ES2627868T3

ES2627868T3 - Composiciones mucoadhesivas que comprenden ácido hialurónico y quitosano para aplicación tópica

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Publication number: ES2627868T3
Application number: ES12791441.4T
Authority: ES
Inventors: Ruggero Bettini; Annalisa BIANCHERA; Massimo CORUZZI; Lisa ELVIRI
Original assignee: MDT INT'L SA
Current assignee: MDT INT'L SA
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2017-07-31
Anticipated expiration: 2032-10-25
Also published as: EP2922581B1; TW201429478A; PL2922581T3; EP2922581A1; TWI639434B; WO2014063735A1; AR093156A1

Abstract

Una composición que comprende ácido hialurónico y sales del mismo en mezcla con quitosano y sales del mismo y una sal de glicerofosfato en una solución acuosa, en la que el quitosano tiene un grado de desacetilación en el intervalo del 60 al 80 % y dicha composición tiene una propiedad de transición sol-gel a 35-38 ºC, formando así un hidrogel a dichas temperaturas.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones mucoadhesivas que comprenden acido hialuronico y quitosano para aplicacion topica Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a composiciones acuosas de acido hialuronico combinadas con quitosano y glicerofosfato que tienen propiedades termogelificantes y mucoadhesivas y uso de las mismas para la reepitelizacion y reparacion de heridas mucosas por administracion topica.

Antecedentes de la invencion

[0002] El acido hialuronico (en lo sucesivo en el presentes documento denominado como HA) es un polisacarido biologico de alto peso molecular ya conocido que tiene un caracter polianionico y que pertenece a la clase de glicosaminoglicanos no sulfatados. Esta presente en gran medida en todos los tejidos conectivos de los vertebrados, en el liquido sinovial articular y en el cartilago, donde es un componente principal, y los fluidos endobulbares del ojo.

[0003] En la naturaleza puede alcanzar un peso molecular superior a 10.000 kDa, pero, como se sabe, cuando se extrae y se manipula el acido hialuronico siempre es una fraccion comunmente identificada por un peso molecular medio, que se forma por diferentes polimeros que tienen un peso molecular comprendido en un intervalo de pesos moleculares, concretamente, se caracteriza por un indice de polidispersidad.

[0004] Se emplea ampliamente para muchas aplicaciones medicas, incluyendo la administracion a los ojos, articulaciones, mucosas y piel para tratar una diversidad de estados patologicos.

[0005] En la actualidad, muchas fracciones de este biopolimero extraido de fuentes animales o caldo bacteriano se han usado durante mucho tiempo en condiciones patologicas tales como cicatrizacion de heridas, enfermedades artrosicas/artriticas y cirugia ocular, basandose estos usos esencialmente en su funcion biologica y en las propiedades fisicas no newtonianas (por ejemplo, viscosidad y/o su viscoelasticidad estructural) de sus soluciones acuosas. Tanto la viscosidad como las propiedades viscoelasticas dependen principalmente del intervalo de pesos moleculares de las fracciones de HA, la concentracion polimerica, pero otras caracteristicas tecnicas, tales como el grado de reticulacion de cadena con agentes quimicos, pueden contribuir a aumentar el rendimiento reologico, asi como al peso molecular reivindicado.

[0006] De hecho, las propiedades reologicas de HA son influenciadas o resultantes de la combinacion de las diferentes caracteristicas tecnicas de la muestra considerada.

[0007] No obstante, es conocimiento y practica comun hacer referencia a fracciones de HA de alto peso molecular cuando se solicita una alta viscosidad y/o propiedades viscoelasticas, en particular, por ejemplo, en condiciones inflamatorias de la articulacion de la rodilla o cirugia ocular, donde se emplea acido hialuronico para fines de suplementacion de los fluidos sinoviales o endobulbares por sus propiedades de viscosidad/viscoelasticas.

[0008] En lo que se refiere a la propiedad de cicatrizacion de heridas, esto se atribuye principalmente a fracciones de acido hialuronico que tienen pesos moleculares esencialmente bajos y se ha reivindicado que una fraccion de este polisacarido que tiene un peso molecular de 50 a 100 kDa exhibe una baja viscosidad en soluciones acuosas pero tiene la capacidad para promover la reparacion del tejido de la herida (Documento US 5.925.626).

[0009] La fraccion HA reivindicada, como otras fracciones de HA de bajo peso molecular, no muestra ninguna propiedad mucoadhesiva, pero esta propiedad puede ser particularmente util para la aplicacion topica de la misma.

[0010] De hecho, la principal necesidad de cicatrizacion de heridas y, en particular, para el tratamiento de los tejidos mucosos internos de las cavidades internas del cuerpo, donde no es aplicable un aposito para heridas, consiste en poner a disposicion en el sitio a tratar una cantidad apropiada de acido hialuronico y durante un tiempo suficiente para explotar su actividad biologica.

[0011] El documento WO2009/024677 desvela el uso de acido hialuronico, preferiblemente asociado a vitaminas, para la preparacion de composiciones destinadas a mejorar mediante administracion topica la proteccion del tejido mucoso de las vias respiratorias superiores e inferiores, del tracto intestinal y del ojo. Las composiciones utiles para el tratamiento de la mucosa del tracto intestinal se administran por via oral en formas farmaceuticas gastro- resistentes.

[0012] Sin embargo, para mejorar el tiempo de retencion en el sitio de aplicacion, una caracteristica particularmente significativa es la propiedad bioadhesiva y mucoadhesiva de las composiciones utilizadas.

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[0013] Por ejemplo, para el tratamiento de la piel y el epitelio de la mucosa se desvelan composiciones altamente bioadhesivas y mucoadhesivas de biopolimeros, tales como acido alginico, acido hialuronico y sulfato de dermatan, asociados a polimeros sinteticos, tales como alcohol polivinilico y policarbofilo (Documento WO96/03973). Estas composiciones se reivindican como utiles para el tratamiento de la sequedad y deshidratacion de la piel y los tejidos mucosos, asi como vehiculos para la absorcion percutanea de sustancias activas.

[0014] Un biopolimero, que actualmente esta recibiendo mucha atencion para aplicaciones topicas cutaneas y mucosas por su capacidad para unirse a alta cantidad de agua y formar hidrogeles, es el quitosano. El quitosano es un derivado desacetilado de quitina que consiste en unidades de glucosamina y N-acetil-glucosamina; es un polimero cationico biocompatible, biodegradable, no toxico, insoluble en agua, pero soluble en acidos acuosos diluidos hasta pH 6,2. Se utiliza ampliamente en muchas aplicaciones, pero su mala solubilidad en soluciones neutras constituye un obstaculo importante para su uso en contextos fisiologicos. Con el fin de superar este inconveniente, la estructura del quitosano se modifico quimicamente de diversas maneras al final para obtener un quitosano injertado covalentemente o reticulado y para mejorar de esta manera su solubilidad en agua y sus propiedades gelificantes. Sin embargo, tales modificaciones quimicas requieren a menudo el uso de reactivos toxicos que dificultan parcialmente el traslado de dichos productos a aplicaciones biomedicas.

[0015] Un posible medio para evitar el uso de agentes quimicos es preparar hidrogeles fisicos de quitosano que exploten su naturaleza cationica en la formacion de complejos polielectroliticos (PEC) mediante interacciones ionicas con polianiones que consisten tanto en polimeros sinteticos como biopolimeros, tales como, por ejemplo, alcohol polivinilico y polisacaridos anionicos, incluyendo acido hialuronico, respectivamente (Berger J. et al., Eur. J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004, 57, 35-52).

[0016] Sin embargo, la formacion de hidrogeles estables, homogeneamente dispersados, que contienen quitosano y HA en solucion es desafiante debido al hecho de que la adicion de HA a la solucion de quitosano constituye un elemento perturbador, potencialmente conflictivo. De hecho, las cargas basicas del quitosano conducen a interacciones anionicas con las cargas anionicas de HA y, en consecuencia, proporcionan la precipitacion de un complejo de polielectrolito de HA-quitosano con separacion de fases. Esta ocurrencia es tan comun que es ampliamente explotada y reportada como una estrategia para la produccion de micro o nanoparticulas (se enumeran algunos ejemplos en Berger J. et al., citados previamente). Otra caracteristica peculiar del quitosano es su capacidad para formar geles termosensibles con polioles que llevan una unica cabeza anionica de fosfato, y en particular con glicerofosfato.

[0017] El documento US 6.344.488 desvela una formacion de temperatura controlada y dependiente del pH de geles de polisacaridos ionicos que consisten en un sistema de soluciones acuosas de quitosano/organofosfato que muestran una transicion sol/gel dentro de temperaturas comprendidas entre 30 y 60 °C y un pH comprendido entre 6,5 a 7,4. Los geles obtenidos a pH superior a 6,9 son termorreversibles, mientras que los geles obtenidos a pH inferior a 6,9 son termorreversibles. Ademas, en la patente se indica claramente que el quitosano tiene un peso molecular comprendido entre 10 y 2.000 kDa, pero la patente no especifica nada sobre la otra caracteristica del quitosano, concretamente, el grado de desacetilacion. El organofosfato preferido es glicerofosfato. El documento US 6.344.488 desvela tambien el metodo de preparacion de hidrogeles y describe en detalle su comportamiento despues del calentamiento, pero no incluye el caso de la adicion de otras sustancias activas u otros polisacaridos tales como acido hialuronico.

[0018] Despues, el mecanismo de formacion de geles termosensibles mediante la asociacion de sales de quitosano y glicerofosfato se informa por los mismos autores (Chenite A. et al., Biomaterials, 2000, 21, 2155 - 2161; Chenite A. et al., Carbohydr. Polym., 2001, 46, 39 - 47). De acuerdo con los datos mostrados, la presencia de glicerofosfato permite una mayor hidratacion de quitosano a bajas temperaturas, promoviendo de este modo la estabilidad de la solucion a pH cercano a la neutralidad. Vale la pena senalar que en los articulos en referencia se consideran las caracteristicas quimicas del quitosano (concretamente el grado de desacetilacion y el peso molecular). Los resultados mostrados indican que el peso molecular no tiene un efecto significativo sobre la temperatura de gelificacion, mientras que el grado de desacetilacion parece ser critico para las temperaturas a las que tiene lugar la transicion sol/gel. En particular, la temperatura de gelificacion incipiente aumenta a medida que disminuye el grado de desacetilacion. Para el quitosano que tiene un grado de desacetilacion del 70, 81 y 91 %, las temperaturas de gelificacion indicadas son de 66 °C, 57 °C y 37 °C, respectivamente. El grado de desacetilacion es tambien critico para la estabilidad de los hidrogeles (Ruel-Gariepy E. et al., Int. J. Pharmaceutics, 2000, 203, 89-98).

[0019] El documento US2006/0280797 describe una matriz polimerica que comprende una solucion de al menos un polimero termico de gelificacion inversa, por ejemplo, una solucion de quitosano y 8-glicerofosfato, y al menos un polimero gelificante anionico en forma de polvo, por ejemplo, acido hialuronico, en el que la matriz polimerica es un gel solido que es inyectable debido a las propiedades de adelgazamiento por cizalladura del polimero gelificante anionico y vuelve a su viscosidad original despues de la cizalladura. Son raros los datos referentes a la produccion

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de hidrogel termosensible que contiene quitosano y acido hialuronico.

[0020] Fang et al. (Eur. J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2008, 68, 626-636) y Chen et al. (Polymer, 2009, 50, 107-116) informan sobre hidrogeles termosensibles compuestos por quitosano y acido hialuronico pero en ambos casos se requiere una modificacion quimica de quitosano, HA o ambos para superar las incompatibilidades entre estas moleculas.

[0021] Como se ha mencionado previamente, de hecho, la preparacion de hidrogeles dispersados homogeneamente que combinan quitosano y un polisacarido polianionico, tal como acido hialuronico, no es un problema trivial.

Resumen de la invencion

[0022] El proposito de la presente invencion es proporcionar composiciones que comprenden acido hialuronico en una solucion acuosa para tratar lesiones mucosas por administracion topica y particularmente para tratar mucosas de cavidades corporales, tales como cavidades orales, nasales, gastrointestinales, colorrectales y vaginales, bien de origen traumatico, origen iatrogenico u origen relacionado con un trastorno. La administracion de HA se dirige al alivio de las lesiones de las mucosas, con un interes particular en las lesiones derivadas de la quimioterapia y/o radioterapia utilizadas para tratar el cancer.

[0023] La principal necesidad de la cicatrizacion de heridas de tejidos, tales como los tejidos mucosos, es poner a disposicion en el sitio una cantidad apropiada de acido hialuronico con un tiempo de contacto con la lesion suficiente para proporcionar alivio del tejido y luego desencadenar los procesos de curacion.

[0024] Es un proposito adicional de la presente invencion proporcionar composiciones que comprenden acido hialuronico en una solucion acuosa capaz de formar hidrogel, preferiblemente in situ despues de la aplicacion topica.

[0025] Para los fines anteriormente mencionados, una composicion ideal debe poseer las caracteristicas de biocompatibilidad, seguridad y mucoadhesividad, para garantizar una buena persistencia en el sitio de administracion. La capacidad de ser termosensible en la formacion de hidrogeles es tambien una caracteristica relevante en vista de la aplicacion perseguida.

[0026] Las composiciones donde el acido hialuronico se combina con quitosano y glicerofosfato sodico se consideran potencialmente utiles para el suministro de acido hialuronico en el sitio a tratar.

[0027] Por lo tanto, en un primer aspecto, el objeto de la invencion son composiciones que comprenden acido hialuronico y sales del mismo en mezcla con quitosano y sales del mismo y una sal de glicerofosfato en una solucion acuosa, en la que el quitosano tiene un grado de desacetilacion en el intervalo del 60 al 80 %, y en la que dichas composiciones tienen una propiedad de transicion sol-gel a 35-38 °C, formando asi un hidrogel a dichas temperaturas. Ademas, estas composiciones estan dotadas adicionalmente de propiedades mucoadhesivas. Las composiciones que comprenden acido hialuronico y sales del mismo en mezcla con quitosano y una sal de glicerofosfato opcionalmente comprenden adicionalmente una sal de acido inorganico u organico.

[0028] Las composiciones de la invencion estan destinadas a ser utilizadas en el tratamiento de heridas mucosas, ya sea de origen traumatico, iatrogenico o relacionado con un trastorno, de las cavidades orales, nasales, gastrointestinales, vaginales y colorrectales corporales por administracion topica. El uso preferido es para el alivio (reepitelizacion y reparacion) de lesiones mucosas derivadas de quimioterapia y/o radioterapia y en particular para lesiones de la mucosa colorrectal derivadas de la radioterapia usada para tratar el cancer colorrectal.

[0029] Estos y otros propositos, que se haran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, se consiguen por las composiciones que comprenden acido hialuronico combinado con quitosano y glicerofosfato en la solucion acuosa objeto de la invencion.

[0030] Otras caracteristicas y ventajas de la presente invencion se describiran en la siguiente descripcion detallada de realizaciones preferidas, pero no exclusivas, de la presente invencion.

Breve descripcion de las figuras

[0031] La descripcion se da con referencia a las figuras adjuntas, que se proporcionan puramente con fines indicativos y por tanto no son limitantes.

La figura 1 muestra el porcentaje de agua unida en las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1-3 y 7 frente a la relacion entre las concentraciones de quitosano y de HA.

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La figura 2 muestra el porcentaje de HA liberado en funcion del tiempo de la composicion del ejemplo 1; las barras representan la desviacion estandar (n = 3).

La figura 3 muestra el porcentaje de HA liberado en funcion del tiempo de la composicion a base de Carbopol correspondiente a la composicion 1; las barras representan la desviacion estandar (n = 3).

La figura 4 muestra el porcentaje de HA liberado en funcion del tiempo de la composicion a base de quitosano del ejemplo 2; las barras representan la desviacion estandar (n = 3).

La figura 5 muestra el porcentaje de HA liberado en funcion del tiempo de la composicion a base de Carbopol correspondiente a la composicion del ejemplo 2; las barras representan la desviacion estandar (n = 3).

Descripcion detallada de la invencion

[0032] Para los fines de la presente invencion, se definen a continuacion los siguientes terminos y expresiones usados en la descripcion general.

[0033] La expresion "acido hialuronico" pretende hacer referencia a una fraccion de acido hialuronico extraida de fuentes animales u obtenida por fermentacion microbiana que tiene un peso molecular de 7-250 kDa (7.000250.000). La viscosidad intrinseca de esta fraccion determinada segun Ph. Eur. 7.0, 2011 pagina 2928, es inferior a 0,65 m3/kg.

[0034] Para el proposito de la invencion, el acido hialuronico preferido es una fraccion que tiene un peso molecular que varia de 30 a 250 kDa y mas preferiblemente de 30 y 100 kDa. El acido hialuronico esta preferiblemente en forma de sal con un metal alcalino y mas preferiblemente esta en forma de sal sodica, a saber hialuronato sodico.

[0035] El termino "quitosano" pretende definir en el presente documento un polisacarido derivado de la desacetilacion de quitina, que tiene un grado de desacetilacion (denominado en el presente documento DD) que varia del 60 al 80 % obtenido a partir de fuentes naturales, tales como cascara de crustaceos o de la pared celular de los hongos. El peso molecular de dicho quitosano esta comprendido en el intervalo de 50 a 300 kDa y preferiblemente de 80 y 200 kDa.

[0036] Para el proposito de la invencion, el quitosano preferido tiene un grado de desacetilacion de aproximadamente el 70-80 %. El quitosano desacetilado al 75 % es el mas preferido y es un quitosano con una viscosidad entre 30 y 70 mPas a una concentracion del 1 % (p/v) en acido acetico al 1 % a 20 °C.

[0037] Ademas, un quitosano que tiene el grado de desacetilacion mencionado puede estar en forma de sal y puede seleccionarse de entre sulfato de clorhidrato, acetato, lactato, malato, succinato, ascorbato, fumarato, adipato y quitosano.

[0038] El termino "glicerofosfato" se refiere en el presente documento a una sal alcalina o alcalinoterrea, preferiblemente de sodio, de acido D o L a-glicerofosforico, acido p-glicerofosforico y mezcla de los mismos. Puede prepararse a partir de fuentes naturales, tal como, por ejemplo, por hidrolisis de lecitina o por fosforilacion de glicerol. Para el proposito de la invencion, el glicerofosfato preferido es una sal sodica de acido p-glicerofosforico y esta segun Ph. Eur. Eur. 7.0, concretamente como material cristalino hidratado con 4 a 6 moleculas de agua de cristalizacion. El pentahidrato sodico glicerofosfato es el mas preferido.

[0039] La expresion "solucion(es) de polisacarido(s)" se refiere en el presente documento a soluciones acuosas transparentes del polisacarido relacionado no gelificado y estable a temperaturas que varian de 0 °C a temperatura ambiente (por ejemplo, 15-25 °C).

[0040] Las expresiones "temperatura de transicion sol/gel" y "temperatura de gelificacion" son equivalentes y se entiende en el presente documento que se refieren a cualquier temperatura que varia de 34 °C a aproximadamente 40 °C, preferiblemente a 35-38 °C, a la que una solucion acuosa transparente que comprende acido hialuronico, quitosano y glicerofosfato se convierte en un hidrogel dispersado homogeneamente sin ninguna formacion de precipitados y separacion de fases.

[0041] Con el fin de cumplir el proposito de la invencion, es decir, proporcionar composiciones de hidrogel mucoadhesivas que comprenden acido hialuronico para su aplicacion topica en los tejidos mucosales interiores de una cavidad corporal, se previo una composicion acuosa a base de soluciones de quitosano y glicerofosfato sodico como un sistema potencial util para ser explotado para el desarrollo de un dispositivo medico adecuado. Como se menciona en el estado de la tecnica, se sabe que dicho sistema posee la caracteristica distintiva de ser capaz de formar hidrogeles termosensibles, aumentando consistentemente su viscosidad por calentamiento, mientras que las propiedades mucoadhesivas o la adicion de otros componentes no se investigan.

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[0042] Sin embargo, se espera que la adicion a este sistema de un polianion, tal como acido hialuronico, de lugar a los problemas tecnicos anteriormente mencionados debido a la incompatibilidad mutua en solucion acuosa entre los dos polisacaridos tomados como tal.

[0043] Por lo tanto, para composiciones que comprenden acido hialuronico y sales del mismo combinadas con quitosano y sales del mismo y una sal de glicerofosfato en una solucion acuosa dotada de una transicion sol-gel a 35-38 °C y propiedades mucoadhesivas, esta incompatibilidad tiene que resolverse para obtener hidrogeles estables y evitar la formacion de complejos polielectroliticos por interacciones ionicas entre quitosano y acido hialuronico con separacion de fases.

[0044] El logro de este proposito se basa en una serie de caracteristicas tecnicas: las caracteristicas de los polisacaridos utilizados, la relacion entre ellos y el pH.

[0045] El HA se ha seleccionado a partir de las fracciones que presentan un bajo peso molecular por sus propiedades conocidas en la cicatrizacion de heridas y aunque tambien por razones tecnologicas. De hecho, se ha informado ampliamente en la bibliografia que los fragmentos de origen natural derivados de la degradacion de HA participan activamente en la remodelacion y regeneracion de tejidos, desempenando asi un papel crucial en la cicatrizacion de heridas, y al mismo tiempo, se sabe que el tamano del polimero puede afectar profundamente a su comportamiento en la composicion, ya que el numero de interacciones entre las dos cadenas polimericas es estrictamente dependiente de su tamano molecular. A continuacion, el HA para las composiciones de acuerdo con la invencion tiene un peso molecular de 7 a 250 kDa y preferiblemente de 30 a 250 kDa, y mas preferiblemente de 30 a 100 kDA.

[0046] En cuanto al quitosano, contrariamente a lo que se desvela en el estado de la tecnica para las composiciones de la presente invencion, la mejor realizacion de quitosano con referencia a la temperatura de gelificacion en el intervalo fisiologico en torno a 35-38 °C es el quitosano que tiene un grado de desacetilacion del 75 %, mientras que con un quitosano con un DD del 95 %, los hidrogeles obtenidos muestran a una temperatura entre 0 y 40 °C la formacion de coacervados con separacion de fases brusca. Por lo tanto, el quitosano o sales del mismo para las composiciones de acuerdo con la invencion tiene un grado de DD del 60-80 % y preferiblemente del 70-80 %, y mas preferiblemente tiene un grado de DD del 75 %. La caracteristica mas critica para las composiciones que comprenden acido hialuronico y sales del mismo combinadas con quitosano y sales del mismo y glicerofosfato sodico en una solucion acuosa son las relaciones entre quitosano y HA. Teniendo en cuenta el quitosano, estas relaciones pueden estar comprendidas entre 1:0,6 (HA:quitosano) y 1:45 (HA:quitosano). Preferiblemente, las relaciones entre HA y quitosano son: 1:10 (HA:quitosano); 1:6 (HA:quitosano); 1:3 (HA:quitosano) y 1:1,8 (HA:quitosano).

[0047] Para la capacidad termogelificante, las relaciones entre quitosano y glicerofosfato pueden estar comprendidas entre 1:0,8 y 1:15 (quitosano:glicerofosfato). Las relaciones preferidas son de 1:1,8 a 1:7,0 (quitosano:glicerofosfato).

[0048] Por lo tanto, en una realizacion para las composiciones de la invencion que comprenden acido hialuronico y sales del mismo combinadas con quitosano y sales del mismo, y una sal de glicerofosfato en una solucion acuosa de la presente invencion, el contenido de los componentes esta en los siguientes intervalos en % p/v:

- acido hialuronico de 0,1 a 1,5;

- quitosano de 1,0 a 4,5; y

- glicerofosfato de 4,0 a 15 como sustancia anhidra y el pH esta comprendido de 6,9 a 7,1.

[0049] En una realizacion preferida, las composiciones de la invencion comprenden:

- acido hialuronico de 0,3 a 1,0;

- quitosano de 1,8 a 3,0; y

- glicerofosfato de 5,6 a 12,7 como sustancia anhidra y el pH esta comprendido de 6,9 a 7,1.

[0050] En este caso, cuando el glicerofosfato es segun Ph. Eur. 7,0, y es como una sustancia pentahidrato, los intervalos indicados anteriormente se encuentran en % p/v del 8 al 18 %. Ademas, para los propositos de la invencion, el glicerofosfato pentahidrato es preferiblemente el 8 % en peso/volumen.

[0051] Por lo tanto, las composiciones preferidas de la invencion son: acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0

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% y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v; acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v; acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v, y acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v. La ultima composicion es la mas preferida.

[0052] Cuando el quitosano utilizado no esta en forma de sales, las composiciones pueden comprender ademas un acido inorganico u organico en un intervalo del 0,6 al 0,9 % p/v con el fin de solubilizar el quitosano en agua y proporcionar un pH casi en el intervalo fisiologico, concretamente, 6,9 y 7,1. Dichos acidos inorganicos u organicos se seleccionan del grupo que consiste en clorhidrato, acido sulfurico, acido acetico, acido lactico, ascorbico, malico, succinico, adipico o fumarico, preferiblemente el acido es acido lactico.

[0053] Entre las composiciones capaces de proporcionar geles espesos tras el calentamiento a 37°C, dos son los mas preferidos: composicion que comprende el 0,3 % de HA, 3 % de quitosano, 8 % de glicerofosfato sodico pentahidrato y el 0,9 % de acido lactico, y composicion que comprende el 1,0 % de HA, 1,8 % de quitosano, 8,0 % de glicerofosfato sodico pentahidrato y el 0,6 % de acido lactico.

[0054] En una realizacion, las composiciones se pueden preparar mezclando soluciones acuosas de los componentes individuales en las proporciones adecuadas para obtener la concentracion perseguida a temperaturas que varian de 0 a 25 °C. La solucion acuosa de quitosano se anade con un acido inorganico u organico seleccionado de acido clorhidrico, sulfurico, acetico, lactico, ascorbico, malico, succinico, adipico o fumarico, y se anade preferiblemente con acido lactico, cuando el quitosano no esta en forma de sal. Las temperaturas de preparacion no afectan a la gelificacion tras el calentamiento a 37 °C, pero influyen fuertemente en el aspecto de las composiciones en cuanto a claridad y homogeneidad. En realidad, las composiciones preparadas a temperaturas superiores a 10 °C pueden presentar una opalescencia/turbidez con signos de separacion de fase. Por esta razon, las temperaturas de 0 a 4 °C son las temperaturas de partida para la preparacion de las composiciones que se prefieren.

[0055] El agua desempena un papel muy critico en el comportamiento de estas composiciones, en particular, cuanto mayor es la cantidad de agua unida, mejores son las caracteristicas del gel: la cuantificacion del agua libre en la formulacion represento aproximadamente el 90 % del agua total, afectando significativamente a la estabilidad de las composiciones. Ninguna de las composiciones, en cualquiera de las condiciones de almacenamiento ensayadas, concretamente, a 4 °C o a 25 °C o a 40 °C, mostro signos significativos de termorreversibilidad, excepto por una ligera disminucion de la viscosidad para composiciones con un contenido mas alto de HA recien preparado o despues de 4 °C de almacenamiento.

[0056] En una realizacion adicional, las composiciones de la invencion pueden obtenerse preparando dos soluciones acuosas de partida separadas, una que contiene una solucion acuosa acida de quitosano o una solucion acuosa de una sal de quitosano, y la otra una solucion acuosa de glicerofosfato sodico y HA, a mezclar en el momento de la administracion. Las soluciones de partida se pueden concentrar dos veces con respecto a la concentracion final en la composicion deseada y pueden mezclarse a temperatura ambiente a traves de un dispositivo adecuado, por ejemplo un inyector automatico uniendo las dos jeringas a una conexion en Y. En estas condiciones, la solucion resultante conserva todavia la capacidad de convertirse en un gel espeso en menos de 15 minutos cuando se calienta a 37 °C. Esto es bastante interesante especialmente teniendo en cuenta que todas las etapas pueden realizarse a temperatura ambiente, eliminando asi la necesidad de enfriar soluciones antes de mezclar, y los hidrogeles pueden formarse in situ en el momento de la administracion al sujeto en necesidad del tratamiento.

[0057] A continuacion, se describen brevemente los resultados obtenidos con algunas realizaciones de las composiciones de la invencion y se desvelan en detalle en los ejemplos.

[0058] Como primera etapa, el contenido de agua en las composiciones preparadas como ejemplos se cuantifico mediante analisis termogravimetrico (TGA) dando como resultado una buena concordancia con la cantidad nominal (datos no mostrados). El agua desempena un papel muy importante en el comportamiento de las composiciones, en particular, cuanto mayor es la cantidad de agua unida, mejores son las caracteristicas del gel, ya que sus interacciones con las cadenas polimericas de quitosano determinan la capacidad de la composicion para convertirse en un gel, asi como su estabilidad. Con el fin de cuantificar la cantidad de agua libre, que es congelable, se realizaron experimentos de calorimetria diferencial de barrido (DSC) sobre composiciones que tenian diferentes contenidos de quitosano y acido hialuronico: la cantidad de agua libre dio lugar respectivamente al 87,2 % (relacion de la composicion quitosano:HA igual a 10:1) y 91,9 % (relacion de composicion quitosano:HA igual a 1,8:1). En otras palabras, la cantidad de agua unida era de 12,8 para la composicion de quitosano:HA igual a 10:1 y 8,1 para la composicion de quitosano:HA igual a 1,8:1. Esto significa que la cantidad de agua unida aumento concomitantemente con la relacion relativa entre el quitosano y el acido hialuronico, lo que sugiere que la union del agua se debe principalmente al quitosano.

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[0059] Las composiciones de acuerdo con la presente invencion se han ensayado en un experimento ex vivo para determinar la mucoadhesividad. Se selecciono la mucosa de cerdo como modelo y se realizo una prueba de lavado frente a una formulacion basada en Carbopol® tomada como norma de oro. Los resultados del ensayo revelaron que las composiciones ensayadas tenian una mucoadhesividad mas alta con respecto a la composicion basada en Carbopol® correspondiente.

[0060] Por lo tanto, las caracteristicas distintivas de las composiciones de la invencion son:

- la presencia de componentes biologicamente seguros y biocompatibles;

- la coexistencia en una solucion acuosa de un compuesto basico, tal como quitosano, y un acido, tal como acido hialuronico, sin modificaciones quimicas tanto del quitosano como del acido hialuronico, evitando de este modo totalmente cualquier riesgo de toxicidad derivado de la reticulacion quimica o fotoiniciada;

- la capacidad para formar hidrogeles a 37 °C;

- alta mucoadhesividad, significativamente mas alta que el norma de oro.

[0061] En conclusion, las composiciones de acuerdo con la presente invencion constituyen un sistema de suministro medico innovador para la administracion en mucosas de acido hialuronico. Poseen las caracteristicas distintivas de permitir la coexistencia en solucion de un compuesto basico tal como quitosano, y un acido tal como acido hialuronico. Ademas, su capacidad para gelificar a 37 °C acompanada de alta mucoadhesividad constituye una buena solucion para la administracion de hidrogeles formados in situ y para una localizacion eficaz y persistente de HA en el sitio del dano.

Ejemplos

[0062] En los siguientes ejemplos se describen la preparacion de la composicion en la que el acido hialuronico, el quitosano y el glicerofosfato se combinan en diferentes cantidades y el quitosano tiene un grado de desacetilacion del 75 % (ejemplos 1-8) o, como comparacion, un grado de desacetilacion del 95 % (ejemplos AF). En lo sucesivo en el presente documento se describe tambien la prueba de caracterizacion realizada sobre las composiciones de acuerdo con la invencion.

Ejemplo 1 Preparacion de una composicion de acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0063] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0064] Para obtener las concentraciones finales de acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0 % y NaGP al 8,0 % p/v, se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA sodico a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,9 % p/v). Las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 6,9.

Ejemplo 2 Preparacion de composiciones de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0065] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0066] Para obtener las concentraciones finales de tres componentes (acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y NaGP al 8,0 % p/v), se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,6 % p/v). La mezcla de las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 6,9.

Ejemplo 3 Preparacion de una composicion de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico

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pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0067] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0068] Para obtener las concentraciones finales de tres componentes (acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y NaGP al 8,0 % p/v), se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP sodico y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA sodico a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,9 % p/v). La mezcla de las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 6,9.

Ejemplo 4 Preparacion de una composicion de acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 18 % p/v.

[0069] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0070] Para obtener las concentraciones finales de tres componentes (acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0 % y NaGP sodico al 18 % p/v), se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA sodico a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,9 % p/v). La mezcla de las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 7,0.

Ejemplo 5 Preparacion de una composicion de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 18 % p/v.

[0071] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0072] Para obtener las concentraciones finales de tres componentes (acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y NaGP al 18 % p/v), se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP sodico y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,6 % p/v). La mezcla de las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 7,1.

Ejemplo 6 Preparacion de una composicion de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 18 % p/v.

[0073] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0074] Para obtener las concentraciones finales de tres componentes (acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y NaGP al 18 % p/v), se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,9 % p/v). La mezcla de las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 7,0.

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Ejemplo 7 Preparation de una composition de acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0075] Se preparo una primera solucion acuosa de quitosano (4 % p/v) anadiendo a una dispersion acuosa de quitosano, con un grado de desacetilacion del 75 %, acido lactico hasta una concentracion del 1 % p/v. Se prepararon por separado una solucion acuosa al 50 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 10 % p/v de hialuronato sodico (HA). Todas las soluciones acuosas se prepararon a 0 °C. A continuacion, las soluciones acuosas obtenidas se estabilizaron en un criostato a temperaturas entre 0 y 25 °C.

[0076] Para obtener las concentraciones finales de tres componentes (acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 1,8 % y NaGP sodico al 8 % p/v), se anadieron muestras de volumenes conocidos de la solucion acuosa al 50 % p/v de NaGP y la solucion acuosa al 10 % p/v de HA sodico a una muestra de volumen conocido de la primera solucion acuosa de quitosano al 4 % (concentracion de acido lactico = 0,9 % p/v). La mezcla de las tres soluciones acuosas se mezclaron con agitacion vorticial o magnetica a temperatura ambiente, obteniendose una solucion homogenea y transparente con un pH final de 6,8.

Ejemplo 8 Preparation de una composition de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0077] La composicion del ejemplo 2 se preparo con un metodo alternativo que permite la mezcla instantanea de dos soluciones distintas.

[0078] Las soluciones de partida se prepararon a temperatura ambiente, se concentraron dos veces con respecto a la concentracion final en la composicion deseada y se mezclaron al mismo tiempo a traves de un inyector automatico.

[0079] En mas detalle, se preparo una solucion de al 3,6 % p/v de quitosano con acido lactico al 1,2 % p/v. Mientras tanto, se prepararon por separado una solucion acuosa al 32 % p/v de glicerofosfato sodico pentahidrato (NaGP) y una solucion acuosa al 4 % p/v de hialuronato sodico (HA) y despues se mezclaron en la misma proporcion, para tener una concentracion de NaGP al 16 % y una concentracion de HA al 2 %.

[0080] Se recogieron 5 ml de cada una de las dos soluciones resultantes con 2 jeringas que se montaron en un conjunto de inyector automatico a una velocidad de 50 |jl/min. Se permitio que las dos soluciones se mezclaran uniendo las dos jeringas a un conector en Y.

[0081] En estas condiciones, la composicion resultante era una solucion homogenea y transparente con un pH final de 7,1.

Ejemplo A Preparation de una composition de acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0082] La preparacion del ejemplo 1 se preparo usando un quitosano que tenia un grado de desacetilacion del 95 %. Se registro una separacion de fases con precipitacion de coacervados.

Ejemplo B Preparation de una composition de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0083] La preparacion del ejemplo 2 se preparo usando un quitosano que tenia un grado de desacetilacion del 95 %. Se registro una separacion de fases con precipitacion de coacervados.

Ejemplo C Preparation de una composition de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 8,0 % p/v.

[0084] La preparacion del ejemplo 3 se preparo usando un quitosano que tenia un grado de desacetilacion del 95 %. Se registro una separacion de fases con precipitacion de coacervados.

Ejemplo D Preparation de una composition de acido hialuronico al 0,3 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 18 % p/v.

[0085] La preparacion del ejemplo 4 se preparo usando un quitosano que tenia un grado de desacetilacion del 95 %. Se registro una separacion de fases con precipitacion de coacervados.

Ejemplo E Preparation de una composition de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 1,8 % y glicerofosfato sodico

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pentahidrato al 18 % p/v.

[0086] La preparacion del ejemplo 5 se preparo usando un quitosano que tenia un grado de desacetilacion del 95 %. Se registro una separacion de fases con precipitacion de coacervados.

Ejemplo F Preparacion de una composicion de acido hialuronico al 1,0 %, quitosano al 3,0 % y glicerofosfato sodico pentahidrato al 18 % p/v.

[0087] La preparacion del ejemplo 6 se preparo usando un quitosano que tenia un grado de desacetilacion del 95 %. Se registro una separacion de fases con precipitacion de coacervados.

Ejemplo 9 Evaluacion de la turbidez de las composiciones de los ejemplos 1, 2 D y E

[0088] La turbidez de las soluciones finales preparadas de acuerdo con los ejemplos 1, 2 D y E se determino leyendo la transmitancia de dichas soluciones a 590 nm usando un espectrofotometro V530 UV-Vis (Jasco, Japon) equipado con una cubeta de cuarzo que con una longitud optica de 1 cm.

[0089] Los resultados se informan en la tabla 1.

Tabla 1. Ensayo de turbidez de las composiciones de los ejemplos 1,2 D y E

Composicion (Ejemplos): Transmitancia de la solucion %

1: 71,05

2: 42,35

D: 2,58

E: 4,05

[0090] Los datos informados en la Tabla 1 indican que la composicion de los Ejemplos D y E eran soluciones no transparentes ya que transmitian solo el 3-4 % de la luz incidente, mientras que la composicion de los Ejemplos 1 y 2 eran soluciones transparentes y claras.

Ejemplo 10 Termogelificacion de las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1-6 en comparacion con las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos A-F

[0091] Las propiedades de transicion sol-gel de las composiciones acuosas preparadas se evaluaron midiendo la diferencia de viscosidad (viscosidad A) entre la viscosidad medida a temperatura ambiente (15-25 °C) y despues de la gelificacion a 37 °C. Las mediciones de viscosidad se realizaron usando un viscosimetro tipo Brookfield Visco- Star-R, equipado con un husillo tipo R7 (Fungila S.A., Italia).

[0092] El ensayo se realizo en las siguientes condiciones:

- Temperatura de partida: 0 - 0,5 °C;

- Tiempo de estabilizacion a la temperatura de partida: 15 minutos;

- Tiempo de estabilizacion a temperatura ambiente (15-25 °C): 30 minutos;

- Calentamiento en un bano termostatico de agua a 37 °C durante 12-16 horas;

- Velocidad del husillo (100 rpm).

[0093] Los resultados se informan en la tabla 2.

Tabla 2. Ensayo de termogelificacion de las composiciones del ejemplo 1-6 y de los ejemplos de comparacion A-F

Composiciones (Ejemplos): Quitosano (DD al 75 %) HA NaGP Termogelificacion (viscosidad A)

1: 3,0 0,3 8,0 3,75 103

2: 1,8 1,0 8,0 1,7 103

3: 3,0 1,0 8,0 1,95 103

4: 3,0 0,3 18 4,65 103

5: 1,8 1,0 18 1,85 103

6: 3,0 1,0 18 4,10 103

Composiciones (Ejemplos): Quitosano (DD al 95 %) HA NaGP Termogelificacion (viscosidad A)

A: 3,0 0,3 8,0 -

B: 1,8 1,0 8,0 -

C: 3,0 1,0 8,0 -

D: 3,0 0,3 18,0 -

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E: 1,8 1,0 18,0 -

F: 3,0 1,0 18,0 -

[0094] Como se muestra por los resultados, el grado de desacetilacion de quitosano parecfa desempenar un papel crucial en la transicion sol-gel de las composiciones ensayadas.

[0095] Un analisis estadfstico de los datos presentados en la Tabla 2 evidencia que, en la termogelificacion, se presento una alta significacion estadfstica de los efectos por el grado de desacetilacion del quitosano (valor de p = 3 x 10-4). Se presento una significacion estadfstica inferior por el efecto de la concentracion de acido lactico (valor de p = 0,025), mientras que el efecto de la concentracion de quitosano, HA y NaGP no fue significativo (valor de p = 0,15, 0,69 y 0,59, respectivamente).

[0096] Este analisis de los efectos permite concluir que la concentracion de HA y NaGP practicamente no tiene efecto dentro del intervalo de concentracion considerado sobre el pH y la capacidad de la formulacion para dar lugar a la termogelificacion, mientras que la concentracion de acido lactico demostro ser un parametro crftico tanto para el pH como para la termogelificacion.

[0097] El pH no se vio afectado por el tratamiento de calentamiento para la termogelificacion.

Ejemplo 11 Termogelificacion de las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1, 3, 4 y 6 a diferentes temperaturas

[0098] Las composiciones se ensayaron con el fin de averiguar la temperatura minima a la que tiene lugar la termogelificacion. Se consideraron cuatro temperaturas diferentes, concretamente, 30, 34,5, 35,5 y 37,5 °C.

[0099] Los resultados obtenidos se informan en la Tabla 3.

Tabla 3. Evaluacion del aumento de viscosidad tras el calentamiento a diferentes temperaturas

Composiciones (Ejemplos): 30 ± 0,5 °C 34,5 ± 0,5 °C 35,5 ± 0,5 °C 37,5 ± 0,5 °C

1: Sin gelificacion Sin gelificacion Sin gelificacion Alta gelificacion

3: Sin gelificacion Sin gelificacion Sin gelificacion Alta gelificacion

4: Unicamente opalescencia Alta gelificacion Alta gelificacion Alta gelificacion

6: Sin gelificacion Alta gelificacion Alta gelificacion Alta gelificacion

[0100] Se puede observar que ninguna de las composiciones ensayadas dio lugar a la termogelificacion a 30 °C. Las composiciones de los ejemplos 4 y 6 se sometieron a transicion sol-gel a 34,5 °C, mientras que para las composiciones de los ejemplos 1 y 3 el fenomeno se observo en torno a 37 °C.

Ejemplo 12 Analisis de calorimetria diferencial de barrido (DSC) de las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1, 2, 3, 7 y 8

[0101] El analisis DSC utilizado para medir la cantidad de agua libre (congelable) se realizo con una DSC 821 e (Mettler Toledo, Estados Unidos) impulsada por un software STARe (Mettler Toledo, Estados Unidos). Esta determinacion se basa en la medicion de la entalpfa de fusion del agua en la muestra en comparacion con la entalpfa de fusion de agua pura por unidad de peso de acuerdo con la siguiente ecuacion (1):

Fw= AHfs/(AHfpw/mpw)

(1)

donde:

Fw es la masa de agua libre en la muestra ensayada; AHfs es la entalpfa de fusion del agua en la muestra ensayada; AHfpw es la entalpfa de fusion de una muestra de agua pura con masa mpw.

[0102] El porcentaje de agua unida, Bw, se calculo de acuerdo con la siguiente ecuacion (2):

Bw=(Tw-Fw)/Twx 100

(2)

donde:

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25

30

35

40

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50

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Tw es la cantidad total de agua en las muestras segun se determina por TGA (TG 50, Mettler Toledo Estados Unidos, impulsado por el software STARe, Mettler Toledo Suiza).

[0103] El porcentaje del agua unida en las muestras se informa en la Tabla 4 con relacion relevante entre quitosano y acido hialuronico.

Tabla 4. Relacion entre la concentracion (%) de quitosano y la concentracion de HA para las diferentes

formulaciones y el: porcentaje relevante de agua unida.

Composiciones (Ejemplos): Relacion de quitosano/HA % de agua unida

2: 1,8 8,09

3
3: 9,07

7: 6 10,57

1: 10 12,77

[0104] Se encontro una correlacion lineal (R2 = 0,996) entre la relacion de concentracion quitosano/acido hialuronico y el porcentaje de agua unida (figura 1).

[0105] Esto indica que a medida que la relacion entre quitosano y HA aumenta, el porcentaje de agua unida tambien aumenta. Esto podria estar relacionado con la interaccion entre quitosano y HA mas que simplemente con la mejor capacidad de quitosano para interactuar con agua con respecto a HA. De hecho, el quitosano esta mas disponible para el agua de union en las composiciones en las que esta menos implicada en las interacciones con el acido hialuronico.

[0106] Tambien se ensayo una composicion preparada de acuerdo con el ejemplo 8 que tenia la mitad de la concentracion de quitosano (0,9 %). Esta formulacion no estaba completamente clara, sugiriendo una hidratacion incompleta de los componentes. Ademas, no funciono en la termogelificacion. Los analisis por DSC y TGA indicaron ausencia de agua ligada en la solucion de partida.

Ejemplo 13 Mucoadhesividad de las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1 y 2: Mucoadhesion ex vivo

[0107] El potencial mucoadhesivo de las composiciones se determino mediante pruebas de lavado adaptadas del metodo informado por Lehr et al. (Lehr A. et al., Int. J. Pharmaceutics, 1992, 78, 43-48).

[0108] Se obtuvieron intestinos de cerdo recien extirpados (Large White, Landrance, 10-11 meses, 145-190 kg) de un matadero local (Parma, Italia) a una hora del sacrificio. El explante intestinal (al menos 30 cm de colon descendente, cortado de la flexion izquierda y sigma) se realizo por un veterinario. El intestino de cerdo recien extirpado se transporto al laboratorio en una solucion salina isotonica en un bano de hielo en una hora desde el sacrificio. Despues de un extenso lavado con solucion salina isotonica (500 ml en al menos tres veces), cada muestra de intestino se corto a lo largo de su longitud y la mucosa se separo cuidadosamente del tejido conectivo subyacente con tijeras quirurgicas prestando atencion a no danar la estructura mucosa.

[0109] Se pego un trozo de tejido intestinal de cerdo (aproximadamente 2 cm x 4 cm) sobre un portaobjetos de vidrio usando pegamento de cianoacrilato, manteniendo el lado luminal hacia arriba. Se distribuyo uniformemente un peso dado de la composicion sobre el tejido de la mucosa intestinal, luego los portaobjetos de vidrio se mantuvieron durante 15 minutos en un horno a 37 °C. Cada portaobjetos de vidrio se colgo despues en el brazo de un aparato desintegrante de comprimidos Ph. Eur. 7.0 (Erweka, Alemania) y se sumergio con regularidad (30 carreras/min) en 30 ml de una solucion tampon de fosfato (pH 6,8) a 37 ± 0,5 °C mediante la operacion del aparato de ensayo de desintegracion de comprimidos Ph. Eur. 7.0.

[0110] A intervalos de tiempo dados, se recogio 1 ml de solucion y se reemplazo por tampon fresco. Las muestras recogidas se congelaron antes de tratamiento adicional para la cuantificacion. Las muestras extraidas de la prueba de lavado se trataron despues y se analizaron por HPLC-ESI-MS para determinar la cuantificacion de HA liberado de la composicion en la solucion tampon. La liberacion de HA se tomo como una indicacion negativa de la capacidad de la composicion para mantener en contacto con la mucosa con el tiempo.

[0111] Se ensayaron las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1 y 2. Para la referencia de control se usaron dos composiciones de gel de Carbopol® que contenian el mismo porcentaje de HA.

Preparacion de muestras para analisis

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0112] El acido hialuronico es un polisacarido lineal de alto peso molecular de origen natural. Las unidades disacaridas de repeticion consisten en acido glucuronico y N-acetilglucosamina a traves de un enlace p-1,4. La cuantificacion directa de HA en solucion no es factible para un gran numero de muestras tales como la obtenida a partir de estos experimentos de liberacion. La HA se suele cuantificar mediante la cuantificacion de uno o mas productos de degradacion de HA. Dado que la degradacion enzimatica de HA es costosa y duradera, se prefieren metodos que incluyen degradacion alcalina o acida. En este estudio se utilizo un protocolo de degradacion de acidos. Adoptando el metodo informado por Alkrad et al (Alkrad J.A. et al., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, 30, 913-919): cada muestra (1 ml) obtenida del experimento de lavado se retiro por secado y despues se trato con 250 pl de una solucion al 47,5 % (v/v) de acido sulfurico. Las muestras se mantuvieron a 45 °C durante 10 minutos, despues la reaccion se detuvo neutralizando con soluciones de hidroxido sodico para alcanzar un pH 5. Cada muestra se llevo a un volumen final de 3 ml con agua destilada, a continuacion se filtro a traves de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 pm y se mantuvo a -20 °C antes del analisis por LC-MS.

Metodo de cromatografia liquida-electronebulizacion-espectrometria de masas

[0113] La separacion por HPLC se realizo en una columna Atlantis® dC18 100 A de 5 pm (2,1 mm x 100 mm) (Waters Corporation, Estados Unidos). La fase movil se suministro mediante una bomba binaria (serie Agilent 1100) y la elucion se realizo en modo gradiente usando una solucion acuosa de acido formico (pH 3,5) (eluyente A) y metanol (eluyente B) a un caudal de 0,2 ml/min. La muestra (Viny: 20 pl) se inyecto en un gradiente ajustado como se indica a continuacion:

Tiempo (min): A (%) B (%)

1: 98 2

2: 98
2

3: 60 40

4: 60 40

5: 20 80

8: 20 80

9: 98 2

13: 98 2

[0114] Los espectros de masas de ESI se registraron usando un MS API 150EX equipado con una fuente de pulverizacion Turboion (Applied Biosystems, Estados Unidos). Los parametros de la interfaz de electronebulizacion se ajustaron como se indica a continuacion: tension capilar 4,5 kV, temperatura de la fuente 450 °C, potencial de desagrupacion 50 V, potencial de enfoque 400 V. Para el analisis cuantitativo se adquirieron senales en ionizacion positiva en modo SIM monitorizando iones a m/z 380, m/z 759. Se uso nitrogeno como una cortina (10 l/hora) y gas nebulizante (10 l/h).

Resultados del estudio de mucoadhesividad

A. Liberacion de HA en los experimentos de lavado

[0115] Se mezclo HA con composiciones a base de quitosano y Carbopol®. Mediante la realizacion de experimentos de lavado como se ha descrito anteriormente, se controlo la liberacion de HA de la composicion de los ejemplos 1 y 2 depositada sobre la mucosa de cerdo en solucion de PBS mantenidas a 37 °C en funcion del tiempo.

[0116] La composicion preparada de acuerdo con el ejemplo 1 (que contenia HA al 0,3 %) libero aproximadamente el 10 % de la cantidad inicial de HA en los primeros 10 minutos, despues de lo cual la concentracion de HA en la solucion tampon se estabilizo indicando que no habia mas liberacion de HA de la composicion (figura 2). La explosion inicial es probablemente atribuible a la caida mecanica de la capa superior de la formulacion debido a la gravedad despues de las primeras carreras de la prueba.

[0117] La composicion a base de Carbopol® correspondiente mostro un perfil de liberacion similar pero se desplazo a mayores valores de % de HA. De hecho, la cantidad de HA liberada despues de 10 minutos fue aproximadamente el 55 % de la dosis. Tambien en este caso se observo una meseta a lo largo de la parte restante del experimento (figura 3).

[0118] En el caso de la composicion a base de quitosano preparada de acuerdo con el ejemplo 2 (que contenia HA al 1 %) se controlo una liberacion de aproximadamente el 60 % de la dosis de HA en los primeros 45 minutos seguida de un aumento muy bajo en la concentracion de HA que alcanzo el 70 % despues de 10 horas (figura 4).

[0119] En el caso de la composicion a base de Carbopol® correspondiente a la composicion 2, la liberacion de HA

se completo en menos de 45 minutos (figura 5).

[0120] Los resultados indicaron claramente la mayor mucoadhesividad de la composicion a base de quitosano tanto en los casos de composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos 1 y 2 con respecto a las 5 composiciones a base de Carbopol® correspondientes.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende acido hialuronico y sales del mismo en mezcla con quitosano y sales del mismo y una sal de glicerofosfato en una solucion acuosa, en la que el quitosano tiene un grado de desacetilacion en el intervalo del 60 al 80 % y dicha composicion tiene una propiedad de transicion sol-gel a 35-38 °C, formando asi un hidrogel a dichas temperaturas.
2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que las relaciones entre acido hialuronico y quitosano son de 1:0,6 a 1:45 (HA:quitosano).
3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que las relaciones entre quitosano y glicerofosfato son de 1:0,8 a 1:15 (quitosano:glicerofosfato).
4. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que las relaciones entre acido hialuronico y quitosano son de 1:10 a 1:1,8 (HA:quitosano).
5. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que las relaciones entre quitosano y glicerofosfato son de 1:1,8 a 1:7,0 (quitosano:glicerofosfato).
6. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el contenido de los componentes esta comprendido en los intervalos:

- acido hialuronico del 0,1 al 1,5 % p/v;

- quitosano del 1,0 al 4,5 % p/v; y

- glicerofosfato anhidro del 4,0 al 15,0 % p/, y

en la que el pH esta comprendido entre 6,9 y 7,1.
7. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que el contenido de los componentes esta comprendido en los intervalos:

- acido hialuronico del 0,3 al 1,0 % p/v;

- quitosano del 1,8 al 3,0 % p/v; y

- glicerofosfato anhidro del 5,6 al 12,7 % p/v.
8. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el glicerofosfato es del 5,6 % p/v.
9. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el acido hialuronico tiene un peso molecular comprendido entre 7 y 250 kDa.
10. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que el acido hialuronico tiene un peso molecular comprendido entre 30 y 250 kDa.
11. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el quitosano tiene un grado de desacetilacion del 70-80 %.
12. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-11, en la que el glicerofosfato esta en forma de hidrato cristalino con 4 a 6 moleculas de agua de cristalizacion.
13. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-12, que comprende ademas un acido inorganico u organico seleccionado de acido clorhidrico, sulfurico, acetico, lactico, sulfurico, ascorbico, malico, succinico, adipico o fumarico en un intervalo del 0,6 al 0,9 % p/v.
14. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la promocion de la cicatrizacion de heridas de la mucosa de las cavidades corporales por administracion topica.
15. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que el uso es para la cicatrizacion de heridas de la mucosa oral, nasal, gastrointestinal, colorrectal y vaginal.
16. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que el uso es para la cicatrizacion de heridas de lesiones mucosas derivadas de quimioterapia y/o radioterapia usadas para tratar el cancer.