WO2019125130A1 - Biopolímero de quitosano y poloxámero 407 obtenido por irradiación gamma que exhibe propiedades fisicoquímicas y biológicas para la reparación de heridas - Google Patents

Biopolímero de quitosano y poloxámero 407 obtenido por irradiación gamma que exhibe propiedades fisicoquímicas y biológicas para la reparación de heridas Download PDF

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wounds
wound
hydrogel
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tissue
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Gerardo LEYVA GOMEZ
Erika Rocio SANTILLAN REYES
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Leyva Gomez Gerardo
Santillan Reyes Erika Rocio
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    • C01B33/14—Colloidal silica, e.g. dispersions, gels, sols
    • C01B33/152—Preparation of hydrogels

Definitions

  • the present invention relates to the field of hydrogel for topical administration and the use of said hydrogels in cosmetic and / or medical applications.
  • the hydrogel developed is based on the biopolymers chitosan and poloxamer 407 and has pharmaceutical properties for the repair of wounds and burns.
  • Hydrogels are considered as essential materials for the treatment and repair of wounds due to their modifiable physical and chemical properties, among them, capacity of adhesion to the tissues, mechanical force to stay intact and later be removed, provide a complete occlusion in the wound , and act as a barrier against bacterial infections; In addition, these materials can absorb the exudate and maintain adequate moisture for a quick wound closure.
  • the present invention provides a hydrogel obtained by a novel method for the manufacture of dressings using readily available polymers, consisting of a mixture of CH and P-407 crosslinked by gamma radiation with the aim of improving the repair of exclslonal wounds, As a viable alternative for the treatment of wounds, it is also known to characterize it by means of physicochemical tests, antimicrobial tests, and in vivo evaluation with the subsequent histological analysis and immunofluorescent tests.
  • the skin is a barrier that covers and protects the internal organs of the body. Being an external organ, it is prone to injury.
  • a repair process is presented that consists of an inflammatory phase, a proliferation phase and a remodeling phase that result in a scar.
  • polymer-based hldrogels which provide moisture to the wound bed and reduce pain.
  • the present invention provides a new hydrogel obtained by gamma irradiation based on chitosan and poloxamer 407, said hydrogel is characterized flslcochemically and the effects of topical application on full-thickness exclslonal wounds performed on the back of the mouse are evaluated.
  • the materials evaluated are: CH 0.75% w / v, P-407 25% w / v, a mixture of P-407 25% w / v with CH 0.75%, and the latter Irradiated at 25 KGy at its original pH (4) and at neutral pH (7).
  • the physicochemical characterization is carried out by pH and precipitation tests, scanning electron microscopy, differential scanning calorimetry, temperature and gelation time, viscosity profile, water absorption or moisture uptake, bloeroslon / swelling, and antimicrobial tests. , in which they highlight the properties of the compounds and hydrogels; especially the hydrogel with the polymer mixture before and after being subjected to Gamma irradiation.
  • Wound repair is analyzed macroscopically, determining the percentage of closure, and microscopically by histological staining of H & E, Masson and Herovlcl, and by immunofluorescent tests using molecular markers to evaluate the recruitment of neutrophils and macrophages by the expression of elastase. and of F4 / 80 respectively; the activation of fibroblasts by a-SMA, and the expression of TGF-p 3 , as a molecular indicator of scar quality.
  • the wounds treated with the gel Irradiated at pH 7 have a higher percentage of wound closure at day 3 compared to the other treatments.
  • FIG. 1 Schematic representation of the possible network formed by the P-407 and the Qultosano.
  • FIG 21 Viscosity graph of the irradiated hydrogel at a pH of 7. Thixotropy is lost (No significant differences found P> 0.05).
  • FIG. 23 Bioerosion percentage graph and / or swelling shown by the different gels.
  • Figure 24 Antibiograms obtained from the agar susceptibility test against the E. coli bacterium, for each of the samples developed.
  • Figure 25 Antibiograms obtained from the agar susceptibility test against S. aureus bacteria, for each of the samples developed.
  • Figure 26 Antibiograms obtained from the susceptibility test in agar against the bacterium P. aeruglnosa, for each of the samples developed.
  • Figure 27 Antibiograms obtained from the susceptibility test on agar against the fungus C. alblcans, for each of the samples developed.
  • FIG. 28 Macroscopic photographs showing the initial phase of the exclslonal wound of full thickness and its resolution at 3, 7 and 11 days after its completion when treated with each of the samples, saline solution (SS): used as control group, P-407, CH, CH + P, CH-P 4, and CH-P 7.
  • SS saline solution
  • Figure 29 Scatter plot showing the percentage of closure (contraction) of the wounds from 0 to 1 1 days and their respective standard errors.
  • Figure 30 Graph of the weight of the animals, from 0 to 1 1 days of treatment.
  • Figure 31 Photographs of H & E staining for the histological segments of the wounds of each treatment at day 3 taken with the 5x objective. In all wounds the presence of eschar without evident re-epithelization but with incipient migration and an abundant inflammatory infiltrate.
  • FIG 32 Photographs of the H & E staining for the histological segments of the wounds of each treatment at day 7 taken with the 5x objective. Most wounds have blood vessels, abundant cellular infiltrate, as well as complete re-epithelialization, with the exception of wounds treated with CH, where total re-epithelialization is not shown.
  • the granulation tissue comprises most of the tissue under repair in the groups treated with P-407, CH + P, CH-P 4 and CH-P 7, with a compact matrix in the central region underlying the dermis.
  • FIG 33 Photographs of H & E staining for the histological segments of the wounds of each treatment on day 1 1 taken with the 5x objective. The wounds reappelled completely in the groups SS, CH + P, CH-P 4 and CH-P 7, while in the other treatments a case is presented where the wound did not reepithelize in its entirety. Most wounds still have granulation tissue with blood vessels and abundant cellular infiltrate.
  • Figure 34 Photographs of Masson's stain for the histological segments of the wounds of each treatment on day 3 taken with the 5x objective.
  • the repair tissue is less abundant in the wounds treated with the Irradiated hydrogels, the fibrin matrix (shown in red) is greater in the wounds treated with CH and CH + P, begins the matrix replacement with incipient synthesis of collagen ( stained blue) in the deep zone of wounds treated with CH-P 4, and CH-P 7.
  • Figure 35 Photographs of Masson's stain for the histological segments of the wounds of each treatment on day 7 taken with the 5x objective. . Granulation tissue and synthesis of collagen (which stains blue) are observed in the wounds treated with the polymer mixture. A compact matrix with similar characteristics to fibrin is still observed in the groups to which SS, P-407, CH, CH + P and CH-P 4 were applied.
  • Figure 36 Photographs of Masson's stain for the histological segments of the wounds of each treatment on day 1 1 taken with the 5x objective. An evident turnover of the granulation tissue is observed by a scar tissue composed mainly of collagen fibers (stained blue) arranged in parallel.
  • FIG 37 Photographs of Herovicl staining for the histological segments of the wounds of each treatment on day 3 taken with the 5x objective.
  • the wounds treated with CH-P 7 presented packed collagen fibers (type I, in magenta color) embedded in the superficial matrix; and the wounds treated with CH-P 4 show an incipient deposit of collagen predominantly poorly packaged (stained light blue).
  • Figure 38 Photographs of Herovlcl staining for the histological segments of the wounds of each treatment at day 7 taken with the 5x objective.
  • the wounds treated with CH + P, CH-P 4 and CH-P 7 show an incipient deposition of collagen I (it is dyed magenta).
  • Figure 39 Photographs of Herovlcl staining for the histological segments of the wounds of each treatment on day 1 1 taken with the 5x objective.
  • the replacement of the tissue by a permanent matrix with an evident deposit of type I collagen is observed, specifically, the wounds treated with SS and CH-P 7 show greater amount of collagen packaged than is dyed magenta.
  • Figure 40 Photographs of the Anti-Elastane immunofluorescence of the wound area on day 3 of each treatment taken with the 20x objective. A similar neutrophil retraction is observed in all treatments, which is slightly lower in the wounds treated with CH, CH + P, CH-P 4 and CH-P 7.
  • Figure 41 Photographs of the Anti-Elastane immunofluorescence of the superficial area of the wound on day 7 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the white line separates the neoformaclone epithelium from the repair zone.
  • the number of neutrophils presents high levels to this day, which means that the Inflammatory phase is persistent. Wounds treated with CH show a higher recruitment of neutrophils compared to the other groups under study.
  • Figure 42 Photographs of the Anti-Elastane immunofluorescence of the superficial area of the wound on day 1 1 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the white line separates the neoformaclone epithelium from the repair zone.
  • the number of neutrophils presents considerable levels to this day, which means that the Inflammatory phase is persistent. There are no obvious differences between treatments.
  • FIG 43 Photographs of the immunofluorescence Antl-F4 / 80 of the deep gron of the wounds on day 3 of each treatment taken with the 20x objective. A low accumulation of macrophages is observed in all treatments; however, it is slightly higher in wounds treated with CH and P407.
  • FIG 44 Photographs of the immunofluorescence Antl-F4 / 80 of the deep gron of the wounds on the 7th day of each treatment taken with the 20x objective.
  • the infiltrate of macrophages in the area of the wound is markedly increased in all treatments from day 3 to day 7.
  • the wounds treated with the irradiated hldrogels, CH and CH + P show a higher recruitment of macrophages compared to the others groups in study.
  • FIG 45 Photographs of the immunofluorescence Antl-F4 / 80 of the deep region of the wounds on day 1 1 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the Infiltrate of macrophages was increased in the wounds treated with SS, P-407 and CH, being in the latter greater than in any other treatment; whereas in the groups treated with CH + P, CH-P 4 and CH-P 7 the number of macrophages remained similar to that of day 7.
  • FIG 46 Photographs of the immunofluorescent Antl-aSMA of the wounds on day 3 of each treatment taken with the 10x objective. No expression of ⁇ -SMA is observed that is related to activated fibroblasts in any of the groups studied.
  • FIG 47 Photographs of the immunofluorescence Antl-aSMA of the surface region of the wounds on day 7 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the white line separates the neoformation epithelium from the repair zone.
  • A-SMA expression is observed in the superficial region of the wound edges.
  • the expression of ⁇ -SMA was higher in the groups treated with the irradiated hldrogels, whereas. wounds that received CH and CH + P have the lowest level of expression.
  • Figure 48 Photographs of the immunofluorescence Antl-aSMA of the superficial region of the wounds on day 1 1 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the white line separates the neoformation epithelium from the repair zone.
  • the expression of ⁇ -SMA decreased in all cases, except for the group treated with CH, where the expression remained similar with respect to day 7.
  • FIG. 49 Photographs of the immunofluorescent Antl-TGF-p3 of the wounds on day 3 of each treatment taken with the 20x objective. Wounds treated with SS and P-407 show slightly higher expression of TGF-p 3 .
  • FIG 50 Photographs of the immunofluorescent Antl-TGF-p3 of the surface region of the wounds on day 7 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the white line separates the neoformation epithelium from the repair zone.
  • the treated P-407 wounds show slightly higher expression of TGF-p 3 .
  • FIG 51 Photographs of the immunofluorescent Antl-TGF-p3 of the surface region of the wounds on day 1 1 of each treatment taken with the 20x objective.
  • the white line separates the neoformation epithelium from the repair zone.
  • the treated P-407 wounds have lower expression of TGF-b 3 ⁇
  • Figure 54 Total positive area for a-SMA of the wounds to which the different treatments were applied on days 3, 7 and 1 1.
  • Figure 55 Percentage of expression of TGF-P3 in the wounds to which the different treatments were applied on days 3, 7 and 1 1. , with respect to the number of total cells present. Quantification performed using the Fiji Is just ImageJ (P> 0.05) ⁇ program .
  • the invention describes the obtaining and the novel use of a hydrogel that accelerates the process of repair of wounds and allows their closure, and can be used in any mammalian subject.
  • CD Differentiation group Cluster of differentiation
  • the skin covers the external surface of the body, and is the largest organ in area and weight. It has an important role in many functions: a) thermoregulation, homeostatic regulation of temperature, b) protection, being a barrier that covers the internal tissues of vertebrates has the ability to protect the body from potentially harmful factors, to mention a few examples , microbial invasion, thermal, chemical, mechanical and osmotic damage. Additionally, it contributes to the homeostasis of the fluids by inhibiting the evaporation of water, thanks to the lipids present on the surface of the skin, protecting the body from dehydration, c) sensory detection, d) has properties that allow absorption, permeability selective chemical products and the excretion through sweat of small amounts of salts, ammonium and urea.
  • the tissues that make up the skin are the epidermis, the dermis and the hypodermis.
  • the epidermis forms the superficial layer of the skin and is a structure composed of a stratified keratinized squamous epithelium. It contains epithelial cells, also known as keratinocytes, which are found on an underlying basal lamina; Merkel cells that function as mechanoreceptors; melanocytes that define the color of the skin; and Langerhans cells that are antigen-presenting cells of the skin's immune system.
  • the epidermis does not contain blood vessels, therefore, cellular nutrients come from a diffusion process from the underlying dermis.
  • This layer provides protection to the body in different ways: keratin protects from heat, abrasion and chemicals, the tight junctions of keratinocytes are a defense against the invasion of microorganisms such as bacteria, viruses, parasites and other organisms, represents a barrier Waterproof that allows to control the loss of water thanks to the lipids, and protects against the harmful effects of UV light by the action of melanin.
  • afferent nerve endings for the sensation of touch, pressure, temperature, as well as pain also reach the epidermis.
  • the epidermis is composed of five different cell layers. These layers include (from the most superficial to the deep) the stratum corneum, the stratum lucidum, the stratum granulosum, the stratum spinosum, and the stratum corneum. germinative stratum. Basal stratum cells continuously undergo cell division to produce new keratinocytes. these new cells gradually migrate towards the surface to populate the outermost layers of the epidermis. As they migrate towards the surface, they differentiate, mature, synthesize and deposit keratin and lipids intracellularly, acquiring a flat appearance. Underlying and separated from the epidermis by a basement membrane, is the dermis.
  • the dermis is a dense connective tissue composed mainly of MEC rich in collagen and elastin that are synthesized by fibroblasts, the main cellular component of the dermis. It provides flexibility and strength to the skin; it is irrigated by blood and lymphatic vessels, and densely innervated, both by the afferent nervous system, as well as by the efferent motor.
  • appendages of epidermal origin such as the pilosebaceous complex, which consists of the hair follicle, the piloerector muscle and the sebaceous gland; also are the sweat glands, whose function is to regulate the balance of fluids and electrolytes, and temperature.
  • Fibroblasts make up most of the cells in the dermis along with mast cells and macrophages.
  • the dermal fibroblasts help to control the production and maintenance of the dominant structural components of the dermis, mainly collagen, which is formed by aggregation of individual collagen polypeptides, known as procollagen, which are synthesized and exported to the MEC.
  • the aggregation process is facilitated by proteoglycans, another product of fibroblasts.
  • the majority of collagen in the dermis is type I and constitutes up to 80% of the collagen in the skin. Collagen type III constitutes around 15%, while type V and VI constitute the rest. The typical ratio of type I collagen to type III collagen is 4: 1. This relationship is maintained even in scars after the wound repair process.
  • hypodermis is the layer below the dermis formed by adipocytes, fibroblasts and macrophages, which contains a large amount of vascularized adipose tissue that contributes both to thermoregulation and to the mechanical properties of the skin.
  • the skin is prone to physical and mechanical injuries. If a deep lesion occurs, that is, a lesion that affects the dermis, it will start a repair process that results in a scar.
  • a wound is the rupture of the epithelial integrity of the skin; Wounds are classified as acute or chronic and then subdivided into subcategories, such as pressure ulcers, venous leg ulcers, diabetic foot ulcers, traumatic wounds and surgical wounds, some diseases such as diabetes and ischemia and such conditions such as malnutrition, aging, local infection and local tissue damage due to burns, delays wound healing.
  • the wound repair or healing process is a dynamic series of events that involve the coordinated interaction of blood and skin cells, proteins, proteases, growth factors, and components of the extracellular matrix, whose immediate objective is to achieve the integrity of the fabric.
  • the process of wound repair can be divided into three phases that overlap in time and space: (1) inflammatory phase; (2) proliferation phase; and (3) remodeling phase.
  • the inflammatory phase starts immediately after a skin injury occurs and presents two important events, one vascular where the main objective is hemostasis and another cellular, in which cells, mainly leukocytes, reach the site of the wound.
  • hemostasis It is known as hemostasis to prevent spontaneous bleeding and to control traumatic hemorrhage.
  • the hemostatic mechanism is a primary defense system of the organism, whose main function is to maintain vascular integrity and at the same time prevent the loss of blood to the outside; by the production of prothrombin to thrombin which converts fibrinogen into fibrin, forming the blood clot; and subsequently, eliminate excess fibrin and inhibit the activity of activated coagulation factors.
  • the provisional matrix or matrix in addition to acting as a barrier against microorganisms, functions as a reservoir of growth factors and cytokines, and as a support for the migration and cellular proliferation of keratinocytes, fibroblasts, and leukocytes.
  • the participation of the vascular system in the hemostasis is through the immediate vasoconstriction after the vascular lesion and that remains for 10 or 15 minutes.
  • This mechanism has two purposes: to prevent the loss of blood through the wound and to cause variations in the speed and type of blood flow. This is achieved through the release of substances with vasoconstrictive activity such as noradrenaline, adrenaline, and bradykinin.
  • the main cellular elements involved in hemostasis are the platelets, which intervene in two different situations, the first is that they form a haemostatic thrombus at the site of the lesion and the second is that they provide substances with procoagulant activity for the formation of fibrin. .
  • platelets undergo a series of changes that lead to the formation of a platelet thrombus.
  • platelets When the platelets release the content of their granules, they secrete several substances such as fibronectin, fibrinogen, histamine, serotonin, EGF and PDGF; On the other hand, platelet degranulation activates the complement cascade, specifically C5, which is a potent neutrophil chemotactic protein. Inflammation has two essential functions whose main objective is to fight the infection.
  • the first is to supply effector cells and cells, specifically leukocytes, to the sites of infection for the destruction of invading microorganisms, and the second is to promote the repair of the injured tissue;
  • this last function is controversial, since the PU.1 mutant, which is unable to produce an inflammatory response because it lacks neutrophils and macrophages, repairs even higher quality without scar formation.
  • capillary vasodilation and leakage of protein-rich plasma fluid will occur at the site of the lesion as a result of the local secondary release of hlstamna from the granules of the mast cells, which in turn indirectly stimulate the production of prostaglandins.
  • the endothelial cells lining the blood vessels are activated to express cell adhesion molecules that promote the binding of circulating leukocytes. Increased blood flow, endothelial activation and altered vascular permeability allow the migration of inflammatory cells to the wound site.
  • the rapid inflammatory response begins with the degranulation of the platelets that arrive at this site, as well as the degranulation induced by the injury of the resident mast cells.
  • Inflammatory mediators generated during the coagulation process such as fibrinopeptides released from fibrinogen and fibrin degradation products, serve to regulate the expression of important intercellular adhesion molecules;
  • substances released by mast cells such as TNF- ⁇ , histamine, proteases, leukotrienes and cytosines represent sources of chemotactic signals.
  • Polymorphonuclear cells are the first cells to reach the site of the wound. They are mainly attracted by TGF-b, PDGF, CXC-8, C5a, the degradation products of flbrinogen, fibrin, collagen and elastin. Neutrophils are the most abundant and dominant leukocytes in the early stages of healing. They are considered short-lived phagocytes that circulate in the blood.
  • antimicrobial substances such as hydrolytic enzymes, NADPH-dependent oxidases, cationic peptides, such as a-defensins and elcosanoldes, and proteases such as cathepsin G, elastase and proteinase 3.
  • Neutrophils mature can not replenish the content of their granules, so that once they use them, they die by apoptosls and are finally phagocytosed by macrophages.
  • neutrophils were not necessary for the repair of a wound; however, different studies have shown that neutrophils do have an additional function in addition to the elimination of microorganisms.
  • neutrophils at the wound site directly inhibit the migration of keratinocytes and possibly their proliferation as a consequence of the release of proteases, which can induce tissue damage.
  • elastase and proteinase 3 are capable of cleaving elastin and a variety of MEC proteins, including flbronectin.
  • the monoclones arrive shortly after the neutrophiles and replace them. They are attracted to flbronectin, C3a, C5a, thrombin, TGF-b, PDGF, TGF-a, VEGF and MIP-1a. In the tissues they are transformed into macrophages, whose function is to phagocytate apoptotic neutrophils, bacteria and other microorganisms. Phagocytosis of pathogens is facilitated by surface receptors of the macrophage that bind to specific parts of the microbial surface.
  • opsonlzaclón for complement and phagocytosis (destruction of the pathogen within the phagocyte by means of ROS, NO and peptides antlmlcroblanos), by macrophages allows the recognition and destruction of microorganisms. They predominate between 48 to 72 hours and can stay for days to weeks.
  • Macrophages participate in the last part of the Inflammatory phase, regulating the arrival of other monoclones and fibroblasts, and releasing PDGF, FGF, VEGF, TGF-a and b, factors that are important for migration, cell proliferation and granulation tissue formation ; Initiating in this way the transition to the proliferation and remodeling phase.
  • they release prolnflamatorlas atocinas, IL-1 b, IL-6 and TNF-a (see Table 1), therefore, it is said that the production of cytokines by macrophages perpetuates the inflammatory process.
  • the cytokines and growth factors are peptides or glycoproteins between 5-30 kD, important for cell signaling and are involved in various physiological responses. They are released transiently, to modulate the repair process by controlling cell growth, differentiation, metabolism and protein synthesis.
  • Table 1 shows a summary of the growth factors and atocinas that are produced by different cells during the process of repair of wounds and their most important functions.
  • the second phase of the wound repair process is proliferation.
  • the main events that take place in this stage are flbroplasm, reepithelialization, anglogenesis, and the formation of granulation tissue.
  • the fibroplasia describes a process that involves the proliferation of the fibroblasts, their migration in the wound, and the production of new collagen and other matrix proteins that contribute to the formation of granulation tissue [14]
  • fibroblasts The migration of fibroblasts is stimulated mainly by PDGF, TGF-b and fibronectin;
  • integrins the expression of integrins on the cell surface is necessary to facilitate the interaction between the fibroblasts and components of the MEC, mainly fibrin, vltronectin, fibronectin and hyaluronic acid.
  • Fibronectin is a glycoprotein and the main component of the provisional matrix after fibrin, which also promotes the activity of fibroblasts. Fibronectin allows the binding of fibroblasts to the extracellular matrix and provides an adherent basis for cell migration.
  • MMPs Matrix Metalloproteases
  • fibroblasts during the process of wound repair is the replacement of the provisional matrix composed mainly of fibrin by a permanent MEC. composed of collagen.
  • Collagen production begins approximately 3 days after damage and is stimulated by a large number of growth factors, such as PDGF, TGF, and FGF.
  • the function of collagen during the process of wound repair is to increase the strength of the tissue and facilitate cell movement. In the early stages of the wound repair process, the proportion of collagen is different, where the amount of type 3 collagen increases by 30%.
  • Anglogenesis is the emergence of new blood vessels from pre-existing ones. This process is activated by an injury, and supplies nutrients to the wound, in addition to contributing to the formation of the granulation tissue.
  • Anglogenesis has been attributed to many molecules, including FGF, VEGF, TGF-b, anglogenin, anglotropin, anglopoiectin-1, TNF-a, and thrombospondin.
  • Anglogenesis begins with the destruction of the wall of pre-existing vessels, the activation of the proliferation of endothelial cells and their migration from vessels near the wound site.
  • endothelial cells begin to migrate along the provisional flbronectin matrix, similar to fibroblasts.
  • the migration of the endotellales cells is stimulated by VEGF, FGF, anglopoyectlna and TGF-b; and for it to occur, it is also necessary that they express integrins and MMPs.
  • the reeptelling is the process by which the epidermis is restored after a skin lesion.
  • the start of the reeptelling occurs hours after the injury.
  • the morphological changes that are observed during the reaplication are the detachment of the eschar and the reestablishment of the epidermis on the granulation tissue in formation.
  • For the reeptelling it is necessary that the migration, proliferation and differentiation of the adjacent keratlnoclites occur, as well as the restoration of the basement membrane connected with the underlying dermis in repair.
  • the keratlnocltos involved in the process of migration and proliferation come from two different locations, the first are cells that are at the edges of the wound and the second, cells from the pllo-sebaceous unit. They are stimulated to migrate, proliferate and differentiate themselves by various factors that include low levels of calcium, high levels of magnesium, changes in pH, and hlpoxla;
  • the growth factors that favor replenishment are EGF, FGF and TGF-b.
  • the elements involved in the migration of keratinocytes are MEC, Integrin receptors, MMPs and growth factors.
  • the keratlnocles use the Integrin receptors of their membrane to interact with the provisional matrix, which, as with fibroblasts, is necessary for the cells to migrate.
  • a series of events occur that include: the elongation of the keratlnocltos, the development of projections similar to pseudopods, and the loss of the cell-cell and cell-matrix junctions.
  • a structure of migrating keratinocytes similar to a tongue is formed, where the keratlnocles close to it increase their proliferation to ensure the presence of cells that migrate and cover the wound.
  • keratinocytes When migration ends, possibly by contact inhibition, keratinocytes attach to the underlying substrate, reconstitute the basement membrane, and then resume the differentiation process to generate a stratified epidermis. It can be observed that there is a monolayer of keratinocytes towards the center of the wound, while there are multilayers of keratlnocles near the edges of the wound, these keratlnoclones begin to proliferate behind the cells that migrate actively forming a structure known as hyperproliferative epithelium.
  • the proliferative phase ends with the formation of granulation tissue, whose main components are: fibroblasts, collagen and blood vessels. Approximately four days after the injury, the provisional flbronectin matrix begins to be replaced. This morphological change is attributed to the invasion of capillaries that serve as the basis for the appearance of granulation tissue. The new blood vessels provide easy access to macrophages and fibroblasts, which continue to provide growth factors that further stimulate anglogénesls and flbroplasla.
  • Tlsular remodeling is the final phase of the wound repair process and continues for 6-24 months after the initial injury. This last phase is characterized by the transition of the granulation tissue to the formation of a scar. Clinical manifestations include contraction, decreased redness and thickness of the wound, and an increase in tissue strength. About two weeks after the injury, the wound begins to contract, resulting in a lesser amount of scar tissue.
  • the contraction of the wound is performed by activated fibroblasts that acquire the contractile cell phenotype, also known as mloflbroblasts. These cells appear in the area of the wound from the fourth day after the injury.
  • the microfloblasts are mesenqulmal cells with characteristics of fibroblasts and smooth muscle cells.
  • the contractile system of the fibroblasts is organized into microflaments of actin that end in their surface, in a transmembrane association with flbronectin fibers. Once this system is developed, the microfloblasts can sustain a contractile force for a long period of time. This is generated by the tension exerted by the fibers in the surrounding extracellular matrix, which produces a local contraction. This contraction is stabilized by the deposition of extracellular matrix, mainly, collagen of types I, III, IV and V, glycoproteins and proteoglycans.
  • microflora of mloflblasts contain actin and mloslna, as well as associated proteins typical of smooth muscle cells.
  • ⁇ -SMA the typical form of actin of cells located in the vessel wall, which functions as biomarker for activated fibroblasts.
  • the expression of a-SMA is controlled by the transforming growth factor bt (TGF-b ⁇ .
  • the contractile activity of the mlofibroblasts is terminated when the tissue is completely re-epithelialized, where the expression of ⁇ -SMA decreases and the cells enter apoptosis; however, when there is a pathology, the activity of the mlofibroblasts persists even though the tissue is already repaired, which leads to its deformation and fibrosis, which is particularly evident in hypertrophic scars.
  • collagen type I is increased with respect to collagen type III, which decreases correspondingly as does the proportion of proteoglycans and water. It also decreases the number of blood vessels in the wound and the number of fibroblasts, which results in a scar less red and relatively acellular.
  • Another feature associated with mature scars is the lack of epidermal appendages, so the resulting tissue lacks hair follicles, sweat glands and sebaceous glands.
  • the scar is the physiological and inevitable endpoint of the process of wound repair in mammals. Although the scar offers a stable restoration of the skin, the quality of the new tissue is inferior with respect to important structural, aesthetic and functional aspects of the original tissue.
  • TGF-bI TGF-bI
  • 2 TGF-bI
  • 3 Active TGFs exert their biological functions through binding to a heteromeric receptor complex, which consists of a type I receptor and a Type II receiver.
  • the three isoforms of TGF-b have functions that are different and necessary for the repair of wounds, but superimposed.
  • the function of the different isoforms of TGF-b was evaluated in incisional wounds of rats.
  • the wounds were treated with neutralizing anti-TGF- ⁇ and anti-TGF ⁇ 2 antibodies, a significant reduction was observed in the extracellular matrix deposition and an improvement of the architecture of the neodermls, suggesting that the Endogenous TGF-bt and b 2 Induce skin healing in adult animals.
  • the treatment of the same type of wounds with exogenous TGF ⁇ 3 inhibited the formation of scars with a better resolution of the wound, which indicates that this isoform antagonizes the effect of the others.
  • TGF-bt overexpression of TGF-bt has been found in hypertrophic scars, which suggests a possible participation of this factor in its formation; and a greater expression of TGF ⁇ 3 in fetal wounds, which are known since 1970, repair by a regenerative process and not with the formation of a scar.
  • the wounds are very extensive or are related to a pathological condition such as diabetes mellitus or venous insufficiency, the closure of these becomes very complicated, so it requires auxiliary or dressings for optimal resolution.
  • the vast majority of these dressings are often costly and require other procedures to achieve the closure of these wounds.
  • Dressing is a term applied to a wide variety of materials used for the repair of injured wounds or tissues; It is a supplement that is used in a wound in order to promote healing and prevent infection and additional damage.
  • An ideal dressing or combination of dressings is one that guarantees optimum healing by: maintaining adequate humidity and pH (to prevent desiccation, allow cell migration, granulation and reepithelization), eliminate excess exudate from the wound (the excessive moisture and autolytic enzymes can damage / macerate the repair tissue and provide a perfect culture for microorganisms), allow thermal insulation (reduce heat loss and maintain the temperature at which tissue reactions occur), and gaseous exchange (adequate levels of 0 2 and C0 2 for healing), adjustable to the wound surface, facilitate debridement when necessary (debridement facilitates the evaluation of the wound, decreases the likelihood of infection and eliminates the necrotic tissue that , otherwise, it would delay the formation of granulation and epithelialization tissues), minimize scar formation, im permeable to foreign bacteria, that is, antimicrobial, non-toxic / non-allergenic, adhesive but non-adherent so that
  • hydrogels are formed by three-dimensional hydrophilic cross-linked polymers of natural or synthetic origin. They consist of a polymer matrix with approximately 96% water content (colloidal system). This class of biomaterials (hydrogels) combine various advantages for the repair of wounds, such as: biocompatibility, biodegradability, ease of application, adjustable mechanical properties, high water content, controlled adhesion to tissues, moist environment for scarring, barrier to bacterial penetration, and a matrix for drug administration.
  • hydrogels can donate water to the wound area and provide a moist environment, which helps in the rapid healing of the wound, also, due to its high water content, porosity and soft consistency, closely simulate natural living tissue, more than any other class of synthetic blomaterials. Additionally they are used in the formation of drug delivery vehicles, dressings, contact lenses and as electrodes or sensors.
  • Hydrogels have the ability to absorb a fraction of wound exudate, transmit moisture vapor and oxygen, but their bacterial and fluid permeability is dependent on the type of secondary dressing used. Hydrogels swell or contract in aqueous solutions due to the association, dissociation and binding of various ions to the polymer chains. These systems can swell in water until they reach a state of equilibrium. The absorption of water by hydrogels is associated with the presence of chemical groups such as -OH, -COOH, -CONH 2 , -CONH-, and -S0 3 H, the existence of capillary zones and differences in osmotic pressure. The forces that make the dissolution of a hydrogel impossible are: the presence of covalent bonds, hydrophobic and electrostatic interactions.
  • These materials can also exhibit adhesive properties due to the incorporation of functional groups within their structures, which can interact and bind to the surrounding tissues (Fig.5); or form interpenetrating networks with the surrounding tissues to mechanically anchor the material in place.
  • Hydrogels are synthesized by physical or chemical gelation, or by a combination of both. Gelation occurs when the water-soluble polymers crosslink physically or chemically to form a non-soluble three-dimensional network, in which water fills the voids between the polymer chains.
  • the invention relates to a new hydrogel based on Poloxamer 407-Qultosan by crosslinking by gamma irradiation, which accelerates the process of repair of wounds and as a vehicle for the administration of drugs that improve healing.
  • a preferred embodiment of the invention is a hydrogel based on Poloxamer 407-Qultosan by crosslinking by gamma irradiation, adjusted to a neutral pH that accelerates the process of wound repair and as a vehicle for the administration of drugs that improve healing.
  • the invention also relates to the process for manufacturing the hydrogel based on Poloxamer 407-Qultosan by cross-linking by gamma irradiation.
  • the invention also relates to the hydrogel based on Poloxamer 407-Qultosan by crosslinking by gamma irradiation, to be used as a dressing for the acceleration of the wound repair process.
  • the invention also relates to the hydrogel based on Poloxamer 407-Chitosan by the cross-linking by gamma irradiation, to be used as a vehicle for the administration of drugs that improve healing.
  • the invention also relates to the hydrogel based on Poloxamer 407-Chitosan by crosslinking by gamma irradiation, for use in the manufacture of a dressing for the acceleration of the wound repair process and as a vehicle for the administration of drugs that improve the cicatrization.
  • the biological activity of the materials developed in a model of exclslonal wound of total thickness in mice of strain CD1 is evaluated by measuring the percentage of wound closure, evaluation of the repair of the full thickness excisional wounds treated with the different hldrogels using H & E histological staining, Masson and Herovic trichrome, analysis of neutrophil and macrophage infiltrates, observation of fibroblast activation, and evaluation of TGF-p expression 3 .
  • a solution of 0.5-0.90% w / v in acetic acid 0.3-0.6% w / v in deionized water is prepared, the resulting solution is kept under stirring at room temperature for 24 hours, then the final solution is filtered and packaged.
  • Poloxamer hydroxide 407 + chitosan (physical mixture, CH + P)
  • Poloxamer 407 solution + qultosano prepared as indicated above are preferably packed in glass containers and subjected to gamma radiation at a dose of 25 kGy absorption, using as source 60 Co.
  • Poloxamer 407-chitosan hydrogel irradiated at pH 7 (mixture irradiated at pH 7; CH-P 7)
  • the poloxamer 407 + chitosan solution prepared as indicated above, is preferably packaged in glass containers with characteristics and subjected to gamma radiation, at an absorption dose of 25KGy, using 60 Co as a source, subsequently the solution is adjusted to a pH of 7 by the addition of triethanolamine.
  • a Leica Stereoscan 440 microscope (Leica Microsystems) was used, the samples that were used to be characterized by this technique, were the lyophilized, this to have a porous powder consistency and obtain images with higher resolution, it is also worth mentioning that They had a gold coating. They were observed in increases of 500X and 1000X in high and low vacuum.
  • the differential scanning calorimetry method was used to determine the possible chemical interactions in the components of the hydrogels, before and after the gamma irradiation treatment (P-407, CH, CH + P407, CH-P 4 and CH-P 7 ).
  • a Q100 calorimeter was used, which was calibrated with a sample of Indium (3mg) and a baseline was made with empty non-hermetic aluminum samples. 3mg of lyophilized sample was placed, and an analysis range of 0 to 200 ° C was used with a heating flow of 10 ° C / min, using nitrogen to purge the analysis chamber. The analysis was done in triplicate.
  • the chemical structure of the new polymers was analyzed by FTIR with a spectrometer, within the range of 4000-400 cm 1 , with a resolution of 4 cm 1 and an average of 32 scans.
  • the solid-gel transition time and temperature for the viscosity experiments was determined in the linear region of the samples analyzed, where the viscosity is directly proportional to the temperature.
  • a temperature ramp of 7-30 ° C was used with a rate of change of 10-1 1 seconds for each unit temperature increase (per degree Celsius), and at a constant speed of 50 rpm.
  • a Brookfield CAP 2000 viscometer was used, using the number 3 needle, at a constant temperature of 37 ° C; for the use of this needle, the equipment was calibrated with the fluid 30000, of known viscosity.
  • the mechanical behavior of the fluids (P-407, CH + P407, CH-P 4 and CH-P 7), in this case the viscosity and the type of relaxation, were obtained by means of the opposition of the different hydrogels to the cutting force or shear.
  • 100mI_ of each of the hydrogels were placed in the VLScosimeter plate, the desired variables were configured: speed range, from 120 to 600rpm and in reverse order, in intervals of 20rpm, waiting 1 1 seconds between each change of speed and 3 seconds for the viscosity record.
  • these cameras with gliccerol solutions and plastic devices were placed in an oven at a temperature of 37 ° C for 6 hours (the hydrogels were in the plastic device, whereby the hydrogels were not in direct contact with the solutions, if not the device that contained them, but gllcerol solutions generated the desired relative humidity in the entire chamber, and therefore the environment within it).
  • the weights of the devices with the hydrogels were recorded again, and by weight difference the percentages of water absorbed or eliminated by each of the prepared hydrogels were determined. This test was done in triplicate. Bioerosion / swelling test
  • the profiles of bioerosion and / or swelling of the hydrogels were determined by a gravlmetric method. This test was carried out by contacting a pool of blood serum of several people. Glass tubes of 1.7 cm in diameter and 1 1 5 cm in height, previously weighed, were used. The first step was to place 1 mL of each of the hydrogels in different tubes (10 per run), at 4 ° C; The next step was to let them equilibrate at room temperature (23-25 ° C) for 12 hours. Then, the tubes with the hydrogels were weighed on a granatar scale and 1 mL of the blood serum pool was added.
  • the tubes are placed in a water bath (brand BS-06) previously equilibrated at 37 ° C and with constant agitation of 50rpm. Subsequently, the supernatant was removed by decanting the tubes for one minute at 2, 4, 6, 8, 1 0, 12, 1 5, 18, 21 and 24 hours after being placed in the bath. Finally, the tubes were weighed and for differences of weights the bioerosion or the swelling of the gels was determined. This test was done in triplicate.
  • a positive gram bacterium S. aureas ATCG292173
  • two gram negative bacteria E. cali ATGC25922 and P. aeruginosa, clinical isolate
  • a fungus C. aib ⁇ cans, clinical isolate
  • the mice were kept under standard laboratory conditions with water and food ad libitum, with 12 hours light-dark cycles, adequate space and ventilation.
  • the permit for the use of animals and the experimental protocols were approved by the Animal Ethics Committee of the Institute before the experimentation. All the animals received attention in accordance with the Official Mexican Standard NOM-062-ZOO-1999 "Technical specifications for the production, care and use of laboratory animals".
  • mice were anesthetized by intraperitoneal (ip) injection with ketamine / xylazine at a dose of 100/10 mg / kg to achieve deep anesthesia.
  • ketamine / xylazine was shaved with a cutting machine and surgical soap was applied to remove the hair residue with a razor.
  • an injury was performed. exclslonal type of total thickness in the occipital region, at a considerable depth, without hurting muscle and 5.5 cm from the nose of the animal.
  • mice were individually housed in appropriately marked and disinfected cages.
  • oral tramadol hydrochloride was administered as an analgesic in a dose of 4mg / kg in water for three days.
  • mice 100 pL of the treatment (qultosan solution, P-407, CH + P407, CH-P 4 and CH-P 7) were applied daily for up to 1 1 days.
  • the mice were divided into three evaluation groups, each with 9 animals, which were given a final point (C0 2 chamber) of 3 in 3, at 3, 7 and 11 days.
  • C0 2 chamber final point
  • mice of the CD1 strain of 2.5 months of age and 35-40 g in weight were selected.
  • Elimination criteria Those animals that did not present a lesion of exclslonal type of total thickness, or that the excision was very deep or with complications, that have developed Infection in the area of injury or some other inflammatory process not related to it.
  • mice that presented some type of skin lesion and / or symptoms of infection.
  • the area of the wounds was measured in the GelDoc XR Blorad photodocument team, using the Quantlty One software.
  • fixation is a process that allows maintaining the integrity of proteins and other structures present in samples, inhibiting the process of innate degradation by means of cryopreservation or treatment with chemical fixatives, and imbibing samples in blocks. of paraffin that provide a support to perform the cutting of tissues.
  • mice On days 3, 7 and 11 of treatment, 3 mice were terminated to obtain tissues from the injured areas, which were fixed in SafeFlx® for 24 hours and cut transversely to the middle of the wound. Then they were dehydrated using gradual aqueous solutions of ethanol (50, 80, 96 and 100%) for 30 minutes each and constant agitation. Dehldratation is simply the elimination of water in the tissue after fixation and it must be done to prepare the tissue to be introduced in non-aqueous media such as paraffin. For this, alcohols are used, since they are mlscibles with the aqueous fixers and also the alcohol can penetrate into the tissue quickly and replace the water.
  • Staining is a technique used in microscopy with the aim of improving the contrast in the image observed through the microscope by using specific dyes to identify different cellular structures such as DNA, proteins, lipids and carbohydrates.
  • H & E staining was performed as follows: first the slides with the tissues were placed in a coplin at 60 S C for half an hour and immediately dewaxed using S xylene at 60 C for 1 0 minutes. Then they were rehydrated using gradual solutions of ethanol (100, 96, 80 and 50%) and finally, distilled water (Elx5). The tissues were placed in Harries' Hematoxylin 30% for 6 minutes and then drops of saturated lithium carbonate were added to turn the color to purple. A wash was performed using distilled water and then placed in acidic Eosin for 25 minutes. The tissues were then dehydrated using 50, 70, 96, 100% and xylene ethanol solutions, to finally make the assembly using Entellan® (permanent installation medium free of water for microscopy).
  • Entellan® permanent installation medium free of water for microscopy.
  • Hematoxylin has a blue-purple color and stains nucleic acids by a complex reaction. It is believed that this dye, or more correctly, the oxidized form (reaction with mercury oxide), hematein, binds with a mordant (metallic cation that confers a net positive charge to the dye-mordant complex, typically Al 3+ ) for dyeing to DNA through coordination with negatively charged phosphate groups.
  • the staining of the nuclei is in principle red, but it becomes the known blue-purple when the tissues are washed with an alkaline solution such as saturated lithium carbonate.
  • eosin is pink and dyes proteins in a non-specific way when joining positively charged groups in proteins, such as amino groups of the Usin residues.
  • the nuclei stain blue, while the cytoplasm and the extracellular matrix have varying degrees of pink staining.
  • the tissues were observed under a microscope and photographs were taken with the 1x, 5x and 20x lenses. This technique allows to evaluate the progress of each stage of the wound repair process by analyzing the cellular infiltrate, re-epithelialization and the formation of granulation tissue.
  • This stain being a trichrome method, has the advantage of allowing the differential demonstration of the connective tissue.
  • the dyes and reagents are applied sequentially and highlight mainly the tissue structures stained by the dyes: the nucleus, the cytoplasm and the extracellular matrix fibers, allowing the selective staining of muscle, collagen fibers, fibrin, and erythrocytes.
  • the procedure performed was as follows: Tissue sections were heated at 60 S C for 30 minutes and dewaxed with xlleno twice for 5 and 2 minutes. Immediately the tissues were refilled using gradual solutions of ethanol and finally, distilled water. Subsequently they were left in the Bouin Fixer at room temperature for 24 hours. The tissues were stained by placing them in the following dyes in the order indicated at different times and performing washes of distilled water (Elx5) between each of them: Weigert Iron hematoxylin (10 minutes), acid fuchsin (15 minutes), Phosphotungstic acid / Phosphomolybdic acid (10 minutes) and aniline blue (8 minutes), and then washed with 1% acetic acid for 4 minutes.
  • Bouin's fixative is a mordant that intensifies the acceptance of subsequent dyes.
  • Weigert iron hematoxylin (ferric chloride as an oxidizing / mordant agent) is used to stain the nuclei of the blue-black cell.
  • Acid fuchsin dyes all red-colored acidophilic components, including collagen.
  • the general rule in a trichrome stain is that a small molecule of dye can penetrate and stain any tissue, but each time a larger molecule of dye can penetrate the same element, the smaller molecule will be replaced by the larger one.
  • the red color diffuses from the collagen fibers and is subsequently replaced by the blue color.
  • the collagen fibers form a less dense network and are apparently very porous, for this reason, the large dye molecules of aniline blue penetrate only the collagen fibers, leaving the fibrin, muscle and erythrocytes unstained. blue.
  • Herovici stain to distinguish the type of collagen from the matrix.
  • the tissues were stained with the plcropolycromial solution for 4 minutes and washed with 1% acetic acid. To finish, the dehldratation was carried out using ethanol and xylene solutions, and they were mounted with Entellan®.
  • Herovici staining of methyl blue or aniline blue and acid fuchsin in an appropriate ratio allows to differentiate the type of collagen present, where the dense mature collagen stains red, while the newly formed collagen is blue.
  • the plcropolycromical dye For this plcropolycromical dye, several dyes are applied: Celestino blue, methanol yellow, and the plcropollcrómlca solution (acidic fuchsin and methyl blue).
  • Celestino blue By combining Celestino blue with alum hematoxylin (used as an aluminum binder) and ferric ammonium sulfate, a resistant acidic nuclear stain is obtained, thanks to the fact that blue Celestino is resistant to the effects of acid, and ferric salt in The solution strengthens the union between the nucleus and hematoxylin to provide a strong nuclear stain.
  • the conjunctive tissue is stained through the methanyl yellow and, since it is an acid dye in combination with the diluted acetic acid, it allows the dye to be fixed to the proteins present in the tissue at the acidic pH. This also increases the affinity of the dye adhered to the fabric by the amino groups of the dye. In this sense, the cytoplasm stains greenish yellow, while keratin; muscle and red blood cells stain bright yellow.
  • Collagen is strongly stained with acid dyes, due to the affinity of the cationic groups of the protein for the reactive amino groups of the acid dyes. Collagen is selective to solutions of acid dyes of large molecular size; for example, acid fuchsin and methyl blue, which tend to bind by means of electrostatic attractions or by Van der Waals forces.
  • Methyl blue stains collagen type III (newly synthesized thin protein fibers), as well as other types of collagen, glycoproteins, proteoglycans and reticulin; whereas collagen type I or "mature" collagen, one of the most abundant proteins in the extracellular matrix, is stained red by acid fuchsin and results in a combination of methyl blue, acidic acid and fuchsin that provide the color according to the density of the collagen present.
  • the fibrin matrix was observed to be reddish brown, the lightly packaged collagen fibers were stained light blue (collagen type III), while the collagen fibers were packed in magenta pink (type I collagen). Using the 1x and 5x objectives, photographs of each wound were obtained and the analysis of them was carried out, knowing that over time the proportion of collagen packed increases with respect to the loose collagen.
  • Immunofluorescence is a technique that allows to analyze the presence of proteins in tissues through the specific interaction between the protein under study and its corresponding antibody.
  • Antibodies directed against neutrophil elastase were used to evaluate the inflammatory infiltrate in the wounds.
  • This protease is stored in the azurophil granules in its active form until the granules are fused with the phagolysosome or release their content to the extracellular medium by exocytosis in response to specific stimuli. It contributes mainly to the intracellular and extracellular elimination of microorganisms by degrading virulence factors.
  • the technique to perform this immunofluorescence was as follows: Initially, the tissues were dewaxed with xleno for 10 minutes, and then rehldrataron with gradual solutions of ethanol for 5 minutes each (100, 96, 80, 70, 50%) and water Mllll -Q®. Subsequently, the block was made with 1% albumin in PBS for two hours at room temperature, because although the antibodies show preferential affinity for specific epitopes, they can bind partially or weakly to non-specific sites in the proteins (also called sites). reagents) that are similar to the binding sites of the white antigen. In this context, non-specific unions can mask the detection of the antigen under study.
  • the primary Anti-Elastase antibody (ab21595) was then placed at a concentration of 1: 200 in 1% albumin, and left for 24 hours at 4 ° C in a humid chamber. 3 washes of 5 minutes were made with a solution of PBS-Triton® 0.3% and the secondary antibody TexasRed (TI-1000) was placed at a concentration of 1: 1000 in 1% albumin, which was allowed to incubate for 2 minutes. hours at 37 ° C. Finally, 3 washes of 5 minutes were made with a solution of PBS-Triton® 0.3% and were mounted using Vectashield® with DAPI (see annex V).
  • This mounting medium is aqueous, is made of glycerin and does not solidify but remains as a viscous liquid in the foil.
  • the slides were permanently sealed by applying nail polish on the entire perimeter of the coverslip.
  • the assembled lamellae were stored at 4 S C until observed under the microscope.
  • Photographs were taken of the areas of the wounds that received the different treatments with the 10x and 20x lenses using rhodamine filter (see Annex V) to observe the mark, which were processed using the Fiji Is just ImageJ program to quantify the cells marked.
  • the tissues were deparaffinized in xylene for 10 minutes and then hydrated with gradual ethanol solutions and Milli-Q® water for 5 minutes each.
  • a solution of 1% albumin in PBS the block was made for two hours at room temperature.
  • the next step was to place the primary antibody Anti-F4 / 80 (ab6640) at a concentration of 1: 100 in 1% albumin, and left for 24 hours at 4 ° C in a humid chamber. 3 washes of 5 minutes were made with a solution of PBS-Triton® 0.3% and immediately the secondary antibody FITC (sc-201 1, see annex V) was placed at a concentration 1: 10 in 1% albumin.
  • the secondary antibody was allowed to incubate for 2 hours at 37 ° C and subsequently 3 washes of 5 minutes were made with a solution of PBS-Triton® 0.3%.
  • the fabrics were assembled using Vectashield® with DAPI.
  • the primary antibody obtained from rat recognizes the mouse antigen F4 / 80, a 160kD glycoprotein that is located in murine macrophages.
  • the F4 / 80 molecule (EMR1) is expressed in the development and throughout adult life, constitutively and during inflammatory processes, infectious, immunological and diseases, in a large variety of populations of macrophages, including Kupffer cells, resident macrophages of bone marrow, timocorticoid macrophages, macrophages of the red pulp of the spleen, macrophages of the medullary lymph nodes and microglial cells.
  • F4 / 80 Low levels of F4 / 80 have been found in monocytes in adulthood; while the marginal zone macrophages and metalophilic macrophages of the marginal zone of the spleen appear to be F4 / 80 negative.
  • the Langerhans cells which are immature dendritic cells present in the epidermis, and some CD8-negative dendritic mellolded cells are F4 / 80 positive.
  • the marker is highly expressed in the plasma membrane and potentially reveals Interactions with neighboring cells in tissues. Tissues were observed under the microscope with the 20x objective using the FITC filter, and photographs were taken of the marked areas, which were processed using the Fiji Is just ImageJ program to quantify positive cells.
  • the tissues were deparaffinized (Xylene) and hydrated (gradual aqueous ethanol solutions and Milli-Q® water) to subsequently block for two hours at room temperature (1% albumin solution in PBS-Triton® 0.3%).
  • the anti-aSMA primal antibody (ab7817) was placed at a 1: 20 concentration with 1% albumin in PBS-Trlon® 0.3%, and left for 24 hours at 4 ° C in a humid chamber. Then 3 washes of 5 minutes were made with a solution of PBS-Trlon® 0.3% and the secondary antibody Alexa Fluor® 488 was applied at a concentration of 1: 1000 in 1% albumin in PBS-Trlon® 0.3%.
  • the secondary antibody was allowed to incubate for 2 hours at 37 ° C and then 3 washes of 5 minutes were made with a solution of PBS-Trlon® 0.3%, to finally assemble the tissues using Vectashleld® with DAPI.
  • a mouse antibody directed to a-SMA was used because it is known that the macromolecules of activated fibroblasts show the expression of this molecule, which is the actin isoform typical of cells located in the vessel wall.
  • photographs were taken of the areas that showed the fluorescent mark by means of the FITC filter with the objective of 10x and 20x. The images were analyzed qualitatively and through the Fiji Is just ImageJ program to quantify the area marked for a-SMA.
  • TGF-p 3 The expression of TGF-p 3 was observed by means of a polyclonal rabbit antibody directed against TGF-b 3 , and this immunofluorescence was performed to evaluate the resolution of the scar, since as previously described, this isoform inhibits the formation of scars with better resolution of wounds.
  • the hydrogels obtained (P-407, CH + P, CH-P 4 and CH-P 7), at refrigeration temperature (4 ° C), are in the form of a colloidal system where the continuous phase is liquid and the dispersed is solid, behaving like a mobile viscous liquid that transforms into a semi-solid transparent gel when the temperature increases. That is, these hldrogels, having a concentration of P-407 greater than 20% w / v, present the phenomenon of inverse thermoreversibility, in which as the temperature increases, the formation of mlcels originates as a result of the dehulling of the block. of PPO, up to a defined point, where micelles come into contact and lose mobility.
  • the pH of the compounds was acid, with values of 4, 4.68 and 4.66 for CH, CH + P and CH-P, respectively, with the exception of the hydrogel of P-407, which was close to neutral (6.33). ).
  • the Irradiated hydrogel was also brought to a neutral pH without any complication.
  • thetanolamine acetate When the thetanolamine is added there is an interaction between this compound and the acetic acid, since when mixed, they form a water-soluble salt called: “thetanolamine acetate", this causes an increase in the pH of the solution and consequently the precipitation of the polymer (when increasing the pH with thetanolamina, the concentration of available [H] decreases, therefore, the amino groups of the qultosano go from its protonated and soluble form (NH 3 + ) to its insoluble form (NH 2 ) causing the precipitation). In the physical mixture, the precipitation is possibly due to the competition that occurs between the POE chains of the P-407 due to the water molecules, which increases the precipitation phenomenon of the CH.
  • Radiation produces free and radical ions, which are responsible for initiating chemical reactions that lead to molecular modifications such as cross-linking (formation of the network structure), degradation (chain splitting and molecular weight reduction), grafting (polymerization of a monomer and graft in the base polymer chain), curing (simultaneous polymerization and crosslinking) and evolution of gas [127] All the modifications mentioned, to a lesser or greater extent, occur in the hydrogel when Irradiated.
  • Irradiated hldrogels show amorphous arrangements (without any specific geometry) (Fig. 10-13), but if they differ from the arrangements shown by the physical mixture and by each of the compounds separately, which is why can rectify that if there is a change in these materials due to Irradiation, however, they show a great similarity with the morphology revealed by the poloxamer alone, which was to be expected since it is the material that is in a greater proportion.
  • Microstructures such as the size, shape and distribution of the particles have an influence on the wound healing process, since this impacts the hydrogel characteristics of the hydrogel, the exchange of gases (high levels of C0 2 increase the acidity and concentrations of 0 2 , decrease the regeneration of cells and help the proliferation of anaerobic bacteria), penetration of bacteria, adhesion, hemostatic capacity, and release of drugs if any.
  • Differential scanning calorimetry high levels of C0 2 increase the acidity and concentrations of 0 2 , decrease the regeneration of cells and help the proliferation of anaerobic bacteria
  • this test allows obtaining the values of the melting point (change of state of solid to liquid aggregation) of the samples, a process that is also endothermic, which are shown in the following table.
  • the melting point is an intensive property and is characteristic of each element or compound, so it is used as a tool for characterization. It can be observed that the Tf was higher for the CH and the P-407, while the physical mixture and the irradiated compounds show values slightly below the Tf of the P-407. In the samples, the melting point of the hydrogel varies very little; however, this variation is sufficient to know that these experienced changes when mixing the polymers, when applying the Irradiation and when adding the trletanolamine, and that none of these is the same.
  • the poloxamer 407 spectrum exhibits an absorption band at 2880 cm 1 , which is attributed to a type of CH bond, while the Interaction band C-0 is observed at 1090 cm 1 .
  • absorption bands characteristic of functional groups appear that appear in 1532 cm 1 (corresponding to -NH 2 ) and 1372 cm 1 , related to the vibration of CH.
  • Another wide band detected from 3600 to 2800 corresponds to the vibrations of the amine NH and hydroxyl OH bonds.
  • the band close to 1 150 cm 1 corresponds to the extracted structure of chitosan, while the 1040 cm 1 band is attributed to the vibration of C-O (Fig. 16).
  • P407 is a triblock copolymer of poly (ethylene oxide) / poly (propylene oxide) / poly (ethylene oxide) (PEO / PPO / PEO) a crosslinking between the two polymers is observed with a greater presence in chains that (PEO / PPO / PEO).
  • the 1 H NMR spectra are useful to show the chemical differences of the CH-P samples; and these are complementary and coincide with the results observed with the FTIR methodology.
  • the spectrum of the sample P407 two signals are observed, a peak resolved at 3.67 ppm and another broad peak at 3.61 ppm. Both signals were assigned to the CH 2 groups related to the PEO and PPO units, respectively. Therefore, the quotient of the intensities of these two NMR signals is proportional to the ratio of the PEO / PPO units. In such a way that it is evident that in the CH + P sample, the ratio of PEO / PPO units is similar to that of P407.
  • the spectrum of the samples subjected to gamma irradiation shows an evolution in the same peak ratio.
  • Table 5 shows the values of the temperature and time at which the sol-gel transition of each of the samples is carried out, that is, to which the solutions become more viscous and semi-solid to form the hydrogel, which would be formed by a solid phase in the form of a network constituted by the chains of the polymers and which immobilizes a liquid phase, either water or the acetic acid solution.
  • the obtained results express that the hldrogels are constituted at a much lower temperature than the body and in a short time interval, taking into account its pharmaceutical application.
  • the formation values of the gellets do not exceed 14 ° C or 2 minutes of time (Fig. 17), so the formation of the gels is not complicated and is very fast.
  • Table 6 shows the results of the statistical comparison, among the majority of the compounds there is a significant difference for temperature and gelalon time, however, it is observed that between the samples "P-407 and CH-P 7 ", There is no significant difference, and indeed, the resulting values for time and the Tgel, among these compounds, are very close, that is, the Irradiated mixture to adjust the pH, needs a lower temperature and a shorter time lapse to carry out the gelalon phenomenon; this may be due to the effect of trletanolamine, because due to its alcohol structure, the oxygen atoms of its "OH” groups can participate in the formation of hydrogen bonds with water, thus decreasing the interaction between it and the polymer, resulting in the formation of mlcelas of P-407 and structures in the form of a network, so that TEA can act as a crosslinking agent.
  • hydrogels will always maintain a moist atmosphere suitable for the healing of the wounds, and will prevent the drying of them, however, it is also desirable that they absorb a certain degree of exudate.
  • hydrogels can absorb and retain large amounts of water depending on their cross-linking, charge density of their network and concentration of their cross-linked polymers, this test was carried out, where the rate of bioerosion and / or swelling was determined of the hydrogels at 37 ° C for different times using human blood serum, which unlike other media, contains proteins and enzymes (Table 7), and simulates the exudate (fluid evacuated from open wounds and that comes from the serum around the tissue inflamed and damaged) that occurs in a wound, which sometimes occurs in excess, and it is important that it is absorbed by the hydrogels to prevent infection and excessive moisture in the wounds, which would harm its clerk / clcatrizaclón.
  • blood serum has different components, including sugar, proteins, enzymes, and more.
  • Hydrogels can be broken down in the presence of enzymes that recognize specific functional groups on the hydrogel backbone and degrade it or simply break down through hydrolysis, either under acidic or basic pH conditions.
  • Trials of bloeroslon can simulate the in vivo behavior of the hydrogel when applied to a wound.
  • Blogelone studies of hldrogels are also important to ensure that materials are degraded into safe components, which can be identified and analyzed to assess their toxicity in host cells.
  • the porosity of the hydrogel is an important factor in its swelling characteristics, since the more porous a material retains a greater amount of water within its structure, that is, it swells more, and vice versa, to a smaller porosity, the hydrogel has a lower swelling capacity, however, to know the porosity of the materials studied, an additional physico-chemical test would be required.
  • the P-407 did not show swelling, but bioerosion, this may be due to being soluble in water thanks to the two hydrophilic chains of POE, these dissolve when in contact with blood serum, however, the solution is minimal , since it does not exceed 10% of bioerosion.
  • this hydrogel has a certain swelling capacity in the early stage due to the diffusion of fluids inside the hydrogel, likewise, the chitosan, presents functional groups such as NH 3 + , which can interact with the water helping genrando this effect.
  • the hydrogel gradually began to bioerosion, which may be due to the degradation of the chitosan and the dissolution of the poloxamer.
  • the irradiated hldrogels showed only a swelling profile, which indicates that the irradiation modifies the effect of the blood serum on the hydrogel. This may be due to the cross-linking developed between the polymer chains of the P-407 and the CH when subjected to Irradiation, which resulted in more stable structures than in the hydrogel formed only by the P-407 or in the mixture of both polymers without Radiation, which leads to a greater stability of the materials.
  • the antibacterial / antifungal activity is an additional property that is sought in an ideal dressing. It has been reported that the CH presents this property, which is conserved when applying Gamma irradiation; however, it is known that the molecular weight and the DD of the CH, and the pH of the medium can improve or eliminate this property; For this reason, antimicrobial and antifungal tests were carried out to evaluate if the samples under study have the capacity to inhibit the growth of microorganisms. The results obtained in this test are shown in table 1 7 and in figures 24 to 27.
  • the CH showed both antibacterial and antimicrobial activity, which is consistent with the studies reported in the literature, where this compound is attributed an antibacterial capacity related to: its molecular weight, lower molecular weight, higher antibacterial activity , (the CH can enter the bacterial cells and alter its metabolism), its degree of deacetylation (the greater degree of deacetylation, greater antibacterial activity), its polycationic nature that allows the interaction with the surface of the bacterial cells (the interaction between the cationic groups of the chitosan and the anlónlcos groups on the surface of the bacterial cells alter the permeability of the membrane producing an osmotic imbalance and inhibiting the transport of essential nutrients, as well as the interaction of these groups positively charged with the DNA and RNA of fungi and bacteria inhibits protein synthesis) and property Chelating agent of chitosan (formation of complexes between chitosan and metal ions necessary for bacterial enzymes, mainly at high pH). Based on the results obtained, it can be said that the CH used for the
  • CH + P presents an antibacterial and antifungal activity in a similar way to the chitosan solution; which suggests that in this hydrogel, the antibacterial and antifungal potential is due to the CH, which is at the same concentration in both samples; although the possibility that the P-407 present in the mixture has the ability to slightly increase this antibacterial property is not ruled out, since this polymer, being a non-ionic surfactant, could interact with the bacterial membrane and alter its permeability; however, a definitive conclusion can not be reached, since the P-407 alone does not have the capacity to inhibit bacterial growth.
  • Figure 28 shows representative photographs of the total thickness excisional wounds (performed on the back of the mouse) at the beginning (0 days), at 3 days (inflammatory phase), at 7 (proliferative phase) and at 1 1 days (Start of the remodeling phase), observing its resolution with the respective treatment that was applied to them.
  • Wound healing is a dynamic process that consists of a complex series of events that begin at the time of injury. Wound repair involves mainly three stages of healing, ie the inflammatory phase, the proliferative phase and the remodeling phase. The previous photographs show that healing, evidenced by the area and contraction of the wound, increases in a time-dependent and treatment-dependent manner in all groups.
  • the wounds that were treated with the hydrogel can provide a matrix that absorbs the blood thanks to its capacity of swelling, and they can also donate water to the wound by reducing fluid loss and maintaining moisture.
  • the skin is composed of two main layers: the epidermis and the dermis.
  • An essential feature of a healed wound is the restoration of an epidermal barrier reflected by the reeplication of the wound.
  • Irradiated hldrogels accelerated wound closure in the first days, mainly CH-P 7 since it was the one that showed the highest percentage of closure, being the pioneer until 6 days, since at 7 days the percentage of closure Be happy with the other treatments, with the exception of the CH, which shows an acceptable closing percentage until day 5, where it begins to be maintained and even delay the closing of the wounds after 7 days, although the clinical photos do not reflect this.
  • Weight is a parameter that indicates the stability of animals; if these lose weight, it would be an indication of inadequate nutrition, presence of some discomforts or some type of depression, the opposite of which if the weight is conserved or increases, which would mean that the animals are in a good condition and they continue with their normal development.
  • Figure 30 shows the weight behavior of the mice used, from 0 to 1 1 days of treatment.
  • the weight in the first days diminishes slightly, which means that the mice present some discomforts due to the pain caused by the wounds, however, the weight was increasing around the third day, which can be seen in the graphic as a slight peak; subsequently, the following days, the weight is again the same as the initial and even increases, in some cases, the weight decreases on certain days, but on day 1 1, no weight is below the Initial, this means that the mice remained in optimal conditions and did not present any type of complication.
  • the histological analysis of the wounds was performed, which, unlike the macroscopic description, allows cell tissue recovery at the cellular level, in order to evaluate the progress of each stage of the wound repair process: on day 3, the inflammatory phase, on day 7, the proliferation phase and on day 1 1, the start of the remodeling phase. This is done by H & E staining to observe the cellular infiltrate, the reeptelling and the formation of the granulation tissue; Masson's trichrome stain to evaluate the evolution and organization of the extracellular matrix over time where the collagen fibers are observed in blue; and Herovicl staining, to determine the maturity of the collagen fibers, lightly light blue packaging (collagen type III), and magenta pink packaging (collagen type I).
  • FIG. 31 shows that the eschar is persistent as the Inflammatory Infiltrate evidenced by the immunofluorescent Antl-elastase (Fig. 40). Only in one case was a complete reepltellzaclón (1/4). In 2/3 of the wounds that have not been repeated, there was a slight epithelial extension towards the wound corresponding to the migration of this tissue from an evident hyperproliferative epithelium. The extracellular matrix of the tissue under repair is not abundant.
  • the amount of the matrix deposited in the wounds treated with this hydrogel is very similar to that observed by the Masson and Herovici stains in the control wounds, however, the fibrin matrix comprised a larger area, covering almost all the tissue under repair with lateral areas that are replacing the fibrin clot by granulation tissue and without presenting a deposit of collagen (Fig. 34 and 37).
  • CH-P 4 Eschar persisted in all cases due to a lack of evident reepithelialization.
  • the inflammatory infiltrate is moderately abundant, this is observed through the H & E staining (Fig. 31) and the Anti-elastase immunofluorescence (Fig. 40).
  • the provisional matrix is scarce compared to the other treatments.
  • the surface matrix is very thin characterized by having compact tissue typical of a matrix composed mainly of fibrin. Underlying this, there is a loose-looking matrix with a pattern characterized by a parallel fibrillar organization, in which an incipient deposit of predominantly poorly packaged collagen is observed that was identified by the Masson (Fig. 34) and Herovici (Fig. 37). This indicates a slight acceleration in the formation of the dermis in repair. Only in a case of three hyperproliferative epithelium with incipient epithelial migration was observed.
  • CH-P 7 The eschar persisted in three mice of four, but in two mice an integration of the same is observed to the tissue under repair; while in the other wounds it is thin. No reepithelialization is observed in any case and only hyperproliferative epithelium and incipient migration are observed in one case.
  • the inflammatory infiltrate is moderately abundant (H & E staining, Fig. 31 and Anti-elastase immunofluorescence, Fig. 40).
  • the eschar of the wounds treated with CH-P 7 presents differences with respect to the other wounds, in which two mice (2/4) show an eschar with an integration to the tissue under repair, while in the rest of the mice the eschar is thin, this is advantageous with respect to the other treatments given that it has been observed in other studies that a reduced eschar accelerates the healing process by allowing a faster reepltellzaclón, in addition, the Integration of the eschar to the tissue , may be due to the adhesive properties of the hydrogel, since CH is known to have this characteristic, although in the other treatments where the compound is present this did not occur, therefore, it is possible that the pH is a factor that is modifying the functional groups in the polymer structure that can interact with the tissues.
  • Inflammatory infiltrate is abundant in wounds treated with SS, P-407, CH and CH + P, while in wounds treated with Irradiated hydrogels it is moderately abundant, indicating a tendency of the latter to reduce the inflammatory response.
  • the wounds treated with SS and CH-P 7 presented packed collagen fibers (type I) embedded in the superficial matrix; and the wounds treated with CH-P 4 show an incipient deposit of collagen that is predominantly poorly packed, demonstrating a delay in the synthesis of collagen in the other treatments.
  • the provisional matrix is being replaced by granulation tissue without the presence of collagen fibers, which suggests that in these wounds there is a transition to the proliferation phase that could be related to a pro-angiogenesis activity.
  • the wounds are completely reepithelialized (2/3), with a wound that presented partial reepithelialization (Fig. 32).
  • the epithelium covering the wound is thicker (8-14 layers) than the control group, as is the stratum corneum.
  • a repair tissue similar to that of the control group is observed, while in two of three there is an immature granulation tissue evidenced by the Masson (Fig. 35) and Herovici (Fig. 38) stains, where vessels appear blood of small caliber and little presence of matrix.
  • CH + P Only in a case of three reepithelialization is complete, while in the other wounds a small portion of the eschar is integrated to the tissue under repair with a partial reepithelialization (H & E staining, Fig. 32).
  • the epithelium of the wound although it is thicker than healthy tissue, has a thickness (8-10 layers) whose proportion is lower than that of the group treated with P-407, being similar to the control group.
  • the granulation tissue covers the entire area that is re-epithelialized, since where the eschar is integrated, a compact matrix corresponding to the fibrin matrix is observed.
  • tissue of granulation presents vessels of greater size than those observed in wounds treated with poloxamer 407, abundant cellular infiltrate and a slightly packed incipient deposit of type I collagen evidenced by the Masson (Flg. 35) and Herovlcl (Fig. 38) stains.
  • CH-P 4 In 1/3 there is no complete reepltellzaclón and in the area without epithelium there is a reduced eschar Integrated to the tissue under repair (Fig. 32). In two of three cases, the new epithelium comprised 1 to 20 epithelial layers, while in the remaining case approximately 7 layers were seen.
  • the matrix of this tissue is more compact in comparison with the wounds treated with the mixture and in addition an incipient deposit of collagen is observed, which is identified as type I collagen, being positive for the Herovlcl staining (Flg. 38). There is also an abundant number of cells (Flg. 32).
  • CH-P 7 The H & E stain showed that the reeptelling is complete for all the cases studied (Fig. 32).
  • the tissue is thickened with respect to healthy skin (7-14 epithelial layers). There is granulation tissue with abundant blood vessels similar in size to the mixture and Irradiated gel, with abundant presence of cells ((Fig. 32).).
  • a compact matrix similar to that of fibrin possibly composed of flbronectin is observed in Masson's stain (Fig. 35), the rest of the matrix is characterized by an evident deposition of matrix rich in type I collagen. (Flg. 38).
  • the matrix of the tissue under repair is more compact compared to the tissue of the mixture and similar to that of the treatment with the gel Irradiated at pH 4.
  • the wound repair process was expected to be in the proliferation phase with an evident reaplication, a large number of cells in the area of injury as a result of the migration and proliferation of fibroblasts and tissue formation of granulation.
  • the results show that most of the wounds have blood vessels, abundant cellular infiltrate, as well as complete reepltellzaclón, except for the wounds treated with CH, where in no case total reepltellzaclón shows, a situation that is also consistent with the kinetics of closure of wounds where the percentage of closure is lower in the group treated with CH.
  • the new epithelium is thicker than the healthy epithelium, which suggests that there is no optimal resolution of the wound in any of the conditions studied, at day 7.
  • the situation is normal since it indicates that there is a process of proliferation and differentiation to restore the epithelial barrier.
  • the groups of CH-P 4 and P-407 presented the thickest epithelium, where the latter additionally showed a thick stratum corneum, which indicates a higher rate of cell differentiation.
  • the wounds treated with CH and CH + P that did not re-epithelialize showed an eschar integrated to the tissue in a similar way to the wounds of CH-P 7 on day 3, confirming that the CH confers properties to the hydrogel that promote the formation of the clot, serving as hemostatic plug.
  • the granulation tissue comprises most of the tissue under repair in the groups treated with CH + P, CH-P 4 and CH-P 7, with a reglon in the central zone underlying the epidermis with characteristics of a compact matrix similar to the of fibrin, which shows that the replacement of provisional matrix is made from the deep region of the edges of the wound towards the superficial and central part. They also present an incipient deposit of collagen I that suggests the beginning of the remodeling phase with the replacement to a permanent matrix.
  • SS The tissue is completely repelled (Fig. 33), with the epithelium being slightly thick (8 strata) compared to healthy tissue. An evident turnover of the granulation tissue is observed by a scar tissue composed mainly of packaged collagen evidenced by the Masson stains (Fig. 36) and Herovicl stains (Fig. 39), and in which several cells still reside.
  • the fibers are organized in parallel, and in the deepest region there is presence of blood vessels of greater caliber while in the superficial zone they are smaller. There is no formation of follicles.
  • CH It is observed by H & E staining that in one of three mice there is a small area of the wound that is still open (Fig. 33), in which a small eschar persists in the region of the wound epithelium.
  • the new epithelium is formed by 8-10 layers and in one of the wounds is observed hyperkeratosis in a region.
  • the replacement of the granulation tissue by scar tissue is evident but less than in the control group, but greater than in the wounds treated with P-407 (Fig. 36 and 39). In comparison with the previous treatments, an abundant presence of cells is observed. There is no formation of hair follicles in the wound area.
  • the blood vessels are distributed throughout the repair tissue and are usually small caliber. In one of three mice, two granulomas are observed embedded in the epithelium of the wound.
  • CH-P 4 In one of four, the wound is still open in the central part, where an eschar also persists in the epithelial area.
  • the thickness of the epithelium consists of 6-8 strata (Fig. 33).
  • An evident replacement of the granulation tissue by scar tissue is observed although the packing of the fibers is initially evidenced by the coloration acquired in the Masson (Fig. 36) and Herovicl (Fig. 39) stains, in addition the fibers begin to be organized in parallel form. There is presence of small caliber blood vessels that is more evident in the deep region of the wound. Cells are observed in the area of the wound and there are no hair follicles.
  • CH-P 7 The H & E stain shows that the wounds are completely repelled (Fig. 33).
  • the thickness of the epithelium is almost similar to the thickness of a healthy epithelium, while in the other, between 8-9 strata are observed. It presents an evident replacement of the granulation tissue by scar tissue composed of collagen type I collagen fibers arranged in a parallel manner evidenced by an intense Herovicl stain (Fig. 39) and Masson (Fig. 36) similar to the wounds of the control group. There are still several small blood vessels and blood vessels embedded in the matrix. In the case where the epithelium is thickened, there are less packed fibers in the papillary dermis possibly corresponding to type III collagen.
  • the P-407 hydrogel presented predominantly erosion, therefore, this material would also provide a humid environment and would not eliminate the excess exudate that is detrimental during wound repair.
  • the hydrogel CH-P 7 shows a tendency to swelling, that is, it has the capacity to absorb the exudate of the wounds, decreasing the wetness of the wounds, a situation that prevents them from reopening.
  • Another explanation could be that the acid pH present in the CH solution and in the hydrogels causes irritation in the skin of the mice, which causes them to scratch and injure the wounds, a situation that is avoided with the hydrogel at pH 7.
  • the thickness of the epithelium decreased (7-10 strata) to this day in all the treatments under study compared to day 7, being that of the P-407 group similar to that of the tissue without injury. While in the case of CH hyperkeratosis was observed suggesting that this compound stimulates cell proliferation.
  • the healing process has not yet ended, especially in the CH group that histologically shows a delay. This means that to be able to make a more detailed study of the last phase of the healing process, it is necessary to increase the number of days evaluated to carry out the histological analysis.
  • This immunofluorescence test (Anti-Elastase) was performed to confirm that the cellular infiltrate observed in the histologies corresponds to an inflammatory infiltrate and to study whether the hydrodiesel has any effect on the recruitment of neutrophils.
  • Neutrophils are the dominant leukocytes in early stages of healing, whose distribution predominates in eschar, for this reason, it was expected that these cells had high levels at day 3 and that they would decrease in the following days; however, the proportion of these cells in the repair region is similar on day 3 and 7 (Fig. 52) in this model. Due to its abundance, the quantification of neutrophils in eschar becomes complicated.
  • This immunofluorescence test (Anti-F4 / 80) was performed to analyze the macrophage infiltrate and determine the effect that the hydrogels could have on these cells.
  • the macrophages are part of the inflammatory infiltrate and are recruited to the wound area predominantly between 48 to 72 hours, their main function is to phagocytose bacteria and other microorganisms, and also participate in the last stage of the inflammatory phase, regulating the transition to the proliferation and remodeling phase, due to the secretion of key growth factors for the progression of these stages.
  • the wounds treated with CH present the highest recruitment of macrophages to this day with a significant increase on day 3 (Fig. 53), which is consistent with what is shown in histologies on day 1 1 wounds to which CH was applied, where the proliferation phase still persists with an evident granulation tissue and little matrix replacement.
  • CH can induce an inflammatory response, by showing a greater recruitment of neutrophils and macrophages.
  • This immunofluorescence test (Antl-aSMA) was performed to observe activated fibroblasts, also known as myoflbroblasts, and to determine the effect that hydrogels could have on these cells with contractile activity.
  • activated fibroblasts also known as myoflbroblasts
  • hydrogels could have on these cells with contractile activity.
  • no a-SMA expression was observed that could be related to the presence of activated fibroblasts in the area of injury, the positive mark can be attributed to the formation of new blood vessels (Fig. 46 and 54 day 3). which present smooth muscle cells expressing a- SMA.
  • day 7 there is an obvious expression of a-SMA in the superficial region of the edges of the wound, independent of that of the blood vessels.
  • Activated fibroblasts appear in the area of the wound from the fourth day after the lesion, for this reason no expression of a-SMA was expected on day 3, which is consistent with what was observed in the immunofluorescences performed; On the contrary, on day 7, high levels of expression were expected, which correspond to the change in the phenotype of the fibroblasts that initiate the contraction of the wound.
  • Fibroblasts begin to infiltrate the wound during the formation of granulation tissue and are involved in several processes of wound healing: contribute to the formation of granulation tissue, produce atocines that favor the proliferation and migration of keratlnocles, and finally differentiate to activated fibroblasts that express ⁇ -SMA to promote wound closure; this last event is regulated by a molecule produced by macrophages: TGF-bt When a fibroblast is stimulated by TGF-bI, a transcription factor is activated that promotes the expression of contractile genes.
  • M1 macrophages produce a significant level of nitric oxide (NO) and proinflammatory cytokines
  • M2 macrophages are a much more heterogeneous population composed of all macrophages that do not correspond to the characteristics of M1, where there is a subgroup , deactivated macrophages or M2c, which are able to control inflammation and are involved in cell remodeling.
  • the results suggest that the CH, present in the same concentration in the unirradiated mixture, would favor the qulmiotaxls of M1 macrophages, while the Irradiated hydrogels promote the qulmiotaxls of macrophages M1 and M2c, the latter being the ones that activate the fibroblasts. This could be confirmed by performing an immunofluorescence that is specific for this subpopulation of macrophages and an immunofluorescent for TGF-b ! to confirm the signaling path.
  • Irradiated hydrogels promote a greater recruitment of macrophages, probably of M2c macrophages, which is maintained until 1 1 days; which release TGF-b ⁇ promoting the early activation of fibroblasts with a change in their phenotype by contractile cells, resulting in a greater deposit of collagen type I and in an accelerated maturation of the wound.
  • FIG. 55 shows that there are no obvious differences in the expression of TGF ⁇ 3 between treatments and days, and that the variation observed is only that between each mouse. In the normal process of healing, this factor is expressed in early stages and is necessary for the closure of wounds n vivo, it is for this reason that levels of expression of this factor are shown in these days. On the other hand, it has been reported that high levels of TGF ⁇ 3 in wounds reduces the deposition of collagen type I by restricting the differentiation of myoflblasts and promoting the degradation of collagen by MMPs. All this leads to the reduction of scar formation.
  • the hldrogel objects of the invention obtained by gamma irradiation through a fast, economical and environmentally friendly procedure, with bloodegradable and blocompatible materials present advantageous characteristics with respect to other materials used as auxiliary dressings in the repair of wounds; This is because they approach the closure of wounds with different physical and biological mechanisms of action since they possess the characteristic of thermoreversility and gellflcaclón properties at low temperature that allow easy application to the wound, show the ability to swell in the presence of serum human allows the control of excessive exudate in skin wounds, show an antimicrobial / antifungal effect preventing infection, CH-P 7 has an admirable wound closure rate during week 1 in mice, presents an increase in macrophages , expression of a-SMA and synthesis of collagen, which results in a greater mature repair of the wound.

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Abstract

La presente invención se refiere a los hidrogeles para la administración tópica y el uso de dichos hidrogeles en aplicaciones cosméticas y/o médicas, el cual está hecho a base de los biopolímeros quitosano y poloxámero 407 y posee propiedades farmacéuticas para la reparación de heridas y quemaduras. Así mismo se divulga el proceso para la preparación de dicho hidrogel obtenido por irradiación gamma la cual exhibe mejoras en las propiedades fisicoquímicas y biológicas para la reparación de heridas y quemaduras y la elaboración de apósitos empleando el hidrogel referido.

Description

BIOPOLIMERO DE QUITOSANO Y POLOXAMERO 407 OBTENIDO POR IRRADIACIÓN GAMMA
QUE EXHIBE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y BIOLÓGICAS PARA LA REPARACIÓN DE
HERIDAS.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de los hldrogeles para la administración tópica y el uso de dichos hidrogeles en aplicaciones cosméticas y/o médicas. El hidrogel desarrollado está hecho a base de los biopolímeros quitosano y poloxámero 407 y posee propiedades farmacéuticas para la reparación de heridas y quemaduras.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La piel humana provee una barrera efectiva contra la penetración microbiana y su subsecuente infección; sin embargo, al ser un órgano externo, es propensa a sufrir lesiones físicas y mecánicas recurrentes. Cuando se presenta una lesión dérmica, el riesgo de contraer una Infección es mayor, además de que los tejidos Internos quedan expuestos a factores potencialmente dañinos. Por este motivo, el cierre y reparación de las heridas después de un evento traumático o una cirugía son de vital importancia en el área clínica y la investigación, el correcto tratamiento de las mismas, dará como resultado una cicatrización adecuada.
En este sentido, el tratamiento de las heridas requiere de diferentes tipos de materiales como auxiliares en la prevención de Infecciones y promoción de una rápida cicatrización para obtener resultados tanto funcionales como cosméticos-estéticos; entre los más comunes se encuentran los vendajes, gasas, algodón, soluciones desinfectantes y material quirúrgico. Hoy en día las suturas siguen siendo la técnica más utilizada para el cierre de las heridas; sin embargo, tiene diversas desventajas (su colocación requiere anestesia, puede Inducir Infecciones, dañar el nervio, provocar reacciones inflamatorias, formar granulomas y cicatrices, y es un método que requiere de conocimientos y ciertas habilidades).
Por otro lado, el manejo de las heridas es una práctica muy costosa en todos los países y representa una enorme carga para los recursos sanitarios; estudios han calculado que el costo del tratamiento de heridas en el Servicio Nacional de Salud (NHS: sistemas de salud financiados con fondos públicos en los países del Reino Unido) es de alrededor mil millones de £ al año, asimismo, en México se ha estimado que el costo mensual de la atención rebasa el millón de pesos mexicanos sólo en instituciones de primer nivel de atención. Para reducir este costo, los productos para el tratamiento de heridas necesitan ser lo más económicos y eficaces posibles.
Debido a estas razones, varios biopolímeros han generado interés por el gran número de aplicaciones biomédicas que presentan, dentro de las cuales el desarrollo de apósitos ha tenido un crecimiento notable en los últimos años gracias a su capacidad para formar hldrogeles. Actualmente, los hidrogeles son considerados como materiales esenciales para el tratamiento y reparación de las heridas debido a sus propiedades físicas y químicas modlflcables, entre ellas, capacidad de adhesión a los tejidos, fuerza mecánica para mantenerse Intacto y posteriormente ser removido, proveen una completa oclusión en la herida, y actúan como una barrera contra las infecciones por bacterias; además, estos materiales pueden absorber el exudado y mantener una humedad adecuada para un cierre rápido de la herida. Asimismo, se ha observado que dos polímeros con la capacidad de formar hidrogeles: el quitosano (CH) y el poloxámero 407(P-407) han servido como auxiliares en la reparación de las heridas, y que la aplicación de Irradiación Gamma a mezclas de hidrogeles produce un entrecruzamiento de los polímeros que potencializa su actividad terapéutica.
La presente invención proporciona un hidrogel que se obtiene mediante un método novedoso para la elaboración de apósitos utilizando polímeros de fácil adquisición, que consiste de una mezcla de CH y P-407 entrecruzados por radiación gamma con el objetivo de mejorar la reparación de heridas exclslonales, como una alternativa viable para el tratamiento de heridas asimismo se da a conocer la caracterización realizada al mismo mediante pruebas fisicoquímicas, pruebas antlmicroblanas, y la evaluación in vivo con el posterior análisis histológico y pruebas de inmunofluorescencla.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La piel es una barrera que cubre y protege los órganos Internos de cuerpo. Al ser un órgano externo, es propensa a sufrir lesiones. Cuando ocurre una lesión profunda, se presenta un proceso de reparación que consta de una fase infamatoria, una fase de proliferación y una fase de remodelación que resultan en una cicatriz. Actualmente, existen diferentes tratamientos que aceleran la reparación y mejoran la resolución de la cicatriz. Tal es el caso de los hldrogeles hechos a base de polímeros, que proporcionan humedad al lecho de la herida y reducen el dolor. Se ha observado que el quitosano (CH) y el poloxámero 407(P-407) han servido como auxiliares en la reparación de las heridas, y que la aplicación de irradiación Gamma a una dosis >25 kGy a mezclas de hidrogeles mejora sus propiedades fisicoquímicas y produce un entrecruzamiento de los polímeros que potencializa su actividad terapéutica.
La presente invención proporciona un nuevo hidrogel que se obtiene por irradiación gamma a base de quitosano y poloxámero 407, dicho hidrogel se caracteriza flslcoquímicamente y se evalúan los efectos de su aplicación tópica en heridas exclslonales de espesor total realizadas en el dorso del ratón. Los materiales que se evalúan son: CH 0.75%p/v, P-407 25%p/v, una mezcla de P-407 25%p/v con CH 0.75%, y esta última Irradiada a 25 KGy a su pH original (4) y a pH neutro (7).
La caracterización fisicoquímica se lleva a cabo mediante las pruebas de pH y precipitación, microscopía electrónica de barrido, calorimetría diferencial de barrido, temperatura y tiempo de gelificación, perfil de viscosidad, absorción de agua o captación de humedad, bloeroslón/hinchamiento, y pruebas antlmicroblanas, en la cuales ponen en evidencia las propiedades de los compuestos e hidrogeles; especialmente el del hidrogel con la mezcla de polímeros antes y después de ser sometido a Irradiación gamma. En estas pruebas se observa que la Irradiación en el hldrogel mantiene la característica de la termorreverslbllldlad Inversa, hace posible el ajuste a un pH neutro sin exhibir un fenómeno de precipitación, cambia su morfología, su viscosidad, disminuye los valores de la entalpia y punto de fusión, aumenta el tiempo y temperatura para su gellflcaclón, no altera su comportamiento de liberación de agua en atmósferas de 20 a 90% de HR, mejora sus propiedades de hlnchamlento, proporcionando un entorno húmedo propicio, y presentan propiedades antlmlcroblanas/antlmlcótlcas contra microorganismos que se encuentran frecuentemente en el lecho de las heridas.
La reparación de las heridas se analiza macroscópicamente, determinando el porcentaje de cierre, y microscópicamente por las tinciones histológicas de H&E, Masson y Herovlcl, y por pruebas de ¡nmunofluorescencla utilizando marcadores moleculares para evaluar el reclutamiento de neutrófllos y macrófagos por la expresión de elastasa y de F4/80 respectivamente; la activación de los fibroblastos por a-SMA, y la expresión de TGF-p3, como un Indicador molecular de la calidad de la cicatriz. Las heridas tratadas con el gel Irradiado a pH de 7 presentan un mayor porcentaje de cierre de la herida al día 3 en comparación con los otros tratamientos. Se observa un mayor reclutamiento de macrófagos, un Incremento en la expresión de a-SMA, y una aceleración de la formación del tejido de granulación y del depósito de la matriz extracelular en las heridas tratadas con los hldrogeles Irradiados. Estos resultados muestran que los hldrogeles Irradiados Incrementan el reclutamiento de macrófagos, que promueven la activación temprana de los fibroblastos, resultando en un mayor depósito de colágena tipo I y en una maduración acelerada de la herida.
Los resultados obtenidos muestran que los hldrogeles Irradiados de qultosano y poloxámero 407, presentan buenas propiedades estructurales, mecánicas, y biológicas que los hacen buenos candidatos para la aplicación como apósitos en heridas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Para los propósitos de ¡lustrar la Invención, se muestran las siguientes figuras:
Figura 1. Heridas excisionales en los ratones de la cepa CD1 .
Figura 2. En la parte superior de la Imagen se muestran los materiales desarrollados a su pH original, y en la parte Inferior se muestran ajustados a un pH de 7. Se observa como la solución de qultosano y la mezcla física presenta precipitados.
Figura 3. Representación esquemática de la posible red conformada por el P-407 y el Qultosano.
Figura 4. SEM.CH a 500X, barra = 50pm .
Figura 5. SEM. CH a 1000X, barra = 20pm . Figura 6. SEM. P-407 a 500X, barra = 50mih.
Figura 7. SEM. P-407 a 10OOX, barra = 20mih.
Figura 8. SEM. CH+P a 500X, barra = 50mih.
Figura 9. SEM. CH+P a 1000X, barra = 20mih.
Figura 10. SEM.CH-P 4 a 500X, barra = 50mih.
Figura 11. SEM. CH-P 4 a 1000X, barra = 20mip.
Figura 12. SEM.CH-P 7 a 500X, barra = 50mih.
Figura 13. SEM. CH-P 7 a 1000X, barra = 20mih.
Figura 14. Termograma obtenido por DSC para las diferentes muestras, a la izquierda se aprecia completa, y a la derecha hay un acercamiento.
Figura 15. Acercamiento del termograma obtenido por DSC para los hldrogeles.
Figura 16. Espectros de FTIR y 1 H RMN de CH, P407, CH+P, y los copolímeros CH-P4 y CH-P 7. El gráfico insertado en la sección B corresponde a la deconvolución del espectro de 1 H RMN de P407 realizado con el programa MestReNova.
Figura 17. Gráfico en donde se representan los valores de tiempo y temperatura de gelaclón de cada una de las muestras.
Figura 18. Gráfico de viscosidad del hidrogel P-407; “Fluido Tixotropico” (Diferencias significativas encontradas al aplicar la prueba estadística t-pareada: *120 rpm, P =0.0036; #360 rpm, P=0.0027).
Figura 19. Gráfico de viscosidad del hidrogel CH+P; “Fluido Tixotropico” (Diferencias significativas encontradas al aplicar la prueba estadística t-pareada: *120 rpm, P =0.0003).
Figura 20. Gráfico de viscosidad del hidrogel irradiado a pH de 4. Se pierde la tixotropía (Sin diferencias significativas encontradas P>0.05).
Figura 21. Gráfico de viscosidad del hidrogel irradiado a pH de 7. Se pierde la tixotropía (Sin diferencias significativas encontradas P>0.05). Figura 22. Gráfica del comportamiento de los diferentes hldrogeles a las distintas humedades relativas del medio (Diferencias significativas encontradas al aplicar la prueba estadística ANOVA: 60%HR: P-407 y CH+P, P =0.213, * 70%HR: P-407 y CH-P 4, P =0.0101 ; CH-P 4 y CH-P 7, P =0.0224).
Figura 23. Gráfica de porcentaje de Bioeroslón y/o hinchamiento mostrado por los distintos geles. (Diferencias significativas encontradas al aplicar la prueba estadística ANOVA: *4hrs: P-407/CH, P =0.0031 ; CH+P/CH-P 4, P =0.01 1 ; CH-P 4/CH-P 7, P =0.0073; *6hrs: P-407/CH-P 4, P =0.0046; CH-P 4/CH-P 7, P =0.0349; *8hrs: P-407/CH+P, P =0.001 ; P-407/CH-P 4; P < 0.0001 , P-407/CH-P 7, P =0.001 ; *10hrs: P-407/CH+P, P =0.0006; P-407/CH-P 4, P < 0.0001 ; P-407/CH-P 7, P =0.0009; *12hrs: P-407/CH-P 4, P < 0.0001 ; P-407/CH-P 7, P < 0.0001 ; CH+P/CH-P 4,P < 0.0001 ; CH+P/CH-P 7, P < 0.0001 ; *15hrs: P-407/CH-P 4, P= 0.0063; P-407/CH-P 7, P=0.0036; CH+P/CH-P 4, P=0.0021 ; CH+P/CH-P 7, P=0.0013; *18hrs: P-407/CH-P 4, P=0.0337; P-407/CH-P 7, P=0.0465; CH+P/CH-P 4, P=0.0237; CH+P/CH-P 7, P =0.0367; *21 hrs: P-407/CH+P, P < 0.0001 ; P-407/CH-P 4, P=0.0369; P- 407/CH-P 7, P=0.0003; CH+P/CH-P 4; P < 0.0001 ; CH+P/CH-P 7, P < 0.0001 ; CH-P 4/CH-P 7, P=0.0197; *24hrs: P-407/CH+P, P < 0.0001 ; P-407/CH-P 4, P=0.0029; P-407/CH-P 7, P=0.0005; CH+P/CH-P 4; P < 0.0001 ; CH+P/CH-P 7, P < 0.0001 ; CH-P 4/CH-P 7, P=0.2829.)
Figura 24. Antibiogramas obtenidos de la prueba de susceptibilidad en agar contra la bacteria E. coli, para cada una de las muestras desarrolladas.
Figura 25. Antibiogramas obtenidos de la prueba de susceptibilidad en agar contra la bacteria S. aureus, para cada una de las muestras desarrolladas.
Figura 26. Antibiogramas obtenidos de la prueba de susceptibilidad en agar contra la bacteria P. aeruglnosa, para cada una de las muestras desarrolladas.
Figura 27. Antibiogramas obtenidos de la prueba de susceptlblllda en agar contra el hongo C. alblcans, para cada una de las muestras desarrolladas.
Figura 28. Fotografías macroscópicas que muestran la fase inicial de la herida exclslonal de espesor total y su resolución a los 3, 7 y 1 1 días posteriores a su realización al tratarlas con cada una de las muestras, solución salina (SS): utilizado como grupo control, P-407, CH, CH+P, CH-P 4, y CH-P 7.
Figura 29. Gráfica de dispersión en donde se presenta el porcentaje de cierre (contracción) de las heridas desde los 0 hasta los 1 1 días y sus respectivos errores estándar.
Figura 30. Gráfico del peso de los animales, desde los 0 hasta los 1 1 días de tratamiento.
Figura 31. Fotografías de la tinción de H&E para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 3 tomadas con el objetivo 5x. En todas las heridas se observa la presencia de escara sin reepitelización evidente pero con migración incipiente y de un infiltrado inflamatorio abundante.
Figura 32. Fotografías de la tinción de H&E para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 7 tomadas con el objetivo 5x. La mayoría de las heridas presentan vasos sanguíneos, infiltrado celular abundante, así como reepitelización completa, a excepción de las heridas tratadas con CH, en donde no se muestra reepitelización total. El tejido de granulación comprende la mayor parte del tejido en reparación en los grupos tratados con P-407, CH+P, CH-P 4 y CH-P 7, con una matriz compacta en la región central subyacente a la dermis.
Figura 33. Fotografías de la tinción de H&E para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 1 1 tomadas con el objetivo 5x. Las heridas reepltellzaron completamente en los grupos SS, CH+P, CH-P 4 y CH-P 7, mientras que en los otros tratamientos se presenta un caso en donde la herida no reepitelizó en su totalidad. La mayoría de las heridas aún presenta tejido de granulación con vasos sanguíneos e Infiltrado celular abundante.
Figura 34. Fotografías de la tinción de Masson para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 3 tomadas con el objetivo 5x. El tejido de reparación es menos abundante en las heridas tratadas con los hidrogeles Irradiados, la matriz de fibrina (se muestra en rojo) es mayor en las heridas tratadas con CH y CH+P, comienza el recambio de matriz con incipiente síntesis de colágena (teñida de azul) en la zona profunda de las heridas tratadas con CH-P 4, y CH-P 7.
Figura 35. Fotografías de la tinción de Masson para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 7 tomadas con el objetivo 5x. . Se observa tejido de granulación y síntesis de colágena (que se tiñe de color azul) en las heridas tratadas con la mezcla de polímeros. Aún se observa matriz compacta con características similares a la fibrina en los grupos a los que se les aplicó SS, P-407, CH, CH+P y CH-P 4.
Figura 36. Fotografías de la tinción de Masson para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 1 1 tomadas con el objetivo 5x. Se observa un recambio evidente del tejido de granulación por un tejido cicatrizal compuesto principalmente por fibras de colágena (teñida de azul) dispuestas en forma paralela.
Figura 37. Fotografías de la tinción de Herovicl para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 3 tomadas con el objetivo 5x. Las heridas tratadas con CH-P 7 presentaron fibras de colágena empaquetada (tipo I, en color magenta) embebidas en la matriz superficial; y las heridas tratadas con CH-P 4 muestran un incipiente depósito de colágena predominantemente poco empaquetada (teñida de azul claro). Figura 38. Fotografías de la tinción de Herovlcl para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 7 tomadas con el objetivo 5x. Las heridas tratadas con CH+P, CH-P 4 y CH-P 7 muestran un Incipiente depósito de colágena I (se tiñe de color magenta).
Figura 39. Fotografías de la tinción de Herovlcl para los segmentos histológicos de las heridas de cada tratamiento al día 1 1 tomadas con el objetivo 5x. Se observa el recambio del tejido por una matriz permanente con un depósito evidente de colágena tipo I, específicamente, las heridas tratadas con SS y CH-P 7 muestran mayor cantidad de colágena empaquetada que se tiñe de color magenta.
Figura 40. Fotografías de la ¡nmunofluorescencia Anti-Elastasa de la zona de la herida al día 3 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. Se observa un reculamiento similar de neutrófllos en todos los tratamientos, el cual es ligeramente menor en las heridas tratadas con CH, CH+P, CH-P 4 y CH-P 7.
Figura 41. Fotografías de la ¡nmunofluorescencia Anti-Elastasa de la zona superficial de la herida al día 7 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. La línea blanca separa al epitelio de neoformaclón de la zona de reparación. El número de neutrófllos presenta niveles elevados a este día, lo que significa que la fase Inflamatoria es persistente. Las heridas tratadas con CH muestran un mayor reclutamiento de neutrófllos en comparación con los otros grupos en estudio.
Figura 42. Fotografías de la ¡nmunofluorescencia Anti-Elastasa de la zona superficial de la herida al día 1 1 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. La línea blanca separa al epitelio de neoformaclón de la zona de reparación. El número de neutrófllos presenta niveles considerables a este día, lo que significa que la fase Inflamatoria es persistente. No se observan diferencias evidentes entre los tratamientos.
Figura 43. Fotografías de la ¡nmunofluorescencia Antl-F4/80 de la reglón profunda de las heridas al día 3 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. Se observa un reculamiento escaso de macrófagos en todos los tratamientos; sin embargo, es ligeramente mayor en las heridas tratadas con CH y P407.
Figura 44. Fotografías de la ¡nmunofluorescencia Antl-F4/80 de la reglón profunda de las heridas al día 7 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. El Infiltrado de macrófagos en la zona de la herida se Incrementa de forma notable en todos los tratamientos del día 3 al día 7. Las heridas tratadas con los hldrogeles Irradiados, CH y CH+P muestran un mayor reclutamiento de macrófagos en comparación con los otros grupos en estudio.
Figura 45. Fotografías de la ¡nmunofluorescencia Antl-F4/80 de la reglón profunda de las heridas al día 1 1 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. El Infiltrado de macrófagos se Incrementó en las heridas tratadas con SS, P-407 y CH, siendo en este último mayor que en cualquier otro tratamiento; mientras que en los grupos tratados con CH+P, CH-P 4 y CH-P 7 el número de macrófagos se mantuvo similar al del día 7.
Figura 46. Fotografías de la ¡nmunofluorescencla Antl-aSMA de las heridas al día 3 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 10x. No se observa expresión de a-SMA que esté relacionada con fibroblastos activados en ninguno de los grupos estudiados.
Figura 47. Fotografías de la ¡nmunofluorescencla Antl-aSMA de la región superficial de las heridas al día 7 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. la línea blanca separa al epitelio de neoformación de la zona de reparación. Se observa expresión de a-SMA en la reglón superficial de los bordes de herida. La expresión de a-SMA fue mayor en los grupos tratados con los hldrogeles Irradiados, mientras que. las heridas que recibieron CH y CH+P presentan el menor nivel de expresión.
Figura 48. Fotografías de la ¡nmunofluorescencla Antl-aSMA de la región superficial de las heridas al día 1 1 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. La línea blanca separa al epitelio de neoformación de la zona de reparación. La expresión de a-SMA disminuyó en todos los casos, excepto para el grupo tratado con CH, en donde la expresión se mantuvo similar con respecto al día 7.
Figura 49. Fotografías de la ¡nmunofluorescencla Antl-TGF-p3 de las heridas al día 3 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. Las heridas tratadas con SS y P-407 presentan ligeramente una mayor expresión de TGF-p3.
Figura 50. Fotografías de la ¡nmunofluorescencla Antl-TGF-p3 de la región superficial de las heridas al día 7 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. La línea blanca separa al epitelio de neoformación de la zona de reparación. Las heridas tratadas P-407 presentan ligeramente mayor expresión de TGF-p3.
Figura 51. Fotografías de la ¡nmunofluorescencla Antl-TGF-p3 de la región superficial de las heridas al día 1 1 de cada tratamiento tomadas con el objetivo 20x. La línea blanca separa al epitelio de neoformación de la zona de reparación. Las heridas tratadas P-407 presentan menor expresión de TGF- b3·
Figura 52. Porcentaje de neutrófilos presentes en las heridas a las que se les aplicaron los diferentes tratamientos a los días 3, 7 y 1 1 . , con respecto al número de células totales presentes. Cuantlflcaclón realizada utilizando el programa Fiji Is just ImageJ (*Día 7: P-407/CH, P=0.0436)†.
Figura 53. Porcentaje de macrófagos presentes en las heridas a las que se les aplicaron los diferentes tratamientos a los días 3, 7 y 1 1 , con respecto al número de células totales presentes. Cuantlflcaclón realizada utilizando utilizando el programa Fiji Is just ImageJ (*Día 7: SS/CH-P 7, P =0.0727; #SS: Día3/Día1 1 , P=0.01 07; #CH : Día3/Día1 1 , P=0.0107; #CH-P 4: Día3/Día1 1 , P=0.0918; #CH- P 7: Día3/Día1 1 , P=0.0908;)†. Figura 54. Área total positiva para a-SMA de las heridas a las que se les aplicaron los diferentes tratamientos a los días 3, 7 y 1 1 . Cuantificación realizada utilizando el programa Fiji Is just ImageJ (#SS: Día7/Día1 1 , P=0.0714; #CH-P 4: Día7/Día1 1 , P=0.0229; #CH-P 7: Día7/Día1 1 , P=0.0286)†.
Figura 55. Porcentaje de expresión de TGF-P3 en las heridas a las que se les aplicaron los diferentes tratamientos a los días 3, 7 y 1 1 . , con respecto al número de células totales presentes. Cuantificación realizada utilizando el programa Fiji Is just ImageJ (P > 0.05)†.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Es un objeto de la presente Invención proporcionar nuevas soluciones terapéutica y cosméticas para el tratamiento de las heridas. Más concretamente, la Invención describe la obtención y el uso novedoso de un hidrogel que acelera el proceso de reparación de las heridas y permite el cierre de las mismas, y se puede usar en cualquier sujeto mamífero.
Las abreviaturas usadas en la presente Invención son las siguientes:
Abreviatura Significado
%p/v Porcentaje peso volumen
°C Grados Celsius
°F Grados Fahrenheit
60Co Cobalto 60
A Adenlna
Á Armstrong
AAc Ácido acrílico
AAm Acrilamida
AIBN 2,2-azo-isobutironitrilo
Al Aluminio
AN Acrilonitrilo
B. subtilis Bacillus subtilis
BHE Barrera hematoencefálica
C Carbono
C. albicans Candida albicans c.b.p. Cuanto baste para
CD Grupo de diferenciación (Cluster of differentiation)
CE50 Concentración efectiva 50
CH Quitosano
CH Solución de quitosano
CH+P Hidrogel de poloxámero 407 + Quitosano (mezcla física)
CH-H Quitosano de alto peso molecular
CH-L Quitosano de bajo peso molecular
CH-M Quitosano de mediano peso molecular
CH-P 4 Hidrogel Irradiado de poloxámero 407 con Quitosano (mezcla Irradiada a pH de 3.5
- 5.5)
CH-P 7 Hidrogel Irradiado de poloxámero 407 con Quitosano y ajustado a un pH=6.5 -7.5
(mezcla Irradiada a pH de 6.5 - 7.5)
CHy Solución de quitosano Irradiado a 25 KGy
CIM Concentración mínima inhibitoria
CL50 Concentración letal 50
cm Centímetro
CMC Concentración micelar crítica
CM-CH Carboxlmetll-qultosano
CMT Temperatura de concentración micelar crítica
-CONH- Amida secundarla
-CONH2 Amida primarla
-COOH Grupo carboxilo
cps Centipoise
Cu Cobre
CXC Quimlocina
D Velocidad de deformación
DAPI 4 6-diamidino-2-fenilindol
DD Grado de desacetilación
DL50 Dosis letal 50
DNA Ácido desoxirrlbonucleico
DSC Calorimetría diferencial de barrido
E. coll Escherichia coll EGF Factor de crecimiento epidérmico
EMA Etil metacrilato
FGF Factor de crecimiento de fibroblastos
FISH Hibridación in situ fluorescente
FITC Isotiocianato de fluoresceína
g Gramos
G' Módulo elástico, de almacenamiento o de cizallamiento
G" Módulo viscoso, de pérdida o fluencia
GEMA Glucosiletil metacrilato
GlcN D-glucosamina
GIcNAc N-acetil-D-glucosamina
h Flora
h Constante de Planck
HA Ácido hialurónico
HCI Ácido clorhídrico
HEMA Hidroxoetil metacrilato
Hg Mercurio
HMIS Sistema de Identificación de Materiales Peligrosos (Hazardous Materials
Identification System)
HMPA Hidroxietil metacrilato
HN03 Ácido nítrico
HR Humedad relativa
IL Interleucina
IR Infrarrojo
kDa Kilodalton
Kg Kilogramos
kGy Kilograys
M Concentración molar, Molaridad
mBar Milibar: unidad de presión equivalente a 10-2Pascales
MEC Matriz extracelular
mg Miligramos
MIP-1a Proteína quimioatrayente de macrófagos mL Mililitros
MMA Metil metacrllato
MMP Metaloproteinasas de matriz
MPa Megapascal
NADPH Dinucleótido de nicotinamida-adenina fosfato
NAGasa N-acetil-R-D-glucosaminidasa
NaOH Hidróxido de sodio
NCCLS Comité Nacional para Estándares de Laboratorio Clínica
NFPA Asociación Nacional para la protección de Incendios (National Fire Protection
Association)
NH Hidrógeno unido a un nitrógeno del grupo acetoamida
NH2 Grupo amina
NH3+ Ion amonio
NHS Sistema Nacional de Saludo del Reino Unido
Ni Níquel
NIPAAm N-isoplropil acrilamida
nm Nanómetros
NO Óxido nítrico
O Oxígeno
0=C Grupo carbonilo
-OH Grupo hidroxilo
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
P-407 Poloxámero 407
PBO Poli-(óxido de butileno)
PCL Policaprolactona
PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas
PEG Poli-(etilenglicol)
PF Propilen fumarato
PH Potencial de hidrógeno
PH -Log [h+]
PHB Poli-(h¡droxi butirato)
pKa -Log ka PLA Ácido poliláctico
PLGA Ácido-poliláctico-co-glicólico
PM Peso molecular
PNVP Poli-(N-vlnllplrrolidona)
POE Poli-(óxido de etileno)
PP Precipitación (precipitado)
PPO Poli-(óxido de propileno)
PVA Poli-(vinilalcohol)
PVAc Poli-(vinilacetato)
QY Número de fotones de fluorescencia emitidos por fotón de excitación absorbido
RNAm Ácido ribonucleico mensajero
ROS Especies Reactivas de oxígeno
rpm Revoluciones por minuto.
S.aureus Staphylococcus aureus
SO Estado fundamental
SD Ratas sprague-dawley
SEM Microscopio Electrónico de Barrido
SMA Actina de Músculo Liso
Sn Nivel de energía, en donde n es número cuántico principal; estado slnglete
-S03H Grupo sulfónico
T Timidina
T/temp. Temperatura
Tgel Temperatura de gelación
tgel tiempo de gelación
TGF Factor de crecimiento transformante
Tn Estado triplete
TNF Factor de Necrosis tumoral
TPF Ester tetrafluorofenilo
U Uracilo
UFC Unidades formadoras de colonias
UV Ultravioleta VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
WVTR Tasa de transmisión de vapor de agua
Zn Zinc
l Longitud de onda
m Viscosidad
pm Micrómetro
v Frecuencia
t Esfuerzo cortante
La piel cubre la superficie externa del cuerpo, y es el órgano más grande en área y peso. Tiene un papel importante en muchas funciones: a) termorregulación, regulación homeostática de la temperatura, b)protección, al ser una barrera que cubre los tejidos internos de los vertebrados tiene la capacidad de proteger al cuerpo de factores potencialmente dañinos, por mencionar algunos ejemplos, invasión microbiana, daño térmico, químico, mecánico y osmótico. Adicionalmente, contribuye a la homeostasis de los fluidos inhibiendo la evaporación de agua, gracias a los lípidos presentes en la superficie de la piel, protegiendo al cuerpo de la deshidratación, c) detección sensorial, d) tiene propiedades que permiten la absorción, la permeabilidad selectiva de productos químicos y la excreción a través del sudor de pequeñas cantidades de sales, amonio y urea.
Los tejidos que componen a la piel son la epidermis, la dermis y la hipodermis.
La epidermis forma la capa superficial de la piel y es una estructura compuesta por un epitelio estratificado escamoso queratinizado Contiene células epiteliales, también conocidas como queratinocitos, los cuales se encuentran sobre una lámina basal subyacente; células de Merkel que funcionan como mecanorreceptores; melanocitos que definen el color de la piel; y las células de Langerhans que son células presentadoras de antígeno del sistema inmune de la piel.
Es Importante mencionar que la epidermis no contiene vasos sanguíneos, por ello, los nutrientes celulares provienen de un proceso de difusión desde la dermis subyacente.
Esta capa provee protección al cuerpo en distintas maneras: la queratlna protege del calor, la abrasión y sustancias químicas, las uniones estrechas de los queratinocitos son una defensa contra la Invasión de microorganismos tales como bacterias, virus, parásitos y otros organismos, representa una barrera Impermeable que permite controlar la pérdida de agua gracias a los lípidos, y protege contra los efectos nocivos de la luz UV por acción de la melanina. Además, las terminaciones nerviosas aferentes para la sensación de tacto, presión, temperatura, así como el dolor, también llegan a la epidermis.
La epidermis está compuesta de cinco capas celulares distintas. Estas capas incluyen (de la más superficial a la profunda) el estrato córneo, el estrato lúcido, el estrato granuloso, el estrato espinoso y el estrato germinativo. Las células del estrato basal experimentan continuamente división celular para producir nuevos queratinocitos. estas células nuevas migran paulatinamente hacia la superficie para poblar las capas más externas de la epidermis. A medida que migran hacia la superficie, se diferencian, maduran, sintetizan y depositan ¡ntracelularmente queratina y lípidos, adquiriendo una apariencia plana. Subyacente y separada de la epidermis por una membrana basal, se encuentra la dermis.
La dermis es un tejido conectivo denso compuesto principalmente de MEC rica en colágena y elastina que son sintetizadas por los fibroblastos, el principal componente celular de la dermis, Proporciona flexibilidad y fuerza a la piel; está irrigada por vasos sanguíneos y linfáticos, y densamente inervada, tanto por el sistema nervioso aferente, así como el eferente motor. En la dermis se encuentran apéndices de origen epidérmico como el complejo pilosebáceo, el cual consta del folículo piloso, el músculo piloerector y la glándula sebácea; también se encuentran las glándulas sudoríparas, cuya función es regular el equilibrio de líquidos y electrólitos, y la temperatura.
Los fibroblastos constituyen la mayoría de las células en la dermis junto con los mastocitos y los macrófagos. Los fibroblastos dérmicos ayudan a controlar la producción y mantenimiento de los componentes estructurales dominantes de la dermis, principalmente colágena, que se forma por agregación de polipéptidos Individuales de colágena, conocidos como procolágena, que son sintetizados y exportados a la MEC. El proceso de agregación es facilitado por proteoglicanos, otro producto de los fibroblastos.
La mayoría de la colágena en la dermis es de tipo I y constituye hasta el 80% de la colágena de la piel. La colágena tipo III constituye alrededor del 15%, mientras que la tipo V y VI constituyen el resto. La relación típica de colágena de tipo I con respecto a la de tipo III es 4:1 . Está relación se mantiene incluso en cicatrices después del proceso de reparación de heridas.
La hipodermis es la capa debajo de la dermis formada por adipocitos, fibroblastos y macrófagos, la cual contiene una gran cantidad de tejido adiposo vascularlzado que contribuye tanto a la termorregulación como a las propiedades mecánicas de la piel.
La piel es propensa a sufrir lesiones físicas y mecánicas. Si se presenta una lesión profunda, es decir, una lesión que afecte la dermis, dará inicio un proceso de reparación que tiene como resultado final una cicatriz.
Una herida es la ruptura de la integridad epitelial de la piel; las heridas se clasifican como agudas o crónicas y luego se subdivlden en subcategorías, tales como las úlceras por presión, úlceras venosas de la pierna, úlceras de pie diabético, heridas traumáticas y heridas quirúrgicas, algunas enfermedades como la diabetes y la isquemia y condiciones tales como la desnutrición, envejecimiento, Infección local y el daño tisular local debido a las quemaduras, demora la cicatrización de heridas. El proceso de reparación de heridas o cicatrización, es una serie dinámica de acontecimientos que implican la interacción coordinada de células de la sangre y de la piel, proteínas, proteasas, factores de crecimiento, y componentes de la matriz extracelular, cuyo objetivo inmediato es lograr la integridad del tejido. El proceso de reparación de heridas puede dividirse en tres fases que se superponen en tiempo y espacio: (1 ) fase inflamatoria; (2) fase de proliferación; y (3) fase de remodelación.
La fase inflamatoria inicia inmediatamente después de que ocurre una lesión en la piel y presenta dos eventos importantes, uno vascular donde el objetivo principal es la hemostasia y otro celular, en el que células, principalmente leucocitos, llegan al sitio de la herida.
Se conoce como hemostasia a la prevención de una hemorragia espontánea y al control de una hemorragia de origen traumático. El mecanismo hemostático es un sistema primario de defensa del organismo, que tiene como principal función mantener la integridad vascular y al mismo tiempo evitar la pérdida de sangre al exterior; mediante la producción de la protrombina a trombina la cual convierte el fibrinógeno en fibrina, formando el coágulo de sangre; y posteriormente, eliminar el exceso de fibrina e inhibir la actividad de los factores de coagulación activados.
El coágulo o matriz provisional, además de actuar como barrera contra microorganismos, funciona como reservorio de factores de crecimiento y citocinas, y como soporte para la migración y proliferación celular de queratinocitos, fibroblastos, y leucocitos.
La participación del sistema vascular en la hemostasia es mediante la vasoconstricción inmediata posterior a la lesión vascular y que permanece por 10 o 15 minutos. Este mecanismo tiene dos propósitos: evitar la pérdida de sangre a través de la herida y provocar variaciones en la velocidad y tipo de flujo sanguíneo. Esto se logra por medio de la liberación de sustancias con actividad vasoconstrictora como noradrenalina, adrenalina, y bradicinina.
Los principales elementos celulares que participan en la hemostasia son las plaquetas, las cuales intervienen en dos situaciones diferentes, la primera es que forman un trombo hemostático en el sitio de la lesión y la segunda es que proveen sustancias con actividad procoagulante para la formación de fibrina. Durante su activación, las plaquetas sufren una serie de cambios que llevan a la formación de un trombo plaquetario. Estos cambios comprenden la expresión de un mayor número de receptores de membrana, la adhesión al endotelio vascular, un cambio de forma (que consiste en una transformación esférica de la plaqueta con la aparición de pequeños pseudópodos), la síntesis de prostanglandinas y tromboxanos, la liberación del contenido de sus gránulos y por último, la agregación.
Cuando las plaquetas liberan el contenido de sus gránulos, secretan varias sustancias tales como fibronectina, fibrinógeno, histamina, serotonina, EGF y PDGF; por otro lado, la degranulación plaquetaria activa la cascada del complemento, específicamente C5, que es una proteína quimiotáctica potente de neutrófilos. La inflamación tiene dos funciones esenciales cuyo objetivo principal es combatir la infección. La primera es suministrar moléculas y células efectoras, específicamente leucocitos, a los sitios de Infección para la destrucción de microorganismos invasores, y la segunda es promover la reparación del tejido lesionado; sin embargo, esta última función es tema de controversia, ya que el mutante PU.1 , el cual es incapaz de producir una respuesta inflamatoria porque carece de neutrófilos y macrófagos, repara incluso con mayor calidad sin formación de cicatriz.
Una vez que la hemostasia ha logrado su objetivo, se va presentar vasodilatación capilar y fuga de líquido plasmático rico en proteínas (conocido como un exudado) en el sitio de la lesión como resultado de la liberación secundarla local de hlstamlna a partir de los gránulos de los mastocitos, la cual a su vez estimula de forma indirecta la producción de prostaglandinas. Las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos, se activan para expresar moléculas de adhesión celular que promueven la unión de los leucocitos circulantes. El aumento del flujo sanguíneo, la activación del endotelio y la permeabilidad vascular alterada permiten la migración de células inflamatorias al sitio de la herida.
La rápida respuesta inflamatoria comienza con la degranulación de las plaquetas que llegan a este sitio, así como la degranulación Inducida por la lesión de los mastocitos residentes. Mediadores inflamatorios generados durante el proceso de coagulación, tales como fibrinopéptidos liberados del fibrlnógeno y productos de degradación de fibrina, sirven para regular la expresión de importantes moléculas de adhesión Intercelular; por otro lado, sustancias liberadas por los mastocitos, como el TNF- a, la histamina, proteasas, leucotrienos y citosinas representan fuentes de señales quimiotácticas. Las células locales del sistema inmune, incluyendo a los macrófagos residentes, se activan en respuesta al daño, estas células, a su vez comienzan a producir mediadores Importantes de la inflamación; como consecuencia y en respuesta a estas diversas señales, los niveles de sustancias qulm ¡oatrayentes para leucocitos se incrementan considerablemente, lo que provoca un mayor reclutamiento de estas células. Macroscópicamente, la inflamación se manifiesta por eritema, calor, tumor y dolor.
Los pollmorfonucleares son las primeras células en llegar al sitio de la herida. Son atraídos principalmente por TGF-b, PDGF, CXC-8, C5a, los productos de degradación del flbrinógeno, la fibrina, el colágeno y la elastlna. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes y dominantes en etapas tempranas de la cicatrización. Se les considera como fagocitos de vida breve que circulan en la sangre.
Un par de horas después de la lesión, la mayor parte de los neutrófilos transmigran a través de la pared de las células endoteliales de los capilares sanguíneos, proceso que se conoce como extravasación, para llegar al sitio de la herida. Los neutrófilos reclutados comienzan el desbridamiento del tejido desvitallzado y la fagocitosis de agentes infecciosos. Para realizar esta tarea, los fagosomas ¡ntracelulares que contienen a los microorganismos recién capturados, se fusionan con los gránulos, también llamados llsosomas, del neutrófllo. Éstos contienen diferentes sustancias antlmicroblanas tales como enzimas hidrolíticas, oxidasas dependientes de NADPH, péptidos catiónicos, como las a- defenslnas y elcosanoldes, y proteasas como la catepslna G, elastasa y protelnasa 3. Los neutrófilos maduros no pueden reponer el contenido de sus gránulos, de modo que una vez que los usan, mueren por apoptosls y finalmente son fagocltados por los macrófagos.
Anteriormente, se creía que en ausencia de Infección, los neutrófllos no eran necesarios para la reparación de una herida; sin embargo, diferentes estudios han demostrado que los neutrófllos sí tienen una función adicional además de la eliminación de microorganismos.
En un estudio realizado para Investigar el papel de los neutrófllos en la reparación de las heridas, se observó que a pesar de que la reparación dérmica no se vio afectada por la eliminación de neutrófllos al utilizar antisuero de conejo, la reepltellzaclón se aceleró significativamente. Los autores concluyen que los neutrófllos en el sitio de la herida Inhiben directamente la migración de los queratlnocltos y posiblemente su proliferación como consecuencia de la liberación de proteasas, las cuales pueden Inducir un daño en el tejido. Por ejemplo, la elastasa y la protelnasa 3 son capaces de escindir la elastlna y una variedad de proteínas de la MEC, Incluyendo a la flbronectlna.
Por otro lado, recientes estudios in vitro demostraron que los neutrófllos aislados de sitios de reparación pueden modular el fenotipo y el perfil de expresión de atocinas de los macrófagos. Además, un Informe reciente mostró que el cierre de heridas exclslonales realizadas en ratones deficientes en CD18, se retrasó significativamente. Los autores especularon que la falta de neutrófllos apoptótlcos en el sitio de la herida priva a los macrófagos de su estímulo principal para secretar TGF-bϊ , un mediador clave Implicado en la diferenciación de mloflbroblastos.
Los monocltos llegan poco después de los neutrófllos y los reemplazan. Son atraídos por flbronectlna, C3a, C5a, tromblna, TGF-b, PDGF, TGF-a, VEGF y MIP-1a. En los tejidos se transforman en macrófagos, cuya función es fagocltar neutrófllos apoptótlcos, bacterias y otros microorganismos. La fagocitosis de los patógenos es facilitada por receptores de superficie del macrófago que se unen a llgandos específicos de la superficie microbiana. La combinación de opsonlzaclón para el complemento y la fagocitosis (destrucción del patógeno dentro del fagocito por medio de ROS, NO y péptldos antlmlcroblanos), por los macrófagos permite el reconocimiento y la destrucción de los microorganismos. Predominan entre las 48 a 72 horas y pueden permanecer por días a semanas.
Los macrófagos participan en la última parte de la fase Inflamatoria, regulando la llegada de otros monocltos y fibroblastos, y liberando PDGF, FGF, VEGF, TGF-a y b, factores que son importantes para la migración, proliferación celular y formación del tejido de granulación; Iniciando de esta manera la transición a la fase de proliferación y remodelaclón. Además, liberan las atocinas prolnflamatorlas, IL-1 b, IL-6 y TNF-a (ver Tabla 1), por lo tanto, se dice que la producción de citocinas por los macrófagos perpetúa el proceso Inflamatorio.
Las citocinas y factores de crecimiento son péptldos o gllcoproteínas entre 5-30 kD, Importantes para la señalización celular y están Involucrados en diversas respuestas fisiológicas. Se liberan transitoriamente, para modular el proceso de reparación mediante el control del crecimiento celular, la diferenciación, el metabolismo y la síntesis de proteínas. La tabla 1 muestra un resumen de los factores de crecimiento y atocinas que son producidos por diferentes células durante el proceso de reparación de heridas y sus funciones más Importantes.
Un estudio realizado en años anteriores, demostró que los macrófagos tienen un papel Importante en el proceso de reparación de heridas. En él, la reducción de los niveles de macrófagos utilizando antisuero, tuvo como resultado una disminución del Infiltrado de fibroblastos en la herida y una reducción de la fibrosis; así como niveles de fibrina elevados, y un retraso en la eliminación de fibrina, neutrófllos, eritrocitos y otros desechos. Por otro lado, estudios realizados en ratones genéticamente modificados con niveles reducidos de macrófagos, muestran un retraso en el cierre de la herida y en la reepltellzaclón, defectos en la angiogénesls con una reducción de la formación del tejido de granulación, alteraciones en la producción de citosinas y factores de crecimiento., y pérdida de la diferenciación de fibroblastos y de la contracción de la herida.
La segunda fase del proceso de reparación de heridas es la de proliferación. Los principales eventos que se llevan a cabo en esta etapa son la flbroplasla, la reepitelización, la anglogénesis, y la formación del tejido de granulación.
La fibroplasia describe un proceso que Involucra la proliferación de los fibroblastos, su migración en la herida, y la producción de colágena nueva y otras proteínas de matriz que contribuyen a la formación de tejido de granulación [14] Los fibroblastos en los bordes de la herida comienzan a proliferar, lo que provoca un Incremento en la población de estas células, y aproximadamente cuatro días después de la lesión comienzan a migrar.
La migración de fibroblastos es estimulada principalmente por PDGF, TGF-b y la fibronectina; para que se lleve a cabo la migración celular, es necesaria la expresión de integrlnas en la superficie celular que faciliten la interacción entre los fibroblastos y componentes de la MEC, principalmente fibrina, vltronectina, fibronectina y el ácido hialurónico. La fibronectina es una gllcoproteína y el principal componente de la matriz provisional después de la fibrina, que además promueve la actividad de los fibroblastos. La fibronectina permite la unión de los fibroblastos a la matriz extracelular y brinda una base adherente para la migración celular.
Durante la migración también es necesaria la expresión de enzimas que reconozcan y degraden los componentes de la MEC. Estas enzimas, conocidas como Metaloproteasas de Matriz (MMPs: MMP- 1 , -3 y -19), tienen adlclonalmente otras funciones establecidas que incluyen la liberación de factores de crecimiento de la membrana celular o de la MEC, escisión de receptores de factores de crecimiento de la membrana celular, desprendimiento de moléculas de adhesión celular, disminución de la afinidad de las uniones colágena-lntegrina y la activación de otras MMPs.
Una de las funciones de los fibroblastos durante el proceso de reparación de heridas es el recambio de la matriz provisional compuesta principalmente de fibrina por una MEC permanente compuesta de colágena. La producción de colágena empieza aproximadamente 3 días después del daño y es estimulada por un gran número de factores de crecimiento, como PDGF, TGF, y FGF. La función de la colágena durante el proceso de reparación de heridas, es Incrementar la fuerza del tejido y facilitar el movimiento celular. En fases tempranas del proceso de reparación de heridas la proporción de colágena es diferente, donde la cantidad de colágena tipo 3 Incrementa en un 30%.
La anglogénesls es el surgimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes. Este proceso se activa ante una lesión, y suministra nutrientes a la herida, además de contribuir a la formación del tejido de granulación. La anglogénesls se ha atribuido a muchas moléculas, Incluyendo al FGF, VEGF, TGF-b, la anglogenlna, la anglotroplna, la anglopoyectlna-1 , TNF-a, y la trombospondina.
La anglogénesls comienza con la destrucción de la pared de los vasos preexistentes, la activación de la proliferación de células endotellales y su migración de los vasos cercanos al sitio de la herida. De acuerdo con Benavldes, dos días después de que ocurre una lesión, las células endotellales comienzan a migrar a lo largo de la matriz provisional de flbronectlna, de manera similar a los fibroblastos. La migración de las células endotellales es estimulada por VEGF, FGF, anglopoyectlna y TGF-b; y para que ésta ocurra, también es necesario que éstas expresen integrinas y MMPs.
Durante la migración de las células endotellales, se van formando túbulos y eventualmente nuevos capilares. Histológicamente se observa degradación de la membrana basal, proliferación celular, formación de estructuras vasculares, reconstrucción de la membrana basal y finalmente regresión e Involución de la vasculatura.
La reepltellzaclón es el proceso por el cual se restaura la epidermis después de una lesión cutánea. El Inicio de la reepltellzaclón se produce horas después de la lesión. Los cambios morfológicos que se observan durante la reepltellzaclón son el desprendimiento de la escara y el restablecimiento de la epidermis sobre el tejido de granulación en formación. Para la reepltellzaclón es necesario que ocurra la migración, la proliferación y la diferenciación de los queratlnocltos adyacentes, así como la restauración de la membrana basal conectada con la dermis subyacente en reparación.
Los queratlnocltos que participan en el proceso de migración y la proliferación provienen de dos localidades distintas, la primera son células que se encuentran en los bordes de la herida y la segunda, células provenientes de la unidad pllo-sebacéa. Son estimulados para migrar, proliferar y diferenciarse por diversos factores que Incluyen bajos niveles de calcio, altos niveles de magnesio, cambios de pH, e hlpoxla; los factores de crecimiento que favorecen la reepltellzaclón son EGF, FGF y TGF-b.
Los elementos Implicados en la migración de los queratlnocltos son la MEC, receptores de Integrinas, MMPs y factores de crecimiento. Los queratlnocltos usan los receptores de Integrinas de su membrana para ¡nteractuar con la matriz provisional, que al Igual que con los fibroblastos, es necesaria para que migren las células. Durante la migración, ocurre una serle de eventos que Incluyen: la elongación de los queratlnocltos, el desarrollo de proyecciones similares a pseudópodos, y la pérdida de las uniones célula-célula y célula-matriz. Se forma una estructura de queratlnocltos migrantes similar a una lengüeta, donde los queratlnocltos cercanos a ella aumentan su proliferación para asegurar la presencia de células que migren y cubran la herida.
Cuando termina la migración, posiblemente por Inhibición de contacto, los queratlnocltos se unen al substrato subyacente, reconstituyen la membrana basal, y después reanudan el proceso de diferenciación para generar una epidermis estratificada. Se puede observar que hay una monocapa de queratlnocltos hacia el centro de la herida, mientras que hay multlcapas de queratlnocltos cerca de los bordes de la herida, estos queratlnocltos comienzan a proliferar detrás de las células que migran activamente formando una estructura conocida como epitelio hiperproliferativo.
La fase proliferativa termina con la formación del tejido de granulación, cuyos componentes principales son: fibroblastos, colágena y vasos sanguíneos. Aproximadamente cuatro días después de la lesión, la matriz provisional de flbronectlna comienza a ser reemplazada. Este cambio morfológico se atribuye a la Invasión de capilares que sirven de base para la aparición del tejido de granulación. Los nuevos vasos sanguíneos proporcionan un fácil acceso a los macrófagos y fibroblastos, quienes continúan suministrando factores de crecimiento que estimulan aún más la anglogénesls y la flbroplasla.
La remodelación tlsular es la fase final del proceso de reparación de heridas y continúa durante 6-24 meses después de que se presentó la lesión Inicial. Esta última fase se caracteriza por la transición del tejido de granulación a la formación de una cicatriz. Las manifestaciones clínicas Incluyen la contracción, disminución del enrojecimiento y grosor de la herida, y un aumento de la fuerza del tejido. Cerca de dos semanas después de la lesión, la herida empieza a contraerse, lo que resulta en una menor cantidad aparente de tejido cicatrizal.
La contracción de la herida es realizada por fibroblastos activados que adquieren el fenotipo de células contráctiles, también conocidos como mloflbroblastos. Estas células aparecen en el área de la herida a partir del cuarto día después de la lesión.
Los mloflbroblastos son células mesenqulmales con características de fibroblastos y células de músculo liso. El sistema contráctil de los mloflbroblastos está organizado en mlcrofllamentos de actlna que terminan en su superficie, en una asociación transmembranal con las fibras de flbronectlna. Una vez desarrollado este sistema, los mloflbroblastos pueden sostener una fuerza contráctil durante un largo período de tiempo. Este es generado por la tensión ejercida por las fibras en la matriz extracelular circundante, que produce una contracción local. Esta contracción se estabiliza por la deposición de matriz extracelular, principalmente, colágena de los tipos I, III, IV y V, gllcoproteínas y proteogllcanos.
Los mlcrofllamentos de los mloflbroblastos contienen actlna y mloslna, así como proteínas asociadas típicas de las células del músculo liso. En particular, muestran la expresión de a-SMA, la ¡soforma de actlna típica de las células situadas en la pared de los vasos, la cual funciona como biomarcador para fibroblastos activados. La expresión de a-SMA es controlada por el factor de crecimiento transformante bt (TGF-b^.
En un proceso normal de cicatrización de heridas de piel, la actividad contráctil de los mlofibroblastos se termina cuando el tejido está completamente reepitelizado, en donde la expresión de a-SMA disminuye y las células entran en apoptosis; sin embargo, cuando existe una patología, la actividad de los mlofibroblastos persiste a pesar de que el tejido ya está reparado, lo que conduce a su deformación y fibrosis, que es particularmente evidente en cicatrices hipertróficas.
La deposición de colágena por los fibroblastos continúa durante un período prolongado con un aumento neto que es alcanzado tres semanas después de la lesión del tejido. Cuando la herida se cierra, inicia la degradación de colágena tipo III por acción de las MMPs y la síntesis de colágena tipo I aumenta.
Con el tiempo, la proporción de colágena tipo I se Incrementa con respecto a la colágena tipo III, la cual disminuye de forma correspondiente al igual que la proporción de proteoglicanos y agua. También disminuye la cantidad de vasos sanguíneos en la herida y el número de fibroblastos, lo que resulta en una cicatriz menos roja y relativamente acelular. Otra característica asociada con cicatrices maduras es la falta de apéndices epidérmicos, por lo que el tejido resultante carece de folículos pilosos, glándulas sudoríparas y sebáceas.
La cicatriz es el punto final fisiológico e inevitable del proceso de reparación de heridas en mamíferos. A pesar de que la cicatriz ofrece una restauración estable de la piel, la calidad del tejido nuevo es Inferior con respecto a importantes aspectos estructurales, estéticos y funcionales del tejido original.
Existen tres isoformas de TGF-b: TGF-bI , 2, y 3. Los TGF^s activos, ejercen sus funciones biológicas a través de la unión a un complejo de receptor heteromérico, el cual consiste de un receptor de tipo I y un receptor de tipo II. Las tres isoformas de TGF-b presentan funciones que son distintas y necesarias para la reparación de las heridas, pero superpuestas.
En un estudio realizado se evaluó la función de las diferentes isoformas de TGF-b, en heridas incisionales de ratas. Para esto, las heridas fueron tratadas con anticuerpos neutralizantes anti-TGF-bϊ y anti-TGF^2, se observó una reducción significativa en la deposición de la matriz extracelular y una mejora de la arquitectura de la neodermls, lo que sugiere que el TGF-bt y b2 endógenos Inducen la cicatrización cutánea en animales adultos. Por otra parte, el tratamiento del mismo tipo de heridas con TGF^3 exógeno Inhibió la formación de cicatrices con una mejor resolución de la herida, lo que indica que esta isoforma antagonlza el efecto de las otras.
Adicionalmente, se ha encontrado una sobreexpresión de TGF-bt en cicatrices hipertróficas, lo que sugiere una posible participación de este factor en su formación; y una mayor expresión de TGF^3 en heridas fetales, las cuales se sabe desde 1970, reparan por un proceso regenerativo y no con la formación de una cicatriz. Cuando las heridas son muy extensas o se relacionan a una condición patológica tal como la Diabetes mellitus o la insuficiencia venoso, el cierre de estas se torna muy complicado, por lo que se requiere de auxiliares o apósitos para una óptima resolución. La gran mayoría de estos apósitos suelen ser costos y requieren de otros procedimientos para lograr el cierra de estas heridas. Además no hay apósitos para lograr el cierre de estas heridas. Además no hay apósitos que promuevan una resolución de alta calidad que se refleje en una cicatriz prominente y más funcional.
Apósito es un término aplicado a una amplia variedad de materiales utilizados para la reparación de heridas o tejidos lesionados; es un complemento que se emplea en una herida con el fin de promover la cicatrización y prevenir la infección y el daño adicional.
Es importante, que un apósito no sólo realice la función que se indica en sus especificaciones, sino que también lo haga en un balance costo -efectivo. Un apósito o combinación de apósitos ideal, es uno que garantiza la curación óptima por: mantener una humedad y pH adecuados (para prevenir la desecación, permitir la migración celular, la granulación y reepitelización), eliminar el exceso de exudado de la herida (la humedad excesiva y las enzimas autolíticas pueden lesionar/macerar el tejido de reparación y proporcionar un cultivo perfecto para microorganismos), permitir el aislamiento térmico (reducir la pérdida de calor y mantener la temperatura a la que se producen las reacciones tisulares), e intercambio gaseoso (niveles adecuados de 02 y C02 para la cicatrización), ajustable a la superficie de la herida, facilitar, cuando sea necesario el desbridamiento (el desbridamiento facilita la valoración de la herida, disminuye la probabilidad de infección y elimina el tejido necrótico que, de otra forma, retrasaría la formación de los tejidos de granulación y epitelización), minimizar la formación de cicatrices, impermeable a las bacterias extrañas, es decir, antimicrobiano, no tóxico /no alergénico, adhesivo pero no adherente para poder retirarlo sin causar trauma a la herida, es decir, que la separación sea sin dolor, suave al tacto y cómodo. Estos apósitos disminuyen el dolor en el reposo, durante la deambulación y durante los cambios de apósito. Al mismo tiempo, el ambiente húmedo permite una entrega rápida y eficiente de cualquier agente antimicrobiano añadido, evitando así que la herida se infecte. Por lo cual, los apósitos que crean y mantienen un ambiente húmedo son ahora considerados como los que proporcionan las condiciones óptimas para la curación de heridas.
Los hidrogeles están formados por polímeros reticulados tridimensionales hidrófilos y de origen natural o sintético. Se componen de una matriz de polímeros con aproximadamente 96% de contenido de agua (sistema coloidal). Esta clase de biomateriales (hidrogeles) combinan diversas ventajas para la reparación de heridas, tales como: biocompatibilidad, biodegradabilidad, facilidad de aplicación, propiedades mecánicas ajustables, alto contenido de agua, adhesión controlada a tejidos, ambiente húmedo para la cicatrización, barrera a la penetración bacteriana, y una matriz para la administración de fármacos.
Estos hidrogeles pueden donar agua a la zona de la herida y proporcionar un ambiente húmedo, que ayuda en la rápida cicatrización de la herida, asimismo, debido a su alto contenido de agua, porosidad y consistencia blanda, simulan estrechamente el tejido vivo natural, más que cualquier otra clase de blomateriales sintéticos. Adicionalmente se utilizan en la formación de los vehículos de liberación de fármacos, apósitos, lentes de contacto y como electrodos o sensores.
Los hidrogeles tienen la capacidad de absorber una fracción de exudado de la herida, transmiten vapor de humedad y oxígeno, pero su permeabilidad bacteriana y de líquido es dependiente del tipo de apósito secundario utilizado. Los hidrogeles se hinchan o contraen en soluciones acuosas debido a la asociación, disociación y la unión de varios iones a las cadenas de polímero. Estos sistemas pueden hincharse en agua hasta que alcanzan un estado de equilibrio. La absorción de agua por hidrogeles está asociada a la presencia de grupos químicos tales como -OH, -COOH, -CONH2, -CONH-, y -S03H la existencia de zonas capilares y las diferencias en la presión osmótica. Las fuerzas que hacen imposible la disolución de un hidrogel son: la presencia de enlaces covalentes, interacciones hidrofóbicas y electrostáticas.
Estos materiales también pueden exhibir propiedades adhesivas debido a la incorporación de grupos funcionales dentro de sus estructuras, que pueden interactuar y enlazar con los tejidos circundantes (Fig.5); o formar redes ¡nterpenetrantes con los tejidos circundantes para anclar mecánicamente el material en su lugar.
Los hidrogeles son sintetizados por gelificación física o química, o por una combinación de ambos. La gelificación se produce cuando los polímeros solubles en agua se entrecruzan física o químicamente para formar una red tridimensional no soluble, en la cual el agua llena los espacios huecos entre las cadenas del polímero.
La invención, se refiere a un nuevo hidrogel a base de Poloxámero 407-Qultosano mediante el entrecruzamiento por irradiación gamma, que acelera el proceso de reparación de las heridas y como vehículo para la administración de fármacos que mejoran la cicatrización.
Una modalidad favorita de la invención es un hidrogel a base de Poloxámero 407-Qultosano mediante el entrecruzamiento por irradiación gamma, ajustado a un pH neutro que acelera el proceso de reparación de las heridas y como vehículo para la administración de fármacos que mejoran la cicatrización.
La invención se refiere asimismo al proceso de fabricación del hidrogel a base de Poloxámero 407-Qultosano mediante el entrecruzamiento por irradiación gamma.
La invención se refiere también al hidrogel a base de Poloxámero 407-Qultosano mediante el entrecruzamiento por irradiación gamma, para usarse como apósito para la aceleración del proceso de reparación de las heridas. La invención se refiere Igualmente al hidrogel a base de Poloxámero 407-Quitosano mediante el entrecruzamlento por Irradiación gamma, para usarse como vehículo para la administración de fármacos que mejoran la cicatrización.
La Invención se refiere además al hidrogel a base de Poloxámero 407-Quitosano mediante el entrecruzamiento por irradiación gamma, para usarse en la fabricación de un apósito para la aceleración del proceso de reparación de las heridas y como vehículo para la administración de fármacos que mejoran la cicatrización.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son presentados para fines ilustrativos y no para limitar el alcance de la invención.
Se han desarrollado diversas técnicas químicas, físicas y mecánicas para evaluar las propiedades de los hldrogeles. Los distintos compuestos desarrollados se caracterizan mediante nueve técnicas distintas, estas son: pruebas de pH y precipitación, microscopía electrónica de barrido, calorimetría diferencial de barrido, determinación del tiempo y temperatura de gelaclón, viscosidad, prueba de absorción de agua, bloeroslón y pruebas antlmicroblanas y antlmicótlcas. Asimismo se evalúa la actividad biológica de los materiales desarrollados en un modelo de herida exclslonal de espesor total en ratones de la cepa CD1 mediante la medición del porcentaje del cierre de heridas, evaluación de la reparación de las heridas excisionales de espesor total tratadas con los distintos hldrogeles mediante las tinciones histológicas H&E, tricrómica de Masson y Herovicl, análisis del Infiltrado de neutrófllos y macrófagos, observación de la activación de los fibroblastos, y evaluación de la expresión de TGF-p3.
Preparación de las muestras
Hidrogel de poloxámero 407 (23-28%p/v; P-407):
Se prepara una solución a 23-28 % p/v de P-407 en agua ultrapura agitando el polímero durante 5 horas a temperatura de 2-5°C, la solución final se filtra a la misma temperatura y se envasa.
Solución de quitosano (0.5 - 0.90% p/v; CH):
Se prepara una solución de 0.5 - 0.90% p/v en ácido acético 0.3-0.6 % p/v en agua desionlzada, la solución resultante se mantiene bajo agitación a temperatura ambiente durante 24 horas, posteriormente la solución final se filtra y se envasa.
Hidrogel de poloxámero 407+quitosano (mezcla física; CH+P)
Se prepara una solución de 0.5 - 0.90% /25 %p/v de CH y Poloxámero 407 respectivamente, en ácido acético 0.5% p/v en agua desionlzada a 2-5°C, posteriormente se mantiene bajo agitación a la misma temperatura durante 24 horas. Luego la solución se filtra y se envasa. Hidrogel de poloxámero 407- quitosano (mezcla irradiada; CH-P 4)
La solución de poloxámero 407 + qultosano, preparada como se Indicó anteriormente se envasa preferentemente en envases de vidrio y se somete a radiación gamma, a una dosis de absorción de 25KGy, utilizando como fuente 60Co.
Hidrogel de poloxámero 407-quitosano irradiado a pH =7 (mezcla irradiada a pH de 7; CH-P 7)
La solución de poloxámero 407 + quitosano, preparada como se indicó anteriormente se envasa preferentemente en envases de vidrio con características y se somete a radiación gamma, a una dosis de absorción de 25KGy, utilizando como fuente 60Co, posteriormente la solución se ajusta a un pH de 7 mediante la adición de trietanolamina.
Pruebas de pH y precipitación
Se utilizaron 10mL de cada uno de las muestras preparadas: P-407, CH, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7. Las muestras se colocaron en un vaso de precipitados y se mantuvieron en agitación constante; con ayuda de una jeringa de 1 mL, se les fue añadiendo trietanolamina gota por gota, y en todo momento se fue monitoreando el pH con el potenciómetro. La prueba se realizó a una temperatura de 4°C, excepto con la solución de quitosano, esto con la finalidad de tener los compuestos en forma líquida y tratar de ajustarlos a un pH=7. Se analizó de forma macroscópica la aparición de algún precipitado.
Liofilización de las muestras.
Se colocaron 5mL de cada uno de los compuestos (P-407, CH, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7) en viales de vidrio y se congelaron a -20°C durante 3hrs, después se pusieron en un vaso de congelación rápida y se conectaron a la liofilizadora LABCONCO freezone 6, esta se programó para llevar a cabo la liofilización a una temperatura de -50°C y a un vació de 175X10 3mBar. El proceso de liofilización duró 24 horas.
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
La caracterización morfológica de los materiales (P-407, CH, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7), se llevaron a cabo en un microscopio electrónico de barrido, esto con el fin de conocer las estructuras de cada material y realizar un comparativo entre los componentes solos, mezclados, al someterlos a irradiación y al ajustar el pH.
Se utilizó un microscopio Leica Stereoscan 440 (Leica Microsystems), las muestras que se utilizaron para poder ser caracterizadas por esta técnica, fueron las liofilizadas, esto para que tuvieran una consistencia de polvo poroso y obtener imágenes con mayor resolución, también cabe mencionar que no tuvieron recubrimiento de oro. Se observaron en aumentos de 500X y 1000X en alto y bajo vacío.
Calorimetría Diferencial de Barrido Se empleó el método de calorimetría diferencial de barrido para determinar las posibles interacciones químicas en los componentes de los hidrogeles, antes y después del tratamiento de irradiación gamma (P-407, CH, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7). Se utilizó un calorímetro Q100, el cual fue calibrado con una muestra de Indio (3mg) y se realizó una línea base con porta muestras de aluminio no herméticas vacías. Se colocaron 3mg de muestra liofilizada, y se empleó un rango de análisis de 0 a 200°C con un flujo de calentamiento de 10°C/min, usando nitrógeno para purgar la cámara de análisis. El análisis se realizó por triplicado.
Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR)
Se analizó la estructura química de los nuevos polímeros mediante FTIR con un espectrómetro, dentro del rango de 4000-400 cm 1 , con una resolución de 4 cm 1 y un promedio de 32 barridos.
Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
Se realizaron mediciones mediante NMR de protones (1H NMR) con un espectrómetro (campo estático = 9.4 T) en una frecuencia de 100.61 MHz a 25°C. Las muestras fueron disueltas en agua deuterada y los espectros se procesaron mediante el programa TOP Spin software.
Tiempo y temperatura de gelación
La determinación del tiempo y temperatura de la transición sol-gel de cada uno de los hidrogeles (P-407, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7) se llevó a cabo utilizando el método de cizalla oscilatoria en el Viscosímetro Brookfield CAP 200, previamente calibrado con el fluido 30000 para la utilización de la aguja del número 3. Las muestras (100pL de cada hidrogel), se colocaron en el plato del equipo, de forma líquida y se ajustaron las variables.
El tiempo y temperatura de transición sólido-gel, para los experimentos de viscosidad se determinó en la región lineal de las muestras analizadas, región en donde la viscosidad es directamente proporcional a la temperatura. Se utilizó una rampa de temperatura de 7-30°C con una velocidad de cambio de 10-1 1 segundos por cada aumento de unidad de temperatura (por cada grado Celsius), y a una velocidad constante de 50 rpm. Estas determinaciones se realizaron por triplicado y utilizando el software Capcalc V.1.02. Brookfield Engineering Laboratory.
Finalmente, los resultados obtenidos se sometieron a una prueba de Análisis de varianza de un factor en Excel, con el fin de determinar las posibles diferencias significativas de tiempo y temperatura de gelación, entre los hidrogeles analizados (Ver anexo III).
Determinación de los perfiles de viscosidad
Se utilizó un viscosímetro Brookfield CAP 2000, empleando la aguja número 3, a una temperatura constante de 37°C; para el uso de esta aguja, el equipo fue calibrado con el fluido 30000, de viscosidad conocida. El comportamiento mecánico de los fluidos (P-407, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7), en este caso la viscosidad y el tipo de relajación, se obtuvieron por medio de la oposición de los diferentes hidrogeles a la fuerza de corte o cizalla. Para ello, se colocaron 100mI_ de cada uno de los hidrogeles en el plato del vlscosímetro, se configuraron las variables deseadas: rango de velocidad, de 120 a 600rpm y en orden Inverso, en Intervalos de 20rpm, esperando 1 1 segundos entre cada cambio de velocidad y 3 segundos para el registro de la viscosidad.
Esta determinación se realizó utilizando el software Capcalc VJ.02. Brookfield Engineering Laboratory. El análisis se realizó por triplicado.
Prueba de captación de humedad.
Se prepararon distintas soluciones de gllcerol (grado analítico) y se emplearon para proporcionar distintas humedades relativas en las cuales estuvieron en contacto los hidrogeles, como una aproximación del comportamiento de las soluciones de Interés en contacto con una herida.
Tabla 1.
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Se colocaron 5mL de cada uno de los hidrogeles: P-407, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7 en forma líquida, en dispositivos de plástico circulares de peso conocido, de 3.1 cm de diámetro por 1 .4 cm de altura y se dejaron gellflcar por 12 horas a temperatura ambiente (23-25°C). Pasadas las doce horas, se registraron los pesos Iniciales de los hidrogeles en una balanza granatarla (Multl-functlon balance GX serles), se colocaron en una cámara cilindrica de vidrio, con dimensiones de 4.8 cm de diámetro y 5 cm de altura, a cada una de estas cámaras previamente se les colocó 20mL de las distintas soluciones de gllcerol, y se cerraron herméticamente para establecer las distintas humedades relativas. Posteriormente estas cámaras con las soluciones de gllcerol y los dispositivos de plástico se colocaron en un horno a una temperatura de 37 °C por 6 horas (los hidrogeles se encontraban en el dispositivo de plástico, por lo cual los hidrogeles no estaban en contacto directo con las soluciones, si no el dispositivo que los contenía, pero las soluciones de gllcerol generaron la humedad relativa deseada en toda la cámara, y por lo tanto el ambiente dentro de la misma). Transcurrido este periodo, se registraron nuevamente los pesos de los dispositivos con los hidrogeles, y por diferencia de pesos se determinaron los porcentajes de agua absorbidos o eliminados por cada uno de los hidrogeles preparados. Esta prueba se realizó por triplicado. Prueba de bioerosión/hinchamiento
Los perfiles de bioerosión y/o hinchamiento de los hidrogeles (P-407, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7), se determinaron mediante un método gravlmétrlco. Esta prueba se llevó poniendo en contacto un pool de suero sanguíneo de varias personas. Se emplearon tubos de vidrio de 1 .7cm de diámetro y 1 1 5cm de altura previamente pesados. El primer paso fue colocar 1 mL de cada uno de los hidrogeles en diferentes tubos (10 por cada corrida), a 4°C; el siguiente paso fue dejarlos equilibrar a temperatura ambiente (23-25°C) por 12 horas. Después, los tubos con los hidrogeles se pesaron un una balanza granatarla y se les adicionó 1 mL del pool de suero sanguíneo. Luego los tubos se colocan en un baño de agua (marca BS-06) previamente equilibrado a 37°C y con agitación constante de 50rpm. Posteriormente, el sobrenadante fue removido decantando los tubos durante un minuto a las 2, 4, 6, 8, 1 0, 12, 1 5, 18, 21 y 24 horas de haberse puesto en el baño. Finalmente, los tubos se pesaron y por diferencias de pesos se determinó la bioerosión o el hinchamiento de los geles. Esta prueba se hizo por triplicado.
Pruebas antimicrobianas/antimicóticas
Esta prueba se realizó para determinar la capacidad antimlcrobiana y antimlcótica in vitro de los diferentes compuestos desarrollados (CH, P-407, CH+P, CH-P 4 y CH-P 7). La técnica utilizada fue la de difusión por disco.
Para esta prueba de susceptibilidad se utilizó una bacteria gram positiva (S. áureas ATCG29213), dos gram negativas (£. cali ATGC25922 y P. aeruginosa ; aislado clínico) y un hongo ( C . aibícans ; aislado clínico).
La técnica para realizar esta prueba fue la siguiente: discos de papel filtro (de 6mm de diámetro) previamente esterilizados se embebieron con 25pL de cada uno de los compuestos (los compuestos se aplicaron en los discos en forma de sol y posteriormente se dejaron gelificar por 5 minutos), entre ellos un control negativo de agua destilada estéril, después se preparó una suspensión del inoculo mediante el método de la turbidez; para ello, se tomó una porción de bacterias o del hongo de la cepa correspondiente de un cultivo de 24 horas, y se suspendió en un tubo con solución salina hasta llegar a la concentración deseada, la suspensión se estandarizó a 0.5 en escala de McFarland (correspondiente a aproximadamente 1 .5X108 UFC/mL). Después, se sumergió un hisopo de algodón estéril en la suspensión, se removió el exceso de líquido del hisopo presionándolo contra la pared del tubo y se inocularon en las diferentes placas con agar Müeller Hlnton mediante el método de siembra masiva. Luego se procedió a colocar los discos en cada una de las placas, se Identificaron adecuadamente, se colocaron a una distancia razonable y se presionaron para asegurar el contacto completo con la superficie del agar y que no se cayeran durante la incubación, que fue el siguiente paso. La incubación se hizo a una temperatura de 37°C en una incubadora (BINDER) por 24 horas. Para concluir, las placas se examinaron detenidamente, se observaron a contra luz, y en caso de presentarse halos de Inhibición, estos se midieron redondeando al milímetro más cercano con una regla, vernler o un calibrador.
Evaluación in vivo Animales
La evaluación se llevó a cabo en ratones de la cepa CD1 machos (n=27). Los ratones se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio con agua y alimento ad libitum, con ciclos de 12 horas de luz-oscuridad, espacio y ventilación adecuados. El permiso para el uso de animales y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto antes de la experimentación. Todos los animales recibieron atención de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999“Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio”.
Creación de las heridas.
Los ratones se anestesiaron por inyección intraperitoneal (ip), con ketamina/xilacina a una dosis de 100/10 mg/kg para lograr una anestesia profunda. Paso seguido, la piel dorsal de los animales se afeitó con una máquina de corte y se aplicó jabón quirúrgico para retirar los residuos de pelo con una navaja, Inmediatamente, con ayuda de un blopslador/sacabocado de 5mm de diámetro, se realizó una lesión de tipo exclslonal de espesor total en la reglón occipital, a una profundidad considerable, sin llegar a lastimar músculo y a 5.5 cm de distancia desde la nariz del animal. A cada animal se le realizaron dos lesiones de manera horizontal con una separación de 7mm; cada una de las heridas se trató con los distintos compuestos de Interés (100pL aproximadamente), entre ellos hubo un control, al cual se le aplicó solución salina fisiológica. Después de la recuperación de la anestesia, los ratones se alojaron Individualmente en jaulas debidamente marcadas y desinfectadas. Asimismo se administró como analgésico clorhidrato de tramadol por vía oral en una dosis de 4mg/kg en el agua, por tres días.
Aplicación del tratamiento
Se aplicaron 100pL del tratamiento (solución de qultosano, P-407, CH+P407, CH-P 4 y CH-P 7) diariamente hasta por un tiempo de 1 1 días. Los ratones se dividieron en tres grupos de evaluación, cada uno con 9 animales, a los cuales se les dio punto final (cámara de C02) de 3 en 3, a los 3, 7 y 1 1 días. Para la posterior toma de muestra de la herida correspondiente a la evaluación histológica y caracterización biológica.
Tabla2.
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Criterios de inclusión.
Se seleccionaron ratones machos de la cepa CD1 de 2.5 meses de edad y de 35-40g de peso.
Criterios de eliminación. Aquellos animales que no presentaron una lesión de tipo exclslonal de espesor total, o que la excisión haya sido muy profunda o con complicaciones, que hayan desarrollado Infección en la zona de lesión o algún otro proceso Inflamatorio no relacionado con la misma.
Criterios de exclusión
Ratones que presentaron algún tipo de lesión en la piel y/o síntomas de Infección.
Tamaño de la muestra.
Se manejó un total de 27 animales. Se evaluaron tres tiempos posteriores a la lesión en el día 3,7 y 1 1 , cada grupo por triplicado.
Descripción de las variables de estudio.
Variable Independiente: Lesión exclslonal de espesor total
Variable dependiente: Porcentaje de cierre de la herida.
Documentación de las heridas y su porcentaje de cierre.
La observación de la evolución de las heridas se realizó diariamente y se documentó de una manera cualitativa mediante fotografías; para poder llevar a cabo un análisis cuantitativo, se marcó diariamente con un plumón de punto fino, el perímetro de las heridas en un dispositivo de plástico, para posteriormente con ayuda de un software determinar el área.
Para poder llevar a cabo estos análisis fue necesario anestesiar temporalmente (por 3 minutos) a los ratones con ¡sofluorano vía nasal.
Medición de las áreas de las heridas.
El área de las heridas se midió en el equipo fotodocumentador GelDoc XR Blorad, mediante el software Quantlty One.
Los resultados obtenidos de las áreas, se trataron para obtener el porcentaje de cierre de las heridas utilizando la fórmula reportada: 100
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Dónde: A0=área al día 0; A,=área al día del tratamiento
Posteriormente los datos se sometieron a un análisis estadístico con el programa GraphPadPrlsm 6 mediante una prueba no paramétrica (KW, a=0.05), con el fin de ver si hay diferencias significativas en cuanto al cierre de la herida entre los distintos tratamientos aplicados.
Registro del peso de los animales. Una variable importante es el peso de los animales, puesto que este es un indicativo de la salud y estabilidad de los mismos, un cambio drástico en el peso de los animales puede indicar que éstos están en malas condiciones o que presentan una complicación, por lo tanto se llevó a cabo el registro del peso diariamente con la ayuda de una balanza granatarla e igualmente los animales estaban anestesiados temporalmente con ¡sofluorano.
Técnicas histológicas
Fijación, inclusión y corte de los tejidos
Para poder examinar de forma precisa la piel es importante preservar, en la medida de lo posible, el estado original del tejido. Esto se logra mediante una técnica conocida como fijación, que es un proceso que permite mantener la integridad de las proteínas y otras estructuras presentes en las muestras, Inhibiendo el proceso de degradación Innato mediante crlopreservación o tratamiento con fijadores químicos, y embebiendo las muestras en bloques de parafina que proporcionen un soporte para realizar el corte de los tejidos.
A los días 3, 7 y 1 1 de tratamiento se dio punto final a 3 ratones para obtener los tejidos de las zonas lesionadas, los cuales se fijaron en SafeFlx® por 24 horas y se cortaron de forma transversal a la mitad de la herida. Después se procedió a deshidratarlos utilizando soluciones acuosas graduales de etanol (50, 80, 96 y 100%) durante 30 minutos cada uno y agitación constante. La deshldratación es simplemente la eliminación de agua en el tejido posterior a la fijación y es necesario realizarla para preparar al tejido que se introducirá en medios no acuosos como la parafina. Para ello, se utilizan alcoholes, ya que son mlscibles con los fijadores acuosos y además el alcohol puede penetrar en el tejido rápidamente y sustituir al agua. Dado que la mayoría de los alcoholes no son mlscibles con la parafina es necesario añadir un paso conocido como aclaramlento, en donde se utilizan agentes que son solubles en alcohol, para removerlos de forma efectiva, y en parafina. Por esta razón, los tejidos se colocaron en una mezcla de etanol-Citrlsolv® (disolvente a base de llmoneno sustituto de xlleno para uso en histología) 50:50 por 15 minutos, y por último, en Citrlsolv® a 60SC por 10 minutos.
Los tejidos deshidratados se embebieron en parafina (Paraplast®) a 60SC, y una hora después la parafina se sustituyó por una nueva, se sacaron del horno y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Finalmente, se realizó la Inclusión de los tejidos en hlstosettes correctamente identificados.
Los tejidos ya Incluidos en los bloques se dejaron enfriar. En seguida, se realizaron cortes entre 4-5 pm en el micrótomo Leica RM2125RT y se montaron en portaobjetos para el posterior análisis histológico.
Tinción de H&E para el análisis histomorfológico de las heridas
La tinción es una técnica utilizada en microscopía con el objetivo de mejorar el contraste en la imagen observada a través del microscopio mediante el uso de colorantes específicos para identificar diferentes estructuras celulares tales como DNA, proteínas, lípidos y carbohidratos.
La tinción de H&E se realizó de la siguiente manera: primero los portaobjetos con los tejidos se introdujeron en un coplin a 60SC durante media hora e inmediatamente se desparafinaron utilizando xileno a 60SC por 1 0 minutos. Después se rehidrataron utilizando soluciones graduales de etanol (100, 96, 80 y 50%) y por último, agua destilada (El¡x5). Los tejidos se colocaron en Hematoxilina de Harrls al 30% durante 6 minutos y en seguida se les agregaron gotas de carbonato de litio saturado para virar el color a morado. Se realizó un lavado utilizando agua destilada y posteriormente se colocaron en Eosina ácida por 25 minutos. A continuación, los tejidos se deshidrataron utilizando soluciones de etanol al 50, 70, 96, 100% y xlleno, para finalmente hacer el montaje utilizando Entellan® (medio de montaje permanente libre de agua para microscopía).
La hematoxilina tiene un color azul-púrpura y tiñe los ácidos nucleicos mediante una reacción compleja. Se cree que este colorante, o más correctamente, la forma oxidada (reacción con óxido de mercurio), hemateína, se une con un mordiente (catión metálico que confiere una carga positiva neta al complejo colorante-mordiente, típicamente Al3+) para teñir al DNA mediante la coordinación con los grupos fosfato cargados negativamente. La tinción de los núcleos es en principio de color rojo, pero se convierte en el conocido azul-púrpura cuando los tejidos se lavan con una solución alcalina como carbonato de litio saturado. Por su parte, la eosina es rosa y tiñe proteínas de forma no específicamente al unirse a los grupos cargados positivamente en las proteínas, tales como grupos amlno de los residuos de Usina. En un tejido típico, los núcleos se tiñen azul, mientras que el citoplasma y la matriz extracelular tienen diversos grados de tinción de color rosa.
Los tejidos se observaron al microscopio y se sacaron fotografías con los objetivos 1 x, 5x y 20x. Esta técnica permite evaluar el progreso de cada etapa del proceso de reparación de las heridas mediante el análisis del infiltrado celular, la reepitelización y la formación del tejido de granulación.
Tinción Tricrómica de Masson para observar la matriz de colágena
Esta tinción, al ser un método tricrómico, tiene la ventaja de permitir la demostración diferencial del tejido conectivo. En general, en estas técnicas los colorantes y los reactivos se aplican en forma secuencial y resaltan principalmente las estructuras tisulares teñidas por los colorantes: el núcleo, el citoplasma y las fibras de matriz extracelular, permitiendo la tinción selectiva de músculo, fibras de colágena, fibrina, y los eritrocitos.
El procedimiento realizado fue el siguiente: Los cortes de los tejidos se calentaron a 60SC por 30 minutos y se desparafinaron con xlleno dos veces durante 5 y 2 minutos. Inmediatamente los tejidos se rehldrataron utilizando soluciones graduales de etanol y por último, agua destilada. Posteriormente se dejaron en el Fijador de Bouin a temperatura ambiente por 24 horas. Los tejidos se tiñeron colocándolos en los siguientes colorantes en el orden Indicado a diferentes tiempos y realizando lavados de agua destilada (El¡x5) entre cada uno de ellos: hematoxilina de Hierro de Weigert (10 minutos), fucsina ácida (15 minutos), ácido Fosfotúngstico/Fosfomolíbdico (10 minutos) y azul de anilina (8 minutos), y después se lavaron con ácido acético al 1 % por 4 minutos. Finalmente se realizó la deshldratación de los mismos utilizando soluciones de etanol y xlleno, y el montaje con Entellan®. El fijador de Bouin es un mordiente que intensifica la aceptación de los colorantes posteriores. La hematoxilina de hierro de Weigert (cloruro férrico como agente oxidante/mordiente) se utiliza para teñir los núcleos de la célula de color azul-negro. La fucsina áclda tiñe todos los componentes acldófllos de color rojo, Incluyendo la colágena. La regla general en una tinción tricrómica es que una molécula pequeña de colorante puede penetrar y teñir cualquier tejido, pero cada vez que una molécula de colorante más grande puede penetrar en el mismo elemento, la molécula más pequeña será reemplazado por el de mayor tamaño. Cuando los tejidos se exponen al ácido fosfotúngstlco/fosfomolíbdlco, el color rojo se difunde desde las fibras de colágena y posteriormente se sustituye por el color azul. Las fibras de colágena forman una red menos densa y que es aparentemente muy porosa, por esta razón, las moléculas de colorante grandes del azul de anilina penetran únicamente en las fibras de colágena, dejando a la fibrina, al músculo y a los eritrocitos sin teñir de azul.
Las fibras de colágena teñidas de azul de la matriz en reparación de los tejidos, así como la fibrina teñida de rojo, se observaron en el microscopio de campo claro y se sacaron fotografías a 1 x, 5x y 20x. Esto permite evaluar la evolución de la matriz extracelular a lo largo del tiempo, de una matriz provisional de fibrina a una matriz de colágena permanente, y comparar entre los tratamientos aplicados.
Tinción de Herovici para distinguir el tipo de colágena de la matriz.
Para esta tinción se calentaron las laminillas a 60SC por 30 minutos y se desparaflnaron con xlleno durante 10 minutos a 60SC. En seguida, los tejidos se rehldrataron utilizando soluciones graduales de etanol por 5 minutos cada una y, por último, agua destilada. Posteriormente se tiñeron colocándolos en los siguientes colorantes en el orden Indicado a diferentes tiempos y realizando lavados de agua destilada (Ellx5) entre cada uno de ellos: Azul Celestino (3 minutos), hematoxilina de Ragoud (5 minutos), y amarillo de metanllo (45 minutos). El siguiente paso fue realizar lavados con ácido acético al 0.5% y se colocaron en carbonato de litio saturado por 5 minutos. Inmediatamente los tejidos se tiñeron con la solución plcropollcrómlca durante 4 minutos y se lavaron con ácido acético al 1 %. Para terminar, se realizó la deshldrataclón de los mismos utilizando soluciones de etanol y xlleno, y se montaron con Entellan®.
La combinación en la tinción de Herovici del azul de metilo o azul de anilina y la fucsina áclda en una proporción apropiada permite diferenciar el tipo de colágena presente, en donde la colágena madura densa se tiñe de color rojo, mientras que la colágena recién formada es azul.
Para esta tinción plcropollcrómlca, se aplican varios colorantes: azul de Celestino, amarillo de metanllo, y la solución plcropollcrómlca (fucsina áclda y azul de metilo). Al combinar el azul de Celestino con la hematoxilina de alumbre (utiliza como mordiente aluminio) y el sulfato férrico de amonio se obtiene una tinción nuclear ácido resistente, gracias a que el azul Celestino es resistente a los efectos del ácido, y la sal férrica en la solución fortalece la unión entre el núcleo y la hematoxilina para proporcionar una tinción nuclear fuerte. La tinción del tejido conjuntivo se realiza a través del amarillo de metanilo y, dado que es un colorante ácido en combinación con el ácido acético diluido, permite la fijación del colorante a las proteínas presentes en el tejido por el pH ácido. Esto además incrementa la afinidad del colorante adherido al tejido por los grupos amino del colorante. En este sentido, el citoplasma se tiñe de color amarillo verdoso, mientras que la queratlna; el músculo y los glóbulos rojos se tiñen de color amarillo brillante.
La colágena se tiñe fuertemente con colorantes ácidos, debido a la afinidad que tienen los grupos catiónlcos de la proteína por los grupos anlónlcos reactivos de los colorantes ácidos. La colágena es selectiva a soluciones de colorantes ácidos de gran tamaño molecular; por ejemplo, la fucsina ácida y el azul de metilo, que tienden a unirse por medio de atracciones electrostáticas o por fuerzas de Van der Waals. El azul de metilo tiñe la colágena tipo III (fibras proteicas delgadas recién sintetizadas), así como otros tipos de colágena, glucoproteínas, proteoglicanos y la reticulina; mientras que la colágena tipo I o colágena «madura», una de las proteínas más abundantes en la matriz extracelular, se tiñe de color rojo por la fucsina ácida y da como resultado una combinación del azul de metilo, ácido pícrlco y fucsina ácida que proporcionan el color de acuerdo con la densidad de la colágena presente.
La matriz de fibrina se observó de color café rojizo, las fibras de colágena ligeramente empaquetas se tiñeron de azul claro (colágena tipo III), mientras que las fibras de colágena empaquetas de rosa magenta (colágena tipo I). Utilizando los objetivos 1 x y 5x se obtuvieron fotografías de cada herida y se realizó el análisis de las mismas sabiendo que con el tiempo la proporción de colágena empaquetada se Incrementa con respecto a la colágena laxa.
Inmunofluorescencia para analizar el infiltrado de neutrófilos
La Inmunofluorescencia es una técnica que permite analizar la presencia de proteínas en tejidos mediante la interacción específica entre la proteína en estudio y su anticuerpo correspondiente.
Se utilizaron anticuerpos dirigidos contra la elastasa de neutrófilos para evaluar el infiltrado inflamatorio en las heridas. Esta proteasa se almacena en los gránulos azurófilos en su forma activa hasta que los gránulos se fusionan con el fagolisosoma o liberan su contenido al medio extracelular por exocitosis en respuesta a estímulos específicos. Contribuye principalmente a la eliminación ¡ntracelular y extracelular de microorganismos al degradar factores de virulencia.
La técnica para realizar esta Inmunofluorescencia fue la siguiente: Inlcialmente, los tejidos se desparafinaron con xlleno 10 minutos, y después se rehldrataron con soluciones graduales de etanol durante 5 minutos cada uno (100, 96, 80, 70, 50%) y agua Mllll-Q®. Posteriormente se hizo el bloqueo con albúmina al 1 % en PBS durante dos horas a temperatura ambiente, porque a pesar de que los anticuerpos muestran afinidad preferencial para epítopos específicos, éstos pueden unirse parcial o débilmente a sitios no específicos en las proteínas (también llamados sitios reactivos) que son similares a los sitios de unión del antígeno blanco. En este contexto, uniones no específicas pueden enmascarar la detección del antígeno en estudio.
Después se colocó el anticuerpo primario Anti-Elastasa (ab21595) a una concentración 1 :200 en albúmina al 1 %, y se dejó durante 24 horas a 4°C en una cámara húmeda. Se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Tritón® 0.3% y se procedió a colocar el anticuerpo secundario TexasRed (TI-1000) a una concentración 1 :1000 en albúmina al 1 %, el cual se dejó incubar por 2 horas a 37°C. Finalmente se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Tritón® 0.3% y se montaron utilizando Vectashield® con DAPI (ver anexo V). Este medio de montaje es acuoso, está hecho a base de glicerina y no solidifica sino que permanece como un líquido viscoso en la laminilla. Los portaobjetos se sellaron de forma permanente aplicando esmalte de uñas en todo el perímetro del cubreobjetos. Las laminillas montadas se almacenaron a 4 SC hasta su observación en el microscopio.
Se tomaron fotografías de las zonas de las heridas que recibieron los diferentes tratamientos con los objetivos 10x y 20x utilizando el filtro de rodamina (ver anexo V) para observar la marca, las cuales se procesaron utilizando el programa Fiji Is just ImageJ para cuantificar las células marcadas.
Inmunofluorescencia para analizar el infiltrado de macrófagos
Primeramente, los tejidos se desparafinaron en xileno 10 minutos y a continuación se hidrataron con soluciones de etanol graduales y agua Milli-Q® durante 5 minutos cada uno. Utilizando una solución de albúmina al 1 % en PBS se hizo el bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. El siguiente paso fue colocar el anticuerpo primario Anti-F4/80 (ab6640) a una concentración 1 :100 en albúmina al 1 %, y se dejó durante 24 horas a 4°C en una cámara húmeda. Se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Tritón® 0.3% e inmediatamente se colocó el anticuerpo secundario FITC (sc-201 1 , ver anexo V) a una concentración 1 :10 en albúmina al 1 %. El anticuerpo secundario se dejó incubar por 2 horas a 37°C y posteriormente se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS- Tritón® 0.3%. Por último, los tejidos se montaron empleando Vectashield® con DAPI.
El anticuerpo primario obtenido de rata, reconoce el antígeno de ratón F4/80, una glicoproteína de 160kD que se localiza en macrófagos murinos. La molécula F4/80 (EMR1 ) se expresa en el desarrollo y durante toda la vida adulta, constitutivamente y durante procesos inflamatorios, infecciosos, inmunológicos y enfermedades, en una gran variedad de poblaciones de macrófagos, incluyendo a las células de Kupffer, macrófagos residentes de médula ósea, macrófagos timocorticoidales, macrófagos de la pulpa roja del bazo, macrófagos de los nodulos linfoides medulares y células microgliales. Niveles bajos de F4/80 se han encontrado en monocitos en edad adulta; mientras que los macrófagos de la zona marginal y macrófagos metalofílicos de la zona marginal del bazo parecen ser F4/80 negativos. Por otro lado, Las células de Langerhans, las cuales son células dendrítlcas Inmaduras presentes en la epidermis, y algunas células dendrítlcas mleloldes CD8 negativas son F4/80 positivas. El marcador es altamente expresado en la membrana plasmática y potenclalmente revela Interacciones con las células vecinas en los tejidos. Los tejido se observaron al microscopio con el objetivo de 20x utilizando el filtro para FITC, y se tomaron fotografías de las zonas que presentaron marca, las cuales se procesaron utilizando el programa Fiji Is just ImageJ para cuantificar las células positivas.
Inmunofluorescencia para analizar la expresión de a-SMA por fibroblastos activados
Los tejidos se desparafinaron (Xileno) e hidrataron (soluciones acuosas de etanol graduales y agua Milli- Q®) para posteriormente realizar el bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente (solución de albúmina al 1 % en PBS- Tritón® 0.3%). Inmediatamente se colocó el anticuerpo primarlo Anti-aSMA (ab7817) a una concentración 1 :20 con albúmina al 1 % en PBS-Trltón® 0.3%, y se dejó durante 24 horas a 4°C en una cámara húmeda. Después se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Trltón® 0.3% y se aplicó el anticuerpo secundarlo Alexa Fluor® 488 a una concentración 1 :1000 en albúmina al 1 % en PBS-Trltón® 0.3%. El anticuerpo secundarlo se dejó incubar por 2 horas a 37°C y en seguida se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Trltón® 0.3%, para finalmente realizar el montaje de los tejidos utilizando Vectashleld® con DAPI.
Se utilizó un anticuerpo de ratón dirigido a a-SMA porque se sabe que los mlcrofilamentos de los fibroblastos activados muestran la expresión de esta molécula, que es la isoforma de actina típica de las células situadas en la pared de los vasos. Para evaluar su expresión por los fibroblastos especializados, se tomaron fotografías de las zonas que presentaban la marca fluorescente por medio del filtro FITC con el objetivo de 10x y 20x. Las imágenes se analizaron cualitativamente y mediante el programa Fiji Is just ImageJ para cuantificar el área marcada para a-SMA.
Inmunofluorescencia para analizar la expresión de TGF-p3
La expresión de TGF-p3 se observó por medio de un anticuerpo de conejo policlonal dirigido contra TGF- b3, y esta Inmunofluorescencia se realizó para evaluar la resolución de la cicatriz, ya que como se describió previamente, esta isoforma Inhibe la formación de cicatrices con una mejor resolución de las heridas.
El procedimiento seguido fue: primero, los tejidos se desparafinaron 10 minutos en xileno, y a continuación, se realizó la hidrataclón de los mismos utilizando soluciones graduales de etanol y agua Mllll-Q®. Después se realizó el bloqueo con albúmina al 1 % en PBS durante dos horas a temperatura ambiente, para posteriormente colocar el anticuerpo primarlo Anti-TGFp3 (ab15537) a una concentración 1 :50 en albúmina al 1 %, el cual se dejó durante 24 horas a 4°C en una cámara húmeda. Se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Trltón® 0.3% y se procedió a colocar el anticuerpo secundarlo TexasRed (TI-1000) a una concentración 1 :1000 en albúmina al 1 %, el cual se dejó por 2 horas a 37°C. Finalmente se realizaron 3 lavados de 5 minutos con una disolución de PBS-Trltón 0.3% y se montaron los tejidos aplicando Vectashleld® con DAPI. Se tomaron fotografías de las zonas de las heridas que mostraban fluorescencia con el filtro de rodamlna utilizando los objetivos 1 0x y 20x, y se procesaron utilizando el programa Fiji Is just ImageJ para cuantlflcar la expresión de TGF-p3.
RESULTADOS.
Descripción de las muestras
Todas las muestras (soluciones e hldrogeles tanto la mezcla como los Irradiados) se lograron obtener satisfactoriamente. La siguiente tabla muestra la descripción física de las mismas.
Tabla3.
Figure imgf000039_0001
Durante la preparación de las muestras, se observó que los polímeros (P-407 y CH) se ¡ncorporan/dlspersan lentamente en el agua/solución acuosa ácido acético, por lo cual su preparación es un tanto tardada, asimismo, la filtración de las soluciones de CH requieren de un tiempo prolongado, debido a su viscosidad.
Las muestras resultantes, fueron transparente, a excepción del CH-P 7, que es ligeramente traslúcido. Se observó que el P-407 no confiere ninguna coloración a las muestras desarrolladas, no así el qultosano, el cual confiere una coloración amarillo pálido; sin embargo, el proceso de Irradiación Intensifica ese color amarillo como consecuencia principalmente de la oxidación , y creación de dobles enlaces (secuencias pollénlcas) formados a través de las reacciones de especies activas tales como radicales libres. En el caso del hidrogel CH-P 7, la trletanolamlna le confiere opacidad. Los aromas característicos se deben al ácido acético utilizado, sin embargo, en el CH-P 7 la trletanolamlna neutraliza casi totalmente este aroma. Los hidrogeles obtenidos (P-407, CH+P, CH-P 4 y CH-P 7), a temperatura de refrigeración (4°C), se encuentran en forma de sistema coloidal donde la fase continua es líquida y la dispersa es sólida, comportándose como un líquido viscoso móvil que se transforma en un gel transparente seml-sólido al aumentar la temperatura. Es decir, estos hldrogeles al tener una concentración de P-407 mayor a 20%p/v, presentan el fenómeno de termorreversibilidad inversa, en el cual al ir aumentando la temperatura, se origina la formación de mlcelas como resultado de la deshldratación del bloque de PPO, hasta un punto definido, en donde, las micelas entran en contacto y pierden movilidad.
Los resultados muestran que los hidrogeles sometidos a Irradiación lograron conservar esta propiedad, lo cual es muy útil para su utilización en heridas, puesto que esta característica permite realizar la gellflcaclón in situ, es decir, se pueden aplicar en el área de la herida de forma líquida para alcanzar una mejor penetración en los tejidos, y posteriormente estos compuestos se ¡rían gellflcando, de forma tal que a la temperatura corporal (37°C) se encontrarían en forma de hidrogel, característica que les confiere el uso de depósitos para liberación prolongada.
Pruebas de pH y precipitación
Con el objetivo de llevar los materiales a un pH neutro para poder evitar o disminuir daños en los tejidos debido a un pH ácido, llevar a cabo una colocación sin dolor en el sitio de la herida, y poder utilizarlos como vehículos de fármacos y proteínas que solo son estables a un pH neutro, se realizó un ajuste de pH a 7 y se observó el comportamiento y apariencia de cada uno de estos.
El pH de los compuestos fue ácido, con valores de 4, 4.68 y 4.66 para CH, CH+P y CH-P, respectivamente, a excepción del hidrogel de P-407, el cual se encontraba a un valor cercano al neutro (6.33). Al añadir la thetanolamina gota a gota para tratar de ajustar los materiales a un pH de 7, en algunos compuestos, los resultados no fueron favorables, puesto que estos no son estables a un pH neutro y muestran un fenómeno de precipitación (Fig. 2); la solución de CH comenzó a formar precipitados puntuales desde un pH=5.63 y la mezcla física (no Irradiada) a un pH=6.50, solo que en este último caso, el precipitado observado fue masivo. No obstante, al hidrogel de P-407 sí fue posible llevarlo a un pH de 7 sin observar la presencia de algún precipitado. De la misma manera, el hidrogel Irradiado también se llevó a un pH neutro sin ninguna complicación.
El fenómeno de precipitación mostrado en las mezclas con CH, refleja que este polímero no es soluble a un pH mayor de 6 (pKa=6.5), esto ocurre debido a que el compuesto es una base débil y posee grupos amino primarios. A pH bajo, los grupos amino se protonan conviniendo el qultosano en un polielectrolito catlónico soluble en agua, por otro lado, cuando el polímero pierde su carga precipita, esto ocurre a un pH de 6 y 6.5. Al agregar la thetanolamina ocurre una Interacción entre este compuesto y el ácido acético, ya que al mezclarlos, estos forman una sal soluble en agua llamada: “acetato de thetanolamina”, esto provoca un aumento del pH de la solución y consecuentemente la precipitación del polímero(al aumentar el pH con la thetanolamina, disminuye la concentración de [H ] disponibles, por lo cual, los grupos amino del qultosano pasan de su forma protonada y soluble (NH3 +) a su forma ¡nsoluble (NH2) provocando la precipitación). En la mezcla física, la precipitación se debe, posiblemente, además de lo mencionado, a la competencia que se presenta entre las cadenas de POE del P-407 por las moléculas de agua, lo cual acrecienta el fenómeno de precipitación del CH.
Por su parte, la mezcla Irradiada, al ajustarla a pH=7, no formó precipitados. La radiación produce iones libres y radicales, los cuales son responsables de iniciar reacciones químicas que llevan a modificaciones moleculares como reticulación (formación de la estructura de red), degradación (escisión de la cadena y reducción de peso molecular), Injerto (polimerización de un monómero e injerto en la cadena del polímero base), curado (polimerización simultánea y reticulación) y evolución de gas [127] Todas las modificaciones mencionadas, en menor o mayor proporción, se presentan en el hidrogel al ser Irradiado. Por lo tanto, una degradación del CH llevaría a la formación de ollgómeros (monómeros de glucosamlna), los cuales son solubles en agua, asimismo, estos podrían producir redes e Injertos con las cadenas del P-407, y al agregar trletanolamlna (que también es soluble), no se llevaría a cabo un fenómeno de precipitación, permitiendo ajustar el pH.
Microscopía electrónica de barrido
Con el motivo de analizar el posible cambio en la morfología debido a la Irradiación gamma, se registraron las siguientes mlcrografías obtenidas con el microscopio electrónico de barrido para las muestras de CH, P-407, CH+P, CH-P 4 y CH-P 7.
Las Imágenes obtenidas en esta prueba, revelaron distintos tipos de estructuras, primeramente, la solución de qultosano muestra una estructura laminar (Flg. 4 y 5), mientras que el hidrogel de P-407 presenta una agrupación amorfa, (Flg. 6 y 7), la constitución de la mezcla, a pesar de que únicamente están unidas de una manera física su morfología es distinta a la observada para cada uno de los compuestos por separado. (Flg. 8 y 9).
Por otra parte, los hldrogeles Irradiados muestran arreglos amorfos (sin ninguna geometría específica) (Flg. 10-13), pero que si difieren de los arreglos mostrados por la mezcla física y por cada uno de los compuestos por separado, por lo cual se puede rectificar que si hay un cambio en estos materiales debido a la Irradiación, sin embargo, muestran una gran similitud con la morfología revelada por el poloxámero solo, lo cual era de esperarse puesto que es el material que se encuentra en una mayor proporción.
Mlcroestructuras tales como el tamaño, la forma y distribución de las partículas tienen Influencia en el proceso de cicatrización de heridas, puesto que esto Impacta en las características de hlnchamlento del hidrogel, el Intercambio de gases (altos niveles de C02 aumentan la acidez y bajas concentraciones de 02, disminuyen la regeneración de las células y ayuda a la proliferación de bacterias anaerobias), penetración de bacterias, adhesión, capacidad hemostática, y liberación de fármacos en caso de contener alguno. Calorimetría diferencial de barrido
Las posibles modificaciones de la Interacción entre los materiales, por efecto de la Irradiación se pueden conocer mediante esta prueba. Los resultados obtenidos mediante esta técnica para observar la estabilidad térmica de nuestras muestras, se exponen en los termogramas (Flg. 14 y 15).
En estos gráficos, se observa que todas las muestras tienen picos endotérmicos, por lo cual al suministrarles energía en forma de calor los materiales la absorben, y esto, se ve reflejado en los valores de las entalpias (tabla 13). Como una medida de la cantidad de energía que un sistema absorbe o emite. En una reacción endotérmica, el cambio de entalpia es positivo para el sistema, porque este gana energía en forma de calor.
Asimismo, esta prueba permite obtener los valores del punto de fusión (cambio de estado de agregación sólido a líquido) de las muestras, proceso que también es endotérmico, los cuales se muestran en la siguiente tabla.
Tabla4.
Figure imgf000042_0001
El punto de fusión es una propiedad intensiva y es característica de cada elemento o compuesto, por lo cual se utiliza como una herramienta para la caracterización. Se puede observar que la Tf fue mayor para el CH y el P-407, mientras que la mezcla física y los compuestos irradiados muestran valores ligeramente por debajo de la Tf del P-407. En las muestras, el punto de fusión de los hldrogeles varia muy poco; sin embargo, esa variación es suficiente para saber que estos experimentaron cambios al mezclar los polímeros, al aplicar la Irradiación y al agregar la trletanolamlna, y que ninguno de estos es Igual.
Estos dos parámetros obtenidos mediante DSC, Indican que la Irradiación sí tiene Influencia y cambia el número de Interacciones químicas de los materiales de cada una de las muestras. Debido a la dosis de Irradiación a la cual se sometieron los materiales (25KGy), se puede decir que ocurrió un entrecruzamlento. Además, los resultados sugieren que se llevó a cabo una probable esclclón de las cadenas pollmérlcas, al ser sometidas a la Irradiación. Posiblemente, lo que ocurre en estos materiales al momento de la Irradiación, es que en un primer plano ocurra la esclclón de las cadenas y seguidamente se estén entrecruzando, lo cual explicaría la disminución de su Tf, tal como se observó en los resultados.
Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR)
Del análisis realizado, el espectro de poloxámero 407 exhibe una banda de absorción en 2880 cm 1 , que se atribuye a un tipo de enlace C-H, mientras que la banda de Interacción C-0 se observa a 1090 cm 1. Del análisis realizado del espectro de qultosano se observan bandas de absorción características de grupos funcionales que aparecen en 1532 cm 1 (correspondiente a -NH2) y 1372 cm 1 , relacionado a la vibración de C-H. Otra banda amplia detectada desde 3600 hasta 2800 corresponde a las vibraciones de los enlaces amina N-H e hidroxilo O-H. La banda cercana a 1 150 cm 1 corresponde a la estructura sacarida de quitosano, mientras que la banda de 1040 cm 1 es atribuida a la vibración de C- O (Fig. 16).
El espectro de la mezcla CH+P coincide en alta proporción con el de P407, lo que significa que no hay ninguna interacción con esta combinación y que corresponde a P407, debido a que es el mayor componente en la mezcla. El resultado más notable se observa en el espectro de las muestras sometidas a irradiación gamma. En ambas muestras (CH-P 4 y CH-P 7) los espectros se ajustan al de P407, aunque cuando se normalizan las intensidades se observa un incremento en la intensidad de la banda correspondiente a C-H. Incluso, las razones de intensidad (medidas con el programa OMNIC) de las bandas 2880 y 1090 cm 1 son 1 .13, 1 .19 y 1 .20 para CH+P, CH-P 4, y CH-P 7, respectivamente. Considerando que P407 es un copolímero en tribloque de poli(oxido de etileno)/poli(oxido de propileno)/poli(oxido de etileno) (PEO/PPO/PEO) se observa un entrecruzamiento entre los dos polímeros con una presencia mayor en cadenas que (PEO/PPO/PEO).
Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
Los espectros de 1H NMR son útiles para evidenciar las diferencias químicas de las muestras CH-P; y estos son complementarios y coinciden con los resultados observados con la metodología de FTIR. En el espectro de la muestra P407 se observan dos señales, un pico resuelto en 3.67 ppm y otro pico amplio en 3.61 ppm. Ambas señales se asignaron a los grupos CH2 relacionados a las unidades PEO y PPO, respectivamente. Por tanto, el cociente de las intensidades de estas dos señales de NMR es proporcional a la razón de las unidades de PEO/PPO. De tal manera que es evidente que en la muestra de CH+P, la razón de unidades PEO/PPO es similar a la de P407. El espectro de las muestras sometidas a irradiación gamma muestra una evolución en la misma razón de picos. La intensidad de los grupos asociados a las unidades de PPO incrementa con la irradiación, lo que se evidencia en el espectro de la muestra CH-P 7. Este resultado coincide con lo registrado por FTIR. Por lo que con las dos técnicas se observa un entrecruzamiento de CH2 con P407. Los resultados de NMR indican también un entrecruzamiento de las unidades de CH2-CH2-0 y las unidades de glucosamina (Fig. 16).
Temperatura y tiempo de gelificación
Con objetivo de determinar el tiempo y temperatura de la transición sol-gel de cada uno de los hidrogeles, se llevó a cabo el método de cizalla oscilatoria.
En la tabla 5 se muestran los valores de la temperatura y del tiempo a los cuales se lleva a cabo la transición sol-gel de cada una de las muestras, es decir, a los cuales las soluciones se van volviendo más viscosas y semisólidas hasta formar el hidrogel, el cual estaría conformado por una fase sólida en forma de red constituida por las cadenas del/los polímeros y que Inmoviliza a una fase líquida, ya sea el agua o la solución de ácido acético. Tabla5.
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Los resultados obtenidos expresan que los hldrogeles se constituyen a una temperatura mucho menor a la corporal y en un Intervalo de tiempo corto, tomando en cuenta su aplicación farmacéutica. Los valores de formación de los hldrogeles no rebasan los 14°C, ni los 2 minutos de tiempo (Fig. 17), por lo cual la formación de los geles no es complicada y es muy rápida.
Se puede observar que los parámetros de temperatura y tiempo de gelaclón, están estrechamente relacionados y son directamente proporcionales; puesto que cuando se requiere de una mayor temperatura para llevar a cabo el proceso de gelaclón; también se requiere de un mayor tiempo, y viceversa. La gráfica anterior, muestra que los resultados obtenidos no difieren tanto entre sí, sin embargo, todos son distintos, dejando en evidencia que la Irradiación sí genera cambios, puesto que en esta prueba el hidrogel Irradiado (CH-P 4) obtenido necesitó 4°C y 53 segundos más para llevar a cabo la gelificación, a comparación de la mezcla que solo es física. Lo anterior sugiere que debido a los cambios estructurales que ocurrieron al Irradiar el compuesto, la Tgel aumenta, es decir, la Irradiación hizo que se formara una estructura más estable, que aumenta la gelaclón del compuesto a una temperatura más alta.
Tabla6.
Figure imgf000044_0002
En la tabla 6 se observan los resultados de la comparación estadística, entre la mayoría de los compuestos existe una diferencia significativa para la temperatura y el tiempo de gelaclón, sin embargo, se observa que entre las muestras“P-407 y CH-P 7”, no existe diferencia significativa, y en efecto, los valores resultantes para el tiempo y la Tgel, entre estos compuestos, son muy cercanos, es decir, la mezcla Irradiada al ajustarle el pH, necesita una menor temperatura y un menor lapso de tiempo para llevar a cabo el fenómeno de gelaclón; esto puede deberse al efecto de la trletanolamlna, ya que debido a su estructura de alcohol, los átomos de oxígeno de sus grupos“OH”, pueden participar en la formación de enlaces de hidrógeno con el agua, disminuyendo así la Interacción entre esta y el polímero, dando como resultado, la formación de mlcelas de P-407 y estructuras en forma de red, por lo que la TEA, puede actuar como agente de reticulación. Del mismo modo, si se lleva a cabo la formación de la sal “acetato de trietanolamina”, parte del agua se requiere para la solvatación de sus iones, lo cual puede llevar a una reducción en la actividad de agua con el POE del P-407, y un aumento en la concentración efectiva del polímero (mlcelar).
Pruebas de viscosidad
El comportamiento mecánico de cada uno de los hldrogeles elaborados, fue determinado mediante un vlscosímetro con el fin de observar la deformación y reestructuración de cada uno de ellos y ver si la radiación genera cambios.
En las figuras 18, 19, 20 y 21 , se presentan los gráficos obtenidos al realizar el análisis reológlco; en ellos, se observa el perfil de viscosidad en orden normal y en orden Inverso de cada uno de los hldrogeles desarrollados (prueba realizada a una temperatura constante de 37°C).
Las propiedades mecánicas son de primordial Importancia para determinar el rendimiento de los materiales previstos para someterse a diferentes tipos de estrés en el curso de las aplicaciones blomédlcas, en este caso como apósito para heridas. En las gráficas se observa que para las muestras del P-407 y CH+P, al aplicarles un esfuerzo cortante, la viscosidad va disminuyendo y acto seguido vuelve a aumentar al cesar dicha fuerza debido a la reconstrucción de sus estructuras, sin embargo, no recupera su estructura Inicial de Inmediato, esto solo puede lograrse tras un tiempo de reposo debido al retraso que se produce para adaptarse al cambio. Este fenómeno que se presenta se llama tlxotropía, por lo cual las muestras son clasificadas como fluidos tlxotróplcos.
En el CH-P 4, la tlxotropía se pierde, esto debido a la Irradiación, que hace que los materiales sean más estables por el grado de entrecruzamlento llevado a cabo y que hace que se forme una red. En el caso del CH-P 7, el fenómeno de la tlxotropía también se pierde, ya que al cesar la fuerza de clzallamlento o esfuerzo cortante, el material recupera su viscosidad y por ende, su estructura Inicial, esto es debido a la reticulación dada por la irradiación e influenciada por la trietanolamina.
Prueba de captación de humedad.
Un hidrogel ideal para el cierre de heridas tiene que absorber exudados de la herida al mismo tiempo que evita la deshldrataclón de la misma, y la mantiene húmeda para una curación más rápida, por este motivo se llevó a cabo la prueba de absorción de agua/captación de humedad. Esta prueba se realizó con el propósito de ver cómo se comportan los hldrogeles elaborados en diferentes atmósferas con humedades relativas distintas puesto que el contenido de agua en equilibrio y su capacidad de absorción en los apósitos son Importantes para la absorción rápida de los exudados y la hldrataclón en la herida.
Los resultados arrojados (Fig. 22), muestran que los hldrogeles no absorben, si no que liberan agua al ambiente en diferentes proporciones dependiendo de la humedad relativa del medio, se observa que el patrón de liberación de agua es inversamente proporcional a la humedad relativa; esto es, los hidrogeles llevan a cabo un equilibrio de acuerdo con la humedad de la atmósfera en que se encuentren, puesto que liberan una mayor cantidad de agua (-1 0%) en atmósferas con humedades relativas bajas (20%HR) y esta va disminuyendo (hasta -3%) conforme aumenta la humedad relativa (90%HR).
Con la prueba de humedad relativa se evaluó el comportamiento de los hidrogeles ante diferentes ambientes húmedos que simulan distintas cantidades de exudado, es decir, una HR de 20% representaría una herida con poca cantidad de exudado, mientras que una herida con exudado abundante, se simbolizaría con una HR de 90%. Esto significa, que los hidrogeles liberarían más agua en heridas con poco exudado y poca en heridas con un exudado cuantioso.
Lo anterior, es adecuado, debido a que los hidrogeles siempre mantendrán una atmósfera húmeda adecuada para la cicatrización de las heridas, y evitarán la desecación de las mismas, sin embargo, también es deseable que absorban cierto grado de exudado.
Bioerosión/Hinchamiento
Sabiendo que los hidrogeles pueden absorber y retener grandes cantidades de agua en función de su reticulación, densidad de carga de su red y concentración de sus polímeros entrecruzados, se llevó a cabo esta prueba, en donde se determinó la tasa de bioerosión y/o hinchamiento de los hidrogeles a 37°C por diferentes tiempos utilizando suero sanguíneo humano, que a diferencia de otros medios, contiene proteínas y enzimas (Tabla 7), y simula el exudado (líquido evacuado de las heridas abiertas y que proviene del suero alrededor del tejido inflamado y dañado) que se presenta en una herida, el cual algunas veces llega a producirse en exceso, y es Importante que sea absorbido por los hidrogeles para prevenir la infección y la humedad excesiva en las heridas, lo que perjudicaría su clerre/clcatrizaclón.
Tabla7.
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Como se ve en la tabla 7, el suero sanguíneo tiene diferentes componentes, entre ellos azúcar, proteínas, enzimas, y más. Los hldrogeles pueden descomponerse en presencia de enzimas que reconocen grupos funcionales específicos sobre la cadena principal de hidrogel y la degradan o simplemente se descomponen a través de la hidrólisis, ya sea en condiciones de pH ácldas o básicas. Los ensayos ¡n vltro de bloeroslón pueden simular el comportamiento in vivo de los hldrogeles al aplicarlos en una herida. Estudios de bloeroslón de los hldrogeles también son Importantes para garantizar que los materiales se degradan en componentes seguros, que pueden ser Identificados y analizados para evaluar su toxicidad en células huésped .
De los resultados obtenidos (Flg. 23), se observa que el hidrogel de P-407 presentó un perfil de bioerosión, y los hldrogeles irradiados a ambos pH’s, mostraron un perfil de hinchamiento; pero el hidrogel de P-407 mezclado con CH, mostró un perfil con ambos comportamientos, ya que en las primeras horas (2, 4, 6, 8 y 10), se hinchó, y posteriormente se erosionó.
La porosidad de los hldrogeles es un factor Importante en sus características de hinchamiento, puesto que entre más poroso sea un material retiene una mayor cantidad significativa de agua dentro de su estructura, es decir, se hincha más, y viceversa, a una porosidad menor, el hidrogel tiene una menor capacidad de hinchamiento, no obstante, para conocer la porosidad de los materiales estudiados, se necesitaría realizar una prueba fisicoquímica adicional.
El P-407, no mostró hinchamiento, sino bioerosión, esto puede deberse a que al ser soluble en agua gracias a las dos cadenas hidrofilicas de POE, estas se disuelven al estar en contacto con el suero sanguíneo, sin embargo, la disolución es mínima, puesto que no rebasa el 10% de bioerosión.
En cuanto al CH+P se refiere, este hidrogel, presenta cierta capacidad de hinchamiento en la etapa temprana debido a la difusión de fluidos dentro del hidrogel , asimismo, el quitosano, presenta grupos funcionales como el NH3 +, que pueden interaccionar con el agua ayudando genrando este efecto. Una vez alcanzado el máximo grado de hinchamiento, el hidrogel comenzó a bioerosionarse gradualmente, lo cual puede deberse a la degradación del quitosano y a la disolución del poloxámero.
Contrariamente al hidrogel del P-407 y la mezcla física CH+P, los hldrogeles irradiados mostraron únicamente un perfil de hinchamiento, lo cual nos inidica que la irradiación modifica el efecto del suero sanguíneo sobre el hidrogel. Esto puede deberse al entrecruzamiento desarrollado entre las cadenas poliméricas del P-407 y el CH al someterlos a la Irradiación, lo que hizo que se constituyeran estructuras más estables que en el hidrogel formado solo por el P-407 o en la mezcla de ambos polímeros sin Irradiarse, lo que conlleva a una mayor estabilidad de los materiales.
Todo esto Indica nuevamente que la radiación presenta efectos positivos en los hldrogeles ayudando a estos a presentar un perfil de hinchamiento (lo cual se traduce en absorción de exudado en las heridas) y volviéndolos más resistentes al estar en contacto con los diversos componentes del suero sanguíneo. Lo que sugiere que los hldrogeles CH-P 4 y CH-P 7 podrían tener potencial para prevenir a la herida de la acumulación de líquido por la adsorción de exudado.
Las pruebas fisicoquímicas realizadas de pH y precipitación, tiempo y temperatura de gelaclón, y bloeroslón e hlnchamlento muestran que el hldrogel CH-P 7 desarrollado, puede ser utilizado como vehículo ya que al presentar un pH neutro evita la desnaturalización de principios activos (principalmente moléculas biológicas) provocada por ambientes ácidos o básicos, adlclonalmente, gracias a su termorreverslbllldad Inversa podría mantenerse en refrigeración hasta el momento de su utilización haciendo que se conserven mejor las proteínas/moléculas y a la temperatura fisiológica mostrar gelificación, y finalmente, la irradiación hace posible que el hidrogel se hinche ayudando a controlar la liberación de los principios activos.
Pruebas antimicrobianas/antimicóticas.
La actividad antibacteriana/antimicótica es una propiedad adicional que se busca en un apósito ideal. Se ha reportado que el CH presenta esta propiedad, la cual se conserva al aplicar irradiación Gamma; sin embargo, se sabe que el peso molecular y el DD del CH, y el pH del medio pueden mejorar o eliminar esta propiedad; por esta razón, se realizaron pruebas antimicrobianas y antimicóticas para evaluar si las muestras en estudio tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos. Los resultados obtenidos en esta prueba se muestran en la tabla 1 7 y en las figuras 24 a 27.
Tabla 8.
Figure imgf000048_0001
Los datos revelan que el P-407 no presenta ningún tipo de actividad antlmlcroblana, mientras que el CH, CH+P y CH-P 4 muestran una gran capacidad antlbacterlana puesto que en estos compuestos se observó Inhibición del crecimiento de las tres bacterias estudiadas; presentando cada una de ellas halos de Inhibición de entre 8 a 1 1 mm de diámetro. De la misma manera, estas muestras tienen una capacidad antlmlcótlca, ya que lograron evitar el crecimiento de C. alblcans con halos de Inhibición desde 9 a 1 1 mm de diámetro. Por último, el CH-P 7 muestra actividad antibacterlana al Inhibir el crecimiento de las tres bacterias con halos de Inhibición de 10 y 1 1 mm de diámetro. Sin embargo, no presenta actividad antlmicótlca, puesto que C. alblcans, mostró un desarrollo total en la zona del agar donde se encontraba este compuesto, sin revelar ningún tipo de sensibilidad ante los discos impregnados con esta muestra.
Como se esperaba, el CH mostró actividad tanto antlbacteriana, como antlmicótlca, lo cual concuerda con los estudios reportados en la literatura, en donde a este compuesto se le atribuye una capacidad antibacterlana relacionada a: su peso molecular, a menor peso molecular mayor actividad antibacterlana, (el CH puede entrar en las células bacterianas y alterar su metabolismo), su grado de desacetilación (cuanto mayor grado de desacetilación, mayor actividad antibacterlana), su naturaleza policatiónlca que permite la interacción con la superficie de las células bacterianas (la interacción entre los grupos catiónlcos del quitosano y los grupos anlónlcos en la superficie de las células bacterianas alteran la permeabilidad de la membrana produciendo un desequilibrio osmótico e Inhibiendo el transporte de nutrientes esenciales, asimismo la interacción de estos grupos cargados positivamente con el ADN y ARN de hongos y bacterias Inhibe la síntesis de proteínas) y la propiedad quelante del quitosano (formación de complejos entre el quitosano y iones metálicos necesarios por las enzimas bacterianas, principalmente a un pH elevado). Con base a los resultados obtenidos, se puede decir que el CH utilizado para la preparación de las muestras, el cual presenta un DD de 75% y bajo peso molecular, tiene la capacidad de Inhibir el crecimiento de mlcroorganlmos comunes presentes en las heridas.
Asimismo, el CH+P, presenta una actividad antibacteriana y antifúngica de manera similar a la solución de quitosano; lo cual sugiere que en este hidrogel, el potencial antlbacteriano y antlfúngico, es debido al CH, el cual se encuentra a la misma concentración en ambas muestras; aunque no se descarta la posibilidad de que el P-407 presente en la mezcla tenga la capacidad de aumentar ligeramente esta propiedad antibacterlana, dado que este polímero, al ser un surfactante no iónico, podría interaccionar con la membrana bacteriana y alterar su permeabilidad; sin embargo, no se puede llegar a una conclusión definitiva, puesto que el P-407 por sí solo no tiene la capacidad de Inhibir el crecimiento bacteriano.
En el caso del CH-P 4, la actividad antlbacteriana y antifúngica permaneció presente, y en algunos casos es mayor (al mostrar halos de Inhibición de un tamaño ligeramente mayor que el CH). Estos resultados no sólo demuestran que la irradiación Gamma no altera la capacidad del CH de Inhibir el crecimiento microbiano, sino que además la aumenta, esto puede deberse a la acción de la irradiación aplicada, la cual puede provocar una degradación (escisión) de las cadenas pollméricas, disminuyendo el peso molecular, y conllevando a una mayor facilidad de penetración de los componentes en la superficie celular, Impidiendo el paso de nutrientes y con esto provocar su destrucción; aunque en este caso tampoco se descarta la posibilidad de que el P-407 presente en el hidrogel sea el que provoca este efecto. Finalmente, en el CFI-P 7 la capacidad antlbacteriana no se ve alterada a pesar de la modificación del pH, situación que es contraria a lo esperado, ya que se sabe el CFI pierde su actividad antimlcrobiana a un pH neutro por la desprotonación de los grupos amina y la baja solubilidad en agua. Esta situación se puede explicar porque, como ya se mencionó, la aplicación de la irradiación gamma permite neutralizar el pH sin que exista una precipitación del CFI y a que uno de los efectos de la irradiación es la degradación (escisión, ver la prueba de DSC) de las cadenas polimérlcas que provoca una disminución de su tamaño y consecuentemente permite un fácil acceso de los componentes al interior de la célula, en donde al no estar protonados los grupos amina del CH, tienen la capacidad de formar complejos con los iones metálicos necesarios para las enzimas bacterianas, alterando su metabolismo. Por otro lado, la actividad antimlcótica desapareció, dejando en evidencia que el hongo es resistente a un pH neutro, por lo que puede crecer sin complicaciones. Esto puede deberse a que la actividad antimlcótica del CFI es debido a su carácter policatiónico, que resulta en una fuerte unión del polímero a la superficie negativa de las células, la cual se pierde al modificar el pH a 7.
Lo anterior sugiere que, estos materiales cumplen con un requisito más de los establecidos para ser un apósito ideal y/o vehículo para la liberación controlada de fármacos, ya que; al ser aplicados en las heridas, prevendrían su Infección, y ayudarían a un mejor cierre de las mismas.
Evaluación in vivo
Porcentaje de cierre de las heridas
Esta prueba se llevó a cabo para poder determinar macroscópicamente los efectos de la aplicación tópica de cada una de la muestras en el cierre de heridas excisionales a diferentes tiempos.
En la figura 28 se muestran fotografías representativas de las heridas excisionales de espesor total (realizadas en el dorso del ratón) al inicio (0 días), a los 3 días (fase inflamatoria), a los 7 (fase proliferativa) y a los 1 1 días (Inicio de la fase de remodelación), observando su resolución con el respectivo tratamiento que les fue aplicado.
La cicatrización de heridas es un proceso dinámico que consiste en una serle compleja de eventos que comienzan en el momento de la lesión. La reparación de las heridas implica principalmente tres etapas de cicatrización, es decir, la fase inflamatoria, la fase proliferativa y la fase de remodelación. Las fotografías anteriores muestran que la cicatrización, evidenciada por el área y contracción de la herida, aumenta de una manera dependiente del tiempo y del tratamiento en todos los grupos.
Como se presenta en la tabla 9 y en la figura 29, la cinética del cierre de las heridas se obtuvo a partir de las mediciones y cálculos para determinar el área de la herida en diferentes días, y se expresaron como porcentaje de cierre/contracción de la herida. Al aplicar la prueba KW; estadísticamente no se encuentran diferencias significativas en el cierre de la herida al comparar entre todos los grupos. Solo existen diferencias significativas en el porcentaje de cierre entre los diferentes días de estudio, es decir, entre 0-1 1 días. Tabla 9.
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Descripción clínica de las heridas
Día 0
Las heridas fueron creadas y en su mayoría presentaron sangrado. Al día 0, clínicamente, se observa una herida totalmente abierta excisional de espesor total, en la que puede visualizarse el músculo sin daño aparente cubierto por tejido conjuntivo; las heridas en todos los grupos tienen un área Inicial de aproximadamente 19.635mm2 (F 5 cm).
En las heridas que fueron tratadas con los hldrogeles, estos pueden proporcionaron una matriz que absorba la sangre gracias a su capacidad de hlnchamlento, y además pueden donar agua a la herida al reducir la pérdida de líquidos y mantener la humedad.
Día 3 (Fase inflamatoria)
Al tercer día posterior a la lesión, las heridas mostraron una reducción del área lesionada, así como una contracción en aumento, y ya se presentaban costras en el lecho de la herida. En ningún caso se observó evidencia de Infección en ningún grupo.
A este día, el menor porcentaje de cierre fue presentado por los ratones tratados con CH+P (17.524 %) y el mayor, fue el del grupo tratado con CH-P 7 (46.451 %). Esta diferencia puede deberse a los efectos de la Irradiación en el hldrogel (esto con base a que el segundo grupo con el mayor porcentaje de cierre fue el tratado con CH-P 4).
Día 7 (Fase de proliferación)
En este día, se observa una mayor contracción de las heridas, en todos los casos, ya se rebasa el 50% del porcentaje de cierre; todas las heridas muestran costra, la cual en la mayoría de los casos presenta una coloración café obscuro.
Al día 7, el menor porcentaje de cierre fue presentado por los ratones tratados con CH (53.194 %), situación que sugiere un retraso en la cicatrización en comparación con los otros grupos en estudio. El resto de los tratamientos muestra un cierre similar de las heridas, aunque el porcentaje es ligeramente mayor, para el grupo CH+P (76.800%), por lo cual se puede deducir que su mejor actividad cicatrizante lo muestra entre los 3 y 7 días. El tratamiento con CH+P, aunque disminuyó la velocidad de cierre de la herida durante los primeros días, durante la fase Inflamatoria, se observó un Incremento en la tasa del cierre de la herida a los 7 días posteriores a la lesión, durante la fase de proliferación. Lo que sugiere que estos hldrogeles Influyen de manera distinta durante el curso de la cicatrización. Día 11 (Fase de remodelación)
La piel se compone de dos capas principales: la epidermis y la dermis. Una característica esencial de una herida cicatrizada es la restauración de una barrera epidérmica reflejada por la reepltellzaclón de la herida.
Al día 1 1 , las heridas ya muestran una gran evolución, a este tiempo, todavía se observa una costra, no obstante, esta ya es de menor tamaño y delgada, el porcentaje de cierre mostrado a este día, ya es de más del 90% en todos los grupos, lo que nos Indica que ya hay una reepltellzaclón, sin embargo, esta no se ha completado totalmente, por lo que se concluye que para poder estudiar de forma más extensa esta última fase, es necesario dejar evolucionar por más tiempo las heridas, hasta observar macroscópicamente una reepltellzaclón completa, con un porcentaje de cierre total y sin costra. No hubo evidencia macroscópica de Infección, hemorragia, cicatrices queloldes o hipertróficas en todos los animales durante el experimento.
A este día, las áreas de heridas fueron muy similares en todos los grupos, ya que solo hubo una mínima diferencia en cuanto a los porcentajes de cierre mostrados, el menor porcentaje de cierre fue presentado por los ratones tratados con CH+P (91 .273 %) y el mayor, fue el del grupo CH-P 7 (93.799 %). Las fotografías de la figura 28, muestran que las costras son sumamente pequeñas, y entre ellas, la que se observa con un mejor aspecto y a simple vista más pequeña, es la de CH-P 7. No obstante, la Información de la calidad del cierre de las heridas con respecto a cada uno de los tratamientos aplicados se observa en la sección de las tinciones histológicas y pruebas de Inmunofluorescencla.
Los hldrogeles Irradiados aceleraron el cierre de las heridas en los primeros días, principalmente el CH-P 7 ya que fue el que mostró el mayor porcentaje de cierre, siendo el pionero hasta los 6 días, puesto que a los 7 días el porcentaje de cierre se ¡guala con los demás tratamientos, a excepción del CH, el cual muestra un porcentaje de cierre aceptable hasta el día 5, en donde comienza a mantenerse e Incluso retrasar el cierre de las heridas a los 7 días, aunque las fotos clínicas no reflejan esto.
Peso de los animales.
El peso es un parámetro que Indica la estabilidad de los animales; si estos bajan de peso, sería un Indicativo de una alimentación Inadecuada, presencia de algunos malestares o algún tipo de depresión, todo lo opuesto a que si el peso se conserva o aumenta, lo que querría decir que los animales están en un buen estado y siguen con su desarrollo normal.
La figura 30, muestra el comportamiento del peso de los ratones utilizados, desde los 0, hasta los 1 1 días de tratamiento.
Como se observa, el peso en los primeros días disminuye ligeramente, lo que quiere decir que los ratones presentan algunos malestares debidos al dolor ocasionado por las heridas, no obstante, el peso fue Incrementándose alrededor del tercer día, lo cual se puede apreciar en la gráfica como un ligero pico; posteriormente, a los siguientes días, el peso vuelve a ser el mismo que el inicial e incluso aumenta, en algunos casos, el peso disminuye ciertos días, pero al día 1 1 , ningún peso está por debajo del Inicial, esto quiere decir, que los ratones permanecieron en condiciones óptimas y no presentaron ningún tipo de complicación.
Tinciones histológicas
Se realizó el análisis histológico de las heridas, que, a diferencia de la descripción macroscópica, permite estudiar a nivel celular la recuperación del tejido, con el fin de evaluar el progreso de cada etapa del proceso de reparación de las heridas: al día 3, la fase inflamatoria, al día 7, la fase de proliferación y al día 1 1 , el inicio de la fase de remodelación. Esto mediante la tinción de H&E para observar el infiltrado celular, la reepltellzaclón y la formación del tejido de granulación; la tinción tricrómica de Masson para evaluar la evolución y organización de la matriz extracelular a lo largo del tiempo en donde las fibras de colágena se observan en azul; y la tinción de Herovicl, para determinar la madurez de las fibras de colágena, ligeramente empaquetas de color azul claro (colágena tipo III), y empaquetas de rosa magenta (colágena tipo I).
Se describe brevemente lo observado en los segmentos histológicos de las zonas de la lesión de cada tratamiento a los 3, 7 y 1 1 días post-leslón.
Día 3 (Fig. 31 , 34, 37)
SS: Mediante la tinción de H&E se observó que en todos los casos persistió la escara y la herida no reepltellzó (3 ratones de 3, 3/3). El infiltrado celular se presentó de manera abundante y resultó positivo para la inmunofluorescencla Antl-elastasa (Fig. 40), la cual confirma la presencia de neutrófllos que forman parte del Infiltrado inflamatorio. Se observó con la tinción de Masson una gran cantidad de tejido en reparación caracterizado por una matriz extracelular compacta en la superficie, probablemente correspondiente a la matriz provisional de fibrina, mientras que en la reglón subyacente, se observó la presencia de una matriz laxa cuyas fibras se organizan paralelamente entre ellas con reglones organizadas en redes en la parte más profunda del tejido (Fig. 34). Ocasionalmente (2/3) se presentaron de manera dispersa, fibras de colágena empaquetada evidenciadas por las tinciones de Masson y Herovicl (Fig. 37). Se observó una ligera extensión de la epidermis sana hacia la reglón de la herida Indicando el Inicio de la migración epitelial (2/3).
P-407: La tinción de H&E (Fig. 31 ) muestra que la escara es persistente al Igual que el Infiltrado Inflamatorio evidenciado por la inmunofluorescencla Antl-elastasa (Fig. 40). Solo en un caso se observó una reepltellzaclón completa (1/4). En 2/3 de las heridas que no han reepltellzado se presentó una ligera extensión epitelial hacia la herida correspondiente a la migración de este tejido a partir de un evidente epitelio hiperprollferatlvo. La matriz extracelular del tejido en reparación es poco abundante. En la superficie de la herida se presentan reglones de matriz extracelular compacta correspondiente a la matriz de fibrina que aparentemente está siendo sustituida por nueva matriz correspondiente al tejido de granulación que, aunque menos densa que la matriz de fibrina, aún se observa compacta sin presencia de fibras de colágena mediante las tinciones de Masson (Fig. 34) y Herovicl (Fig. 37). CH: Se presenta escara y no hay reepitelización, aunque hay indicios del inicio de la migración epitelial a partir de un epitelio hiperproliferativo (2/3), evidenciado por la tinción de H&E (Fig. 31 ). Se observó la presencia de un infiltrado inflamatorio abundante confirmado por la ¡nmunofluorescencia Anti- elastasa (Fig. 40). La cantidad de la matriz depositada en las heridas tratadas con este hidrogel es muy parecida a la observada mediante las tinciones de Masson y Herovici en las heridas control, sin embargo, la matriz de fibrina comprendió un área mayor, abarcando casi todo el tejido en reparación con áreas laterales que se encuentran sustituyendo al coágulo de fibrina por tejido de granulación y sin presentar depósito de colágena (Fig. 34 y 37).
CH+P: Se presentaron características muy similares a las heridas tratadas con CH sólo que aquí no se observó un recambio de la matriz de fibrina sino una persistencia (tinción de Masson, Fig. 34). Mediante la tinción de H&E (Fig. 31 ), se observa la presencia de escara con nula reepitelización y un infiltrado inflamatorio abundante evidenciado por la ¡nmunofluorescencia Anti-elastasa (Fig. 40). Las tinciones de Masson y Herovici mostraron que la zona de reparación presentó una matriz muy compacta correspondiente a la matriz de fibrina que abarcó la mayor parte del tejido de reparación, sin presencia evidente de una matriz laxa (Fig. 34 y 37). Aunque se evidencio la presencia de un epitelio hiperproliferativo en 2/3 con una incipiente migración epitelial. Estos resultados indican un retraso en la formación del tejido de granulación.
CH-P 4: La escara persistió en todos los casos debido a una falta de reepiteelización evidente. El infiltrado inflamatorio es medianamente abundante, esto observado mediante la tinción H&E (Fig. 31 ) y la ¡nmunofluorescencia Anti-elastasa (Fig. 40). Mayoritahamente la matriz provisional es escasa en comparación de los otros tratamientos. La matriz superficial es muy delgada caracterizada por presentar tejido compacto propia de una matriz compuesta principalmente de fibrina. Subyacente a esta, hay una matriz con apariencia laxa con un patrón caracterizado por una organización fibrilar paralela, en la cual se observa un incipiente depósito de colágena predominantemente poco empaquetada que fue identificada por las tinciones de Masson (Fig. 34) y Herovici (Fig. 37). Esto indica una ligera aceleración en la formación de la dermis en reparación Únicamente en un caso de tres se observó epitelio hiperproliferativo con una migración epitelial incipiente.
CH-P 7: La escara persistió en tres ratones de cuatro, pero en dos ratones se observa una integración de la misma al tejido en reparación; mientras que en las otras heridas ésta es delgada. No se observa reepitelización en ningún caso y sólo se observa epitelio hiperproliferativo y migración incipiente en un caso. El infiltrado inflamatorio es medianamente abundante (tinción de H&E, Fig. 31 y la ¡nmunofluorescencia Anti-elastasa, Fig. 40). Las tinciones de Masson (Fig. 34) y Herovici (Fig. 37) mostraron, en general, que la matriz provisional es escasa pero con mayor proporción que en las heridas tratadas con el gel irradiado a pH=4. En los casos en donde no se observa la escara integrada al tejido, se presenta una matriz superficial compacta de fibrina; mientras que en los otros casos hay presencia evidente de fibras empaquetadas correspondientes a colágena tipo I, embebidas en una matriz superficial medianamente compacta. Por otro lado, en uno de los casos en el que se observa escara y matriz de fibrina, la matriz profunda es laxa con una organización paralela de las fibras. Al Igual que el grupo tratado con CH-P 4, hay una aparente aceleración en la síntesis de colágena.
Al día tres, en todos los casos, las heridas presentan escara y no presentan reepltellzaclón completa, esto corresponde con lo observado en los porcentajes de cierre, en donde el cierre máximo a este día fue menor al 50.0%; únicamente un ratón de cuatro de los que fueron tratados con P-407 presentó reepltellzaclón completa; sin embargo, no hay evidencia suficiente para establecer que esto se deba al tratamiento dado que se requiere de un mayor número de repeticiones. Por otro lado, la escara de las heridas tratadas con CH-P 7 presenta diferencias con respecto a las otras heridas, en las cuales dos ratones (2/4) muestran una escara con una Integración al tejido en reparación, mientras que en el resto de los ratones la escara es delgada, esto es ventajoso con respecto a los otros tratamientos dado que se ha observado en otros estudios que una escara reducida acelera el proceso de cicatrización al permitir una reepltellzaclón más rápida, además, la Integración de la escara al tejido, puede deberse a las propiedades adhesivas del hidrogel, ya que se sabe que el CH tiene esta característica, aunque en los otros tratamientos en donde está presente el compuesto esto no ocurrió, por lo tanto, es posible que el pH sea un factor que está modificando los grupos funcionales en la estructura del polímero que pueden interactuar con los tejidos.
Como ya se mencionó, no se observa reepltellzaclón total de las heridas, pero sí el Inicio de la migración epitelial a partir de un epitelio hiperproliferativo, el cual está presente en la mayoría de las heridas de cada tratamiento (2/3); sólo en el caso de los hidrogeles Irradiados, esto se observó únicamente en una herida. A pesar de la poca migración epitelial, a este día las heridas tratadas con CH- P 7 y CH-P 4 fueron las que presentaron el mayor porcentaje de cierre, lo que sugiere que el cierre está ocurriendo principalmente por contracción y no por reepltellzaclón del tejido.
El infiltrado Inflamatorio es abundante en las heridas tratadas con SS, P-407, CH y CH+P, mientras que en las heridas tratadas con los hidrogeles Irradiados es medianamente abundante, Indicando una tendencia de estos últimos a reducir la respuesta Inflamatoria.
En cuanto a la MEC, en los grupos control y P-407 se observó una gran cantidad de tejido en reparación (menor en el P-407) caracterizado por una matriz provisional superficial de fibrina y una matriz laxa compuesta de fibras organizadas paralela y retlcularmente en la reglón subyacente profunda del tejido, dejando en evidencia que el P-407 no tiene efecto sobre la matriz provisional. De forma similar, las heridas tratadas con CH y CH+P presentan una gran cantidad de tejido en reparación compuesto principalmente por una matriz de fibrina con la diferencia de que ésta última abarca la mayor parte del tejido. Esto muestra que a pesar de que el P-407 se encontraba en mayor proporción, el efecto observado en el hidrogel con la mezcla es atribuido al CH, el cual pudiera estar relacionado con la actividad hemostática del polímero que promueve la matriz abundante de fibrina.
En los otros tratamientos (CH-P 4 y CH-P 7) el tejido en reparación fue escaso, compuesto principalmente por fibrina en la reglón superficial y por una matriz profunda laxa organizada en fibras paralelas, sugiriendo de esta manera que los hldrogeles Irradiados tienen la capacidad de disminuir la cantidad de tejido en la matriz provisional.
Adicionalmente, las heridas tratadas con SS y CH-P 7 presentaron fibras de colágena empaquetada (tipo I) embebidas en la matriz superficial; y las heridas tratadas con CH-P 4 muestran un incipiente depósito de colágena predominantemente poco empaquetada, lo que demuestra un retraso en la síntesis de colágena en los otros tratamientos. Finalmente, en los grupos del P-407 y CH, la matriz provisional está siendo sustituida por tejido de granulación sin presencia de fibras de colágena, lo que sugiere que en estas heridas hay una transición a la fase de proliferación que pudiera estar relacionado con una actividad pro-angiogénesis.
Día 7 (Fig. 32, 35, 38)
Descripción
SS: Mediante la tinción de H&E (Fig. 32) se observa que las heridas están completamente reepitelizadas, en donde el epitelio nuevo es más grueso y consta de varias capas epitelilales (8-10 estratos) en comparación con el epitelio sano (3-4 estratos), evidenciadas con la tinción de Herovici (Fig. 38). La dermis en reparación presenta un matriz compacta con fibras gruesas organizadas paralelamente en dos ratones de tres. Solo en un caso, se observa el tejido de granulación caracterizado por poco depósito de ECM (tinciones de Masson, Fig. 35 y Herovici, Fig. 38), y presencia abundante de células y vasos sanguíneos
P-407: En general, las heridas se observan completamente reepitelizadas (2/3), con una herida que presentó reepitelización parcial (Fig. 32). El epitelio que cubre la herida es más grueso (8-14 capas) que el del grupo control, al igual que el estrato córneo. En un caso de tres se observa un tejido en reparación similar al del grupo control mientras que en dos de tres hay un tejido de granulación inmaduro evidenciado por las tinciones de Masson (Fig. 35) y Herovici (Fig. 38), donde aparecen vasos sanguíneos de calibre pequeño y poca presencia de matriz.
CH: Mediante la tinción de H&E (Fig. 32), se observó que ninguna de las heridas presentó reepitelización completa. La escara persiste y está integrada al tejido de reparación, en estas áreas se observa una matriz desorganizada compacta, con presencia de fibrina, evidenciada por una coloración roja en la tinción de Masson (Fig. 35); sin embargo, subyacente a esta matriz y en las zonas laterales a ella, hay formación de tejido de granulación, con abundante presencia celular y vasos sanguíneos de calibre similar a los de las heridas del grupo control.
CH+P: Solamente en un caso de tres la reepitelización es completa, mientras que en las otras heridas una pequeña porción de la escara está integrada al tejido en reparación con una reepitelización parcial (tinción de H&E, Fig. 32). El epitelio de la herida, aunque es más grueso que el tejido sano, tiene un grosor (8-10 capas) cuya proporción es menor a la del grupo tratado con P-407, siendo similar al grupo control. El tejido de granulación abarca toda el área que está reepitelizada, ya que en donde está integrada la escara, se observa una matriz compacta que corresponde a la matriz de fibrina. El tejido de granulación presenta vasos de mayor tamaño a los observados en las heridas tratadas con poloxámero 407, abundante Infiltrado celular y un Incipiente depósito de colágena tipo I ligeramente empaquetada evidenciada por las tinciones de Masson (Flg. 35) y Herovlcl (Fig. 38).
CH-P 4: En 1/3 no hay reepltellzaclón completa y en la zona sin epitelio hay una escara reducida Integrada al tejido en reparación (Flg. 32). En dos de tres casos, el nuevo epitelio comprendió de 1 1 a 20 capas epiteliales, mientras que en el caso restante se apreciaron aproximadamente 7 capas. Mediante las tinciones de Masson (Flg. 35) y Herovlcl (Flg. 38) se observó que mayohtahamente (2/3) hay presencia de una matriz compacta que parece ser de fibrina en la zona central de la herida. Adyacente, en las zonas laterales a ésta se observa tejido de granulación con vasos sanguíneos de tamaño semejante a los observados con la mezcla. La matriz de este tejido es más compacta en comparación con las heridas tratadas con la mezcla y además se observa un depósito Incipiente de colágena, la cual se Identifica como colágena tipo I, al ser positiva para la tinción Herovlcl (Flg. 38). También hay abundante número de células (Flg. 32).
CH-P 7: La tinción de H&E mostró que la reepltellzaclón es completa para todos los casos estudiados (Flg. 32). El tejido se observa engrosado con respecto a la piel sana (7-14 estratos epiteliales). Hay tejido de granulación con abundantes vasos sanguíneos de tamaño similar a los de la mezcla y al gel Irradiado, con abundante presencia de células ((Flg. 32).). En la reglón subyacente al epitelio, se observa en la tinción de Masson (Flg. 35) una matriz compacta similar a la de fibrina posiblemente compuesta por flbronectlna, el resto de la matriz se caracteriza por un depósito evidente de matriz rica en colágena tipo I (Flg. 38). La matriz del tejido en reparación es más compacta en comparación con el tejido de la mezcla y similar a la del tratamiento con el gel Irradiado a pH 4.
Al día 7 se esperaba que el proceso de reparación de las heridas se encontrara en la fase de proliferación con una reepltellzaclón evidente, un gran número de células en la zona de lesión como consecuencia de la migración y proliferación de fibroblastos y la formación del tejido de granulación. Los resultados muestran que la mayoría de las heridas presentan vasos sanguíneos, Infiltrado celular abundante, así como reepltellzaclón completa, a excepción de las heridas tratadas con CH, en donde en ningún caso se muestra reepltellzaclón total, situación que es además congruente con la cinética de cierre de las heridas en donde el porcentaje de cierre es menor en el grupo tratado con CH. Esto sugiere que este polímero retrasa el cierre de las heridas en el día 7, lo que es contrario a lo esperado, ya que en otros estudios se ha observado que este compuesto acelera la reepltellzaclón, aunque es Importante considerar que este estudio fue realizado en quemaduras utilizando ratas, a diferencia de este estudio en donde el modelo experimental fue con heridas exclslonales de ratón. Adlclonalmente, en las heridas tratadas con P-407 y CH-P 4 ocurrió que solo 1/3 no reepitelizó completamente; sin embargo, para el caso del CH+P, 2/3 ratones presentaron característica. Esto apoya la observación de que el CH retrasa el cierre de las heridas.
En todos los tratamientos, el nuevo epitelio es más grueso que el epitelio sano, lo que sugiere que no hay una resolución óptima de la herida en ninguna de las condiciones estudiadas, al día 7. Esta situación es normal dado que indica que hay un proceso de proliferación y diferenciación para restaurar la barrera epitelial. Los grupos del CH-P 4 y P-407 presentaron el epitelio más grueso, en donde este último adicionalmente mostró un estrato córneo grueso, lo que indica una mayor tasa de diferenciación celular. Las heridas tratadas con CH y CH+P que no reepitelizaron mostraron una escara integrada al tejido de forma similar a las heridas del CH-P 7 al día 3, confirmando que el CH le confiere propiedades al hidrogel que promueven la formación del coágulo sirviendo como tapón hemostático.
El tejido de granulación comprende la mayor parte del tejido en reparación en los grupos tratados con CH+P, CH-P 4 y CH-P 7, con una reglón en la zona central subyacente a la epidermis con características de matriz compacta similar a la de fibrina, que muestra que el recambio de matriz provisional se hace desde la reglón profunda de los bordes de la herida hacia la parte superficial y central. Asimismo presentan depósito Incipiente de colágena I que sugiere el Inicio de la fase remodelaclón con el recambio a una matriz permanente. Es Importante señalar que a diferencia de los grupos control (en donde la matriz provisional aún se observa compacta y no presenta características de tejido de granulación), P-407 (en donde el tejido de granulación aún es Inmaduro), CH (en donde aún no se presenta reepltellzaclón total) y CH+P (en donde 2/3 ratones no reepitelizaron completamente), los grupos CH-P 4 y CH-P 7 presentan reepltellzaclón completa, tejido de granulación evidente y depósito de colágena tipo I, lo que sugiere que el proceso de reparación está más avanzado en las heridas a las que se les aplicaron los hldrogeles irradiados, efecto que pudiera deberse a la aplicación de irradiación gamma en los materiales.
Día 11 (Fig. 33, 36, 39)
Descripción
SS: El tejido está completamente reepltellzado (Fig. 33)., siendo el epitelio ligeramente grueso (8 estratos) en comparación con el tejido sano Se observa un recambio evidente del tejido de granulación por un tejido cicatrizal compuesto principalmente por colágena empaquetada evidenciada por las tinciones de Masson (Fig. 36) y Herovicl (Fig. 39), y en el cual aún residen varias células. Las fibras se encuentran organizadas en forma paralela, y en la reglón más profunda se observa presencia de vasos sanguíneos de mayor calibre mientras que en la zona superficial son de menor. No hay formación de folículos.
P-407: La tinción de H&E mostró que en un caso de tres hay una ligera porción de la herida que no está reepltellzada, y que el epitelio está formado por 5-6 estratos, siendo más delgada que en las heridas del grupo control (Fig. 33). Hay un incipiente recambio del tejido de granulación por tejido cicatrizal observado con las tinciones de Masson (Fig. 36) y Herovicl (Fig. 39). Hay presencia de vasos sanguíneos, los cuales son predominantemente de calibre pequeño y con algunas células. No se observan folículos en la zona lesionada.
CH: Se observa mediante la tinción de H&E que en uno de tres ratones hay una pequeña área de la herida que aún está abierta (Fig. 33), en la que persiste una pequeña escara en la reglón del epitelio de la herida. El nuevo epitelio está formado por 8-10 estratos y en una de las heridas se observa hiperqueratosis en una región. El recambio del tejido de granulación por tejido cicatrizal es evidente pero menor que en el grupo control, pero mayor que en las heridas tratadas con P-407 (Fig. 36 y 39). En comparación de los tratamientos anteriores se observa una abundante presencia de células. No hay formación de folículos pilosos en el área de la herida. Los vasos sanguíneos se distribuyen en todo el tejido de reparación y son generalmente de calibre pequeño. En uno de tres ratones se observan dos granulomas embebidos por el epitelio de la herida.
CH+P: En dos heridas de tres la reepitelización fue completa, en el otro caso la herida aún se encuentra abierta (Fig. 33). El epitelio de la herida costa de 6-9 estratos. Hay un Incipiente recambio del tejido de granulación por tejido cicatrizal, en el cual se observan varias células y vasos sanguíneos de calibre pequeño distribuidos a toda la zona lesionada, y las fibras de colágena empaquetada (positiva para las tinciones de Masson, Fig. 36 y Herovicl, Fig. 39) se organizan en forma paralela entre sí.
CH-P 4: En una de cuatro, la herida se encuentra aún abierta en la parte central, en donde además persiste una escara en la zona epitelial. El grosor del epitelio consta de 6-8 estratos (Fig. 33). Se observa un recambio evidente del tejido de granulación por tejido cicatrizal aunque el empaquetamiento de las fibras es inicial evidenciado por la coloración adquirida en las tinciones de Masson (Fig. 36) y Herovicl (Fig. 39), además las fibras comienzan a organizarse en forma paralela. Hay presencia de vasos sanguíneos de calibre pequeño que es más evidente en la reglón profunda de la herida. Se observan células en la zona de la herida y no hay folículos pilosos.
CH-P 7: La tinción de H&E muestra que las heridas están completamente reepltellzadas (Fig. 33). En un caso, el grosor del epitelio es casi similar al grosor de un epitelio sano, mientras que en el otro se observan entre 8-9 estratos. Presenta un recambio evidente del tejido de granulación por tejido cicatrizal compuesto por fibras de colágena tipo I empaquetada dispuestas en forma paralela evidenciada por una Intensa tinción de Herovicl (Fig. 39) y Masson (Fig. 36) similar a las heridas del grupo control. Aún hay presencia de varias células y vasos sanguíneos de calibre pequeño embebidos en la matriz. En el caso donde el epitelio está engrosado, hay fibras menos empaquetadas en la dermis papilar posiblemente correspondientes a colágena tipo III.
Las heridas reepltellzaron completamente en los grupos SS y CH-P 7, mientras que para cada uno de los otros tratamientos se presenta un caso (1 ratón de 3) en donde la herida no reepitelizó en su totalidad, esto sugiere que hay un retraso en la reepitelización que persiste hasta el día 1 1 . En el caso de los hidrogeles, esta situación pudiera deberse a un exceso de humedad en el lecho de la herida que pudiera estar causando un daño en la piel, esto con base a los resultados obtenidos en la prueba de bloeroslón, en donde el hidrogel de CH+P es el que muestra el mayor grado de erosión (proporciona una mayor cantidad de agua a la herida), por lo que su capacidad para absorber exudado es baja, además las heridas tratadas con este material presentan ligeramente un menor porcentaje de cierre (sin diferencias que fueran estadísticamente significativas) al día 1 1 . Así mismo, el hidrogel de P-407 presentó predominantemente erosión, por lo tanto, este material también proporcionaría un ambiente húmedo y no se eliminaría el exceso de exudado que es perjudicial durante la reparación de la herida. Por el contrario, el hldrogel CH-P 7 muestra una tendencia al hlnchamlento, es decir, tiene la capacidad de absorber el exudado de las heridas, disminuyendo la húmeda de las mismas, situación que evita que éstas vuelvan a abrirse. Otra explicación podría ser que el pH ácido presente en la solución de CH y en los hidrogeles causa irritación en la piel de los ratones, lo que provoca que éstos se rasquen y lesionen las heridas, situación que se evita con el hidrogel a pH 7.
Por otro lado, el grosor del epitelio disminuyó (7-10 estratos) a este día en todos los tratamientos en estudio en comparación con el día 7, siendo el del grupo P-407 similar al del tejido sin lesión. Mientras que en el caso del CH se observó hiperqueratosis sugiriendo que este compuesto estimula la proliferación celular.
En este día ya es posible visualizar el recambio del tejido de granulación por tejido cicatrizal con depósitos evidentes de fibras de colágena tipo I dispuestas en forma paralela, específicamente, las heridas tratadas con SS y CH-P 7 muestran mayor cantidad de colágena empaquetada que se tiñe de color magenta, dejando en evidencia que si bien en los primeros días el cierre de la herida se acelera, la resolución de la misma no se ve mejorada al aplicar este hidrogel. Argumento que se reitera por la organización de las fibras de colágena en paralelo, característica de cicatrices y no de tejido sano en donde las fibras se entrecruzan en forma de cesta. Con base en estos resultados se puede establecer que los tratamientos únicamente presentan diferencias en los primeros días de aplicación dado que al día 1 1 ya no se observan diferencias con respecto al grupo control (SS), y en el caso de los hidrogeles P-407, CH+P y CH-P 4 aplicarlo durante un largo periodo de tiempo no muestra un beneficio el cierre de las heridas sino todo lo contrario, por lo tanto, la aplicación de los hidrogeles debería de ser únicamente en los primeros días, posteriores a la lesión.
Además, a pesar del incipiente recambio de matriz, la zona de la herida aún contiene células y vasos sanguíneos, por lo tanto, el proceso de cicatrización aún no ha terminado, sobre todo en el grupo del CH que muestra histológicamente un retraso. Esto significa que para poder hacer un estudio más detallado de la última fase del proceso de cicatrización, es necesario aumentar el número de días evaluados para llevar a cabo el análisis histológico.
Por último es importante mencionar que en algunas heridas tratadas con CH se presentó la formación de granulomas, situación que ya había sido reportada con anterioridad en otros estudios; en donde se explica que el granuloma se forma para eliminar cuerpos extraños que promueven la inflamación; sin embargo, el cuerpo humano tiene la capacidad de biodegradar al quitosano.
Pruebas de Inmunofluorescencia
Después de realizar el análisis histológico de las heridas de cada tratamiento y encontrar diferencias en el proceso de reparación, principalmente en los hidrogeles irradiados; se llevaron a cabo pruebas de inmunofluorescencia para determinar los posibles efectos que las muestran en estudio pudieran llegar a tener sobre las principales células que participan en el cierre de heridas: neutrófilos, macrófagos y fibroblastos activados; así como en la expresión de TGF-p3 como marcador de una resolución de alta calidad. A continuación se muestran los resultados obtenidos para cada prueba de ¡nmunofluorescencia realizada, fotografías representativas de cada tratamiento a los días 3, 7 y 1 1 , y las gráficas resultantes de la cuantificación.
Inmunofluorescencia para analizar el infiltrado de neutrófilos
Se realizó esta prueba de ¡nmunofluorescencia (Anti-Elastasa), para confirmar que el infiltrado celular observado en las histologías corresponde a un Infiltrado inflamatorio y para estudiar si los hldrogeles tienen algún efecto en el reclutamiento de neutrófilos. Los neutrófilos son los leucocitos dominantes en etapas tempranas de la cicatrización, cuya distribución predomina en la escara, por esta razón, se esperaba que éstas células presentaran niveles elevados al día 3 y que disminuyeran en los días posteriores; sin embargo, la proporción de estas células en la región de reparación es sim ilar en el día 3 y el 7 (Fig. 52) en este modelo. Debido a su abundancia, la cuantificación de los neutrófilos en la escara se torna complicada.
Las observaciones muestran que el número de neutrófilos en la zona de reparación disminuye, pero no se abate al día 1 1 . El grupo tratado con CH mostró un mayor número de neutrófilos al día 7, que correlaciona con un retraso en el proceso de cicatrización como se estableció en las histologías. Este retraso pudiera ser consecuencia del número elevado de neutrófilos, los cuales se sabe Inhiben directamente la migración de queratinocitos y posiblemente su proliferación como consecuencia de la liberación de proteasas que pueden Inducir un daño en el tejido ; sin embargo, se requiere de un mayor número de réplicas para poder confirmar este resultado. Finalmente, al día 1 1 se observa una reducción evidente de la proporción de neutrófilos en este grupo, la cual es similar a la de los otros grupos en estudio.
Por otro lado, no se observan diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo control (SS) que indiquen que los hidrogeles en estudio tengan algún efecto en estas células fagocíticas, lo que significa que los hidrogeles irradiados no generan una respuesta inflamatoria mayor a la que se produce originalmente por la lesión.
Inmunofluorescencia para analizar el infiltrado de macrófagos
Se realizó esta prueba de inmunofluorescencia (Anti-F4/80) para analizar el infiltrado de macrófagos y determinar el efecto que los hidrogeles pudieran llegar a tener sobre estas células. Los macrófagos forman parte del infiltrado inflamatrorio y son reclutados a la zona de la herida predominantemente entre las 48 a 72 horas, su principal función es fagocitar bacterias y otros microorganismos, y además participan en la última etapa de la fase inflamatoria, regulando la transición a la fase de proliferación y de remodelación, por la secreción de factores de crecimiento clave para la progresión de dichas etapas.
En general, al día tres el infiltrado de macrófagos es bajo en todos los casos, siendo las heridas tratadas con CH y P-407 las que presentan el mayor número de macrófagos en comparación con los otros tratamientos (Fig. 43). Estas células prodlmina a las 72 horas (día 3), por lo tanto, se esperaba que el número de macrófagos fuera mayor a este día; sin embargo, eso no fue lo que se observó. Esta disminución puede estar relacionada a la presencia de neutrófllos que sugiere una fase Inflamatoria aguda persistente, lo que además coincide con las histologías, en donde al día 3 aún no hay formación del tejido de granulación y continúa la matriz temporal de fibrina.
Al día siete, se incrementó de forma notable el reclutamiento de estas células, principalmente en las heridas que fueron tratadas con CH, CFI+P, CFI-P 4 y CFI-P 7; de las cuales, las heridas tratadas con los hidrogeles Irradiados, son las que presentan el mayor número de macrófagos (Fig 44 día 7 y Fig. 53) con una diferencia evidente al compararlas con el grupo control (SS), en donde el grupo tratado con el hidrogel CFI-P 7, muestra una diferencia que es estadísticamente significativa (Fig. 53). Estos resultados sugieren que la actividad de recultamiento de macrófagos está dada por el CH, tal como se ha visto en estudios en donde este compuesto estimula su qulmiotaxls, y que además este efecto no se pierde después de que el compuesto se expone a Irradiación Gamma.
Estas células, que pueden llegar a permanecer por días a semanas en la zona de lesión, se encargan de regular la transición a la fase de proliferación mediante la liberación de factores de crecimiento Importantes, por esta razón, al día 7, el número de macrófagos es mayor y es posible observar la formación del tejido de granulación en todas las histologías, a excepción del grupo tratado con SS, el cual a su vez presenta un menor número de macrófagos.
Finalmente, para el día 1 1 , el Infiltrado de macrófagos aumentó de forma significativa con respecto al día 3, en las heridas del grupo control, P-407 y CH; mientras que en las heridas tratadas con la mezcla de ambos polímeros (CH+P, CH-P 4 y CH-P 7), el número de estas células se mantuvo, siendo ligeramente mayor que en el grupo control (Fig. 53). La presencia de macrófagos a este día esta relacionado con la regulación de la transclón a la fase de remodelación, e histológicamente es posible observar que la mayoría de las heridas se encuentran en el Indo de la esta última fase. Al ser similar el número de macrófagos presentes en la zona de lesión en todos los tratamientos (excepto el CH), se puede decir, que los hidrogeles Irradiados ya no tienen un efecto evidente sobre estas células a los 1 1 días. Por otro lado, las heridas tratadas con CH, presentan el mayor reclutamiento de macrófagos a este día con un incremento significativo al del día 3 (Fig. 53), que es congruente con lo que se muestra en las histologías al día 1 1 para las heridas a las que se les aplicó CH, en donde aún persiste la fase de proliferación con un evidente tejido de granulación y poco recambio de matriz. Con base a lo observado en esta inmunofluorescencla, y en la inmunofluorescencla para analizar el Infiltrado de neutrofllos, se puede decir que el CH puede inducir una respuesta Inflamatoria, al mostrar un mayor reclutamiento de neutrófllos y macrófagos.
Inmunofluorescencla para analizar la expresión de a-SMA
Se realizó esta prueba de inmunofluorescencla (Antl-aSMA) para observar fibroblastos activados, también conocidos como mioflbroblastos, y determinar el efecto que los hidrogeles pudieran llegar a tener sobre estas células con actividad contráctil. Al día 3 no se observa expresión de a-SMA que pudiera estar relacionada con la presencia de fibroblastos activados en la zona de lesión, la marca positiva se puede atribuir a formación de nuevos vasos sanguíneos (Fig. 46 y 54 día 3), los cuales presentan células de músculo liso que expresan a- SMA. Al día 7 hay una expresión evidente de a-SMA en la reglón superficial de los bordes de la herida Independiente a la de los vasos sanguíneos. Las heridas tratadas con CH y CH+P presentan niveles de expresión más bajos que el grupo control (SS), mientras que los grupos tratados con los hldrogeles Irradiados muestran mayor expresión (Fig . 54 día 7), lo que significa que hay una mayor actlvadad contráctil ejercida por estas células en estas heridas. Por último, al día 1 1 se observa una disminución evidente en la expresión de a-SMA en todos los grupos, excepto en las heridas tratadas con P-407 y CH, en donde en el primero, aún persiste la expresión de a-SMA, y en el segundo, los niveles se mantuvieron similares con respecto al día 7 (Fig. 54 día 1 1 ).
Los fibroblastos activados aparecen en el área de la herida a partir del cuarto día después de la lesión, por esta razón no se esperaba expresión de a-SMA al día 3, lo que es consiste con lo observado en las ¡nmunofluorescenclas realizadas; por el contrario, al día 7 sí se esperaban niveles elevados de expresión que se corresponden con el cambio de fenotipo de los fibroblastos que Inician la contracción de la herida. La presencia de un mayor número de fibroblastos activados en las heridas tratadas con los hldrogeles Irradiados, podría sugerir que estos favorecerían el cierre de las heridas, prlmordlalmente por contracción, mientras que los otros tratamientos podrían promover otros mecanismos alternos, tal como la reepltellzaclón y la formación del tejido de granulación en tiempos posteriores al día 7, como sugieren los análisis histológicos; así como una mayor deposición de fibras de colágena, por esta razón, al día 7 es posible observar fibras de colágena tipo I en la tinción de Herovlcl en las heridas tratadas con los hldrogeles Irradiados en donde se presenta la mayor área marcada por a-SMA, sugiriendo una fase de remodelación temprana.
Existe una relación entre un mayor número de macrófagos y niveles de expresión de a-SMA elevados en los hldrogeles Irradiados. Los fibroblastos comienzan a Infiltrarse en la herida durante la formación de tejido de granulación y están Involucrados en varios procesos de la cicatrización de la herida: contribuir a la formación de tejido de granulación, producir atocinas que favorecen la proliferación y la migración de queratlnocltos, y finalmente diferenciarse a fibroblastos activados que expresan a-SMA para promover el cierre de heridas; este último evento está regulado por una molécula producida por los macrófagos: TGF-bt Cuando un fibroblasto es estimulado por TGF-bI , se activa un factor de transcripción que promueve la expresión de genes contráctiles. La expresión de estos genes provoca cambios en el cltoesqueleto, y en última Instancia, la diferenciación a mloflbroblastos y el desarrollo de la función contráctil. Por lo tanto, al haber un mayor número de macrófagos que producen TGF-bt se promueve una activación temprana de los fibroblastos, resultando en un mayor depósito de colágena I y en una maduración acelerada de la herida.
Este argumento podría ser completamente cierto si esta relación también existiera para las heridas tratadas con CH y CH+P, en donde al día 7 se observa un gran número de macrófagos; sin embargo, no hay niveles elevados de expresión de a-SMA. Esto podría deberse a que existen varias subpoblaclones de macrófagos: los macrófagos activados por agentes microbianos y citocinas conocidos como macrófagos M1 y los moduladores de la Inflamación denominados macrófagos M2. Los macrófagos M1 producen un importante nivel de óxido nítrico (NO) y citocinas proinflamatorlas, por otro lado, los macrófagos M2 son una población mucho más heterogénea compuesto por todos los macrófagos que no corresponden a las características de los M1 , en donde existe un subgrupo, los macrófagos desactivados o M2c, que son capaces de controlar la Inflamación y están implicados en la remodelación tlsular. Los resultados sugieren que el CH, presente en igual concentración en la mezcla sin irradiar, favorecería la qulmiotaxls de macrófagos M1 , mientras que los hidrogeles Irradiados promueven la qulmiotaxls de macrófagos M1 y M2c, siendo estos últimos los que activan a los fibroblastos. Esto podría confirmarse realizando una inmunofluorescencla que fuera específica para esta subpoblación de macrófagos y una inmunofluoresencla para TGF-b! que confirme la vía de señalización.
Adlclonalmente, la heridas que presentaron el menor porcentaje de cierre fueron a las que se les aplicó CH, esto pudiera estar relacionado con un menor número de mioflbroblastos en la zona lesionada provocando una disminución en la tasa de contracción y en consecuencia un menor cierre de la herida como se muestra en la figura 29.
Finalmente al día 1 1 hay una disminución de la expresión de la actlna porque el número de fibroblastos activados en el sitio de lesión se reduce debido a que la actividad contráctil de estas células se termina cuando el tejido está completamente reepltellzado. La marca positiva que se observa en los grupos de P-407 y CH se debe a la expresión de a-SMA por fibroblastos activados en las heridas que de acuerdo a las histologías aún no han reepltellzado.
En resumen, los hidrogeles Irradiados promueven un mayor reclutamiento de macrófagos, probablemente de macrófagos M2c, que se mantiene hasta los 1 1 días; los cuales liberan TGF-bϊ promoviendo la activación temprana de los fibroblastos con un cambio en su fenotipo por células contráctiles, resultando en un mayor depósito de colágena tipo I y en una maduración acelerada de la herida.
Inmunofluorescencia para analizar la expresión de TGF-p3
Se realizó esta prueba de inmunofluorescencla para estudiar la expresión de TGF^3 y determinar si los hidrogeles modifican la expresión de este factor que pudiera sugerir una resolución de alta calidad de la herida. Esto debido a que se ha observado que en heridas con mínima o ninguna formación de cicatriz, hay un aumento significativo en la proporción de TGF^3.
La figura 55 muestra que no hay diferencias evidentes en la expresión de TGF^3 entre los tratamientos y los días, y que la variación que se observa es únicamente la que existe entre cada ratón. En el proceso normal de cicatrización, este factor se expresa en fases tempranas y es necesario para el cierre de heridas ¡n vivo, es por esta razón que se muestran niveles de expresión de este factor en estos días. Por otro lado, se ha reportado que niveles elevados de TGF^3 en heridas reduce la deposición de colágena tipo I mediante la restricción de la diferenciación de los mioflbroblastos y la promoción de la degradación del colágeno por MMPs. Todo ello conduce a la disminución de la formación de cicatrices. Durante los tiempos analizados de las histologías, no se observó que los tratamientos presentaran una mejor resolución de la cicatriz, por lo tanto, se esperaba que los niveles de TGF-p3 fueran similares a los del grupo control, tal como se observa en los resultados. Además, al haber un mayor número de fibroblastos activados y depósito de colágena en las heridas tratadas con los hldrogeles Irradiados, es congruente que no haya niveles de expresión elevados para este factor sabiendo que restringe la activación de estas células, situación que es congruente con lo que se observa al día 3, en donde los niveles del factor son ligeramente menores para el grupo al que le aplicó el hidrogel CH-P 7.
Como se ha descrito y ejemplificado, los hldrogeles objetos de la Invención obtenidos por Irradiación gamma a través de un procedimiento rápido, económico y respetuoso con el medio ambiente, con materiales blodegradables y blocompatlbles presentan características ventajosas con respecto de otros materiales utilizados como apósitos auxiliares en la reparación de las heridas; esto debido a que abordan el cierre de heridas con diferentes mecanismos de acción tanto física como biológica ya que poseen la característica de termoreverslbllldad y propiedades de gellflcaclón a baja temperatura que permiten una fácil aplicación a la herida, muestran la capacidad de hincharse en presencia de suero humano permite el control del exudado excesivo en las heridas de la piel, muestran un efecto antlmlcroblano/antlfúnglco previniendo la Infección, el CH-P 7 posee una admirable tasa de cierre de la herida durante la semana 1 en ratones, presenta un aumento de macrófagos, expresión de a-SMA y síntesis de colágena, que resulta en un mayor reparación madura de la herida.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1 . Un hidrogel para la reparación de heridas que comprende el copolímero poloxámero 407 y el polísacarido quitosano entrecruzados.
2. El hidrogel de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho hidrogel es obtenido por medio de irradiación gamma.
3. El hidrogel para la reparación de heridas de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la solución del copolímero poloxámero 407 y el polisacárido quitosano es de 23-28 % / 0.5 - 0.90% p/v respectivamente.
4. El hidrogel para la reparación de heridas de conformidad con las reivind icaciones anteriores, caracterizado por que la solución del copolímero poloxámero 407 y el polisacárido quitosano es de preferentemente 25 / 0.75 % p/v respectivamente.
5. Una composición farmacéutica en forma de hidrogel de conformidad con las reivindicaciones anteriores que comprende el copolímero poloxámero 407 y el polísacarido quitosano entrecruzados por irradiación gamma para la reparación de las heridas.
6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5 que puede comprender además un fármaco que mejora la cicatrización.
7. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usarse como apósito para la reparación de las heridas.
8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 o 2 para usarse como apósito para la aceleración del proceso de reparación de las heridas.
9. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dicha composición es administrable a un mamífero en necesidad de la misma.
10. La composición farmacéutica para uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicha composición es administrable repetidamente.
1 1 . La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones precedentes en donde dicha composición es administrable de forma de tópica.
12. Un apósito para la aceleración del proceso de reparación de las heridas que comprende el hldrogel de conformidad con la reivindicación 1 .
13. Un proceso para producir un hidrogel para la reparación de heridas que comprende los pasos:
a) Preparar una solución de polisacarido quitosano y poloxamero 407 en ácido acético 0.3-0.6 %p/v en agua desionizada.
b) Agitar la solución preparada por 24 horas a una temperatura de aproximadamente 2- 5°C.
c) Filtrar la solución.
d) Envasar la solución para irradiación, preferentemente en envases de vidrio.
e) Irradiar la solución de quitosano y Poloxámero 407 a una dosis de absorción de 25KGy, con una fuente de 60Co.
f) Envasar el producto resultante.
14. El proceso de la reivindicación 13, en donde la solución de quitosano y Poloxámero 407 es de 0.5 - 0.90 /23-28 %p/v, respectivamente.
15. El proceso de la reivindicación 13, en donde la solución de quitosano y Poloxámero 407 es de preferentemente 0.75 /25 %p/v, respectivamente.
16. El proceso de la reivindicación 13, en donde el agua desionizada empleada en la solución está a 4°C.
17. El uso del hidrogel de las reivindicaciones 1 a 4 para fabricar un apósito para la aceleración del proceso de reparación de las heridas.
18. El uso de una composición farmacéutica de la reivindicación 5 para fabricar un apósito para la aceleración del proceso de reparación de las heridas.
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