酸敏脂质体；
4） DSPE-PEG2000-DVar7插入至单酸敏脂质体：将步骤3）制备得到的包载阿霉素的单酸敏脂质体与步骤1）制备的DSPE-PEG2000-DVar7混合，于50~60 ℃水浴中反应0.5~2 h，至脂质体溶液恢复澄清即插入完成，得到包载阿霉素的双重酸敏性脂质体。
进一步的方案，DOPE、 CHEMS、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-DVar7的质量比为：60:40:4:2。
本发明的有益效果：
本发明的双重酸敏性脂质体将酸性pH敏感多肽和pH敏感磷脂联合起来，通过酸性敏感多肽对肿瘤酸性微环境的响应，将双重酸敏性脂质体更多滞留在肿瘤部位，提高了肿瘤对药物的摄取，延长了药物在肿瘤中的滞留时间，同时通过酸性敏感磷脂对肿瘤酸性微环境的响应，增加了药物的控释和递送效率，因而与单纯化药、普通脂质体载药、单响应脂质体载药的治疗效果相比，获得了更好的肿瘤抑制效果。
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明双重酸敏性脂质体结构示意图；
图2为双重酸敏性脂质体包载阿霉素后的结构示意图；
图3为双重酸敏性脂质体合成方法示意图；
图4为双重酸敏性脂质体包载阿霉素制备方法示意图；
图5为三种脂质体不同pH条件下在MDA-MB-435S肿瘤细胞的摄取情况
（DOPC-lip@Cy5.5：添加了荧光物质Cy5.5的普通脂质体；DOPE-lip@Cy5.5：添加了荧光物质Cy5.5的单酸敏脂质体；DOPE-DVar7-lip@Cy5.5：添加了荧光物质Cy5.5的双重酸敏性脂质体，下图同）；
图6为三种脂质体不同pH条件下在Hela肿瘤细胞中的摄取情况；
图7为不同脂质体在MDA-MB-435S肿瘤模型的近红外荧光活体成像；
图8为图7中脂质体在MDA-MB-435S肿瘤模型近红外荧光活体成像的定量对比图；
图9为肿瘤细胞摄取包载阿霉素的脂质体的流式细胞定量图（DOPC-lip@DOX：包载了阿霉素的普通脂质体；DOPE-lip@DOX：包载了阿霉素的单酸敏脂质体；DOPE-DVar7-lip@DOX：包载了阿霉素的双重酸敏性脂质体，下图同）；
图10为阿霉素脂质体的细胞毒性比较；
图11为裸鼠给药后肿瘤体积变化情况；
图12 为各个治疗组的肿瘤重量对比情况。
具体实施方式
本发明的一种双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧基的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，多肽DVar7的 氨基酸序列为ACEEQNOWARYLEWLFPTETLLLEL D(Ala-Cys-Glu-Glu-Gln-Asn-Pro-Trp-Ala-Arg-Tyr-Leu-Glu-Trp-Leu-Phe-Pro-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Leu-Glu-Leu)；pH性敏感磷脂优选为DOPE，含有羧基的脂质优选为为CHEMS（结构图如图1）。多肽DVar7通过DSPE-PEGn连接至磷脂双分子层骨架表面，n为1000~3000，优选为2000。
以所述双重酸敏性脂质体为载体可包载抗癌药物，其双分子层可包载脂溶性药物，其亲水核心可包载水溶性药物，如阿霉素等碱性水溶性药物（如图2所示）。
具体实施方式及产品实验结果通过实施例详细介绍。实施例中所用药品来源如下。
多肽DVar7（ACEEQNOWARYLEWLFPTETLLLEL):吉尔生化公司合成。DSPE-PEG2000-MAL：西安瑞禧生物科技有限公司。HEPES，EDTA﹒2Na﹒2H2O:美国Sigma-Aldrich公司生产。二油酰磷脂酰胆碱（DOPC），二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)，胆固醇（Cholesterol），胆固醇琥珀酸酯（Cholesteryl hemisuccinate，CHEMS）：上海艾韦特医药科技有限公司。DSPE-PEG2000：NOF Corporation（Tokyo，Japan）。Cy5.5:美国AAT Bioquest公司。三氯甲烷分析纯：北京化工厂。Sephadex G-50：美国Pharmacia Bitech公司。微孔滤膜（孔径0.22 μm，直径13 mm）：Nalge Nuc International公司。超纯水（18.2 MΩ H2O）：来自超纯水系统Mili-QS（美国Milipore公司）。其他化学试剂均为分析纯。Leiboviz’s L-15培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、无菌PBS缓冲液、0.25%胰酶：中科迈晨科技有限公司。生理盐水：国药集团化学试剂有限公司。一次性无菌1 mL注射器：美国碧迪医疗器械有限公司。游标卡尺：国药集团化学试剂有限公司。
试剂配制：
pH 7.0的HBS溶液：精确称取HEPES 0.238 g，EDTA﹒2Na﹒2H2O 0.206 g，加超纯水45mL，用1M NaOH调pH至7.0，超纯水定容至50mL。
pH 7.8的HBS溶液：精确称取HEPES 0.238 g，EDTA﹒2Na﹒2H2O 0.206 g，加超纯水45 mL，用1M NaOH调pH至7.8，超纯水定容至50 mL。
实施例1
本实施例为制备双重酸敏性脂质体，并通过与普通脂质和单酸敏脂质体的对比验证其效果。具体步骤如下：
DSPE-PEG2000-DVar7的合成：
DSPE-PEG2000-DVar7由线性多肽DVar7与DSPE-PEG2000-MAL偶联而成，DSPE-PEG2000-MAL与多肽DVar7反应摩尔比为1.2 : 1。
本实施例中合成方法：精确称取DSPE-PEG2000-MAL3.53 mg（约1.2 μmol），用氯仿3mL溶解后移入25 mL茄型瓶中，用真空旋转蒸发仪旋蒸10 min，旋干成一层均匀薄膜，加入1.5 mL pH 7.0的HBS溶液，茄型瓶封口后置于37 ℃水浴锅中至脂膜脱落，37 ℃水浴超声至溶液澄清，吸出加入到装有3.065 mg DVar7（约1 μmol）的2 mL EP管中，DSPE-PEG2000-MAL与多肽DVar7反应摩尔比为1.2 : 1，于涡旋震荡器上涡旋至DVar7完全溶解。用安捷伦1260 Infinity HPLC系统进行反应监测及产物分离纯化。流动相A为去离子水（含0.05%TFA），B为乙腈（含0.05% TFA），反应监测使用C 4分析柱，流速1 mL/min，分离收集产物使用C4半制备柱，流速为3 mL/min。信号选取210 nm及254 nm。D-Var7完全溶解后，HPLC监测反应，于27 min出现新峰。用C4半制备柱对产物进行分离并收集，经液氮迅速冷冻，置于真空冷冻干燥机内，冻干得到白色粉末。
荧光脂质体的制备：
制备三种荧光脂质体，DOPC-lip@Cy5.5（添加了荧光物质Cy5.5的普通脂质体），DOPE-lip@Cy5.5（添加了荧光物质Cy5.5的单酸敏脂质体），DOPE-DVar7-lip@Cy5.5（添加了荧光物质Cy5.5的双重酸敏性脂质体，结构如图1，其中的荧光物质未标出，制备方法如图3）。DOPC-lip@Cy5.5以非酸敏磷脂DOPC为骨架，为非酸敏脂质体，DOPE-lip@Cy5.5以酸性敏感磷脂DOPE为骨架，为单酸敏脂质体，DOPE-DVar7-lip@Cy5.5是以酸性敏感磷脂DOPE为骨架，表面修饰酸敏性多肽DVar7的双重酸敏脂质体。配方如表1所示。按配方精确称取各种材料，用氯仿将材料溶解（制备DOPE-DVar7-lip时将除DSPE-PEG2000-DVar7以外的其他组分溶解），移入25 mL棕色茄型瓶中，总体积10 mL，37 ℃水浴条件下，抽真空旋蒸至形成一层均匀薄膜，继续旋蒸5 min至有机溶剂清除完全。吸取1.5 mL pH 7.8的HBS溶液加入茄型瓶中，将茄型瓶置于37 ℃水浴中水化20 min，涡旋使脂膜脱落，移入2 mL EP管中，用锡纸包裹，用超声探头超声10 min（超声1 s停顿1 s），使形成均一稳定的脂质体溶液。之后，将脂质体溶液过Sephadex G-50凝胶柱，用pH 7.8的HBS溶液洗脱，除去游离的Cy5.5荧光染料，收集得到载有Cy5.5的荧光脂质体。将制备DOPE-DVar7-lip时第一步制备得到的荧光脂质体与相应比例的DSPE-PEG2000-DVar7混合，于55 ℃水浴中反应1 h，至脂质体溶液恢复澄清即插入完成，得到靶向脂质体DOPE-DVar7-lip。
表1
Cy5.5荧光脂质体的细胞摄取：
为验证肿瘤细胞在不同pH条件下对三种脂质体的摄取情况，确定酸敏脂质体的酸敏性，本实施例选取了MDA-MD-435S和Hela两种肿瘤细胞系。取对数期生长的细胞，用0.25%胰酶消化后收集，分两组，离心（1000 rpm，5 min），弃去上清，分别加入pH 7.4和pH 6.0的培养基稀释成细胞悬液，使细胞浓度约为106 cells/mL，吹打均匀，取18个1.5 mL EP管，其中9个EP管中加入1 mL pH 7.4的细胞悬液，分为三组，分别加入三种荧光脂质体各20 nmol，每组三个平行样；另外9个EP管中加入1 mL pH 6.0的细胞悬液，分为三组，分别加入三种荧光脂质体各20 nmol，每组三个平行样。使用流式细胞仪（BD FACSCalibur）上机测试。
测试结果如图5、6所示，在pH 6.0的条件下，酸敏脂质体DOPE-lip@Cy5.5与DOPC-lip@Cy5.5相比，DOPE-lip@Cy5.5比DOPC-lip@Cy5.5摄取明显增高；双重酸敏脂质体DOPE-DVar7-lip@Cy5.5与单酸敏脂质体DOPE-lip@Cy5.5相比，前者在肿瘤细胞的摄取增加得更明显。综上结果表明，在酸性微环境下，双重酸敏脂质体相比单酸敏脂质体和普通脂质体，其在肿瘤细胞的摄取体现出明显优势。
荧光脂质体在荷瘤鼠体内的光学活体成像：
为验证酸敏脂质体在荷瘤鼠体内的靶向性，用Cy5.5荧光脂质体进行了光学活体成像。待荷瘤裸鼠肿瘤体积达到200~300 mm3时，将9只荷瘤鼠随机分成三组，每组三只，分别注射三种Cy5.5荧光脂质体5 nmol，于给药后的第4，24，48和72 h进行光学活体成像，显像结束后放置两天，对注射DOPE-DVar7-lip组三只荷瘤鼠进行第二次给药，给药前45 min，尾静脉注射25%葡萄糖溶液，使体内葡萄糖终浓度达到5 mg/g。在给药后的第4，24，48和72 h再次进行光学活体成像。处理图像，比较三种荧光脂质体在不同时间点肿瘤部位的摄取差异，验证酸敏脂质体在肿瘤部位的酸性靶向性，将DOPE-DVar7-lip组的两次显像结果进行对比，验证葡萄糖处理能否提高肿瘤部位对酸敏脂质体的摄取。
测试结果如图7、8所示，双重pH敏感的荧光脂质体在肿瘤部位的摄取有绝对优势，且用葡萄糖处理酸化肿瘤微环境后，其摄取可进一步提升。
实施例2
本实施例为使双重酸敏性脂质体包载阿霉素，并通过与普通脂质和单酸敏脂质体的对比验证其效果。具体步骤如下：
空白脂质体的制备：
制备三种阿霉素长循环脂质体，DOPC-lip@DOX，DOPE-lip@DOX，DOPE-DVar7-lip@DOX（结构见图2，制备方法见图4）。DOPC-lip@DOX以非酸敏磷脂DOPC为骨架，为非酸敏脂质体，DOPE-lip@DOX以酸性敏感磷脂DOPE为骨架，为单酸敏脂质体，DOPE-DVar7-lip@DOX是以酸性敏感磷脂DOPE为骨架，表面修饰酸敏性多肽DVar7的双重酸敏脂质体。首先进行载药前空白脂质体的制备，配方如表2所示。按配方精确称取各种材料，用氯仿将材料溶解（制备DOPE-DVar7-lip@DOX时将除靶向磷脂DSPE-PEG2000-DVar7以外的其他组分溶解），移入25mL茄型瓶中，总体积10 mL，37 ℃水浴条件下，抽真空旋蒸至形成一层均匀薄膜，继续旋蒸5min至有机溶剂清除完全。DOPC-lip脂质体所在茄型瓶中加入1.5 mL pH 5.23的(NH4)2SO4溶液，DOPE-lip和DOPE-DVar7-lip所在茄型瓶中加入1.5 mL pH7.0的(NH4)2SO4溶液，将茄型瓶封口后置于37 ℃水浴中水化20 min，涡旋使脂膜脱落，移入2 mL EP管中，用超声探头超声10 min（超声1 s停顿1 s），使形成均一稳定的脂质体溶液。之后，将脂质体溶液过Sephadex G-50凝胶柱，DOPC-lip用pH 7.8的HBS溶液洗脱，得到外水相为pH 7.8的HBS溶液，内水相为pH 5.23的(NH4)2SO4溶液的脂质体溶液。DOPE-lip及DOPE-DVar7-lip用pH 9.0的PB缓冲液洗脱，得到外水相为pH 9.0的PB缓冲液，内水相为pH 7.0的(NH4)2SO4的溶液的脂质体溶液。
表2
空白脂质体装载阿霉素：
按药脂比（w/w）1:10的比例精确称取三份盐酸阿霉素，用超纯水溶解后，分别加入到对应的脂质体溶液中，将混合物置于37 ℃水浴锅中进行阿霉素包载。
后插入法制备主动靶向的阿霉素脂质体：
将制备DOPE-DVar7-lip@DOX时第一步制备得到的阿霉素脂质体与相应比例的DSPE-PEG2000-DVar7混合，于55 ℃水浴中反应1 h，至脂质体溶液恢复澄清即插入完成，得到靶向阿霉素脂质体DOPE-DVar7-lip@DOX。
阿霉素脂质体的肿瘤细胞摄取：
为验证肿瘤细胞不同pH条件下摄取阿霉素脂质体含量随时间的变化，本实施例中，用流式细胞术对不同时间点各组阿霉素的摄取进行了定量。选取MDA-MD-435S肿瘤细胞系，取对数期生长的细胞，用0.25%胰酶消化后收集，分两份分装后离心（1000 rpm，5 min），弃去上清，分别加入pH 7.4和pH 6.0的培养基稀释成细胞悬液，使细胞浓度约为106 cells/mL，吹打均匀，加入6孔板中，每孔2 mL，12 h后，分别加入三种药物DOPC-lip@DOX、DOPE-lip@DOX和DOPE-DVar7-lip@DOX，每种药物四个孔，然后将6孔板放回细胞培养箱中培养，同一药物的四个孔分别于加药后1 h、2 h、4 h、8 h弃去药液，换用相应pH值的新鲜培养基继续培养至8 h，弃去培养基，用0.25%的胰酶消化后收集，用预冷的无菌PBS洗三次，弃上清后每管加入400 μL PBS溶液重悬，过筛网后转入流式管中，使用流式细胞仪（BD FACSCalibur）上机测试。
结果如图9所示，DOPE-lip@DOX和DOPE-DVar7-lip@DOX，在pH 6.0的条件下，摄取明显高于pH 7.4的环境。这个结果再一次验证了这两种脂质体的酸敏性。
阿霉素脂质体的体外细胞杀伤实验：
为验证三种阿霉素脂质体在不同pH条件下的对肿瘤细胞的杀伤效果，本实施例进行了MTT实验。
MTT法测定阿霉素脂质体对肿瘤细胞毒性的实验步骤如下：（1）细胞铺板：选取MDA-MB-435S肿瘤细胞系，取对数期生长的细胞，用0.25%胰酶消化后加入培养基吹打均匀，分为两份，分别用pH 7.4和pH 6.0的培养基稀释为1×105 cells/mL，边吹打边加入96孔板中，每孔100 μL，两个pH值各铺4个板，放回细胞培养箱中培养24 h；（2）加药：弃去培养液，每组的四个96孔板分别加入相应pH值培养基稀释后的四种药物：游离阿霉素、DOPC-lip@DOX、DOPE-lip@DOX、DOPE-DVar7-lip@DOX，每个96孔板所加药物中DOX浓度分别为0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL，每个浓度六个复孔，加药后放回细胞培养箱中孵育4 h，弃上清后加入相应pH值的新鲜培养基继续培养至48 h；（3）测定：每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，放回培养箱中孵育4 h，小心弃去培养液，每孔加DMSO 200 μL，涡旋10 min，使结晶完全溶解。于酶联免疫检测仪OD490 nm处测定各孔的吸光度值。
实验结果见图10，双重酸敏脂质体DOPE-DVar7-lip在pH 7.4和pH 6.0的环境中，IC50值分别为23.50 μg/mL和16.68 μg/mL，其在pH 7.4的IC50值约为pH 6.0的1.41倍，表明在pH 6.0的条件下，双重酸敏脂质体的细胞杀伤作用明显增强，原因是pH 6.0的微环境使得细胞内外pH梯度差增大，DOPE-DVar7-lip上的靶头DVar7在酸性条件下可以变构进而插入到细胞膜上，促进脂质体与肿瘤细胞膜的融合，DOPE酸性敏感磷脂在酸性微环境中，不仅可以促进膜融合，还可以促进脂质体在肿瘤细胞内释放药物阿霉素，酸性微环境下DOPE-DVar7-lip的双重pH响应，使得脂质体更多地进入肿瘤细胞并可以快速释放阿霉素，产生一个高浓度药物聚集，进而发挥更强的肿瘤细胞杀伤作用。
双重响应的阿霉素脂质体在荷瘤鼠的靶向治疗：
为验证双重酸敏阿霉素脂质体在不同pH肿瘤酸性微环境的治疗效果，待肿瘤体积生长至50 ~80 mm3时，选择42只，按肿瘤体积大小平均分成七组，每组六只。尾静脉注射给药100μL，给药剂量为阿霉素5 mg/kg。
（1）对照组：注射生理盐水；（2）阿霉素治疗组：注射阿霉素；（3）正常微环境实验组：DOPC-lip@DOX组：注射DOPC-lip@DOX；DOPE-lip@DOX组：注射DOPE-lip@DOX；DOPE-DVar7-lip@DOX组：注射DOPE-DVar7-lip@DOX。（4）酸性微环境实验组：DOPC-lip@DOX组：注射DOPC-lip@DOX，打药前45 min静脉注射高浓度（25%）葡萄糖（终浓度为5 mg/g），打药后第2，3，4天，每天腹腔注射500 μL等渗（5%）的葡萄糖溶液维持酸性微环境；DOPE-DVar7-lip@DOX组：注射DOPE-DVar7-lip@DOX，打药前45 min静脉注射高浓度（25%）葡萄糖，打药后第2，3，4天，每天腹腔注射500 μL 等渗（5%）的葡萄糖溶液维持酸性微环境。
整个治疗周期：第0，4，8，12，16天给药，共五次。检测肿瘤质量和重量。
其结果如图11、12所示，用双重酸敏脂质体可以使得肿瘤生长得到完全抑制，效果明显由于其他两种脂质体。
Claims (10)
1.一种双重酸敏性脂质体，其特征在于：以pH敏感性磷脂和含有羧基的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，所述多肽DVar7为全D型多肽，氨基酸序列为ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL。
2.根据权利要求1所述的双重酸敏性脂质体，其特征在于：所述pH性敏感磷脂为DOPE，所述含有羧基的脂质为CHEMS。
3.根据权利要求1所述的双重酸敏性脂质体，其特征在于：所述多肽DVar7通过DSPE-PEGn连接至磷脂双分子层骨架表面，n为1000~3000。
4.根据权利要求3所述的双重酸敏性脂质体，其特征在于：n为2000。
5.一种以权利要求1~4中任意一项所述的双重酸敏性脂质体为载体形成的药物。
6.根据权利要求5所述药物，其特征在于：所述双重酸敏性脂质体内部的亲水核心包载有阿霉素。
7.一种双重酸敏性脂质体的制备方法，所述双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧基的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，所述多肽DVar7的氨基酸序列为ACEEQNOWARYLEWLFPTETLLLEL；所述pH敏感性磷脂为DOPE，所述含有羧酸的脂质为CHEMS；所述多肽DVar7通过DSPE-PEG2000连接至磷脂双分子层骨架表面，其特征在于：包括以下制备步骤：
1）合成DSPE-PEG2000-DVar7：由线性多肽DVar7与DSPE-PEG2000-MAL偶联合成DSPE-PEG2000-DVar7；
2）制备单酸敏脂质体：将制备单酸敏脂质体的各种材料：包括DOPE、 CHEMS、DSPE-PEG2000，在反应器中用氯仿溶解， 37 ℃水浴条件下，抽真空旋蒸去除溶剂获得脂膜；加入中性缓冲液，37 ℃水浴，涡旋使脂膜脱落，超声，形成均一稳定的脂质体溶液；将脂质体溶液过Sephadex G-50凝胶柱，用缓冲液洗脱，获得单酸敏脂质体；
3） DSPE-PEG2000-DVar7插入至单酸敏脂质体：将步骤2）制备得到的单酸敏脂质体与步骤1）制备的DSPE-PEG2000-DVar7混合，于50~60 ℃水浴中反应0.5~2 h，至脂质体溶液恢复澄清即插入完成，得到双重酸敏性脂质体。
8.根据权利要求7所述的双重酸敏性脂质体的制备方法，其特征在于：DOPE、 CHEMS、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-DVar7的质量比为：60:40:4:2。
9.一种包载阿霉素的双重酸敏性脂质体的制备方法，所述双重酸敏性脂质体，以pH敏感性磷脂和含有羧酸的脂质形成磷脂双分子层骨架，表面修饰酸敏性线性多肽DVar7，所述多肽DVar7的 氨基酸序列为ACEEQNOWARYLEWLFPTETLLLEL；所述pH敏感磷脂为DOPE，所述含有羧酸的脂质为CHEMS；所述多肽DVar7通过DSPE-PEG2000连接至磷脂双分子层骨架表面，其特征在于：包括以下制备步骤：
1）合成DSPE-PEG2000-DVar7：由线性多肽DVar7与DSPE-PEG2000-MAL偶联合成DSPE-PEG2000-DVar7；
2） 制备单酸敏脂质体：将制备单酸敏脂质体的各种材料：包括DOPE、 CHEMS、 DSPE-PEG2000，在反应器中用氯仿溶解， 37 ℃水浴条件下，抽真空旋蒸去除溶剂获得脂膜；加入中性缓冲液，37 ℃水浴，涡旋使脂膜脱落，超声，形成均一稳定的脂质体溶液；将脂质体溶液过Sephadex G-50凝胶柱，用缓冲液洗脱，获得单酸敏脂质体；
3） 包载阿霉素：按药脂重量比1:10的比例称取盐酸阿霉素，用超纯水溶解后，加入到单酸敏脂质体溶液中，将混合物置于37 ℃水浴反应，得到包载阿霉素的单酸敏脂质体；
4）DSPE-PEG2000-DVar7插入至单酸敏脂质体：将步骤3）制备得到的包载阿霉素的单酸敏脂质体与步骤1）制备的DSPE-PEG2000-DVar7混合，于50~60 ℃水浴中反应0.5~2 h，至脂质体溶液恢复澄清即插入完成，得到包载阿霉素的双重酸敏性脂质体。
10.根据权利要求9所述的双重酸敏性脂质体的制备方法，其特征在于： DOPE、 CHEMS、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-DVar7的质量比为：60:40:4:2。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20210214399A1 (en) * | 2017-12-19 | 2021-07-15 | Beijing Zeqin Biomedical Co., Ltd | Ph low insertion peptide and composition thereof |
| CN114588103A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-06-07 | 山东大学 | 负载紫杉醇脂质体的泊洛沙姆温敏凝胶及制备方法与应用 |
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2019
- 2019-05-08 CN CN201910378947.9A patent/CN110200916A/zh active Pending
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