CN101810855A - 一种ii型胶原关节软骨修复液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种II型胶原关节软骨修复液及其制备方法。关节软骨经脱脂→去血清→表面活性剂处理→氧化剂处理→消毒等环节去除细菌、病毒等有害物质。软骨经酸溶酶解、盐析、透析等过程，去除杂蛋白及其他变性的蛋白，获得高纯度、高活性II型胶原溶液。将无毒无热源的原料与辅料、等渗溶液经过适宜的配比混合后，灌装于无菌无热源的一次性推注器中，得到一次性注射用II型胶原关节软骨修复液。II型胶原关节软骨修复液其他为辅料及等渗溶液。本发明的II型胶原关节软骨修复液能够对受损关节起到润滑和缓解疼痛、改善关节活动程度的作用，并从根本上实现对软骨组织的内在修复，适用于各种关节软骨损伤、各类关节炎患者。

Description

一种II型胶原关节软骨修复液及其制备方法

技术领域

本发明涉及关节骨科医疗用品领域，具体涉及一种II型胶原关节软骨修复液及其制备方法。

背景技术

关节软骨损伤是指人口老龄化引起的软骨磨损、退变和疾病、创伤、运动损伤造成的软骨损伤。关节软骨的自我修复作用非常有限，病损关节多发生骨关节炎，病情易逐步加重而导致关节功能的丧失。主要与以下因素有关：1)软骨内无血管；2)软骨细胞被固定在一个致密的由胶原和蛋白多糖组成的固体基质中；3)成熟软骨细胞有丝分裂能力极低，不能产生修复所需要的软骨细胞和软骨基质，即胶原和蛋白多糖；4)来自软骨下骨的间充质成分的参与，形成新的结缔组织，经过一系列变化纤维软骨，易发展成为骨关节炎。因此关节软骨损伤的修复重建一直是人们渴望解决的难题。

目前对软骨损伤和骨关节炎的药物治疗目标仍然停留在止痛和缓解症状。软骨损伤关节炎的药物治疗主要包括：1)关节腔内注射透明质酸钠；2)口服氨基葡萄糖和硫酸软骨素；3)使用非甾体镇痛抗炎药等方法。然而，透明质酸钠不能起到促进软骨细胞再生和内在修复，其作用主要是关节润滑作用。外源性透明质酸对恢复关节软骨损伤的具体作用尚不清楚。氨基葡萄糖到人体的消化系统后，降解成葡萄糖和氨基酸，硫酸软骨素是大分子蛋白质也是以氨基酸的形式才能被人体吸收，几乎不可能以原有的形式到达关节。研究发现软骨基质中胶原纤维网的破坏和蛋白多糖的丢失，进而导致软骨细胞的变性和坏死，由浅及深，最终出现软骨全层消失及软骨下骨增生。软骨中胶原的持续降解导致软骨破坏及关节退变，在软骨损伤早期在关节腔内注射II型胶原，为软骨组织补充外源性II型胶原将有利于缓解损伤进程，促进软骨自我修复，从而达到根治损伤和避免关节退变引起关节炎。

然而，目前II型胶原的提取仅限于小规模实验室研究，且在质量方面尚没有按照医疗卫生用品要求控制。真正能够实施生产，质量要求达到无毒、无热源、无菌、高活性和高纯度的原料几乎没有。而应用II型胶原进行关节腔注射用于软骨缺损、关节炎治疗国内已经有文献报道，但未见有II型胶原与其他多糖类辅料配比制备的无毒、无菌、无热源的高浓度II型胶原关节修复液研究报道。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种II型胶原关节软骨修复液的制备方法。采用此方法制备得到的II型胶原关节软骨修复液具有无毒、无热源、高活性和高纯度的特性。

为实现上述目的，采用如下的技术方案：

本发明的II型胶原关节软骨修复液的制备方法包括如下步骤：

1)对哺乳动物关节软骨进行预处理：包括表面活性剂处理、氧化剂处理、消毒环节；

2)提取活性II型胶原原液：将步骤(1)得到的软骨经酸溶酶解、盐析、透析纯化的方式提取活性II型胶原原液；

3)将步骤(2)得到的原液与辅料、等渗溶液混合后，灌装于无菌无热源的一次性推注器中，得到一次性注射用II型胶原关节软骨修复液。

所述活性II型胶原蛋白从猪等哺乳动物软骨中提取。

所述关节软骨来源于猪或牛的关节透明软骨，所述猪、牛或兔来源于经过严格检验检疫的屠宰场或具有特殊资质的实验动物养殖、试验部门。

所述关节软骨进厂后，在进行表面活性剂处理、氧化剂处理、消毒等环节的处理前，用刀片尽量刮除筋膜和脂肪组织，经脱脂、去除血清，脱脂和去除血清的具体方法为在4℃条件下，用20％的NaCL-0.05M Tris-HCL溶液充分浸泡洗涤。再经步骤(2)中的酸溶酶解、酸性盐析、中性盐析、透析等步骤，以去除杂蛋白及其他已变性的蛋白，获得无毒、无热源、高纯度和高活性的II型胶原。

本发明所述的表面活性剂优选的是阳离子表面活性剂，更优选的是选用体积百分数为0.1～5％的洗必泰处理10～60min。

本发明所述的氧化剂处理方法优选的是采用体积百分数为0.1～3％的过氧乙酸处理5～20min。

本发明所述的消毒方法，优选的是采用Co⁶⁰辐照消毒，剂量3～10kGy。

本发明所述的酸溶酶解方法，优选的是采用摩尔浓度0.5～1M醋酸(pH1.5)溶解胃蛋白酶，使其质量百分数终浓度为1～2％，在4℃下酶解12～48h。

所述辅料可选用硫酸软骨素或其钠、钾、钙、锌等盐、透明质酸或其钠、钾、钙等盐、海藻酸或其钠等盐、氨基葡萄糖或硫酸化氨基葡萄糖或盐酸化氨基葡萄糖等中的一种或多种。

所述等渗液为pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。

所述注射用II型胶原关节软骨修复液的组分为：100ml关节修复液中，II型胶原含量为1～500mg，其余为辅料及等渗溶液。优选的，所述辅料含量为1～300mg。

本发明通过在原料处理过程中增加了表面活性剂处理、氧化剂处理、消毒环节以达到去病毒、微生物、热源的效果，使之符合作为注射液产品必须要控制其内毒素和热源的要求。同时，本发明选用的辅料主要是糖蛋白和糖氨多糖，如透明质酸、硫酸软骨素等，它们与胶原一起构成了软骨的细胞外基质，使得在促进软骨修复的同时，给一个更优异的软骨细胞再生环境，同时利于维持软骨良好的生物力学特性；因为缺乏这些糖蛋白或多糖都不利于软骨细胞的生长和分化。注射液可根据制剂中不同组分的比例，调节其粘稠度和粘弹性，相比海绵支架结构来讲，更有利于为关节腔提供一个力学屏障和隔离缓冲作用，避免外力对受损关节的冲击，同时其中的糖胺多糖为关节液及时补充了营养成分，加速了关节软骨及软骨-骨界面层间的自我修复过程，无任何副作用。

本发明的II型胶原关节软骨修复液是一次性无毒、无菌、无热源的填充材料，使用方便、操作简单，适用于各种膝关节炎、颈椎腰椎关节炎及运动、创伤引起的关节软骨缺损的修复和治疗。通过为关节腔补充外源性的活性II型胶原，从根本上促进关节软骨自我修复，增强关节液润滑功能，缓解疼痛，改善关节运动功能，防止受损关节加重病情。本发明的II型胶原关节软骨修复液同时适用于各种关节软骨损伤、退行性骨性关节炎的治疗、创伤导致的骨与软骨病变引起的关节炎的缓解和治疗。本发明将为开拓和实现高品质的II型胶原规模化生产及在关节、骨科的临床应用推广提供参考价值。

附图说明

图1是制备II型胶原的优选实施例1中得到的胶原的吸收峰的检测结果；

图2是制备II型胶原的优选实施例1中得到的胶原的SDS-PAGE电泳图谱；

图3是制备II型胶原的优选实施例2中得到的胶原的吸收峰的检测结果；

图4是制备II型胶原的优选实施例2中得到的胶原的SDS-PAGE电泳图谱；

图5是制备II型胶原的优选实施例3中得到的胶原的吸收峰的检测结果；

图6是制备II型胶原的优选实施例3中得到的胶原的SDS-PAGE电泳图谱；

图7是sigma公司II型胶原标准品(CAS NO.9007-34-5，Pcode：1000578786)的吸收峰的检测结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本发明所述的无毒、无热源和高活性II型胶原制备方法的一个优选实施例为：

(1)原料处理

猪关节透明软骨经筋膜脂肪剔除→清洗浸泡→有毒物质处理→消毒等环节，去除所有细菌、病毒等微生物。

具体方法过程如下：

用刀片将猪关节透明软骨中筋膜脂肪组织彻底剔除，切成薄片。用20％NaCl+0.05M Tris(pH7.5)脱脂及血清成分，充分洗涤至无脂质浮游，液体无泡沫产生。用体积百分数为0.5％洗必泰常温处理30min后，充分洗涤。用体积百分数为0.1％过氧乙酸常温处理15min，洗涤干净后分装至封口袋中包装好后，送Co⁶⁰行辐照灭菌，剂量为5kGy。取回备用。

(2)II型胶原提取

在万级以上洁净区内，将处理好的原料剪碎后，经盐酸胍处理去除多糖、酸溶酶解、盐析和透析纯化去除杂蛋白及其他变性蛋白，最终获得高活性高纯度II型胶原原液。

具体方法过程如下：

消毒后的软骨用纯化水充分洗涤后，剪碎。用10倍体积的4M盐酸胍+0.05M Tris pH7.5溶液搅拌24h，去除蛋白多糖，10000rpm离心20min取沉淀。沉淀用纯化水充分洗涤后，用10倍体积的0.5M HAc溶解胃蛋白酶，使其终浓度为1％，在酸性条件下酶解12-24h，4℃，搅拌反应。10000rpm离心20min，上清液用1mM EDTA终止酶解。酸性盐析：在pH2.5～3.0下，用0.7M NaCl进行盐析，10000rpm离心20min，沉淀称重，用6～10倍体积的0.5M HAc溶解。中性盐析，将上述胶原液装在透析袋中，对0.2M NaCl+0.05M Tris pH7.5溶液透析(透析袋中的蛋白先沉淀后溶解)，加入固体NaCl至终浓度4.0M，静置过夜，离心取沉淀。沉淀用0.5M HAC溶解后，对0.01M Na₂HPO₄充分透析后(1-2天)，离心，沉淀用0.5M HAC溶解。将上述的胶原液对0.2M NaCl+0.05MTris pH7.5(DEAE柱平衡液)透析。过DEAE-52柱，收集流出的胶原液，检测OD_217nm的吸光值。层析后，柱子用洗脱液1.5M NaCl+0.05M Tris pH7.5溶液洗去蛋白多糖。将过柱后的胶原液对PBS透析，低温保存。制备的胶原经紫外吸收峰测定、SDS-PAGE电泳、内毒素测定等检测，结果见图1和图2。其中，图1是本优选实施例制备的胶原的吸收峰的检测结果。由图1可见，本实施例制得的胶原在217nm处有最大吸收峰，与sigma公司标准品(见图7)相比，说明制得的胶原纯度较高。图2是本优选实施例制备的胶原的SDS-PAGE电泳图谱，经电泳图谱分析软件Image J分析，显示II型胶原(C II)除主要的α(由条带的灰度和面积换算，其占凝胶上所有条带灰度和面积的百分比例为76.06％)和β二聚体(同上述方法分析其灰度和面积的百分比，约占凝胶上所有条带灰度和面积的百分比例为16.96％)两条带外，几乎不含有其他的杂带，而sigma公司标准品α链约占66.19％，β二聚体约10.45％，除此外还有另外两条杂带，分别约占9.56％和13.8％。结果表明本实施例提取的II型胶原其纯度较高。内毒素检查结果如下表1、表2所示，其中，表1为凝胶法干扰试验，表2为凝胶半定量试验，试验结果证明内毒素为阴性。

表1

鲎试剂   II型胶原         胶原/内毒素(EU/ml)

                                                        II型胶原阴性对照

批号     批号       2λ      λ       0.5λ     0.25λ

         20091201   ++++     ++++     +-+-      ----    ----

         20100101   ++++     +-++     --+-      ----    ----

0912302

         20100401   ++++     ++++     +--+      ----    ----

         水0911030  ++++     ++++     ---+      ----

         20091201   ++++     +-++     --+-      ----    ----

         20100101   ++++     ++++     ++-+      ----    ----

0912503

         20100401   ++++     +-++     ++--      ----    ----

         水0911030  ++++     ++++     ---+      ----

注：II型胶原均为500倍稀释的pH6-7的溶液，根据药典2005版二部附录XI E要求，作为注射液其内毒素限值为300EU/ml，最大有效稀释倍数为1200倍，干扰预实验显示500倍稀释即显示阴性。鲎试剂和检查用水均为湛江安度斯生物有限公司制品。

表2

II型胶原批  鲎试剂0912302鲎试剂0912503

号          II型  II型胶原  2λ/水  无/检查用水   II型  II型胶原  2λ/水  无/检查用水

            胶原  /2λ              0911030       胶原  /2λ              0911030

20091201    --    ++        ++      --            --    ++        ++      --

20100101    --    ++        ++      --            --    ++        ++      --

20100401    --    ++        ++      --            --    ++        ++      --

注：上述结果表明，用该方法制备的II型胶原其内毒素为阴性。

实施例2

本发明所述的无毒、无热源和高活性II型胶原制备方法的一个优选实施例为：

(1)原料处理

猪关节透明软骨经筋膜脂肪剔除→清洗浸泡→有毒物质处理→消毒等环节，去除所有细菌、病毒等微生物。

具体方法过程如下：

用刀片将猪关节透明软骨中筋膜脂肪组织彻底剔除，切成薄片。用20％NaCl+0.05M Tris(pH7.5)脱脂及血清成分，充分洗涤至无脂质浮游，液体无泡沫产生。用体积百分数为0.1％洗必泰常温处理60min后，充分洗涤。用体积百分数为1％过氧乙酸常温处理20min，洗涤干净后分装至封口袋中包装好后，送Co⁶⁰行辐照灭菌，剂量为3kGy。取回备用。

(2)II型胶原提取

在万级以上洁净区内，将处理好的原料剪碎后，经盐酸胍处理去除多糖、酸溶酶解、盐析和透析纯化去除杂蛋白及其他变性蛋白，最终获得高活性高纯度II型胶原原液。

具体方法过程如下：

消毒后的软骨用纯化水充分洗涤后，剪碎。用10倍体积的4M盐酸胍+0.05M Tris pH7.5溶液搅拌24h，去除蛋白多糖，10000rpm离心20min取沉淀。沉淀用纯化水充分洗涤后，用10倍体积的0.5M HAc溶解胃蛋白酶，使其终浓度为1.8％，在酸性条件下酶解24～48h，搅拌，15℃。10000rpm离心20min，上清液用1mM EDTA终止酶解。酸性盐析，在pH2.5～3.0下，用0.7M NaCl进行盐析，10000rpm离心20min，沉淀称重，用6～10倍体积的0.5M HAc溶解。中性盐析，将上述胶原液装在透析袋中，对0.2M NaCl+0.05M Tris pH7.5溶液透析，(透析袋中的蛋白先沉淀后溶解)，加入固体NaCl至终浓度4.0M，静置过夜，离心取沉淀。沉淀用0.5M HAC溶解后，对0.01M Na₂HPO₄充分透析后(1-2天)，离心，沉淀用0.5M HAC溶解。将上述的胶原液对0.2M NaCl+0.05M Tris pH7.5(DEAE柱平衡液)透析。过DEAE-52柱，收集流出的胶原液，检测OD217nm的吸光值。层析后，柱子用洗脱液1.5M NaCl+0.05M TrispH7.5溶液洗去蛋白多糖。将过柱后的胶原液对PBS透析，低温保存。制备的胶原经紫外吸收峰测定、SDS-PAGE电泳、内毒素测定等检测，图3是本优选实施例制备的胶原的吸收峰的检测结果，由图3可见，本实施例制得的胶原在217nm处有最大吸收峰，与sigma公司标准品(见图7)相比，说明制得的胶原纯度较高。图4是本优选实施例制备的胶原的SDS-PAGE电泳图谱，SDS-PAGE电泳显示主要有α链(分子量为120KD，由条带的灰度和面积换算，其占凝胶上所有条带灰度和面积的百分比例为80.06％)和β二聚体(分子量大于200KD，同上述方法分析其灰度和面积的百分比，约占凝胶上所有条带灰度和面积的百分比例为18.96％)两条带。内毒素检查结果如下表3、表4所示，其中，表3为凝胶法干扰试验，表4为凝胶半定量试验，试验结果证明内毒素为阴性。

表3

鲎试剂  II型胶原         胶原/内毒素(EU/ml)

                                                        II型胶原阴性对照

批号    批号        2λ    λ     0.5λ       0.25λ

        20091202    ++++   ++++   +--+        ----      ----

        20100201    ++++   +-++   +--+        ----      ----

0912302

        20100301    ++++   ++++   +-+-        ----      ----

        水0911030   ++++   ++-+   --+-        ----

        20091202    ++++   +-++   --+-        ----      ----

        20100201    ++++   +++-   ++-+        ----      ----

0912503

        20100301    ++++   +-++   -+--        ----      ----

        水0911030   ++++   +-++   --+-        ----

注：II型胶原均为500倍稀释的pH6-7的溶液，根据药典2005版二部附录XI E要求，作为注射液其内毒素限值为300EU/ml，最大有效稀释倍数为1200倍，干扰预实验显示500倍稀释即显示阴性。鲎试剂和检查用水均为湛江安度斯生物有限公司制品。

表4

II型胶原批  鲎试剂0912302                                 鲎试剂0912503

号          II型  II型胶原  2λ/水    无/检查用水   II型  II型胶原  2λ/水  无/检查用水

            胶原  /2λ                0911030       胶原  /2λ              0911030

20091202    --    ++        ++        --            --    ++        ++      --

20100201    --    ++        ++        --            --    ++        ++      --

20100301    --    ++        ++        --            --    ++        ++      --

注：上述结果表明，用该方法制备的II型胶原其内毒素为阴性。

实施例3

本发明所述的无毒、无热源和高活性II型胶原制备方法的一个优选实施例为：

(1)原料处理

猪关节透明软骨经筋膜脂肪剔除→清洗浸泡→有毒物质处理→消毒等环节，去除所有细菌、病毒等微生物。

具体方法过程如下：

用刀片将猪关节透明软骨中筋膜脂肪组织彻底剔除，切成薄片。用20％NaCl+0.05M Tris(pH7.5)脱脂及血清成分，充分洗涤至无脂质浮游，液体无泡沫产生。用体积百分数为5％洗必泰常温处理10min后，充分洗涤。用体积百分数为3％过氧乙酸常温处理5min，洗涤干净后分装至封口袋中包装好后，送Co⁶⁰行辐照灭菌，剂量为10kGy。取回备用。

(2)II型胶原提取

在万级以上洁净区内，将处理好的原料剪碎后，经盐酸胍处理去除多糖、酸溶酶解、盐析和透析纯化去除杂蛋白及其他变性蛋白，最终获得高活性高纯度II型胶原原液。

具体方法过程如下：

消毒后的软骨用纯化水充分洗涤后，剪碎。用10倍体积的4M盐酸胍+0.05M Tris pH7.5溶液搅拌24h，去除蛋白多糖，10000rpm离心20min取沉淀。沉淀用纯化水充分洗涤后，用10倍体积的0.5M HAc溶解胃蛋白酶，使其终浓度为2％，在酸性条件下酶解24～48h，搅拌，15℃。10000rpm离心20min，上清液用1mM EDTA终止酶解。酸性盐析，在pH2.5～3.0下，用0.7M NaCl进行盐析，10000rpm离心20min，沉淀称重，用6～10倍体积的0.5M HAc溶解。中性盐析，将上述胶原液装在透析袋中，对0.2M NaCl+0.05M Tris pH7.5溶液透析，(透析袋中的蛋白先沉淀后溶解)，加入固体NaCl至终浓度4.0M，静置过夜，离心取沉淀。沉淀用0.5M HAC溶解后，对0.01M Na₂HPO₄充分透析后(1-2天)，离心，沉淀用0.5M HAC溶解。将上述的胶原液对0.2M NaCl+0.05M Tris pH7.5(DEAE柱平衡液)透析。过DEAE-52柱，收集流出的胶原液，检测OD217nm的吸光值。层析后，柱子用洗脱液1.5M NaCl+0.05M TrispH7.5溶液洗去蛋白多糖。将过柱后的胶原液对PBS透析，低温保存。制备的胶原经紫外吸收峰测定、SDS-PAGE电泳、内毒素测定等检测，图5是本优选实施例制备的胶原的吸收峰的检测结果，由图5可见，本实施例制得的胶原在217nm处有最大吸收峰，与sigma公司标准品(见图7)相比，说明制得的胶原纯度较高。图6是本优选实施例制备的胶原的SDS-PAGE电泳图谱，SDS-PAGE电泳显示主要由α(由条带的灰度和面积换算，其占凝胶上所有条带灰度和面积的百分比例为78.24％)和β二聚体(同上述方法分析其灰度和面积的百分比，约占凝胶上所有条带灰度和面积的百分比例为16.19％)两条带。内毒素检查结果如下表5、表6所示，其中，表5为凝胶法干扰试验，表6为凝胶半定量试验，试验结果证明内毒素为阴性。

表5

鲎试剂      II型胶原    胶原/内毒素(EU/ml)

                                                        II型胶原阴性对照

批号        批号        2λ     λ      0.5λ   0.25λ

            20100103    ++++    +-++    -+-+    ----    ----

            20100303    ++++    +-+-    ++--    ----    ----

0912302

            20100402    ++++    +-++    -+-+    ----    ----

            水0911030   ++++    +-++    ---+    ----

0912503     20100103    ++++    +-++    -+--    ----    ----

            20100303    ++++    ++-+    +-++    ----    ----

20100402     ++++    ++-+    ---+    ----    ----

水0911030    ++++    ++++    -+--    ----

注：II型胶原均为500倍稀释的pH6-7的溶液，根据药典2005版二部附录XI E要求，作为注射液其内毒素限值为300EU/ml，最大有效稀释倍数为1200倍，干扰预实验显示500倍稀释即显示阴性。鲎试剂和检查用水均为湛江安度斯生物有限公司制品。

表6

II型胶原批    鲎试剂0912302鲎试剂0912503

号            II型    II型胶原    2λ/水  无/检查用水   II型   II型胶原  2λ/水  无/检查用水

              胶原    /2λ                0911030       胶原   /2λ              0911030

20100103      --      ++          ++      --            --     ++        ++      --

20100303      --      ++          ++      --            --     ++        ++      --

20100402      --      ++          ++      --            --     ++        ++      --

注：上述结果表明，用该方法制备的II型胶原其内毒素为阴性。

实施例4

本实施例的II型胶原关节修复液由II型胶原和硫酸软骨素钠组成，各组分比例为：100ml关节修复液中含II型胶原蛋白1mg，硫酸软骨素钠1mg，其余为pH7.2～7.4等渗PBS溶液。

实施例5

本实施例的II型胶原关节修复液由II型胶原、透明质酸钠、硫酸氨基葡萄糖组成，各组分比例为：100ml关节修复液中含II型胶原蛋白200mg，硫酸氨基葡萄糖100mg，透明质酸钠100mg，其余为pH7.2～7.4等渗PBS溶液。

实施例6

本实施例的II型胶原关节修复液由II型胶原、透明质酸钠、硫酸氨基葡萄糖、海藻酸钠组成，各组分比例为：100ml关节修复液中含II型胶原蛋白500mg，透明质酸钠95mg，硫酸氨基葡萄糖200mg，海藻酸钠5mg，其余为pH7.2～7.4等渗PBS溶液。

实施例7

本优选实施例的II型胶原关节修复液制备方法为在百级洁净区内，将II型胶原关节修复液的原料按适宜配比在4℃条件下快速混合均匀，消泡后，灌装于无菌无热源的一次性推注器中，得到II型胶原关节软骨修复液。上述II型胶原关节软骨修复液的原料包含如前实施例4～6所述的各种情况。

本发明的II型胶原关节修复液按照临床试验规定入选病例符合美国风湿病学会1987年诊断类风湿标准或者60例。入选标准为无其他疾病的关节炎，如膝关节炎、颈椎、腰椎关节炎患者，及运动、创伤等引起的关节软骨缺损患者。使用时，由临床医生对患者疼痛或炎症部位做相关检查和处理后，将一次性推注器中的II型胶原关节修复液注入患处关节腔隙中。对照药采用透明质酸钠注射液。根据随机、双盲、对照临床试验将患者随机分成实验组与对照组，由医生根据患者实际情况确定治疗周期和方案。主要观察指标为：晨僵、休息痛、压痛、日常生活能力、血沉、血清类风湿因子(RF)。疗效评估标准；无效：综合评估指标改善不到30％；改善：综合评估指标改善30％～50％；进步：综合评估指标改善50％～75％；明显进步：综合评估指标改善75％以上。有效率＝(改善+进步+明显进步)病例数/总病例数×100％。入选病例中膝关节炎患者18例，男性7例，女性11例；颈椎炎14例，男性患者9例，女性患者5例；腰椎关节炎患者12例，男性5例，女性7例；创伤或手术引起的软骨缺损患者16例，其中男性7例，女性9例，年龄均在18～65岁之间。随机分成两组，观察时间6个月。表7为两组观察指标改善情况比较结果；表8为膝关节炎治疗后两组间疗效比较结果；表9为颈椎炎治疗后两组间疗效比较结果；表10为腰椎炎治疗后两组间疗效比较结果；表11为创伤或手术引起的软骨缺损治疗后两组间疗效比较结果。

表7

	晨僵/min	休息痛	压痛	日常生活能力	血沉(ESR)	RF/IU.ML-1
							实验组	34.33±61.35	2.21±2.29	5.45±5.86	0.04±0.39	1.38±23.63	6.41±111.48

对照组

72.32±75.65

2.62±1.98

7.14±7.18

0.26±0.36

8.56±9.68

32.11±67.11

表8

表9

表10

表11

患者经9个月治疗，实验组对膝关节炎、颈椎炎、腰椎炎患者肿胀、疼痛有明显改善，炎症反应降低，炎症反应低，活动能力基本恢复，病情得到有效控制，临床效果明显优于对照组。创伤或手术引起的软骨缺损患者经观察治疗9个月，实验组患者均显示不同程度的病症改善，软骨细胞和组织再生良好，新生软骨完全代替缺损软骨，患者活动能力得到改善和恢复。对照品对该病重的治疗效果不明显。

Claims (10)

1.一种II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)对哺乳动物关节软骨进行预处理：包括表面活性剂处理、氧化剂处理和消毒环节；

2)提取活性II型胶原原液：将所述步骤(1)得到的软骨经酸溶酶解、盐析、透析纯化的方式提取活性II型胶原原液；

3)将所述步骤(2)得到的原液与辅料、等渗溶液混合后，灌装于无菌无热源的一次性推注器中，得到一次性注射用II型胶原关节软骨修复液。

2.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂处理为采用体积百分数为0.1-5％的洗必泰处理10-60min。

3.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述氧化剂处理为采用体积百分数为0.1～3％的过氧乙酸处理5～20min。

4.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述消毒采用Co⁶⁰辐照消毒，剂量为3～10kGy。

5.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述酸溶酶解采用摩尔浓度为0.5～1M的醋酸溶解胃蛋白酶，使所述胃蛋白酶的质量百分数终浓度为1～2％后，将所述软骨在4℃下酶解12～48h。

6.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述辅料为硫酸软骨素或其钠、钾、钙、锌盐，透明质酸或其钠、钾、钙盐，海藻酸或其钠盐、氨基葡萄糖或硫酸化氨基葡萄糖或盐酸化氨基葡萄糖中的一种或多种。

7.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述等渗液为pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。

8.如权利要求1所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述注射用II型胶原关节软骨修复液的组分为：100ml关节修复液中II型胶原含量为1～500mg，其余为辅料和等渗溶液。

9.如权利要求8所述的II型胶原关节软骨修复液的制备方法，其特征在于，所述辅料含量为1～300mg。

10.一种按权利要求1-9之一所述的制备方法得到的II型胶原关节软骨修复液。

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