ES2959455T3

ES2959455T3 - Polvo de membrana amniótica y su uso en cicatrización de heridas y en construcciones de ingeniería de tejidos

Info

Publication number: ES2959455T3
Application number: ES15847740T
Authority: ES
Inventors: Sean V Murphy; Aleksander Skardal; Anthony Atala
Original assignee: Wake Forest Univ Health Sciences Inc; Wake Forest University Health Sciences
Current assignee: Wake Forest Univ Health Sciences Inc; Wake Forest University Health Sciences
Priority date: 2014-10-02
Filing date: 2015-10-01
Publication date: 2024-02-26
Anticipated expiration: 2035-10-01
Also published as: JP7486404B2; EP4226929A1; JP2017530153A; US20170203004A1; AU2015328014A1; CA3209485A1; KR102516009B1; AU2015328014B2; JP2021035976A; CA2963273A1; EP3200809A4; DK3200809T3; KR20170075747A; CA2963273C; JP2022174265A; EP3200809B1; AU2021200873B2; WO2016054423A1; EP3200809A1; AU2021200873A1

Abstract

La presente invención incluye composiciones y métodos para la curación de heridas y la regeneración de tejidos. Las composiciones de la presente invención comprenden polvo de membrana amniótica. Las composiciones de la presente invención comprenden polvo de membrana amniótica y un armazón. Los métodos de la presente invención comprenden aplicar una composición de la presente invención a un sujeto para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polvo de membrana amniótica y su uso en cicatrización de heridas y en construcciones de ingeniería de tejidos

Referencia a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reclama prioridad a tenor de 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/058.969, presentada el 2 de octubre de 2014.

Antecedentes de la invención

Las quemaduras extensas y las heridas cutáneas de espesor total pueden ser devastadoras para los pacientes, incluso cuando se tratan. Se estima que cada año se tratan 500.000 quemaduras en los Estados Unidos (Cherryet al.,2008, Natl. Health Stat. Report: 1-39; Pittset al.,2008, Natl. Health Stat. Report: 1-38). La tasa de mortalidad global por lesiones por quemaduras fue del 4,9 % entre 1998-2007 y los costos médicos para los tratamientos de quemaduras se aproximan a los 2 mil millones de dólares por año (Milleret al.,2008, J. Burn Car. Res., 29: 862-871). A nivel mundial, esta estadística aumenta a 11 millones de lesiones por año (Peck, 2011, Burns, 37: 1087-1100). Además de las quemaduras, las heridas crónicas de espesor total constituyen una gran base de pacientes y, a pesar del adelanto técnico de los tratamientos, las tasas de cicatrización se mantienen por debajo de una tasa de éxito del 50 % (Kurdet al.,2009, Wound Repair Regen., 17: 318-325). Se estima que estas heridas crónicas que no cicatrizan afectan a 7 millones de personas por año en los Estados Unidos, con costos anuales que se acercan a los 25 mil millones de dólares (Senet al.,2009, Wound Repair Regen., 17: 763-771). Los pacientes que padecen cualquiera de estos tipos de lesiones se benefician de tratamientos rápidos que dan como resultado el cierre completo y la protección de las heridas. En particular, los pacientes quemados que reciben tratamientos tardíos a menudo están sujetos a deformidades cicatriciales extensas que pueden tener efectos fisiológicos negativos a largo plazo.

El tratamiento de referencia en el tratamiento de la cicatrización de heridas es un injerto de piel de espesor parcial autólogo. Esto implica extraer un trozo de piel de un sitio quirúrgico secundario para el paciente y volver a aplicar el injerto en la herida o quemadura. Si bien este tratamiento produce un resultado clínico razonable, si la herida es extensa, la cantidad y el tamaño de los sitios donantes son limitados. Los aloinjertos son una opción adicional, y van acompañados de la necesidad de inmunodepresores para evitar el rechazo inmunitario del injerto. Estas limitaciones han llevado al desarrollo de sustitutos dérmicos no celulares, que en la mayoría de los casos están compuestos por un armazón polimérico y son costosos de producir, y dan como resultado resultados cosméticos relativamente malos.

El documento WO 2014/040026 describe una composición de polvo de membrana amniótica que puede comprender además un armazón, muy preferentemente un hidrogel a base de ácido hialurónico, gelatina y PEGDA como reticulante.

Existe la necesidad en la técnica de un producto de medicina regenerativa y de cicatrización de heridas que tenga una alta eficacia clínica. La presente invención satisface esta necesidad insatisfecha.

Sumario de la invención

El alcance de la presente invención se define mediante las reivindicaciones. Las realizaciones de la descripción relativas a los métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se divulgue en la descripción pero que no esté cubierto por las reivindicaciones debe considerarse presentado únicamente con fines ilustrativos.

En un aspecto, la presente invención incluye una composición que comprende polvo de membrana amniótica y un armazón, en donde el armazón es un hidrogel, en donde el hidrogel comprende PEGDMal.

En determinadas realizaciones, el polvo de membrana amniótica de la presente invención comprende una cantidad de proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g. En otras realizaciones, el polvo de membrana amniótica comprende además una cantidad de elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g. En otras realizaciones más, el polvo de membrana amniótica comprende además una cantidad de colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g. En otras realizaciones más, el polvo de membrana amniótica comprende además una cantidad de glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. En otras realizaciones más, el polvo de membrana amniótica comprende además una cantidad de trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g. En otras realizaciones más, el polvo de membrana amniótica comprende además una cantidad de pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g. En otras realizaciones más, el polvo de membrana amniótica comprende además una cantidad de gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g.

El polvo de membrana amniótica se incorpora dentro del hidrogel. En otras realizaciones, El polvo de membrana amniótica se incorpora dentro de un hidrogel a base de ácido hialurónico (AH). En otras realizaciones más, el armazón comprende al menos un biopolímero seleccionado del grupo que consiste en hialuronano, quitosano, alginato, colágeno, dextrano, pectina, carragenano, polilisina, gelatina y agarosa. En otras realizaciones más, el armazón comprende al menos un polímero sintético seleccionado del grupo que consiste en (met)acrilato-oligolactida-PEO-oligolactida-(met)acrilato, poli(etilenglicol) (PEO), polipropilenglicol) (PPO), copolímeros de PEO-PPO-PEO (Pluronics), poli(fosfaceno), poli(metacrilatos), poli(N-vinilpirrolidona), copolímeros de PL(G)A-PEO-PL(G)A, poli(etilenimina) y poli(etilglicol) diacrilato.

También se describe en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, un método de inducción de la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto, que comprende administrar la composición de la presente invención en un sitio de tratamiento en el sujeto. En determinadas realizaciones, la composición se aplica directamente a una herida en un sujeto. En otras realizaciones, la composición se aplica como un pulverizador en aerosol, gel, crema o pomada.

En otro aspecto más, la presente invención incluye un envase de kit para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto. En determinadas realizaciones, el envase del kit comprende un primer compartimento que contiene una cantidad predeterminada de materiales precursores de hidrogel y un segundo compartimento que contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende polvo de membrana amniótica y una composición que comprende un reticulante. En otras realizaciones, el envase del kit comprende un primer compartimento que contiene una cantidad predeterminada de materiales precursores de hidrogel y una composición que comprende polvo de membrana amniótica y un segundo compartimento que contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende un reticulante. En otras realizaciones más, el envase del kit comprende una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel recubiertos por un material soluble en agua y un reticulante, en donde el polvo de membrana amniótica, los materiales precursores de hidrogel recubiertos por el material soluble en agua y el reticulante se desecan. En otras realizaciones más, el envase del kit comprende una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel y un reticulante recubierto por un material soluble en agua, en donde el polvo de membrana amniótica, los materiales precursores de hidrogel y el reticulante recubierto por el material soluble en agua se desecan. En otras realizaciones más, el envase del kit comprende una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel y un reticulante, en donde los materiales precursores de hidrogel y el reticulante se desecan a partir de una solución con un pH <7.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. A fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos realizaciones, que actualmente son las preferidas. Debe entenderse que, sin embargo, la invención no está limitada a las disposiciones precisas e instrumentos de las realizaciones mostradas en los dibujos.

La FIG. 1 ilustra las etapas implicadas en la preparación, creación de heridas, administración del tratamiento y vendaje protector de los animales en el estudio.

La FIG. 2 es un conjunto de imágenes que ilustran las etapas de obtención de imágenes y de recogida de tejido. Los paneles A-C ilustran las etapas de la recogida de tejido. Los paneles D y E ilustran análisisex vivo.

La FIG. 3 ilustra la metodología de análisis de imágenes. El panel A ilustra la contracción medida por la superficie definida por el tatuaje (morado) en cada punto de tiempo. La relación de contracción es la medida del cambio de forma que se produce durante la contracción de la herida. El panel B ilustra el cierre de la herida y la epitelización determinada al medir la superficie de la herida abierta (rojo), el epitelio inmaduro (amarillo) y el epitelio maduro (verde).

La FIG. 4 es un conjunto de imágenes que ilustran heridas del Cerdo 1 en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 5 es un conjunto de imágenes que ilustran heridas del Cerdo 2 en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 6 es un conjunto de imágenes que ilustran heridas del Cerdo 3 en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 7 es un conjunto de imágenes que ilustran heridas del Cerdo 4 en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 8 es un conjunto de imágenes que ilustran heridas del Cerdo 5 en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 9 es un conjunto de imágenes que ilustran heridas del Cerdo 6 en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 10 es un gráfico que ilustra el cambio de superficie de la herida en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 11 es un gráfico que ilustra los cambios de contracción de la herida en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 12 es un gráfico que ilustra los cambios de la relación de contracción en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 13 es un gráfico que ilustra los cambios de epitelización en distintos puntos de tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 14 es un conjunto de gráficos que ilustran una combinación de cada componente individual de la superficie de la herida durante la cicatrización. Se muestran el tamaño de la herida (rojo), la epitelización (verde) y las superficies de contracción (azul). Los productos se clasifican de mejor cicatrización (parte superior) a peor cicatrización (parte inferior).

La FIG. 15 es un conjunto de imágenes que ilustran imágenes histológicas de tinción con hematoxilina y eosina (HyE) para los cerdos 1-3.

La FIG. 16 es un conjunto de imágenes que ilustran imágenes histológicas de tinción con hematoxilina y eosina (HyE) para los cerdos 4-6.

La FIG. 17 es un conjunto de imágenes que ilustran la tinción de tejidos con Pentachrome.

La FIG. 18 es un conjunto de imágenes que ilustran la tinción con rojo sirio de tejidos observados con luz polarizada.

La FIG. 19 es un conjunto de imágenes que ilustran la tinción de tejidos con azul alciano para visualizar mucinas/GAG.

La FIG. 20 es un conjunto de imágenes que ilustran la tinción de tejidos con hierro coloidal para visualizar mucinas/GAG. Esta tinción es más específica que la tinción con azul alciano y sustentó las observaciones iniciales.

La FIG. 21 es un conjunto de imágenes que ilustran la inmunotinción para colágeno tipo I (rojo) y colágeno tipo III (verde) con contratinción nuclear con DAPI (azul).

La FIG. 22 es un conjunto de imágenes que ilustran la inmunotinción para neutrófilos (marrón) con contratinción nuclear de hematoxilina (azul).

La FIG. 23 es un conjunto de tres gráficos en que el panel A ilustra marcadores inflamatorios IL 1 alfa de heridas que no cicatrizan con distintos tratamientos; el panel B ilustra marcadores inflamatorios IL 1 beta de heridas que no cicatrizan con distintos tratamientos; y el panel C ilustra marcadores inflamatorios IP10 de heridas que no cicatrizan con distintos tratamientos.

La FIG. 24 es un conjunto de tres gráficos en que el panel A ilustra marcadores inflamatorios relacionados con monocitos MCP-1 con distintos tratamientos; el panel B ilustra marcadores inflamatorios relacionados con monocitos MIP1beta con distintos tratamientos; y el panel C ilustra marcadores inflamatorios relacionados con monocitos IL8 con distintos tratamientos.

La FIG. 25 es un conjunto de tres gráficos en que el panel A ilustra marcadores antiinflamatorios de heridas cicatrizadas IL5 con distintos tratamientos; el panel B ilustra marcadores antiinflamatorios de heridas curadas IL4 con distintos tratamientos; y el panel C ilustra marcadores antiinflamatorios de heridas curadas IL2 con distintos tratamientos.

La FIG. 26 es un gráfico que ilustra la liberación acumulada de proteínas a lo largo del tiempo a partir del polvo de membrana amniótica descrito en el presente documento (PMA) frente a Tseng (documento US 2007/0071740 A1; en lo sucesivo en el presente documento "Producto de Tseng").

La FIG. 27 es una imagen que ilustra que el hidrogel de ácido hialurónico (AH) de dos partes se puede cargar en una jeringa de doble cámara manteniendo los componentes tiolados separados de los agentes de reticulación multifuncionales (reticulantes).

La FIG. 28 es un gráfico que ilustra la liberación acumulada de proteínas a partir de dos hidrogeles. Uno comprende un reticulante a base de poli (etilenglicol) con grupos funcionales de maleimida (PEGDMal), que está conforme a la invención reivindicada; el otro comprende poli (etilenglicol) diacrilato (PEGDA) y debe considerarse como un ejemplo de referencia, que no es parte de la invención reivindicada.

La FIG. 29 es un gráfico que ilustra las características de hinchamiento de los hidrogeles fabricados con PEGDMal y PEGDA.

La FIG. 30 es un conjunto de imágenes de las cuatro muestras del estudio. El polvo se aplicó directamente a la herida seguido de 1 ml de solución salina estéril. El hidrogel se preparó en un sistema de jeringa de dos partes y se reticuló directamente en la herida, ya sea solo, en capas sobre el polvo de amnios o premezclado con el polvo y cargado en cada cámara de la jeringa.

La FIG. 31 es una imagen que ilustra cómo se preparó el hidrogel en un sistema de jeringa de dos partes.

La FIG. 32 es un conjunto de imágenes que ilustran cómo cicatrizan las heridas con distintos tratamientos a lo largo del tiempo (cerdo 7).

La FIG. 33 es un conjunto de imágenes que ilustran cómo cicatrizan las heridas con distintos tratamientos a lo largo del tiempo (cerdo 8).

La FIG. 34 es un conjunto de imágenes que ilustran cómo cicatrizan las heridas con distintos tratamientos a lo largo del tiempo (cerdo 9).

La FIG. 35 es un gráfico que ilustra el cierre de heridas a lo largo del tiempo.

La FIG. 36 es un gráfico que ilustra los cambios de contracción de la herida a lo largo del tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 37 es un gráfico que ilustra los cambios de la relación de contracción de la herida a lo largo del tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 38 es un gráfico que ilustra los cambios del porcentaje del tamaño original de la herida a lo largo del tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 39 es un gráfico que ilustra el porcentaje del tamaño contraído de la herida a lo largo del tiempo con distintos tratamientos.

La FIG. 40 ilustra el resultado de cicatrización de heridas de comparación. El panel A ilustra una combinación de tamaño de la herida (rojo), epitelización (verde) y superficies de contracción (azul) de la superficie de la herida durante la cicatrización cuando la herida no se trató. El panel B ilustra una combinación de tamaño de la herida (rojo), epitelización (verde) y superficies de contracción (azul) de la superficie de la herida durante la cicatrización cuando la herida se trató con hidrogel. El panel C ilustra una combinación de tamaño de la herida (rojo), epitelización (verde) y superficies de contracción (azul) de la superficie de la herida durante la cicatrización cuando la herida se trató con polvo de amnios bajo hidrogel. El panel D ilustra una combinación de tamaño de la herida (rojo), epitelización (verde) y superficies de contracción (azul) de la superficie de la herida durante la cicatrización cuando la herida se trató con polvo de amnios. El panel E ilustra una combinación de tamaño de la herida (rojo), epitelización (verde) y superficies de contracción (azul) de la superficie de la herida durante la cicatrización cuando la herida se trató con polvo de amnios mezclado con hidrogel.

La FIG. 41 es un conjunto de imágenes que ilustran imágenes histológicas de tinción con hematoxilina y eosina (HyE) representativas para los cerdos 7, 8 y 9.

La FIG. 42 es un conjunto de imágenes que ilustran la tinción con Pentachrome representativa de tejidos con distintos tratamientos.

La FIG. 43 es un conjunto de imágenes que ilustran la tinción con rojo sirio representativa de tejidos observados con luz polarizada.

La FIG. 44 es un diagrama esquemático que ilustra la prueba de compresión para medir las propiedades mecánicas de la piel regenerada.

La FIG. 45 es un gráfico que ilustra una curva de tensión-deformación no lineal representativa para la regeneración de piel porcina: resistencia a la compresión (flecha roja), la región elástica cuya pendiente da el módulo de Young para la compresión (línea verde) y el límite de elasticidad(yield point),por encima del cual el material se daña y actúa plásticamente (flecha azul).

La FIG. 46 ilustra los efectos del polvo de amnios en la resistencia a la compresión de la piel. El panel A ilustra la máxima resistencia a la compresión de las muestras de piel regenerada de las 5 condiciones experimentales. El panel B ilustra la resistencia máxima a la compresión de los grupos recopilados sin polvo de amnios y con polvo de amnios (p < 0,05).

La FIG. 47 ilustra los efectos del polvo de amnios sobre el módulo de Young de la piel. El panel A ilustra el módulo de Young de las muestras de piel regenerada de las 5 condiciones experimentales. El panel B ilustra la tensión en el límite elástico con 5 condiciones experimentales.

La FIG. 48 ilustra los resultados de la comparación de la contracción de la herida. El panel A ilustra la contracción de la herida entre los grupos sin tratar y los tratados con polvo de amnios en el estudioin vivouno. El panel A ilustra la contracción de la herida entre los grupos sin tratar y los tratados con polvo de amnios en el estudioin vivodos.

Descripción detallada

En el presente documento se describen composiciones y métodos para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos. En una realización, la presente invención incluye una composición como se define en la reivindicación independiente 1, comprendiendo dicha composición un polvo de membrana amniótica y un armazón, en donde el armazón es un hidrogel, en donde el hidrogel comprende PEGDMal.

En una realización, la composición de la invención está exenta de células, minimizando así las posibles respuestas inflamatorias en el sujeto al que se administra. El producto de cicatrización de heridas de la invención tiene una alta eficacia clínica sin precisar un componente celular, sin embargo, el producto para la cicatrización de heridas de la invención conserva la bioactividad de un tratamiento celular.

El polvo de membrana amniótica se incorpora dentro del hidrogel. En una realización, el armazón a base de membrana amniótica de la invención potencia la regeneración de tejidos. En otra realización adicional, el armazón a base de membrana amniótica de la invención reduce la contracción de tejidos. En otra realización adicional, el armazón a base de membrana amniótica potencia el desarrollo de vasos sanguíneos en tejido en regeneración.

En otra realización, el polvo de membrana amniótica se incorpora dentro de un hidrogel a base de ácido hialurónico (AH).

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, se describen los métodos y materiales preferidos.

Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con él en esta sección.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

"Aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± el 20% o ± el 10%, más preferentemente ± el 5%, incluso más preferentemente ± el 1 %, y aún más preferentemente ± el 0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

Como se usa en el presente documento, el término "AMNIOGRAFT®" se refiere al aloinjerto de membrana amniótica vendido por Bio-Tissue, Inc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "armazón a base de membrana amniótica" se refiere a un armazón que puede usarse junto con polvo de membrana amniótica o solución amniótica. Por ejemplo, dicho armazón se puede mezclar con polvo de membrana amniótica antes de su uso, o se puede aplicar a una herida sobre el polvo de membrana amniótica o la solución amniótica ya aplicada a tal herida.

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición de polvo de membrana amniótica" se refiere a una composición que comprende polvo amniótico.

Como se usa en este caso, "biocompatible" se refiere a cualquier material, el cual, cuando se implanta en un mamífero, no provoca una respuesta adversa en el mamífero. Un material biocompatible, cuando se introduce en un individuo, no es tóxico o nocivo para el individuo, ni induce rechazo inmunológico del material en el mamífero.

El término "descelularizado" o "descelularización" como se usa en el presente documento se refiere a una bioestructura (por ejemplo, un órgano, o parte de un órgano), de la cual se ha eliminado el contenido celular y tisular dejando una infraestructura acelular intacta. Órganos tales como el riñón están compuestos por diversos tejidos especializados. Las estructuras tisulares especializadas de un órgano, o parénquima, proporcionan la función específica asociada con el órgano. La red fibrosa de soporte del órgano es el estroma. La mayoría de los órganos tienen una estructura estromal compuesta por tejido conector no especializado que soporta el tejido especializado. El proceso de descelularización elimina el tejido especializado, dejando atrás la compleja red tridimensional de tejido conectivo. La infraestructura del tejido conectivo se compone principalmente de colágeno. La estructura descelularizada incluye un sustrato biocompatible sobre el que se pueden infundir distintas poblaciones celulares. Las bioestructuras descelularizadas pueden ser rígidas o semirrígidas, teniendo la capacidad de modificar sus formas. Los ejemplos de órganos descelularizados útiles en aspectos de la presente invención incluyen, pero no se limita a, el corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra, cartílago, hueso, cerebro, médula espinal, nervio periférico.

La expresión "derivado de" se utiliza en el presente documento para referirse a originarse a partir de una fuente específica.

Una "enfermedad" es el estado físico de un animal en donde el animal no puede mantener la homeostasis y en donde si la enfermedad no mejora, la salud del animal continúa deteriorándose.

Por el contrario, un "trastorno" en un animal es un estado físico en el que el animal puede mantener la homeostasis, pero en el que el estado físico del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si se deja sin tratar, un trastorno no necesariamente provoca una disminución adicional en la salud del animal.

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es la cantidad de compuesto que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al sujeto al que se administra el compuesto. Una "cantidad eficaz" de un vehículo de suministro es la cantidad suficiente para unirse a o suministrar eficazmente un compuesto.

Como se usa en el presente documento, la expresión "parche electrohilado(Electrospun Patch)"se refiere a dextrano electrohilado con material procedente de membrana amniótica que no contiene amnios.

Como se usa en el presente documento, "endógeno" se refiere a cualquier material de o producido dentro de un organismo, célula o sistema.

"Exógeno" se refiere a cualquier material introducido o producido fuera de un organismo, célula, o sistema.

Como se usa en el presente documento, "composición de matriz extracelular'' incluye tanto fracciones solubles como no solubles o cualquier porción de las mismas. La fracción no soluble incluye las proteínas de MEC secretadas y componentes biológicos que se depositan en el soporte o armazón. La fracción soluble incluye y se refiere a medios de cultivo en los que se han cultivado células y en los que las células han secretado un agente activo (o agentes activos) e incluye las proteínas y componentes biológicos no depositados sobre el armazón. Ambas fracciones pueden recogerse, y opcionalmente procesarse adicionalmente, y usarse individualmente o en combinación en una diversidad de aplicaciones como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "gel" se refiere a una estructura polimérica tridimensional que en sí misma es insoluble en un líquido particular pero que es capaz de absorber y retener grandes cantidades del líquido para formar una estructura estable, a menudo suave y flexible, pero siempre, en un grado u otro, una estructura retentiva de la forma. Cuando el líquido es agua, el gel se denomina hidrogel. A menos que se indique expresamente otra cosa, el término "gel" se utiliza en la presente solicitud para referirse tanto a estructuras poliméricas que han absorbido un líquido distinto del agua como a estructuras poliméricas que han absorbido agua, siendo fácilmente evidente para los expertos en la materia por el contexto si la estructura polimérica es simplemente un "gel" o un "hidrogel".

Como se usa en el presente documento, un "injerto" se refiere a una célula, tejido u órgano que se implanta en un individuo, normalmente para sustituir, corregir o de otro modo superar un defecto. Un injerto puede comprender además un armazón. El tejido u órgano puede consistir en células que se originan en el mismo individuo; este injerto se denomina en el presente documento mediante los siguientes términos y expresiones intercambiables: "autoinjerto", "trasplante autólogo", "implante autólogo" e "injerto autólogo". Un injerto que comprende células de un individuo genéticamente distinto de la misma especie se denomina en el presente documento mediante los siguientes términos y expresiones intercambiables: "aloinjerto", "trasplante alogénico", "implante alogénico", e "injerto alogénico". Un injerto de un individuo a su gemelo idéntico se denomina en el presente documento "isoinjerto", "trasplante singénico", "implante singénico" o "injerto singénico". Un "xenoinjerto", "trasplante xenogénico", o "implante xenogénico" se refiere a un injerto de un individuo a otro de una especie distinta.

Como se usa en el presente documento, "GRAFTJACKET®" se refiere a un armazón vendido por Wright Medical Technology, Inc. Comprende componentes de sustratos biológicos que incluyen colágeno tipo I, III, IV y VII, elastina, condroitina sulfato, proteoglucanos, ácido hialurónico, laminina, tenacina y factor de crecimiento de fibroblastos.

Como se usa en el presente documento, "un factor de crecimiento" pretende incluir los siguientes factores no limitantes que incluyen, pero sin limitación, hormona de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, factor estimulador de colonias de macrófagos, ligando de c-kit/factor de células madre, ligando de osteoprotegerina, insulina, factores insulínicos de crecimiento, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante (TGF-beta), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y proteína morfogenética ósea en concentraciones de entre niveles de picogramos/ml a miligramos/ml.

Como se usa en el presente documento, la expresión "materiales precursores de hidrogel" se refiere a biopolímeros hidrófilos o polímeros sintéticos, o una mezcla de los mismos, se usan para fabricar un hidrogel al hacer reaccionar los materiales precursores con un reticulante. Los biopolímeros hidrófilos o el polímero sintético pueden modificarse para facilitar mejor la reacción de reticulación. Un ejemplo no limitante de modificación es la tiolación (por ejemplo, la incorporación de grupos funcionales tiol).

"Células nativas", como se usa en el presente documento, significa células que son nativas, residentes o endógenas de la membrana placentaria, es decir, células que no se añaden de forma exógena a la membrana placentaria.

Los términos "paciente", "sujeto", "individuo", y similares se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a cualquier animal, o células del mismo,in vitrooin situ,susceptibles de los métodos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones no limitantes, el paciente, sujeto o individuo es un mamífero, y en otras realizaciones, el mamífero es un ser humano.

"Proliferación" se utiliza en el presente documento para referirse a la reproducción o multiplicación de formas similares, especialmente de células. Es decir, la proliferación abarca la producción de un mayor número de células y puede medirse mediante, entre otras cosas, simplemente el recuento del número de células, midiendo la incorporación de 3H-timidina en la célula, y similares.

"Progresión de o a través del ciclo celular" se usa en el presente documento para referirse al proceso mediante el cual una célula se prepara para y/o entra en mitosis y/o meiosis. La progresión a través del ciclo celular incluye la progresión a través de la fase G1, la fase S, la fase G2 y la fase M.

Como se usa en el presente documento, "armazón" se refiere a una estructura, que comprende un material biocompatible que proporciona una superficie adecuada para la adherencia y proliferación de células. Un armazón puede además proporcionar estabilidad mecánica y soporte. Un armazón puede tener una forma o configuración particular para influir o delimitar una forma o configuración tridimensional asumida por una población de células en proliferación. Tales formas o configuraciones incluyen, pero no se limita a, películas (por ejemplo, una forma dos dimensiones sustancialmente mayores que la tercera dimensión), cintas, cuerdas, láminas, discos planos, cilindros, esferas, formas amorfas tridimensionales, etc. Un ejemplo no limitante de un armazón es un hidrogel.

Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos de patología, con el fin de disminuir o eliminar estos signos.

Como se usa en el presente documento, "tratar una enfermedad o trastorno" significa reducir la frecuencia con la que un paciente experimenta un síntoma de la enfermedad o trastorno. Enfermedad y trastorno se usan indistintamente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "ingeniería de tejidos" se refiere al proceso de generar un tejidoex vivopara su uso en la sustitución o reconstrucción de tejidos. La ingeniería de tejidos es un ejemplo de "medicina regenerativa", que abarca enfoques para la reparación o sustitución de tejidos y órganos mediante la incorporación de células, genes u otros componentes biológicos básicos, junto con materiales y técnicas de bioingeniería.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "injerto de tejido" y "reconstrucción de tejido" se refieren a la implantación de un injerto en un individuo para tratar o aliviar un defecto de tejido, tal como un defecto pulmonar o un defecto de partes blandas.

"Trasplante" se refiere a una red biocompatible o un tejido, órgano o célula de donante a trasplantar. Un ejemplo de trasplante puede incluir, pero sin limitación, células o tejido de la piel, médula ósea y órganos sólidos tales como corazón, páncreas, riñón, pulmón e hígado.

El término "herida" como se usa en el presente documento se refiere a todo tipo de lesiones en los tejidos, incluidos los infligidos por cirugía y traumatismos, incluyendo quemaduras, así como lesiones por afecciones médicas crónicas, tales como la aterosclerosis, enfermedades vasculares o diabetes. Las composiciones descritas en el presente documento son útiles para el tratamiento de todo tipo de heridas, incluyendo heridas en tejidos internos y externos. Los apósitos para heridas están destinados a tratar las diversas etiologías de heridas que afectan las tres capas de la piel (es decir, la epidermis, dermis y capas subcutáneas).

Intervalos: A lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Ha de comprenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Composición

La presente invención incluye una composición de polvo de membrana amniótica como se define en la reivindicación independiente 1, comprendiendo dicha composición polvo de membrana amniótica para su uso en aplicaciones de cicatrización de heridas y regeneración de tejidos, comprendiendo además la composición un armazón, en donde el armazón es un hidrogel, en donde el hidrogel comprende PEGDMal.

La membrana amniótica, o amnios, es un tejido delgado que forma la pared del saco amniótico. Durante el embarazo, la membrana amniótica rodea y protege al embrión en desarrollo. La membrana amniótica comprende una membrana basal gruesa y una matriz estromal avascular.

En un aspecto, la composición comprende una cantidad de proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 40 mg/g a 450 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 50 mg/g a 400 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 60 mg/g a 350 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 70 mg/g a 300 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 80 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 90 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 110 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 120 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 130 mg/g a 250 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 140 mg/g a 250 mg/g.

En otro aspecto, la composición comprende una cantidad de elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 10 mg/g a 95 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 15 mg/g a 90 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 20 mg/g a 85 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 25 mg/g a 80 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 30 mg/g a 75 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 35 mg/g a 70 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 40 mg/g a 65 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 40 mg/g a 60 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 40 mg/g a 55 mg/g.

En otro aspecto más, la composición comprende una cantidad de colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 50 mg/g a 750 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 100 mg/g a 700 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 150 mg/g a 650 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 200 mg/g a 600 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 250 mg/g a 550 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 300 mg/g a 500 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 350 mg/g a 450 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 400 mg/g a 550 mg/g.

En otro aspecto más, la composición comprende una cantidad de glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,2 mg/g a 3,5 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,3 mg/g a 3,0 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,4 mg/g a 2,5 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,5 mg/g a 2,0 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,6 mg/g a 1,8 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,7 mg/g a 1,5 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,8 mg/g a 1,4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 0,9 mg/g a 1,3 mg/g.

En otro aspecto más, la composición comprende una cantidad de trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 50 pg/g a 950 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 50 pg/g a 400 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 75 pg/g a 900 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 100 pg/g a 850 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 125 pg/g a 800 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 150 pg/g a 750 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 175 pg/g a 700 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 200 pg/g a 650 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 225 pg/g a 600 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 250 pg/g a 550 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 275 pg/g a 500 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 300 pg/g a 450 pg/g.

En otro aspecto más, la composición comprende una cantidad de pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 1 pg/g a 45 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 1 pg/g a 40 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 2 pg/g a 40 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 3 pg/g a 35 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 4 pg/g a 40 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 5 pg/g a 35 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 6 pg/g a 30 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 7 pg/g a 25 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 8 pg/g a 25 pg/g. De manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 9 pg/g a 20 pg/g; de manera adecuada, la cantidad está en el intervalo de 10 pg/g a 15 pg/g.

En otro aspecto más, la composición comprende una cantidad de gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g. De manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 1,3 ng/g; de manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 1,1 ng/g; de manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 1,0 ng/g; de manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 0,7 ng/g; de manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 0,5 ng/g; de manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 0,3 ng/g; de manera adecuada, la cantidad de TSG-6 es inferior a 0,1 ng/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g y elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g.

De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g y la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g y la elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g y colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g y el colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g y el colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g y elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g.

De manera adecuada, la cantidad de colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g y la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g y la elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende glucosaminoglucano en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g y elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de glucosaminoglucanos está en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g y la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de glucosaminoglucanos está en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g y la elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g y colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g, la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g y el colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g, la elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g y el colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g, la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g, la elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g, el colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g, el colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g, el colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g, el colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g. De manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g, la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g, el colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 4 mg/g; de manera adecuada, la cantidad de proteína total está en el intervalo de 100 mg/g a 250 mg/g, la elastina está en el intervalo de 20 mg/g a 60 mg/g, el colágeno está en el intervalo de 100 mg/g a 600 mg/g y los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g, glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g y trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g, glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g y pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g, glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g y gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g.

En otro aspecto más, la composición comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g, glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g, trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g, pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g y gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g.

El método de preparación de polvo de membrana amniótica y la composición que comprende polvo de membrana amniótica se divulga en el documento PCT/US13/58940, presentada el 10 de septiembre de 2013.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden polvo de membrana amniótica. Como se describe en otra parte del presente documento, la presente invención se basa en el descubrimiento de que la membrana amniótica potencia la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos. Las formulaciones se pueden emplear en mezclas con ingredientes adicionales, por ejemplo, excipientes convencionales, es decir, sustancias transportadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración en la herida o el sitio de tratamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en los tampones para presión osmótica, colorantes y/o sustancias aromáticas y similares. También se pueden combinar cuando se desee con otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes analgésicos.

Como se usa en el presente documento, "ingredientes adicionales" incluyen, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: excipientes; agentes tensioactivos; agentes de dispersión; diluyentes inertes; agentes de granulación y disgregantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleosos; agentes de suspensión; agentes de dispersión o humectantes; agentes emulsionantes, emolientes; tampones; sales; agentes espesantes; cargas; agentes emulsionantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Se conocen en la técnica otros "ingredientes adicionales" que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de la invención y están descritos, por ejemplo, en Genaro, ed. (1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA).

La composición de la invención puede comprender un conservante de desde aproximadamente el 0,005 % al 2,0 % en peso total de la composición. El conservante se utiliza para evitar el deterioro en caso de exposición a contaminantes en el entorno.

Los ejemplos de conservantes útiles en conformidad con la invención incluyen, pero no se limitan a, los seleccionados del grupo que consiste en alcohol bencílico, ácido sórbico, parabenos, imidurea y combinaciones de los mismos. Un conservante particularmente preferido es una combinación de alcohol bencílico a aproximadamente del 0,5 % al 2,0 % y de ácido sórbico del 0,05%al 0,5 %.

En una realización, la composición incluye un antioxidante y un agente quelante que inhibe la degradación de uno o más componentes del polvo de membrana amniótica. Los antioxidantes preferidos para algunos compuestos son BHT, BHA, alfa-tocoferol y ácido ascórbico en el intervalo preferido de aproximadamente del 0,01 % al 0,3 % y más preferentemente BHT en el intervalo del 0,03 % al 0,1 % en peso por peso total de la composición. Preferentemente, el agente quelante está presente en una cantidad del 0,01 % al 0,5 % en peso del peso total de la composición. Los agentes quelantes particularmente preferidos incluyen sales de edetato (por ejemplo, edetato de disodio) y ácido cítrico en el intervalo de pesos de aproximadamente el 0,01 % al 0,20 % y más preferentemente en el intervalo del 0,02 % al 0,10% en peso del peso total de la composición. El agente quelante es útil para quelar iones metálicos en la composición que pueden ser perjudiciales para el período de estabilidad de la formulación. Si bien el BHT y el edetato de disodio son los agentes antioxidantes y quelantes particularmente preferidos respectivamente para algunos compuestos, pueden sustituirse por otros antioxidantes y agentes quelantes adecuados y equivalentes, como saben los expertos en la materia.

Una composición farmacéutica de la invención también puede prepararse, envasarse o venderse en forma de emulsión de aceite en agua o de emulsión de agua en aceite. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal tal como el aceite de oliva o de cacahuete, un aceite mineral tal como parafina líquida, o una combinación de estos. Tales composiciones pueden comprender además uno o más agentes emulsionantes tales como gomas de origen natural tales como goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos de origen natural tales como fosfátidos de soja o de lecitina, ésteres o ésteres parciales derivados de combinaciones de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como monooleato de sorbitán, y productos de condensación de tales ésteres parciales con óxido de etileno tales como monooleato de polioxietilensorbitán. Estas emulsiones también pueden contener ingredientes adicionales que incluyen, por ejemplo, agentes edulcorantes o aromatizantes.

Los métodos para impregnar o recubrir un material con una composición química son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos para depositar o unir una composición química sobre una superficie, métodos de incorporación de una composición química en la estructura de un material durante la síntesis del material (es decir, tal como con un material fisiológicamente degradable), y métodos de absorción de una solución o suspensión acuosa u oleosa en un material absorbente, con o sin secado posterior.

En determinados casos, un beneficio de la composición de la presente invención es que tiene la capacidad de rellenar heridas irregulares y profundas. Por tanto, en una realización, la composición farmacéutica se puede aplicar por vía tópica a una herida o a un sitio que necesite regeneración tisular.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, pero no se limita a, preparaciones líquidas o semilíquidas tales como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite tales como cremas, pomadas o pastas, y soluciones o suspensiones. Las formulaciones que se pueden administrar por vía tópica pueden comprender, por ejemplo, desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 % (p/p) de principio activo, aunque la concentración del principio activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del principio activo en el disolvente. Las formulaciones para la administración tópica pueden comprender adicionalmente uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.

Se pueden utilizar potenciadores de la permeabilidad. Estos materiales aumentan la tasa de penetración de fármacos a través de la piel. Los potenciadores típicos en la técnica incluyen etanol, monolaurato de glicerol, PGML (monolaurato de polietilenglicol), dimetilsulfóxido, y similares. Otros potenciadores incluyen el ácido oleico, alcohol oleílico, etoxidiglicol, laurocapram, ácidos alcanocarboxílicos, dimetilsulfóxido, lípidos polares, o N-metil-2-pirrolidona.

Un vehículo aceptable para el suministro tópico de algunas de las composiciones de la invención puede contener liposomas. La composición de los liposomas y su uso son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. n.° 6.323.219).

En realizaciones alternativas, las formulaciones adecuadas para administración tópica pueden combinarse opcionalmente con otros ingredientes tales como adyuvantes, antioxidantes, agentes quelantes, tensioactivos, agentes espumantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, viscosificadores, agentes tamponantes, conservantes, y similares. En otra realización, se incluye en la composición un potenciador de la impregnación o penetración que es eficaz para mejorar la penetración percutánea de los componentes de la membrana amniótica en y a través del estrato córneo con respecto a una composición que carece del potenciador de la impregnación. Los expertos en la materia conocen diversos potenciadores de la permeación, que incluyen el ácido oleico, el alcohol oleílico, el etoxidiglicol, el laurocapram, los ácidos alcano-carboxílicos, el dimetilsulfóxido, los lípidos polares o la N-metil-2-pirrolidona. En otro aspecto, la composición puede comprender además un agente hidrotrópico, que actúa aumentando el desorden en la estructura del estrato córneo y permite de esta manera el aumento de transporte a través del estrato córneo. Los expertos en la materia conocen diversos agentes hidrópicos, tales como el alcohol isopropílico, el propilenglicol o el sulfonato de xileno de sodio.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica deben aplicarse en una cantidad eficaz para lograr los cambios deseados. Como se usa en el presente documento "cantidad eficaz" significará una cantidad suficiente para cubrir la región de superficie cutánea en la que se desea un cambio. Un compuesto activo debería estar presente en una cantidad de desde aproximadamente el 0,0001 % a aproximadamente el 15% en peso del volumen de la composición. Más preferentemente, debería estar presente en una cantidad de desde aproximadamente el 0,0005 % a aproximadamente el 5 % de la composición; muy preferentemente, debería estar presente en una cantidad de desde aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1 % de la composición. Dichos compuestos pueden ser de origen sintético o natural.

En otra realización, la composición farmacéutica que comprende polvo de membrana amniótica se puede aplicar a un vendaje o apósito, que luego se aplica a la herida o sitio de tratamiento de un sujeto. Por ejemplo, en una realización, un apósito se empapa en una solución líquida o suspensión líquida que comprende polvo de membrana amniótica. En otra realización, se aplica una pomada que comprende polvo de membrana amniótica a la superficie de un apósito o vendaje.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende una solución o suspensión atomizada o en aerosol que comprende una membrana amniótica en polvo. Dichos aerosoles o formulaciones en aerosol, cuando se dispersan, tienen preferentemente un tamaño promedio de partícula o gotita en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 nanómetros, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Los ejemplos de formulaciones descritas en el presente documento no son exhaustivos y se entiende que la invención incluye modificaciones adicionales de estas y otras formulaciones no descritas en el presente documento, pero que los expertos en la materia conocen.

Armazones a base de membrana amniótica

La presente invención incluye un armazón a base de membrana amniótica útil en la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos. Por ejemplo, en una realización, el polvo de membrana amniótica se incorpora dentro de un armazón. En algunos casos, el polvo de membrana amniótica se aplica a la superficie de un armazón o se mezcla en el sitio con el armazón. En una realización, el armazón se aplica a la superficie de la herida sobre el polvo de membrana amniótica o se aplica una composición que comprende polvo de membrana amniótica y un armazón a la superficie de la herida. Por ejemplo, cuando el armazón es un hidrogel, que está conforme a la invención reivindicada, el hidrogel se aplica a la superficie de la herida directamente sobre el polvo de membrana amniótica o se aplica una composición que comprende polvo de membrana amniótica a la superficie de la herida. El armazón de la invención es un hidrogel, en donde el hidrogel comprende PEGDMal.

En una realización, el armazón puede comprender cualquier polisacárido, incluyendo glucosaminoglucanos (GAG) o glicosaminoglucanos, con una viscosidad, masa molecular y otras propiedades deseables adecuadas. Glucosaminoglucano se refiere a cualquier glucano (es decir, polisacárido) que comprenda una cadena de polisacárido no ramificado con una unidad de disacárido repetitiva, siempre que uno de los cuales sea siempre un aminoazúcar. Estos compuestos como clase tienen una alta carga negativa, son fuertemente hidrófilos y comúnmente se les llama mucopolisacáridos. Este grupo de polisacáridos incluye heparina, heparán sulfato, condroitina sulfato, dermatán sulfato, queratán sulfato y ácido hialurónico. Estos GAG se encuentran predominantemente en las superficies celulares y en la matriz extracelular. Por glucosaminoglucano también se entiende cualquier glucano (es decir, polisacárido) que contenga predominantemente derivados de monosacáridos en los que un grupo hidroxilo alcohólico se ha sustituido por un grupo amino u otro grupo funcional tal como sulfato o fosfato. Un ejemplo de un glucosaminoglucano es el poli-N-acetil glucosaminoglucano, comúnmente denominado quitosano. Los ejemplos de polisacáridos que pueden ser útiles en la presente invención incluyen dextrano, heparán, heparina, ácido hialurónico, alginato, agarosa, carragenano, amilopectina, amilosa, glucógeno, almidón, celulosa, quitina, quitosano y diversos polisacáridos sulfatados tales como heparán sulfato, condroitina sulfato, sulfato de dextrano, dermatán sulfato o queratán sulfato.

(a) Hidrogeles

La presente invención incluye una composición que comprende un hidrogel y un polvo de membrana amniótica. Los hidrogeles generalmente pueden absorber una gran cantidad de líquido y, en equilibrio, normalmente están compuestos de un 60 al 99 % de líquido y solo de un 1 al 40 % de polímero. En algunos casos, el contenido de agua del hidrogel es de aproximadamente el 99 %. En otros casos, el contenido de agua del hidrogel es de aproximadamente el 70-90 %. Los hidrogeles son particularmente útiles debido a la biocompatibilidad inherente de la red polimérica reticulada (Hill-West,et al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5967-5971). La biocompatibilidad de los hidrogeles se puede atribuir a la hidrofilia y la capacidad de absorber grandes cantidades de líquidos biológicos (Brannon-Peppas. Preparation and Characterization of Cross-linked Hydrophilic Networks in Absorbent Polymer Technology, Brannon-Peppas and Harland, Eds. 1990, Elsevier: Ámsterdam, pág. 45-66; Peppas y Mikos. Preparation Methods and Structure of Hydrogels in Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Peppas, Ed. 1986, CRC Press: Boca Raton, Fla., pág. 1-27). Los hidrogeles pueden prepararse reticulando biopolímeros hidrófilos o polímeros sintéticos o ambos. En otras palabras, los hidrogeles se preparan haciendo reaccionar materiales precursores con reticulantes, en donde los materiales precursores son biopolímeros hidrófilos o polímeros sintéticos o ambos. Ejemplos de hidrogeles formados por reticulación física o química de biopolímeros hidrófilos, incluyen, pero sin limitación, hialuronanos, quitosanos, gelatina, alginatos, colágeno, dextrano, pectina, carragenano, polilisina, gelatina o agarosa, (véase: W. E.

Hennink y C. F. van Nostrum, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 54, 13-36 y A. S. Hoffman, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 43, 3 12). Estos materiales consisten en cadenas principales de alto peso molecular hechas de polisacáridos o polipéptidos lineales o ramificados. Los ejemplos de hidrogeles basados en polímeros sintéticos de reticulación química o física incluyen, pero sin limitación, (met)acrilato-oligolactida-PEO-oligolactida-(met)acrilato, poli(etilenglicol) (PEO), polipropilenglicol) (PPO), copolímeros de PEO-PPO-PEO (Pluronics), poli(fosfaceno), poli(metacrilatos), poli(N-vinilpirrolidona), copolímeros de PL(G)A-PEO-PL(G)A, poli(etilenimina), etc. (véase A. S Hoffman, 2002 Adv. Drug Del. Rev, 43, 3-12).

Hay muchos tipos de reticulantes conocidos en la técnica (Fei,et al.,2000, Journal of Applied Polymer Science, 78: 278-283; Hennink,et al.,2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 13-36; Janik,et al.,2008, Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section B-Beam Interactions with Materials and Atoms, 208: 374-379; Liu,et al.,2005, Radiation Physics and Chemistry 72: 635-638; Nagasawa,et al.,2004, Carbohydrate Polymers, 58: 109-113; Onuki,et al,2008, International Journal of Pharmaceutics, 349: 47-52; Shen,et al.,2006, Polymer Bulletin, 56: 137-143; Shu,et al.,2004, Biomaterials, 25: 1339-1348). De acuerdo con la invención reivindicada, se utiliza PEGDMal como reticulante. En determinadas realizaciones, se puede utilizar más de reticulante para fabricar hidrogeles. Dichos reticulantes pueden incluir, pero sin limitación, glutaraldehído, epóxidos (por ejemplo, bis-oxiranos), dextrano oxidado, p-azidobenzoil hidrazida, ester de N-[a-maleimidoacetoxi]succinimida, monohidrato de p-azidofenil glioxal, bis-[p-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro, bis[sulfosuccinimidilo]suberato, ditiobis[succinimidil propionato, disuccinimidil suberato, clorhidrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA) y otros reactivos de reticulación bifuncionales conocidos por los expertos en la materia. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las propiedades mecánicas del hidrogel están muy influenciadas por el tiempo de reticulación y la cantidad de agentes de reticulación. De acuerdo con la invención reivindicada, el reticulante es un reticulante a base de poli (etilenglicol) con grupos funcionales de maleimida (PEGDMal).

En una realización, el hidrogel comprende al menos un biopolímero. En otras realizaciones, el armazón de hidrogel comprende además al menos dos biopolímeros. En otras realizaciones más, el armazón de hidrogel comprende además al menos un biopolímero y al menos un polímero sintético. En una realización, el hidrogel de la presente invención comprende ácido hialurónico, gelatina y PEGDMal.

En una realización, se modifican los componentes del hidrogel de la invención. Por ejemplo, en una realización, los monómeros pueden modificarse con anhídrido metacrílico (MA); en otra realización, los monómeros o los materiales precursores de hidrogel pueden estar tiolados (por ejemplo, incorporando grupos tiol funcionales).

Los hidrogeles y los métodos para su preparación que se pueden usar en la presente invención se han divulgado en la solicitud de patente PCT/US13/58940, presentada el 10 de septiembre de 2013.

Los hidrogeles se parecen mucho a la matriz extracelular viva natural (Ratner y Hoffman. Synthetic Hydrogels for Biomedical Applications in Hydrogels for Medical and Related Applications, Andrade, Ed. 1976, American Chemical Society: Washington, D. C., pág. 1-36). Los hidrogeles también pueden degradarsein vivoal incorporar polímeros de PLA, PLGA o PGA. Además, los hidrogeles pueden modificarse con fibronectina, laminina, vitronectina o, por ejemplo, RGD, para la modificación de la superficie, lo que puede propiciar la adhesión y proliferación celular (Heungsoo Shin, 2003, Biomaterials 24: 4353-4364; Hwanget al.,2006 Tissue Eng. 12: 2695-706). En efecto, modificar los pesos moleculares, las estructuras de bloques, los enlaces degradables y los modos de reticulación pueden influir en la fuerza, la elasticidad y las propiedades de degradación de los hidrogeles instantáneos (Nguyen y West, 2002, Biomaterials 23(22): 4307-14; Ifkovits y Burkick, 2007, Tissue Eng. 13(10): 2369-85).

Los hidrogeles también se pueden modificar con grupos funcionales para unir covalentemente una diversidad de proteínas (por ejemplo, colágeno) o compuestos tales como agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos que pueden estar unidos a la matriz incluyen, pero no se limita a, analgésicos, anestésicos, antifúngicos, antibióticos, antinflamatorios, antihelmínticos, antídotos, antieméticos, antihistamínicos, antihipertensivos, antipalúdicos, antimicrobianos, antipsicóticos, antipiréticos, antisépticos, antiartríticos, antituberculosos, antitusivos, antivíricos, fármacos cardioactivos, laxantes, agentes quimioterapéuticos, un agente de obtención de imágenes coloreado o fluorescente, corticoides (tales como esteroides), antidepresivos, depresivos, ayudas de diagnóstico, diuréticos, enzimas, expectorantes, hormonas, hipnóticos, minerales, suplementos nutritivos, parasimpaticomiméticos, suplementos de potasio, sensibilizantes a radiación, un radioisótopo, sedantes, sulfonamidas, estimulantes, simpaticomiméticos, ansiolíticos, antiinfecciosos urinarios, vasoconstrictores, vasodilatadores, vitaminas, derivados de xantina y similares. El agente terapéutico también puede ser otras moléculas orgánicas pequeñas, entidades aisladas naturalmente o sus análogos, agentes organometálicos, metales quelados o sales metálicas, fármacos a base de péptidos o agentes de unión o dirigidos a receptores peptídicos o no peptídicos.

Se contempla que el enlace del agente terapéutico a la matriz puede ser a través de un enlace sensible a proteasas u otro enlace biodegradable. Las moléculas que se pueden incorporar en la matriz de hidrogel incluyen, pero no se limita a, vitaminas y otros suplementos nutricionales; glucoproteínas (por ejemplo, colágeno); fibronectina; péptidos y proteínas; hidratos de carbono (tanto simples como complejos); proteoglucanos; antígenos; oligonucleótidos (ADN y/o ARN sentido y/o antisentido); anticuerpos (por ejemplo, para agentes infecciosos, tumores, fármacos u hormonas); y reactivos de terapia génica.

La matriz de hidrogel reticulada estabilizada de la presente invención se puede estabilizar y potenciar adicionalmente mediante la adición de uno o más agentes potenciadores. Por "agente potenciador" o "agente estabilizante" se entiende cualquier compuesto añadido a la matriz de hidrogel, además de los componentes de alto peso molecular, que potencie la matriz de hidrogel proporcionando mayor estabilidad o ventajas funcionales. Los agentes potenciadores adecuados, que se mezclan con componentes de alto peso molecular y se dispersan dentro de la matriz de hidrogel, incluyen muchos de los aditivos descritos anteriormente en relación con la matriz termorreversible analizada anteriormente.

El agente potenciador puede incluir cualquier compuesto, especialmente compuestos polares que, cuando se incorpora a la matriz de hidrogel reticulada, potencia la matriz de hidrogel proporcionando mayor estabilidad o ventajas funcionales.

Los agentes potenciadores preferidos para su uso con la matriz de hidrogel reticulada estabilizada incluyen aminoácidos polares, análogos de aminoácidos, derivados de aminoácidos, colágeno intacto y quelantes de cationes divalentes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sales del mismo. Los aminoácidos polares incluyen la tirosina, cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos polares preferidos son L-cisteína, ácido L-glutámico, L-lisina y L-arginina. Las concentraciones adecuadas de cada agente potenciador preferido particular son las mismas que se han indicado anteriormente en relación con la matriz de hidrogel termorreversible. Los aminoácidos polares, el EDTA y las mezclas de los mismos, son los agentes potenciadores preferidos. Los agentes potenciadores pueden añadirse a la composición de la matriz antes o durante la reticulación de los componentes de alto peso molecular.

Los agentes potenciadores son particularmente importantes en la matriz de hidrogel bioactiva reticulada estabilizada debido a las propiedades inherentes que propician dentro de la matriz. La matriz de hidrogel presenta una bioactividad intrínseca que se hará más evidente a través de las realizaciones adicionales que se describen en lo sucesivo en el presente documento. Se cree que la bioactividad intrínseca es una función de la estereoquímica única de las macromoléculas reticuladas en presencia de los aminoácidos polares potenciadores y reforzadores, así como otros agentes potenciadores.

En una realización, el polvo de membrana amniótica se incorpora al hidrogel. Por ejemplo, el polvo de membrana amniótica se puede añadir o mezclar con la solución de hidrogel antes de la gelificación o polimerización del gel. El polvo de membrana amniótica se puede añadir a una solución de hidrogel en cualquier cantidad deseada para producir el efecto deseado. En una realización, se aplica directamente una cantidad eficaz de polvo de membrana amniótica a una herida, luego se aplica un hidrogel encima del polvo de membrana amniótica. En algunas realizaciones, el hidrogel permite la difusión de los componentes de la membrana amniótica hacia el hidrogel y por todo el mismo.

(b) Método para formar armazones

En la solicitud de patente PCT/US13/58940, presentada el 10 de septiembre de 2013, se ha divulgado un método de preparación de armazones que se pueden utilizar con la presente invención.

Agente terapéutico

Una aplicación descrita en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, es un método para propiciar el cierre de una herida en un paciente usando la composición de la invención. En una realización, este método es útil para el cuidado clínico y personal de heridas y la regeneración de partes blandas. En conformidad con el método, la composición que comprende polvo de membrana amniótica se transfiere a una herida. El método propicia el cierre de heridas tanto externas (por ejemplo, superficiales) como internas. Las heridas para las que el método descrito en el presente documento es útil para propiciar el cierre incluyen, pero no se limita a, rozaduras, avulsiones, neumotórax abierto, heridas por quemadura, contusiones, heridas por arma de fuego, heridas por incisión, heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas punzantes, heridas en sedal, heridas por arma blanca, heridas quirúrgicas, heridas subcutáneas o heridas tangenciales. No es necesario que el método consiga la curación o el cierre completo de la herida; es suficiente que el método sirva para propiciar cualquier grado de cierre de la herida. En este sentido, el método puede emplearse solo o como complemento de otros métodos para curar tejido herido.

En una realización, la composición que comprende polvo de membrana amniótica se aplica directamente a una herida o sitio de tratamiento de un sujeto. Como se describe en otra parte del presente documento, el polvo de membrana amniótica se puede incorporar en una formulación farmacéutica que incluye pomadas tópicas, cremas, aerosoles y similares.

En una realización descrita en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, el método comprende el uso de un armazón a base de membrana amniótica, descrito en otra parte en el presente documento, como apósito para heridas o injerto para heridas cutáneas externas. En un contexto clínico, el armazón se puede utilizar para tratar heridas que sean el resultado de un traumatismo, quemaduras, úlceras, rozaduras, desgarros, cirugía u otros daños. Los cirujanos pueden usar estos armazones para cubrir y proteger la superficie de la herida, para sustituir temporalmente el tejido cutáneo perdido o dañado, y para guiar la generación de tejido nuevo y la cicatrización de heridas en la superficie dañada. En un contexto clínico, en algunas realizaciones, el armazón se puede sujetar a la superficie de la herida usando suturas, adhesivos o vendajes superpuestos. El armazón se puede cortar para que coincida con el tamaño de la herida o se puede superponer a los bordes de la herida. En algunos casos, el armazón se puede moldear para penetrar en las cavidades formadas por heridas profundas.

En una realización, se aplica un hidrogel en un estado fluido a una herida o sitio de tratamiento. En algunos casos, el hidrogel se polimeriza en la herida o el sitio de tratamiento. En una realización, el hidrogel se induce a polimerizar instantáneamente antes de su uso, por ejemplo, a través de PEGDMal. En otra realización, el hidrogel se forma en el sitio de tratamiento instantáneamente utilizando una jeringa de doble cámara o similar, en donde una cámara contiene un reticulante, mientras que el otro contiene un biopolímero o un polímero sintético o ambos. En otra realización, el hidrogel se aplica a una herida inmediatamente después de aplicar a dicha herida una composición que comprende polvo de membrana amniótica.

En otro aspecto, la invención se refiere a un envase de kit para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto. El envase tiene dos compartimentos con una barrera o similar para separarlos. En otras palabras, el envase tiene un recinto y una barrera que separa el recinto en dos compartimentos. En una realización, los dos compartimentos son del mismo tamaño. En otra realización, los dos compartimentos son de tamaño distinto. En otra realización adicional, un compartimento encierra al otro compartimento. En una realización, un compartimento del envase contiene una cantidad predeterminada de materiales precursores de hidrogel; el otro compartimento contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende polvo de membrana amniótica y una composición que comprende un reticulante. En otra realización, un compartimento del envase contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende polvo de membrana amniótica y materiales precursores de hidrogel y el otro compartimento contiene una composición que comprende un reticulante. En otra realización adicional, un compartimento contiene una cantidad predeterminada de materiales precursores de hidrogel hidratados y una composición que comprende polvo de membrana amniótica; el otro compartimento contiene una composición que comprende un reticulante.

La barrera debe ser lo suficientemente fuerte para mantener los sellos entre los compartimentos durante la manipulación normal. Al mismo tiempo, la barrera debe ser susceptible de un medio de ruptura en el momento de su uso. La ruptura de la barrera se logra agarrando el envase por el medio y tirando o sacudiendo rápidamente desde ambos extremos. Como alternativa, la barrera se puede romper apretando, girando un tapón, presionando un émbolo, agitando vigorosamente o presionando los compartimentos. Una vez rota la barrera, el polvo de membrana amniótica de un compartimento puede mezclarse con el hidrogel que contiene o formarsein situ.

Como alternativa, la barrera funciona como una válvula con un control fuera del envase para abrir la barrera justo antes de su uso. En este caso, no es necesario romper la barrera.

En otra realización, el envase tiene un compartimento. Dicho compartimento comprende una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel recubiertos con un material soluble en agua y un reticulante. Todos estos componentes están en forma desecada para que los materiales precursores de hidrogel recubiertos con un material soluble en agua no reaccionen con el reticulante. Inmediatamente antes del uso, se añade agua al envase que disuelve el recubrimiento. Los materiales precursores de hidrogel expuestos reaccionan luego con el reticulante para formar un hidrogel. En un ejemplo no limitante, el material de recubrimiento soluble en agua es gelatina.

En otra realización adicional, el envase tiene un compartimento. Dicho compartimento comprende una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel y un reticulante recubierto con un material soluble en agua. Todos estos componentes están en forma desecada para que los materiales precursores de hidrogel no reaccionen con el reticulante recubierto con un material soluble en agua. Inmediatamente antes del uso, se añade agua al envase que disuelve el recubrimiento. El reticulante expuesto reacciona luego con los materiales precursores del hidrogel para formar un hidrogel. En un ejemplo no limitante, el material de recubrimiento soluble en agua es gelatina.

En otra realización adicional, el envase también tiene un compartimento. El compartimento comprende una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel y un reticulante. Los materiales precursores de hidrogel y el reticulante se desecan a partir de una solución que tiene un pH inferior a 7. En determinadas realizaciones, el pH está en el intervalo de 0,1 a 6,5. En un ejemplo, el pH es de 6; o 5; o 4; o 3; o 2; o 1. Inmediatamente antes del uso, se añade agua básica al envase para neutralizar la solución resultante a aproximadamente pH = 7, después de lo cual los materiales precursores del hidrogel y el reticulante reaccionan para formar el hidrogel.

En otra realización adicional, el envase está sellado al vacío y comprende además materiales desecantes.

El envase del kit es beneficioso para aumentar el tiempo de almacenamiento, mantener las temperaturas de almacenamiento adecuadas, el mantenimiento de los componentes bioactivos y para proporcionar un tiempo conveniente para la formación del hidrogel y la aplicación del producto al sujeto.

En una realización, el recinto está fabricado de polietileno, polipropileno, poliéster aluminio, película de polímero aluminizado y otros plásticos convencionales u otros materiales de envasado adecuados para la presente invención.

En una realización, la barrera está fabricada de polietileno, polipropileno, poliéster aluminio, película de polímero aluminizado, gelatina y otros plásticos convencionales u otros materiales de envasado adecuados para la presente invención.

En una realización, el envase de kit tiene un indicador para indicar que la barrera o similar está rota. En un caso, el indicador es un colorante dependiente del pH (tal como el rojo fenol). Al mezclar el pH se equilibra a 7, dando como resultado el color correcto.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

La invención se describe ahora con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a estos Ejemplos, sino que debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento. Solo los ejemplos que comprenden el polvo de membrana amniótica en combinación con un armazón de hidrogel que comprende PEGDMal están de acuerdo con la invención reivindicada. Otros ejemplos deben considerarse como ejemplos de referencia.

Procedimiento general de preparación de polvo de membrana amniótica

La placenta humana donada se recogió y almacenó a 4°C hasta su uso posterior. La membrana amniótica (avascular/interna) se disecó manualmente de la membrana coriónica (vascular/externa). Se eliminaron todos los coágulos de sangre que estuvieren presentes. La membrana se lavó con 500-1000 ml de solución salina estéril.

Utilizando tijeras y pinzas estériles, se cortó la membrana amniótica en trozos de aproximadamente 5x5 cm. A continuación, los trozos de amnios se transfirieron a un recipiente estéril de 500 ml y se lavaron cinco veces con 100 ml de solución salina estéril. A continuación, los trozos se lavaron con 500 ml de agua estéril.

Los trozos de amnios se transfirieron a tubos de 50 ml. Durante la transferencia, los trozos se deslizaron a lo largo del borde del recipiente de 500 ml para eliminar la mayor cantidad de agua posible de cada trozo. Cada tubo de 50 ml se llenó hasta un máximo de 25 ml. Los tubos de 50 ml que contenían los trozos de amnios se mantuvieron a -80 °C durante 12-24 horas.

Se retiraron las tapas de los tubos de 50 ml y se cubrieron los tubos con parafilm. Se perforaron varios agujeros pequeños en el parafilm. Los tubos se colocaron en un recipiente liofilizador de vidrio preenfriado y se liofilizaron durante 48-72 horas.

Se rellenó un congelador/molino SPEX® SAMPLEPREP®8970 con nitrógeno líquido. Los trozos de membrana amniótica liofilizados se colocaron en la cámara del congelador/molino. Los trozos de membrana se molieron durante 3 ciclos de 5 minutos de enfriamiento, 5 minutos de molienda. A continuación, el polvo se irradió con rayos gamma durante 1 hora a 1 mega rad y luego se almacenó en alícuotas a -80 °C hasta su uso posterior.

Experimentos de comparación

Se ha llevado a cabo un estudio de comparación entre el polvo de membrana amniótica incluido en las composiciones de la presente invención (en lo sucesivo en el presente documento "PMA") y el producto obtenido de membrana amniótica descrito en Tseng,et al.,documento US 2007/0071740 A1 (en lo sucesivo en el presente documento "Producto de Tseng").

Etapas de preparación del PMA:

1. Recoger la placenta humana donada. Conservar a 4 °C hasta su uso.

2. Disecar manualmente la membrana amniótica (avascular/interior) de la membrana coriónica (vascular/exterior).

3. Retirar cualquier coágulo de sangre y lavar la membrana con 500-1000 ml de solución salina estéril.

4. Utilizar tijeras y pinzas estériles para cortar la membrana amniótica en trozos de aproximadamente 5x5 cm.

5. Transferir los trozos de amnios a un recipiente estéril de 500 ml y lavar cinco veces con 100 ml de solución salina estéril.

6. Realizar un lavado con 500 ml de agua estéril.

7. Transferir los trozos de amnios a tubos de 50 ml eliminando la mayor cantidad de agua posible de cada pieza deslizándolos por el borde del recipiente de 500 ml.

8. Rellenar cada tubo de 50 ml hasta un máximo de 25 ml.

9. Colocar tubos de 50 ml que contengan trozos de amnios a -80 °C durante 12-24 horas.

10. Retirar las tapas de los tubos de 50 ml y cubrir con Parafilm. Perforar varios agujeros pequeños en el Parafilm.

11. Colocar los tubos en un recipiente de liofilizador de vidrio preenfriado y liofilizar durante 24-48 horas.

12. Rellenar el congelador/molino Spex Sampleprep 6870 con nitrógeno líquido.

13. Colocar la membrana amniótica liofilizada en la cámara del congelador/molienda y moler durante 3x ciclos de 5 minutos de enfriamiento, molienda de 5 minutos.

14. Pesar el polvo y almacenar a -80 °C.

Etapas de preparación de Tseng (basado en el documento US 2007/0071740 A1. Reivindicaciones y el párrafo [0095])

1. Recoger y congelar placenta en un ultracongelador de -80 °C disponible en el mercado (el almacenamiento puede oscilar entre 48 horas y 7 días).

2. Transferir la placenta a un ambiente de 4 °C (refrigerador) durante 24 horas.

3. Llevar a temperatura ambiente con o sin adición de solución salina normal durante 4 horas.

4. Aislar el material amniótico de la placenta descongelada.

5. Lavar en HBSS (Invitrogen n.° de cat. 14175), colocar en un tubo de centrífuga estéril y centrifugar a 4 °C durante 5 minutos a 5000 rpm.

6. Retirar el líquido y pesar el material de amnios.

Etapas 7 y 8 Optativas pero realizadas

7. Cortar la membrana amniótica en trozos pequeños para que quepan en el barril de un Biopulverizer.

8. Congelar en nitrógeno líquido, pulverizar hasta un polvo fino y pesar.

9. Preparar tampón frío p Bs 1x, pH 7,4, que contenga inhibidores de proteasas (cóctel de inhibidores de proteasas P8340, Sigma, y complementado con PMSF 1 mM) e inhibidores de fosfatasas (fluoruro de sodio 50 mM y vanadato de sodio 0,2 mM).

10. Añadir tampón al polvo a 1:1 (ml/g).

11. Mantener en hielo y homogeneizar con un Tissue Tearor (Biospec products) 5 veces, 1 minuto cada vez, con un intervalo de enfriamiento de 2 minutos.

12. Estos extractos solubles en agua se denominan extractos de membrana amniótica (EMA) "totales".

13. Conservar el EMA total para su posterior análisis.

Observaciones iniciales

El protocolo divulgado por Tseng implica múltiples y prolongadas etapas de congelación/descongelación, dando como resultado el almacenamiento del material de amnios a 4 °C o temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo. En comparación, el PMA se aísla lo más rápido posible y se congela inmediatamente a -80 °C antes de la conservación por liofilización. Esta metodología garantiza la conservación de los componentes sensibles y potencialmente bioactivos del producto. El PMA es estable y mantiene su estado de polvo a temperatura ambiente. El producto de Tseng solo se parece a un polvo brevemente después de retirarlo del nitrógeno líquido en la etapa 8. Después de esta fase, el polvo se "derrite" rápidamente en una suspensión líquida. Adicionalmente, la falta de etapas de lavado repetidas y minuciosas da como resultado un producto que está contaminado con sangre y otros contaminantes biológicos, dando como resultado que el producto final parezca rojo, mientras que el PMA tiene un aspecto blanco/beis.

Ensayos

Todos los ensayos se realizaron con cantidades iguales de los productos en peso. El producto de Tseng final está en una forma líquida que comprende 1 g/ml de "polvo" de Tseng. Por lo tanto, se utilizó un volumen adecuado de producto de Tseng para igualar el peso de PMA. Los ensayos utilizados incluyeron ensayos colorimétricos (PIERCE®/SIRCOL®) para medir la proteína total, colágeno, la elastina y los GAG, los kits de ELISA QUANTIKINE® (R&D systems, MyBiosource) para medir TSG-6, PTX-3 y TSP-1. Se realizó PCR en tiempo real para medir la expresión génica. Se evaluó la liberación de proteína a partir del PMA y el producto de Tseng durante 7 días (FIG. 26). Se colocaron veinticinco mg de cada material en tubos de microcentrífuga y se completó hasta 200 ul con PBS. Cada día, los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a 6000 rpm para separar el material insoluble y el sobrenadante. Los sobrenadantes se recogieron y congelaron para futuros análisis y se añadieron de nuevo a cada tubo 200 ul de PBS recién preparado. La incubación se realizó a 37 °C en un agitador. Todos los ensayos se formaron sobre tres aislamientos de amnios distintos para cada producto de amnios (n=3) y se realizaron usando patrones de control positivo que se usaron para generar curvas patrón para los ensayos colorimétricos y ELISA en placa. Se utilizó el peso de material de partida máximo sugerido para todos los ensayos con la excepción del ELISA de TSG-6.

Al evaluar TSG-6, el primer intento utilizando el peso de material de partida máximo sugerido dio como resultado que todas las muestras analizadas tuvieran componentes inferiores al límite detectable. Se realizó un segundo ensayo utilizando el doble del material de partida máximo sugerido, y el producto de Tseng tuvo un TSG-6 bajo pero detectable. El TSG-6 no fue detectable en el PMA. No fue posible aumentar más el volumen del material de partida debido a limitaciones de espacio en los pocillos de ensayo.

Resultados

En la siguiente Tabla 1 se enumera un sumario de la cantidad promedio de componentes en cada composición. Los resultados demuestran que la cantidad de proteína total en el PMA es aproximadamente 10 veces mayor que la del producto de Tseng; la cantidad de elastina en el PMA es aproximadamente 15 veces mayor que la del producto de Tseng; y la cantidad de colágeno en el PMA es aproximadamente 100 veces mayor que la del producto de Tseng. La cantidad de glucosaminoglucanos en el PMA es de aproximadamente 1 mg/g mientras que no había glucosaminoglucanos detectables en el producto de Tseng.

Los resultados de la RT-PCR demostraron que ambas muestras contenían ARN intacto, susceptible de amplificarse (GAPDH); sin embargo, no se detectó expresión del gen de TSG-6.

La eliminación de ARN y ADN se puede lograr en una etapa optativa: añadir agua al PMA para hacer una solución; añadir ARNasa y ADNasa a la solución; incubar en condiciones de reacción adecuadas y luego liofilizar la solución resultante.

La curva de liberación acumulada resultante (FIG. 26) demostró una cantidad significativamente aumentada de proteína liberada del PMA en comparación con el producto de Tseng. Estas diferencias fueron significativas (p < 0,001) en todos los puntos temporales.

Los resultados de cada uno de estos ensayos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1

Estudioin vivouno

Descripción general del estudio/métodos

Animales:

Se compraron seis cerdos Yorkshire sin patógenos específicos (SPF, del inglésSpecific Pathogen Free)y se les permitió aclimatarse durante el período necesario de 2 semanas. Al comienzo del estudio, los cerdos pesaban aproximadamente 40-50 kg. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wake Forest (A13-015-Productos de amnios para la cicatrización de heridas en cerdos).Entrenamiento con arnés:

Antes de la cirugía, se entrenaron los animales para que toleraran el arnés de plástico. Se proporcionaron galletas de animales como distracción e incentivo para el contacto humano. En primer lugar, los animales se aclimataron al olor del plástico. Una vez aclimatados, el arnés se colocó sobre el animal bajo supervisión durante un período de tiempo, aumentando gradualmente el tiempo hasta que el animal se sintiera cómodo usando el arnés indefinidamente. El tiempo con el arnés se fue aumentando gradualmente hasta que el animal se habituó por completo al plástico. Este proceso normalmente toma de 2 a 3 semanas (puede ser parte del período original de 2 semanas).

Heridas de espesor total:

Se sedaron y anestesiaron los animales con una combinación de ketamina, xilazina, acepromacina, y se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano inhalado a través de un tubo endotraqueal. A los cerdos anestesiados se les depiló el lomo mediante afeitado. Los animales se inmovilizaron y colocaron en decúbito supino. Los animales se tatuaron con ocho tatuajes de 4x4 cm en el dorso para indicar la superficie de la herida por escisión. La piel del dorso se limpió con agua y jabón, y se esterilizó con p-yodo y alcohol al 70 %. Para la creación del defecto, se crearon 8 superficies de herida en la piel mediante la eliminación de 4x4 cm de piel de espesor total en la parte central de la espalda a lo largo de la superficie torácica y lumbar. Se hicieron incisiones a lo largo de los bordes de la herida con un bisturí hasta la capa del panículo carnoso y se extrajo la piel suprayacente (Figura 1).

Tratamientos de heridas:

Posteriormente, la superficie de la herida se trató con productos disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o con los productos obtenidos de amnios actualmente inventados de manera similar. Un grupo adicional no se sometió a ningún tratamiento. Las seis opciones experimentales se distribuyeron entre los 8 defectos de la piel para controlar las diferencias en la ubicación de las heridas, dando como resultado un total de 8 aplicaciones de cada producto. Los seis cerdos se trataron en dos rondas de experimentos, donde se inició el tratamiento de la segunda ronda después de la eutanasia de la primera ronda. Cada ronda experimental duró 30 días, durante el cual se inspeccionaron las heridas 2 veces por semana para 1) la documentación del tamaño de la herida, la reepitelización y el cierre, y 2) la limpieza, la administración de antibióticos y el revendaje.

Preparación de hidrogel:

El hidrogel de amnios utilizado en este estudioin vivouno se preparó de acuerdo con las etapas que se describen a continuación. Este ejemplo se debe considerar como un ejemplo de referencia, en que se utiliza PEGDA como reticulante.

1. Se disolvió fotoiniciador IRGACURE® 2959 (4-(2-hidroxietoxi)fenil-(2-propil)cetona, Sigma St. Louis, MO) en agua estéril para hacer una solución al 0,05 % p/v. Se disolvieron HEPRASIL® (derivado de AH tiolado y heparinizado) y GELIN-S® (gelatina tiolada) en agua para preparar soluciones al 2 % p/v. Se disolvió EXTRALINK®, un reticulante PEGDA, en agua para hacer una solución al 4 % p/v.

2. Las soluciones de Heprasil®, GELIN-S® y EXTRALINK® se mezclan a continuación en una relación de 2:2:1 en volumen.

Nota: La solución resultante se reticula espontáneamente mediante una reacción de adición de tiol-acrilato de tipo Michael en el transcurso de 15 a 30 minutos. Este tipo de reticulación es el método de reticulación normal descrito por el fabricante. Este marco de tiempo es demasiado lento para implementarse de manera eficaz para el cuidado de heridas. En cambio, se utiliza el siguiente método de reticulación.

3. Los tres componentes se mezclan, se agita con agitador vorticial y se aplica a la superficie diana deseada como un líquido, y se irradia con luz ultravioleta (365 nm, 18 w/cm2) para iniciar una reacción de reticulación progresiva de tioleno mucho más rápida.

Grupos:

1. Control no tratado

2. AMNIOGRAFT® (Bio-Tissue, Inc)

3. GRAFTJACKET® (Wright medical Technology, Inc.)

4. Polvo de amnios, fabricado de acuerdo con el procedimiento

descrito en el presente documento, y a incorporar en las composiciones descritas en el presente documento y de acuerdo con la invención reivindicada.

5. Hidrogel de amnios

6. Parche electrohilado

Eutanasia:

A los 30 días postratamiento, finalizó el estudio y se recogieron las zonas de herida. Los animales se sedaron con ketamina, xilazina y acepromacina. A continuación, el animal se trasladó a la sala de necropsias. Se administró una sobredosis letal de beuthanasia mediante inyección intravenosa. Las heridas de cada animal se dividieron en 4 cuartos: dos para histología e inmunohistoquímica, uno para análisis por PCR de biomarcadores de cicatrización de heridas y otro para ensayos de proteínas (FIG. 2).

Análisis de imágenes:

La contracción se midió en cada uno de los puntos de tiempo midiendo la superficie dentro del cuadrado tatuado utilizando el software ImageJ y se expresó con respecto al tamaño del tatuaje original. En estudios anteriores se ha utilizado una relación de contracción de la herida como un medio adicional para describir las heridas contraídas. Además de la medición de la superficie de contracción de la herida analizada anteriormente, la relación de contracción de la herida describe el grado en que la herida ha cambiado de forma desde la herida cuadrada inicial. Las heridas que cicatrizan por reepitelización normalmente mantienen su forma cuadrada inicial al tiempo que se contraen ligera y simétricamente. Sin embargo, las heridas muy contráctiles, habitualmente se contraen desde los bordes de la herida, dando como resultado una herida en forma de estrella. El cierre de la herida y la epitelización se midieron utilizando ImageJ para determinar la superficie de la herida abierta, de epitelio maduro e inmaduro, que se pueden identificar por el color y la textura de la herida en cicatrización. Generalmente las heridas abiertas eran de color rojo oscuro y brillantes, el epitelio inmaduro era de color rojo claro y opaco/mate (debido a una fina capa de epidermis) y el epitelio maduro era de color blanco/rosado y opaco/mate. Estos componentes se midieron expresados como mediciones individuales con respecto al tamaño original de la herida y se combinaron para demostrar la contribución de todos los componentes a la cicatrización de la herida a lo largo del tiempo (FIG. 3).

Histología e IHQ:

1) tinción de HyE

2) tinción con Pentachrome para colágeno, mucinas/GAG, elastina y fibras maduras

3) Tinción de rojo sirio para colágenos maduros e inmaduros

4) Tinción de azul alciano para mucinas/GAG

5) Hierro coloidal para mucinas/GAG

6) Inmunohistoquímica para colágeno tipo I y colágeno tipo III

7) Inmunohistoquímica, infiltración de neutrófilos

Biomarcadores de cicatrización de heridas:

Se realizó PCR cuantitativa para biomarcadores de heridas que cicatrizan y que no cicatrizan, incluyendo marcadores inflamatorios de heridas que no cicatrizan (IL1 alfa, IL1 beta e IP-10), marcadores inflamatorios relacionados con monocitos (MCP-1, MIP-1 beta e IL-8) y marcadores antinflamatorios de heridas cicatrizadas (IL2, IL-4 e IL-5). Estos marcadores se seleccionaron debido a su éxito en la predicción de la cicatrización de heridas o la necesidad de desbridamiento en pacientes humanos. La expresión génica de todos los tratamientos se expresó con respecto a la piel sana normal.

Los biomarcadores se seleccionaron basándose en los datos de la publicación:Hawksworth, J.S. et al. Inflammatory biomarkers in combat wound healing. Ann Surg 250, 1002-1007 (2009).

Análisis de proteínas:

La proteína se aisló de una sección de piel correspondiente a una cuarta parte del tejido recogido.

Resultados

Observaciones generales:

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron sin complicaciones.

Las heridas se crearon con un tamaño y profundidad uniformes, aunque se observó cierta flacidez de la piel después de la eliminación de la sección de piel cuadrada. En general, la administración de los productos para el tratamiento de heridas fue sencilla. AMNIOGRAFT® fue el más difícil de aplicar debido a la naturaleza fina y frágil del producto y las dificultades para retirarlo del papel de soporte. Este producto precisó 4 manos para asegurarse de que no se enrollara sobre sí mismo o se doblara, lo que se produjo en varias ocasiones. GRAFTJACKET® fue más fácil de administrar debido a su grosor, sin embargo, el tamaño de este producto variaba y la colocación y la sutura eran difíciles. El parche electrohilado fue el más fácil de administrar de los 3 productos "tipo parche" con un grosor y una rigidez intermedios. Se observó una variación significativa en el producto parche electrohilado, especialmente con los últimos 4 parches recibidos (aplicados a los animales de la ronda 2). Estos parches tenían zonas de coloración desigual, con manchas oscuras que se asemejan a un líquido semiseco. El hidrogel de amnios fue fácil de aplicar por una sola persona y no preciso ningún contacto con las heridas. El líquido de amnios se aplicó con una jeringa con una mano y la luz UV se mantuvo aproximadamente 5 cm por encima de la superficie de la herida. Como era de esperar, el líquido formó rápidamente un gel dentro de la herida y rellenó toda la superficie de la herida en 10 a 15 segundos. polvo de amnios fue el producto más fácil de administrar. Se distribuyó uniformemente una dosis medida de polvo golpeando suavemente el tubo sobre la herida, seguido de la aplicación de 1 ml de solución salina estéril para humedecer el polvo. En el estudioin vivodos descrito a continuación, el polvo se suspendió en 1 ml de solución salina antes de la aplicación y luego se aplicó directamente a la herida como líquido a los tres cerdos. No se detectaron diferencias entre cada método de suministro para ninguno de los parámetros medidos.

Análisis de imágenes:

Se tomaron fotografías digitales para cada uno de los puntos de tiempo (días 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 y 28) y se recopilaron para cada una de las 8 heridas (FIG. 4-9). Nota: La distribución de cicatrización de heridas se describe en la Tabla 2 anterior. Las opciones de tratamiento se mantienen en el mismo orden para cada animal para facilitar la comparación. Los 2 tratamientos inferiores en cada cerdo son las 2 opciones de tratamiento repetidas para ese cerdo.

Cierre de heridas:

El cierre de heridas se correlaciona con la cicatrización satisfactoria de heridas. Cuanto mayor sea la tasa de cierre de las heridas, mejor es el resultado de curación. El cierre de la herida se midió para cada punto de tiempo y se expresó como un porcentaje de la herida presente con respecto a la superficie original de la herida (FIG. 10). El gráfico de la FIG. 10 demuestra que hidrogel de amnios es el que mejor se desempeña en el cierre de heridas; polvo de amnios es el segundo que mejor se desempeña; Las heridas sin tratar, parche electrohilado y AMNIOGRAFT® están en el medio, y GRAFT JACKEt® es el de peor desempeño. El tamaño promedio de la herida era de 17,6 cm2 sin diferencias significativas entre tratamientos ni cerdos. Esta superficie era ligeramente más grande que la superficie de 16 cm2 inicial tatuada debido a la caída de la piel después de una herida por incisión. Esta pequeña diferencia no tuvo efecto sobre la administración del tratamiento. En el punto de tiempo inmediato después del tratamiento de la herida, hubo un aumento inicial de la superficie de la herida para las heridas no tratadas, las tratadas con GRAFTJACKET®, AMNIOGRAFT® y parche electrohilado, debido al estiramiento/retracción de la herida. Esto sugiere que la aplicación de estos tratamientos no estabiliza inmediatamente la superficie de la herida. Por el contrario, las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios no mostraron ningún aumento significativo del tamaño de la herida. Si bien es probable que el hidrogel desempeñe un papel en la estabilización de la superficie de la herida, esto no tiene en cuenta el efecto en el grupo polvo de amnios. Un inicio más temprano de la granulación, que se observó para estos grupos en puntos de tiempo tempranos, puede explicar esta observación. Los grupos tratados con hidrogel de amnios y polvo de amnios mostraron una disminución constante en la superficie de la herida desde el día 0, disminuyendo todos los demás grupos desde el día 4-7 en adelante. Las regiones tratadas con GRAFTJACKET® mostraron la tasa más lenta de cierre de la herida, formando el producto una estructura dura similar a una costra dentro de la herida, impidiendo el cierre. Con el tiempo, este producto se degradó o se secó y se cayó de la herida, facilitando el cierre de aproximadamente el 50 % al final del estudio. Las heridas tratadas con AMNIOGRAFT® parecían tener una tasa de cierre de la herida ligeramente retrasada, pero hacia el día 14 mostraron un cierre de la herida similar al de las heridas no tratadas y las tratadas con el parche electrohilado (~50 %). Estos tres productos continuaron propiciando el cierre de la herida, dando como resultado aproximadamente un 10 % de superficie de herida al final del estudio. Las heridas tratadas con polvo de amnios mostraron un mejor cierre de la herida en comparación con estos productos con una aceleración del 10-15% del cierre de la herida en comparación con las heridas tratadas con AMNIOGRAFT®, no tratadas y tratadas con parche electrohilado desde el día 14 en adelante. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios se desempeñaron mejor que las heridas tratadas con polvo de amnios entre el día 11 y el día 24, mostrando un 25 % de superficie de herida el día 14. Hacia el día 28, tanto los grupos tratados con polvo de amnios como con hidrogel de amnios mostraron casi un 100 % de cierre de la herida, lo que supuso una mejora del 10 % con respecto al siguiente producto con el mejor desempeño y una mejora del 50 % con respecto al producto con el menor desempeño.

Contracción de la herida:

La contracción de la herida se correlaciona con la eficacia de la cicatrización de heridas. Cuanto mayor sea la tasa de contracción, peor será el resultado de la curación. La contracción de la herida se midió para cada punto de tiempo midiendo la superficie dentro del borde del tatuaje y expresando la medición como un porcentaje de la superficie con respecto a la superficie del tatuaje original (FIG. 11). El gráfico de la FIG. 11 demuestra que las sin tratar y con parche electrohilado son las más contraídas; hidrogel de amnios y AMNIOGRAFT® se contraen moderadamente; polvo de amnios está menos contraída que hidrogel de amnios y AMNIOGRAFT®; y GRAFTJACKET® la que menos se contrae.

Al igual que con los datos de cierre de heridas, se observó un aumento inicial en la superficie de la herida/tatuaje durante los primeros 7 días. Esto dio como resultado un porcentaje inicial de contracción negativa de aproximadamente el 10 %. Las heridas no tratadas y las tratadas con parche electrohilado mostraron la mayor contracción, con una contracción rápida que se producía entre el día 4 y el día 11, alcanzando aproximadamente el 40 % de la superficie original del tatuaje.

En el punto de tiempo final, estos productos mostraron una contracción del 50-60 %. Estas mediciones fueron concordantes con las observaciones a lo largo del estudio, en que estos tratamientos parecieron contraer significativamente las heridas en casi todos los puntos de tiempo.

El siguiente grupo de productos fueron de heridas tratadas con hidrogel de amnios y AMNIOGRAFT®, que mostraron una tendencia similar a las heridas no tratadas y las tratadas con parche electrohilado, pero con un aumento retrasado de la contracción y un período de contracción más corto y menos rápido entre el día 7 y el día 11, alcanzando una contracción del 20-30 %. En el punto de tiempo final, estos productos mostraron una contracción del 35-45 %. polvo de amnios se desempeñó mejor que estos productos, con aproximadamente el 10 % de contracción el día 11 y el 30 % de contracción el día 28.

Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® tuvieron la menor cantidad de contracción en la mayoría de los puntos de tiempo. Sin embargo, esto se debe a la estructura de tipo costra que forma el producto, que impide el cierre y la contracción de la herida, que impide el cierre y la contracción de la herida.

Relación de contracción de la herida:

Para medir este fenómeno se realizaron varias mediciones de las heridas en todos los puntos de tiempo (FIG. 12). Se midió la distancia del borde izquierdo de la herida al punto central entre las dos esquinas izquierdas de la herida y se expresó como una relación de la distancia total entre estas esquinas. Esta relación da una descripción aproximada de la cantidad de cambio de forma de la herida. Para referencia, las heridas cuadradas no contraídas tenían una relación cercana a 0, mientras que las heridas en forma de "estrella" muy contraídas tenían una relación cercana a 0,2. Confirmando los datos de contracción, la relación de heridas no tratadas y tratadas con parche electrohilado aumentó a aproximadamente 0,2 durante 28 días. Las heridas tratadas con polvo de amnios, hidrogel de amnios y AMNIOGRAFT® aumentaron en menor medida, mientras que las heridas tratadas con GRAFTJACKET® solo tuvieron un aumento moderado de la tasa de contracción.

Epitelización de heridas:

La epitelización de la herida se correlaciona con el éxito de cicatrización de la herida. Cuanto mayor sea la tasa de epitelización, mejor cicatriza la herida. La epitelización se midió en todos los puntos de tiempo con el epitelio maduro e inmaduro definido por el color (maduro: blanco, inmaduro: rosa) y la presencia de un recubrimiento epitelial de aspecto mate distinto de la superficie de la herida. El gráfico de la FIG. 13 ilustra heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios que muestran la mayor cantidad de epitelización. Inicialmente, todos los tejidos tenían algún nivel de epitelización debido a que la herida por incisión se creaba dentro de la línea del tatuaje. Esta superficie inicial fue constante en todos los tratamientos y cerdos. Las heridas sin tratar, tratadas con parche electrohilado y GRAFTJACKET® mostraron la menor epitelización de la herida, mostrando un inicio muy lento de la epitelización (~2-3 % en el día 14) y una epitelización total baja (~5-7 %) al final del estudio. Las heridas tratadas con AMNIOGRAFT® mostraron un nivel promedio de epitelización de la herida, con una epitelización inicial más lenta (5 % en el día 14) y aproximadamente del 10 % al final del estudio. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios fueron las que mejor se desempeñaron en cuento a la epitelización total de la herida, mostrando una epitelización inicial rápida que alcanzó aproximadamente el 8-10% en el día 14 y el 12% al final del estudio. Estos grupos fueron significativamente mejores que todos los demás tratamientos en cada punto de tiempo.

Análisis combinado de la superficie, la contracción y la epitelización de la herida:

Si bien se puede obtener información importante al analizar los componentes individuales de los mecanismos de cicatrización de heridas, solo observando la imagen completa de la herida durante la cicatrización se puede obtener una representación precisa de la calidad de la cicatrización. Para lograr esto, se representa la superficie total de la herida en cada punto de tiempo dividido en el porcentaje de la superficie de la herida, el porcentaje de contracción y el porcentaje de epitelización (FIG. 14).

Con estos tres componentes medidos que describen completamente la cicatrización de la herida con el tiempo, se pueden observar los mecanismos competitivos de contracción y epitelización para cada tratamiento. La clasificación de cada tratamiento se realizó con los criterios de mejor cicatrización como: superficie de herida pequeña, menor contracción y más epitelización. Los criterios para la peor cicatrización fueron; superficie grande de la herida, más contracción y menos epitelización. Los gráficos de la FIG. 14 demuestran que el polvo de amnios y el hidrogel de amnios tenían significativamente menos herida, menos contracción y más epitelización en comparación con otros productos.

Estos datos destacan la importancia del tipo y la calidad de la cicatrización de heridas, ya que la contracción puede dar como resultado una disminución de la superficie de la herida, pero también conduce a desfiguración, deformidad cicatricial y pérdida de función. Por esta razón, el cierre de la herida por reepitelización es más conveniente ya que esto da como resultado un restablecimiento rápido de la barrera de la piel, con óptimos resultados estéticos y funcionales. Mientras que las heridas tratadas con GRAFTJACKET® mostraron una contracción mínima, también mostraron muy poca epitelización, dan como resultado una superficie abierta de la herida persistente. Por esta razón, GRAFTJACKET® ocupó el último lugar de los productos probados. AMNIOGRAFT®, el parche electrohilado y las heridas no tratadas se agruparon junto a los siguientes productos con mejor desempeño, con AMNIOGRAFT® que tiene una tasa más rápida de cierre de la herida, impulsada por aproximadamente el 50 % de contracción y el 50 % de epitelización. El parche electrohilado y las heridas no tratadas tuvieron una tasa y un grado de cierre de la herida similares en comparación con AMNIOGRAFT®, sin embargo, sin embargo, la mayor parte de este cierre se debió a la contracción. El polvo de amnios y el hidrogel de amnios fueron los productos con mejor desempeño usando estos criterios, con el cierre más rápido y completo de las heridas, que fue impulsado por una epitelización aumentada y una contracción mínima.

Análisis histológico

Se usaron cortes teñidos con hematoxilina y eosina para evaluar y comparar la estructura general y la composición de cada una de las heridas. Las imágenes representativas de los cerdos 1-3 se muestran en la FIG. 15 y de los cerdos 4-6 en la FIG. 16. Se usó piel de cerdo sano como control para este análisis. El análisis de las heridas de los cerdos 1-3 reveló que la mayoría de las heridas tienen algún grado de recubrimiento epidérmico con la excepción de GRAFTJACKET®. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® generalmente tenían la dermis expuesta o estaban cubiertas con un tejido similar a una costra de profundidad variable. Las heridas sin tratar, las tratadas con AMNIOGRAFT® y parche electrohilado parecían tener un recubrimiento inconsistente, una epidermis más fina, y carecía de protrusiones epiteliales 'similares a dedos' perceptibles en la superficie dérmica (crestas interpapilares). La epidermis de las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios se parecía a la piel sana en cuanto a la cobertura, el grosor y la de presencia de crestas interpapilares. La dermis de la piel sana consistía en grandes fibras organizadas de color rosado claro, con sólo un mínimo de fibras desorganizadas, finas y violetas. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® parecían contener muchas células pequeñas con aspecto de células inflamatorias y fibrosas. Esto se transformó en un tejido fibroso grueso en la superficie de la herida. Las heridas no tratadas y las tratadas con parche electrohilado no mostraban ninguna organización de las fibras dérmicas y consistían por completo en fibras pequeñas violetas desorganizadas. Las heridas tratadas con AMNIOGRAFT® tenían algunas fibras rosadas grandes desorganizadas presentes en la dermis, pero esto fue inconsistente entre heridas, y también dentro de heridas individuales, con algunas zonas dominadas por las fibras pequeñas violetas desorganizadas. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios parecían más similares a la piel sana con solo un poco más de fibras desorganizadas. Las heridas tratadas con polvo de amnios parecían algo similares a la piel sana en presencia de grandes fibras rosadas, pero la organización de estas fibras fue inconsistente entre grupos.

Los cerdos 4-6 tenían un aspecto histológico muy similar al de los cerdos 1-3. Este análisis confirmó que las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios tenían una epidermis de aspecto muy maduro con crestas interpapilares regulares. Algunas heridas no tratadas no tenían una epidermis consistente, mientras que algunas heridas tratadas con parche electrohilado mostraron una cobertura epidérmica más gruesa, pero sin crestas interpapilares. Las heridas tratadas con AMNIOGRAFT® y GRAFTJACKET® eran concordantes con las de los tres primeros cerdos. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios parecían tener una dermis muy similar a la de la piel sana, con fibras altamente organizadas que eran de color rosa claro, y solo un mínimo de fibras pequeñas desorganizadas. La dermis de las heridas no tratadas, las tratadas con AMNIOGRAFT® y las tratadas con parche electrohilado parecían similares a las observadas en los cerdos 1-3. En general, parece que, histológicamente, las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios se parecían más a la piel sana. Las heridas no tratadas, las tratadas con AMNIOGRAFT® y las tratadas con parche electrohilado parecían progresar hacia una cicatrización normal, pero presentaban una epidermis inmadura y una dermis desorganizada. Las heridas tratadas con Grafjacket parecían inflamatorias y no mostraban signos de epidermis o dermis en desarrollo.

Tinción con pentachrome:

Se realizó una tinción con Pentachrome para dar una visión general de la composición de la matriz extracelular (MEC) de las heridas. Pentachrome es una tinción que puede identificar múltiples componentes de la MEC simultáneamente. La tinción con pentachrome muestra el colágeno en amarillo, las fibras maduras en rojo, las mucinas y los glucosaminoglucanos (los GAG) en azul/verde y los núcleos y las fibras elásticas en negro. La FIG. 17 muestra las imágenes representativas de los 6 grupos de tratamiento y de piel sana. En este estudio, el solapamiento/gran proximidad del colágeno y las mucinas/GAG dio como resultado una coloración verde de los tejidos. La piel sana tenía una dermis que consistía en fibras de colágeno maduras gruesas (rojas) y tinción positiva en amarillo y verde para el colágeno y las mucinas/los GAG. Se observó muy poca elastina negra o infiltración de células inflamatorias o fibróticas de color púrpura. Los tejidos no tratados y los tratados con GRAFTJACKET® mostraron principalmente núcleos densamente empaquetados con poca tinción roja, verde o amarilla observable. Esto sugiere que estas zonas pueden consistir en tejido granular compuesto por células inflamatorias infiltrantes y fibroblastos. Los tejidos de heridas tratados con AMNIOGRAFT® y parche electrohilado muestran algo de colágeno y mucinas/GAG, pero poco fibroma/músculo teñido de rojo, lo que indica una falta de estructura de la dermis madura normal. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios parecían muy similares a la piel sana con una cantidad intermedia de fibras de colágeno maduras gruesas (rojas) sobre un fondo amarillo/verde de colágeno, mucinas y GAG. Esto sugiere que estos tejidos tienen una composición similar a la piel sana, sin embargo, contiene fibras de colágeno ligeramente menos maduras y más mucinas/GAG.

Tinción con rojo sirio para colágeno inmaduro y maduro:

La tinción con rojo sirio diferencia entre colágeno inmaduro y maduro cuando se observa a la luz polarizada. El colágeno inmaduro desorganizado se tiñe de verde y el colágeno maduro organizado se tiñe de amarillo/naranja. La FIG. 18 ilustra las imágenes representativas de los 6 grupos de tratamiento y de piel sana. La piel sana presentaba una fuerte tinción en verde y naranja, indicando una red organizada de fibras de colágeno maduras más grandes con fibras de colágeno más pequeñas entremezcladas. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® mostraron muy poca tinción verde, excepto dentro de la región de la costra. Contrariamente, hubo tinción positiva para colágeno maduro teñido de naranja. Sin embargo, se localizaba en pequeñas zonas dispuestas esporádicamente por todo el tejido. Las heridas tratadas con parche electrohilado mostraron menos colágeno teñido de naranja, pero aún observable. Sin embargo, hubo una relación de verde-naranja más alta en el grupo de parche electrohilado, lo que indica una regeneración más lenta de la MEC. Los grupos no tratados y los tratados con AMNIOGRAFT® mostraron poca o ninguna tinción naranja, y en su mayoría aparecieron de color verde, lo que indica una regeneración de la<m>E<c>aún más lenta. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios parecían similares a la piel sana, mostrando una distribución similar de naranja y verde. Las heridas tratadas con polvo de amnios parecían tener un poco menos de colágeno maduro organizado teñido de naranja, pero presentaban una notable intensidad y distribución de la tinción.

En resumen, las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios mostraron una tinción organizada similar para el colágeno maduro (rojo) y el colágeno inmaduro (verde) en comparación con la piel sana. El parche electrohilado también mostró algo de tinción para el colágeno inmaduro pero muy poco colágeno maduro organizado. Sin tratar y GRAFTJACKET® no se tiñeron positivamente para estructuras de colágeno organizadas.

Tinción con hierro coloidal y azul alciano para mucinas y GAG:

El azul alciano tiñe las mucinas y los GAG en azul y los núcleos en rosa/rojo. La FIG. 19 muestra las imágenes representativas de los 6 grupos de tratamiento y de piel sana. Las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios mostraron una localización e intensidad similares de tinción con azul alciano en comparación con la piel sana, mientras que GRAFTJACKET® mostró una intensa tinción debajo de la superficie de la costra. Por desgracia, la tinción de fondo no específica dificultó la interpretación de esta tinción.

Como método alternativo para visualizar mucinas y GAG, se utilizó tinción con hierro coloidal. El hierro coloidal tiñe las mucinas carboxiladas y sulfatadas y los GAG de azul y el citoplasma en rosa/rojo. Adicionalmente, la tinción roja oscura de la dermis que muestra la organización del tejido de la dermis es muy evidente en la piel sana. La FIG. 20 muestra las imágenes representativas de los 6 grupos de tratamiento y de piel sana. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® mostraron tinción azul en la costra y de forma aleatoria debajo de la costra. Los tejidos no tratados, tratados con AMNIOGRAFT® y con parche electrohilado mostraron una tinción azul difusa mínima o nula. Las heridas tratadas con hidrogel de amniós y polvo de amniós mostraron una localización e intensidad de la tinción azul similares a las de la piel sana, específicamente, la tinción azul directamente debajo de la epidermis. Además, se observó una tinción roja oscura similar, pero en menor grado que en la piel sana, en los grupos de hidrogel de amnios y polvo de amnios. Se observó una menor cantidad de esta tinción roja en el grupo tratado con parche electrohilado, y poca o ninguna de esta tinción roja se observó en los grupos de no tratados, de tratados con AMNIOGRAFT® y con GRAFTJACKET®.

Tinción inmunohistoquímica de colágeno:

La tinción inmunohistoquímica de colágeno tipo I (rojo) y tipo III (verde) se realizó con anticuerpos fluorescentes con una contratinción de núcleos celulares con d A p I (azul) (FIG. 21). Los cortes de tejido teñidos resultantes procedentes de los 6 grupos de tratamiento y un control de piel sana mostraron un nivel relativo variable de tinción fluorescente que, cuando se combina con tinciones histológicas, da una idea de la calidad del tejido en regeneración y de la matriz extracelular. En los tiempos de exposición de la cámara utilizados para capturar las imágenes fluorescentes (que se mantuvieron constantes en todas las muestras), se observó tinción relativamente débil de colágeno tipo I y tipo III en piel sana, aunque ambas estaban presentes. El grupo tratado con GRAFTJACKET® presentó una morfología tisular notablemente distinta de la de todos los demás grupos. Debido a la fuerte formación de costras que se observa en estas heridas, se observó la costra como una región densamente empaquetada con núcleos y estrías desorganizadas de colágeno tipo III fuerte. Debajo de la costra, se observó poco o nada de colágeno tipo III y una cantidad baja de colágeno tipo I, lo que sugiere que la producción de nueva matriz extracelular en este grupo se retrasó significativamente en comparación con otros grupos. En las heridas no tratadas, las tratadas con AMNIOGRAFT® y con parche electrohilado, se observó una intensa tinción de colágeno tipo I, acompañada de poca tinción de colágeno tipo III, lo que sugiere una producción desequilibrada de colágeno tipo I y, posiblemente, la generación de tejido fibrótico. Contrariamente, en las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios, se observó menos tinción de colágeno tipo I que en los 3 grupos fibróticos anteriores, aunque más que en piel sana, y se observó un nivel similar de tinción de colágeno tipo III que en piel sana. Esto sugiere que los tratamientos de hidrogel de amnios y polvo de amnios consiguen una regeneración de la piel más similar a una piel sana que los otros tratamientos.

En resumen, las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios muestran una intensidad de colágeno tipo III similar a la observada en piel sana, con una tinción de tipo I ligeramente mayor. Las heridas no tratadas, las tratadas con AMNIOGRAFT® y con parche electrohilado mostraron una intensa tinción de tipo I con poca tinción de tipo III. GRAFTJACKET® mostró principalmente de tipo III en la superficie de la costra.

Tinción inmunohistoquímica de neutrófilos:

La visualización inmunohistoquímica de neutrófilos se realizó con anticuerpos y tinción con HRP-estreptavidina. Los cortes de tejido teñidos resultantes procedentes de los 6 grupos de tratamiento y un control de piel sana (FIG. 22) mostraron un nivel relativo variable de tinción marrón que da una idea del nivel de respuesta inmunitaria que se produce en el momento de la recogida del tejido. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® mostraron una alta densidad de neutrófilos teñidos de marrón debajo de la interfaz costra-tejido. Los grupos de AMNIOGRAFT® y de parche electrohilado mostraron zonas localizadas de tinción marrón intensa, principalmente en la superficie de la herida y/o en la interfaz con el parche de tratamiento aplicado. Además, se observaron neutrófilos en toda la dermis. Los grupos de hidrogel de amnios, polvo de amnios y sin tratar mostraron una presencia de neutrófilos de bajo nivel similar a la observada en la piel sana. Hubo un bajo nivel de tinción de fondo no específica, pero fue homogénea entre estos grupos. Estos resultados sugieren: 1) La falta de tratamiento (grupo de no tratados) puede permitir que la respuesta inmunitaria de los neutrófilos se produzca en un momento anterior, haciéndola inobservable a las 8 semanas; y 2) el hidrogel de amnios y el polvo de amnios no suscitan una respuesta o, debido a que se remodelan con mayor facilidad, la respuesta inmunitaria es truncada, mientras que el AMNIOGRAFT®, el GRAFTJACKET® y el parche electrohilado suscitan una respuesta prolongada debido a su composición o a que se remodelan con menor facilidad en la MEC normal.

En resumen, las heridas tratadas con hidrogel de amnios, las heridas tratadas con polvo de amnios y las heridas no tratadas muestran una presencia de neutrófilos de bajo nivel similar a la observada en la piel sana. AMNIOGRAFT® y el parche electrohilado mostraron zonas localizadas de tinción intensa, marcadamente en la superficie de la herida. GRAFTJACKET® mostró una alta densidad de neutrófilos teñidos intensamente en la superficie de la costra subyacente.

Análisis de biomarcadores de herida:

Los biomarcadores de herida se seleccionaron debido a su éxito en la predicción de la cicatrización de heridas o la necesidad de desbridamiento en pacientes humanos. Los biomarcadores de heridas inflamatorias no cicatrizantes (IL1 alfa, IL1 beta e IP-10), los marcadores inflamatorios relacionados con monocitos (MCP-1, MIP-1 beta e IL-8) y los marcadores antiinflamatorios de heridas cicatrizadas (IL2, IL-4 e IL-5) se analizaron mediante PCR cuantitativa y se expresaron con respecto a la piel normal. Las heridas tratadas con GRAFT JACKET® mostraron una alta expresión constante de biomarcadores de heridas inflamatorias no cicatrizantes, mientras que las heridas tratadas con parche electrohilado y no tratadas mostraron expresión de los biomarcadores inflamatorios IL1alfa and IL1beta, respectivamente, lo que sugiere la presencia de inflamación y de resultados de cicatrización posiblemente retrasados (FIG. 23).

Las heridas tratadas con AMNIOGRAFT®, hidrogel de amnios y polvo de amnios mostraron una expresión de biomarcadores que era mayor a la de la piel sana, pero significativamente menor a la de otros grupos de tratamiento. Las heridas tratadas con GRAFT JACKET® nuevamente mostraron una alta expresión constante de biomarcadores de marcadores inflamatorios relacionados con monocitos, concordante con la observación de células inflamatorias infiltrantes en estos tejidos (FIG. 24). Las heridas no tratadas tenían una expresión aumentada de MIP1beta e IL8, aunque esto fue sólo una tendencia menor. Las heridas tratadas con parche electrohilado, AMNIOGRAFT®, polvo de amnios e hidrogel de amnios tenían una baja expresión de biomarcadores inflamatorios relacionados con monocitos. Mientras que la expresión de marcadores antinflamatorios de heridas cicatrizantes fue generalmente baja y variable, las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios tuvieron una tendencia más alta que otros grupos de tratamiento en cuanto a IL4 e IL5 (FIG. 25). Hubo menos variación entre los grupos en cuanto a IL2, aunque la expresión de este biomarcador en los grupos tratados con AMNIOGRAFT®, hidrogel de amnios y polvo de amnios aumentó ligeramente en comparación con otros grupos de tratamiento.

En resumen, mientras que se observó variación entre animales, se observaron tendencias claras para estos marcadores. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® mostraron una expresión aumentada de todos los marcadores de heridas no cicatrizantes de forma concordante con el análisis de imágenes. Las heridas tratadas con parche electrohilado tenían una expresión aumentada de IL1 alfa, pero no de IL1 beta o IP10, mientras que las heridas no tratadas tenían IL1beta aumentada pero no IL1alfa o IP10. En general, las heridas tratadas con AMNIOGRAFT®, las heridas tratadas con polvo de amnios y las heridas tratadas con hidrogel de amnios tuvieron una baja expresión de todos los marcadores de heridas no cicatrizantes.

Sumario

Facilidad de administración del tratamiento:

Las observaciones a partir de las cirugías revelaron que la aplicación de los tratamientos tipo parche estuvo influenciada por la rigidez y flexibilidad del producto, siendo GRAFTJACKET® más rígido y grueso el que no se ajustaba bien a la superficie de la herida, incluso con pequeñas diferencias en tamaño y forma. AMNIOGRAFT®, muy delgado y flexible, era difícil de manipular y de colocar sobre la herida, incluso con dos cirujanos. Aunque un producto más espeso era más fácil de manejar y aplicar, esta propiedad parecía perjudicial para la cicatrización de heridas, inhibiendo el cierre de la herida y la epitelización. El polvo de amnios fue el producto más fácil de administrar, simplemente esparciendo un peso medido con anterioridad de polvo sobre la zona de la herida y humedeciéndolo a continuación con 1 ml de solución salina estéril. También se probó la aplicación de polvo de amnios suspendiendo en primer lugar el polvo en el volumen de solución salina antes de la aplicación a la herida y se encontró que esto simplificó aún más el procedimiento sin detrimento del resultado del tratamiento. Esta metodología también proporciona la opción de aumentar la dosis por superficie de la herida si se desea. El hidrogel de amnios fue muy simple de administrar y la gelificación del producto tomó aproximadamente 10 a 15 segundos dentro de la superficie de la herida. Si bien este producto precisaba el uso de una luz UV, la mejora del producto ha eliminado ahora este requisito. Con la eliminación de la luz UV, el hidrogel de amnios tendría la aplicación más fácil.

Calidad de cicatrización de heridas:

El análisis de cierre de heridas, la contracción y la epitelización demostraron que el hidrogel de amnios y el polvo de amnios fueron superiores en el cierre de heridas y la epitelización, y estuvieron entre los mejores en la prevención de la contracción. Es importante que se realice un análisis global de la cicatrización de heridas para incluir adecuadamente los mecanismos de cicatrización de heridas. El hidrogel de amnios y el polvo de amnios aceleraron la tasa y el alcance del cierre total de heridas a través de la aceleración significativa de la reepitelización de heridas. Esto sugiere que las heridas regeneradas utilizando estos productos no solo cicatrizarán más rápido, sino que cicatrizarán con una cobertura epidérmica madura y sana, con menos deformidad cicatricial y contracción. Si bien estos estudios se realizaron en un modelo de piel sana con una significativa capacidad endógena de cicatrización de heridas, es probable que estos efectos se magnifiquen en heridas que tienen un potencial de crecimiento epitelial retrasado o inhibido. De forma interesante, AMNIOGRAFT® fue el siguiente producto con mejor desempeño después de los otros dos productos de amnios. Esto sugiere que el potencial de regeneración de estos tratamientos está relacionado con el material de partida original de amnios, y que las etapas de procesamiento realizados para producir el hidrogel y el polvo no degradaron esta propiedad, más bien propiciaron la disponibilidad/liberación de factores terapéuticos. Esto puede estar relacionado con el perfil de liberación del hidrogel y el polvo en la herida, lo que puede ser más beneficioso para la cicatrización de heridas en comparación con el perfil de degradación natural de la membrana amniótica. Sobre todas las mediciones de resultados del análisis de imágenes, el parche electrohilado funcionó casi de forma idéntica a las heridas no tratadas, lo que sugiere que este producto no tuvo un efecto beneficioso o perjudicial sobre el cierre de heridas, la contracción o la epitelización. Como se ha analizado anteriormente, el parche grueso y rígido GRAFTJACKET® tuvo un mal desempeño en todas las mediciones de resultados y pareció inhibir el cierre de la herida, la contracción y la epitelización. Es probable que esto se deba al desajuste entre las tasas de degradación del producto y la tasa de cierre natural de la herida. Esto destaca la importancia de un producto para la cicatrización de heridas que sustente y se integre perfectamente la herida en regeneración durante un período de tiempo clínicamente relevante. Los productos que se pueden modificar para adaptarse al entorno de la herida, tal como un gel, acelerarían en gran medida el cierre de heridas variables y difíciles de tratar.

Calidad de la piel:

Las observaciones de la dermis mostraron que las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios tenían una dermis similar a la piel sana, consistente en grandes fibras de colágeno organizadas. Esto sugirió que la dermis había madurado en estos grupos con propiedades funcionales y mecánicas similares a las de la piel sana. La observación de una cobertura epidérmica aumentada durante la cicatrización de heridas se confirmó mediante análisis histológico de los tejidos. Si bien no se realizó el análisis de los cortes de tejido en los primeros puntos temporales, la presencia de una epidermis gruesa y madura con protrusiones dérmicas sustenta los resultados de epitelización acelerada en los grupos tratados de hidrogel de amnios y polvo de amnios. Mientras que otros tratamientos dieron como resultado una cobertura epidérmica, esta parecía más fina y carecía de estas protrusiones dérmicas. Esto sugiere que la epidermis en estos tejidos era menos madura, tal vez desarrollándose más tarde durante el período de cicatrización. La calidad de la MEC de la herida es de importancia clave para el éxito a largo plazo de la cicatrización de la herida. La composición de la MEC tiene una gran influencia sobre las propiedades de cicatrización de heridas. Una MEC normal y sana facilita las propiedades celulares y mecánicas normales, y una composición anómala de la MEC provoca deformidad cicatricial, contracción y pérdida de función. Por este motivo se realizó una caracterización exhaustiva de la histología tisular y la composición de la MEC para estos productos. La tinción histológica confirmó las observaciones iniciales, mostrando que las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios tenían una composición de la MEC dérmica que consistía en fibras de colágeno maduras gruesas entrelazadas con menos colágeno inmaduro y mucinas/GAG con localizaciones e intensidades de tinción concordantes con la piel madura. En las tinciones de colágeno por IHQ, se observó menos colágeno tipo I en los grupos tratados con hidrogel de amnios y polvo de amnios en comparación con los otros grupos. Esto puede indicar menos colágeno fibrótico de tipo cicatriz, que normalmente es desorganizado. Parece que la desaceleración de la deposición de colágeno tipo I desorganizado en el tejido en regeneración puede dar como resultado una formación más lenta, pero más organizada, de fibras de colágeno maduras, con lo que el tejido sería de naturaleza menos fibrótica. Adicionalmente, se observó una tinción ligeramente aumentada con hierro coloidal de mucinas/GAG en los grupos tratados con hidrogel de amnios y polvo de amnios en comparación con otros grupos. Esto puede sugerir además que, al prevenir la formación de colágeno fibrótico desorganizado, no sólo se pueden formar fibras de colágeno maduras, sino también otros componentes de la MEC tales como el ácido hialurónico, heparán sulfato, sulfato de condroitina y otros GAG/proteoglucanos que son importantes para una matriz y un tejido sanos. Por otro lado, las heridas sin tratar, las tratadas con AMNIOGRAFT® y con parche electrohilado, mostraron una composición de la MEC dérmica que consistía en colágeno inmaduro y desorganizado, y en mucinas/GAG difusos. Esto estaba respaldado por la observación de una intensa tinción de colágeno tipo I, acompañada de poca tinción de colágeno tipo III, lo que sugiere que estos tejidos pueden estar progresando hacia la generación de tejido fibrótico, lo que conduce a la contracción y la deformidad cicatricial.

Respuesta inmunitaria:

Como los estudios previos se realizaron en animales inmunocomprometidos, era importante evaluar si los materiales procedentes de tejidos humanos inducen una respuesta inmunitaria en estos animales inmunocompetentes. Curiosamente, se observó una infiltración aumentada de células inflamatorias en las heridas tratadas con AMNIOGRAFT® y parche electrohilado. Esto puede deberse a la presencia de células humanas intactas en el AMNIOGRAFT®, sin embargo, como se desconoce la composición del parche electrohilado, se desconoce la causa de la inflamación en estos grupos. Como se esperaba, las heridas no tratadas solo tenían un bajo nivel de infiltración de células inflamatorias, de forma similar a la piel sana. Las heridas tratadas con GRAFTJACKET® presentaban una importante respuesta inflamatoria, tanto dentro de la superficie de la costra como en el tejido subyacente. Se desconoce si estas respuestas también se habrían observado en la aplicación alogénica en pacientes humanos. Sin embargo, sí sugiere la presencia de antígenos estimulantes en estos productos. Es importante destacar que no se observó una infiltración aumentada de células inflamatorias con hidrogel de amnios o polvo de amnios en el momento de la recogida de tejido, lo que sugiere que estos productos no estimulan una reacción inmunitaria perjudicial en el contexto xenogénico en la misma medida que los otros tratamientos. Esto respalda la aplicación de este producto en el contexto alogénico con un riesgo mínimo. Los biomarcadores inflamatorios han mostrado cierto éxito en la predicción del éxito o fracaso de diversas estrategias de tratamiento de cicatrización de heridas. Se seleccionó un panel de 9 biomarcadores basándose en su capacidad para predecir los resultados de cicatrización de heridas en heridas humanas. Se observaron fuertes tendencias en las tres categorías de biomarcadores, mostrando GRAFT JACKET® de cicatrización retardada una alta expresión de biomarcadores inflamatorios de heridas no cicatrizantes y una baja expresión de biomarcadores de heridas cicatrizantes. Se observó el resultado opuesto al analizar las heridas tratadas con hidrogel de amnios y polvo de amnios, que mostraban una baja expresión de biomarcadores inflamatorios de heridas no cicatrizantes y una expresión aumentada de biomarcadores de heridas cicatrizantes. Esto respalda el uso de estos biomarcadores para predecir la cicatrización de heridas en este modelo. Sin embargo, hubo varias limitaciones en el uso de biomarcadores en el modelo. En primer lugar, en este modelo de animal sano de cicatrización de heridas, la mayoría de los otros tratamientos finalmente dan como resultado el cierre completo de la herida, aunque con niveles variables de eficacia. En comparación con las heridas no cicatrizantes genuinas, es probable que las diferencias en los niveles de expresión entre estas opciones de tratamiento sean más pequeñas, aunque las tendencias observadas coinciden con la imagen y el análisis histológico. En segundo lugar, los tejidos se recolectaron en el punto de tiempo final de este estudio, posiblemente después del momento de máxima inflamación. Esto puede explicar los bajos niveles generales de expresión observados para varios marcadores en estos experimentos.

En conclusión, el hidrogel de amnios y el polvo de amnios fueron los productos más fáciles de administrar en heridas de espesor total en el modelo porcino. La aplicación de estos productos dio como resultado las tasas de cierre de heridas más rápidas, impulsadas principalmente por una nueva epitelización y sin rechazo inmunitario. Estas observaciones estaban sustentadas por análisis histológicos y de biomarcadores, que demostraron que estos tratamientos propician la cicatrización rápida de estas heridas de grosor total, dando como resultado la formación de una epidermis y dermis maduras con una composición similar a la de la piel sana.

Estudio in vivo dos

Estudio in vivo con nuevo hidrogel reticulado con PEGDMAl. Este estudio, en donde el hidrogel está reticulado con PEGDMal, está conforme a la invención reivindicada.

El fin de este estudio fue evaluar si la sustitución del reticulante diacrilato de polietilen (glicol) (PEGDA) por un polietilenglicol funcionalizado con maleimida (PEGDMal) modificaba las propiedades básicas del hidrogel. Este estudioin vivodemostró que no hubo diferencias significativas entre los hidrogeles reticulados con cualquiera de los productos.

PEGDMal es un derivado de PEG reactivo capaz de formar enlaces estables entre los grupos maleimida y tiol de los hidrogeles. La reacción de maleimida-tiol acelera la reticulación en comparación con la reacción tradicional de acrilatotiol, dando como resultado una reticulación casi instantánea al mezclar los componentes del hidrogel, eliminando así el requisito de luz UV para reticular el hidrogel de hialurónico.

La nueva formulación de hidrogel también se puede combinar con polvo de amnios o membrana de amnios solubilizada, combinando el reticulante PEGDMal con polvo/solución de amnios y solución salina en un émbolo de la jeringa, y AH y gelatina en el otro. Adicionalmente, los componentes individuales se pueden almacenar congelados indefinidamente dentro de la jeringa de doble cámara sin reticulación. Después de la descongelación, se ha demostrado que el tiempo de trabajo es de hasta aproximadamente 8 horas, antes de que comiencen a formarse enlaces disulfuro de tiol-tiol dentro de la solución de gelatina y AH tiolado.

Animales y heridas:

Se compraron tres cerdos Yorkshire sin patógenos específicos (SPF, del inglésSpecific Pathogen Free)y se les permitió aclimatarse durante el período necesario de 2 semanas. Al comienzo del estudio, los cerdos pesaban aproximadamente 40-50 kg. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wake Forest (A13-015 - Productos de amnios para la cicatrización de heridas en cerdos). Todo el entrenamiento, la creación de heridas y el vendaje se realizaron como se describe anteriormente. Brevemente, se crearon 8 superficies de herida en la piel mediante la eliminación de 4x4 cm de piel de espesor total en la parte central de la espalda a lo largo de la superficie torácica y lumbar. Se hicieron incisiones a lo largo de los bordes de la herida hasta la capa del panículo carnoso y se extrajo la piel suprayacente.

Tratamientos de heridas:

La superficie de la herida se trató con 88 mg de polvo de amnios, aplicados directamente a la superficie de la herida, 8 ml del transportador de hidrogel de hialuronano modificado solamente, polvo de amnios estratificado bajo el hidrogel o polvo de amnios premezclado con el hidrogel. Un grupo adicional no se sometió a ningún tratamiento. Las imágenes de las heridas tratadas con cada una de las formulaciones de amnios/hidrogel se muestran en la FIG. 30 y la FIG. 31. Las cinco opciones experimentales se distribuyeron entre los 8 defectos de la piel para controlar las diferencias en la ubicación de las heridas. La ronda experimental duró 28 días, durante el cual se inspeccionaron las heridas 2 veces por semana para 1) la documentación del tamaño de la herida, reepitelización y cierre, y 2) limpieza y revendaje.

Preparación de hidrogel

La preparación de hidrogel utilizada en este estudioin vivosiguió el mismo procedimiento descrito en el estudioin vivouno en el presente documento, excepto el uso de PEGDMal como reticulante. La concentración final de AH:gelatina:reticulante (PEGDMal) es la misma que AH:gelatina:reticulante (PEGDA) del estudioin vivouno, pero las concentraciones iniciales y los volúmenes anteriores se modifican para permitir la creación de 2 reactivos de igual volumen que se pueden colocar en jeringas dobles con puntas de jeringas mezcladoras para la deposición (FIG. 27). Se midió la liberación acumulada de proteínas y el hinchamiento del gel durante un período de 14 días (FIG. 28 y FIG.

29). No se observaron diferencias significativas entre los hidrogeles reticulados con cualquiera de los productos.

Grupos:

1. Control no tratado

2. Hidrogel

3. Polvo de amnios

4. Polvo de amnios hidrogel (polvo en capas bajo hidrogel)

5. Polvo de amnios en hidrogel (mezclado antes de la aplicación)

Tabla 3: Distribución de herida:

Análisis del estudio:

A los 28 días postratamiento, finalizó el estudio y se recogieron las zonas de herida. Las heridas se dividieron en dos mitades: una para histología e inmunohistoquímica y otra para pruebas mecánicas. Después de las pruebas mecánicas, este tejido se dividió nuevamente y se almacenó para su posible uso para análisis por PCR de biomarcadores de cicatrización de heridas y ensayos de proteínas.

Análisis de imágenes:

La contracción se midió en cada uno de los puntos de tiempo midiendo la superficie dentro del cuadrado tatuado utilizando el software ImageJ y se expresó con respecto al tamaño del tatuaje original. La relación de contracción de la herida describe el grado en que la herida ha cambiado de forma desde la herida cuadrada inicial. Las heridas que cicatrizan por reepitelización normalmente mantienen su forma cuadrada inicial, al tiempo que se contraen ligera y simétricamente. Las heridas altamente contráctiles generalmente se contraen desde los bordes de la herida, dando como resultado una herida en forma de estrella. El cierre de la herida y la epitelización se midieron utilizando ImageJ para determinar la superficie de la herida abierta, de epitelio maduro e inmaduro, que se pueden identificar por el color y la textura de la herida en cicatrización. Generalmente las heridas abiertas eran de color rojo oscuro y brillantes, el epitelio inmaduro era de color rojo claro y opaco/mate (debido a una fina capa de epidermis) y el epitelio maduro era de color blanco/rosado y opaco/mate. Estos componentes se midieron expresados como mediciones individuales con respecto al tamaño original de la herida y se combinaron para demostrar la contribución de todos los componentes a la cicatrización de la herida a lo largo del tiempo (FIG. 38).

Histología e IHQ:

1) tinción de HyE

3) Tinción de rojo sirio, para colágenos maduros e inmaduros

Pruebas mecánicas:

Para analizar las propiedades mecánicas de las heridas de la piel regenerada, la mitad de cada herida extraída en el momento de la eutanasia se evaluó inmediatamente mediante pruebas de compresión utilizando una máquina de pruebas mecánicas Instron. Las muestras consistieron en el borde exterior de la herida hasta el centro de la herida, y el dispositivo de compresión se orientó a lo largo de este recorrido, como se muestra en la FIG. 44. Cada muestra se comprimió a una velocidad de 5 mm/minuto, durante lo cual se midieron y registraron la carga, la tensión y la deformación utilizando el paquete informático Bluehill que acompaña a la máquina Instron.

Las curvas de tensión-deformación se recopilaron para cada muestra importando los datos en GraphPad Prism, donde se realizó todo el análisis aguas abajo. En general, los tejidos blandos dan como resultado curvas de tensióndeformación no lineales, ya que no son perfectamente elásticos.

Como tal, una curva representativa de tensión-deformación se asemeja a la representada en la FIG. 45. Dicha curva produce los siguientes datos, también representado en la FIG. 45:

• Resistencia a la compresión, que corresponde a la resistencia final donde falla el material. Esto se indica con la flecha roja.

• La porción inicial casi lineal de la curva, que describe el dominio elástico del material. En este dominio, el material se extiende, pero tiene la capacidad de rebotar si se elimina la fuerza aplicada. La pendiente de esta porción lineal da el módulo de Young para la compresión E. Esto se indica con la línea verde.

• La terminación del dominio elástico, o porción lineal inicial de la curva, indicada por la flecha azul, es el límite de elasticidad. Por encima de este punto se produce daño en el material y se comporta plásticamente y no volverá a su estado original.

Resultados

Observaciones generales:

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron sin complicaciones. Las heridas se crearon con un tamaño y profundidad uniformes. Se observó cierta flacidez de la piel después de la eliminación de la sección de piel cuadrada. Se distribuyó uniformemente polvo de amnios golpeando suavemente el tubo sobre la herida, seguido de la aplicación de 1 ml de solución salina estéril para humedecer el polvo. Alternativamente, el polvo podría haberse aplicado mezclándolo primero con solución salina. Estudios anteriores no han mostrado diferencias entre cada método de suministro para ningún parámetro medido. La nueva formulación de hidrogel se preparó en condiciones estériles por la mañana antes de la cirugía y se transportó al quirófano en hielo. Cada uno de los tratamientos de hidrogel fue muy fácil de administrar, precisando solo una mano y dando como resultado la formación de un gel casi instantáneamente dentro de la herida. No se produjo goteo ni pérdida de material. La premezcla del polvo de amnios en los componentes de hidrogel y el suministro a través de una jeringa de doble cámara fue fácil de realizar. Aunque el polvo no era el 100%soluble en las concentraciones suministradas, el polvo mezclado en el tratamiento con hidrogel se suministró fácilmente sin pérdida de producto.

Análisis de imágenes:

Se tomaron fotografías digitales para cada uno de los puntos de tiempo (días 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 y 28) y se recopilaron para cada una de las 8 heridas (FIG. 32, FIG. 33 y FIG. 34). Nota: La distribución de tratamientos de heridas se describe en la Tabla 3 anterior. Las opciones de tratamiento se mantienen en el mismo orden para cada animal para facilitar la comparación. Los tres tratamientos inferiores en cada cerdo son las tres opciones de tratamiento repetidas para ese cerdo.

Cierre de heridas:

El cierre de heridas se correlaciona con la cicatrización satisfactoria de heridas. Cuanto mayor sea la tasa de cierre de las heridas, mejor será el resultado de la cicatrización. El cierre de la herida se midió para cada punto de tiempo y se expresó como un porcentaje de la herida presente con respecto a la superficie original de la herida (FIG. 35). El tamaño promedio de la herida era de 17,5 cm2 sin diferencias significativas entre tratamientos ni cerdos. En el punto de tiempo inmediato después del tratamiento de la herida, hubo un aumento inicial de la superficie de la herida para todas las heridas que no sean las tratadas con polvo de amnios debido al estiramiento/retracción de la herida. Esto sugiere que la aplicación de polvo de amnios ayuda a estabilizar inmediatamente la superficie de la herida. Las heridas no tratadas y las tratadas con hidrogel mostraron la mayor expansión en el tamaño de la herida en los primeros puntos temporales. Los grupos tratados con polvo de amnios mostraron un inicio de granulación más temprano y más pronunciado. Esto se produjo principalmente entre el día 4 y el día 11 y se produjo en cada formulación de tratamiento que contenía polvo de amnios. Todos los grupos mostraron una rápida disminución de la superficie de la herida entre el día 7 y el día 14, desempeñándose todos los grupos de manera similar durante este período. Sin embargo, entre el día 14 y el día 28, los tres grupos tratados con polvo de amnios mostraron un cierre acelerado de la herida, dando como resultado un cierre de casi el 100 % hacia el día 24. En este punto, las heridas no tratadas y las tratadas con hidrogel aún mostraban aproximadamente el 15-20 % de la superficie de la herida. Esta diferencia se observó en cada punto temporal después del día 14. Para comparar los resultados entre los dos estudiosin vivoen el presente documento, se representaron y compararon grupos por duplicado de cada estudio (sin tratar y con polvo de amnios) (FIG. 48). Esta comparación muestra que, aunque se observaron algunas diferencias menores en el desarrollo cronológico de la expansión y contracción de la herida, las tendencias y la tasa de cierre de la herida fueron muy similares, al igual que la mejora cuando se aplicó el polvo.

Contracción de la herida:

La contracción de la herida se correlaciona con la eficacia de la cicatrización de heridas. Cuanto mayor era la tasa de contracción, peor se volvió el resultado de cicatrización. La contracción de la herida se midió para cada punto de tiempo midiendo la superficie dentro del borde del tatuaje y expresada como un porcentaje de la superficie con respecto a la superficie del tatuaje original (FIG. 36). Al igual que con los datos de cierre de heridas, se observó un aumento inicial de la superficie de la herida/tatuaje durante los primeros 7 días. Esto dio como resultado un porcentaje inicial de contracción negativa de aproximadamente el 20 %. Las heridas no tratadas y las tratadas con hidrogel mostraron la mayor contracción, con una contracción rápida que se producía entre el día 7 y el día 14, alcanzando aproximadamente el 50 % de la superficie original del tatuaje. En el punto de tiempo final, estos productos mostraron una contracción del 60 %. Polvo de amnios, polvo gel y polvo en gel son los que menos se contraen, desempeñándose mejor polvo y polvo gel. Estos productos mostraron un aumento retrasado de la contracción y un período de contracción más corto y menos rápido entre el día 7 y el día 18, alcanzando una contracción de aproximadamente el 30 %. En el punto de tiempo final, estos productos mostraron una contracción del 35 %.

Relación de contracción de la herida:

Para medir este fenómeno, se tomaron varias mediciones de las heridas a lo largo de todos los puntos de tiempo (FIG.

37). Se midió la distancia del borde izquierdo de la herida al punto central entre las dos esquinas izquierdas de la herida y se expresó como una relación de la distancia total entre estas esquinas. Esta relación da una descripción aproximada de la cantidad de cambio de forma de la herida. Las heridas cuadradas no contraídas tienen una relación cercana a 0, mientras que las heridas en forma de "estrella" muy contraídas tienen una relación cercana a 0,2. Confirmando los datos de contracción, la relación de heridas no tratadas y tratadas con hidrogel aumentó a aproximadamente 0,15 durante 28 días. Todos los grupos tratados con polvo de amnios aumentaron en menor medida, manteniendo una relación de menos de 0,1 durante el transcurso del estudio.

Epitelización de heridas:

La epitelización de la herida se correlaciona con el éxito de cicatrización de la herida. Cuanto mayor sea la tasa de epitelización, mejor cicatriza la herida. La epitelización se midió en todos los puntos de tiempo por la presencia de un recubrimiento epitelial de aspecto mate distinto de la superficie de la herida (Figura 38). La epitelización se describe como el porcentaje de la superficie original de la herida cubierta por epitelio en cada punto de tiempo. Por lo tanto, el porcentaje de herida restante, la contracción y la epitelización deben ser aproximadamente del 100 %. Inicialmente, todos los tejidos tenían algún nivel de epitelización debido a que la herida por incisión se creaba dentro de la línea del tatuaje. Esta superficie inicial era de aproximadamente el 18-20 % de la superficie dentro del tatuaje y fue homogénea en todos los tratamientos y cerdos. Las heridas no tratadas y las tratadas con hidrogel mostraron la menor epitelización de heridas, mostrando un inicio muy lento de la epitelización (aumento del 0 % en el día 14-18) y una epitelización total baja (~25-30 %) al final del estudio. Las heridas tratadas con polvo de amnios y polvo gel fueron las que mejor se desempeñaron en cuento a la epitelización total de la herida, mostrando una epitelización inicial rápida que alcanzó aproximadamente el 45 % el día 14 y casi el 70 % al final del estudio. Amnios en hidrogel mostró una epitelización ligeramente menor en comparación con los otros dos grupos tratados con polvo de amnios, pero aún fue significativamente mejor que los grupos sin tratar y con hidrogel. La epitelización de la herida también se analizó con respecto a la superficie de la herida contraída dividiendo la superficie de epitelización de la herida por la superficie del límite del tatuaje contraído (FIG. 39). Esto proporciona información sobre la composición de la herida dentro de los límites de la contracción y muestra el cierre de la herida influenciado por la epitelización.

Análisis combinado de la superficie de la herida, la contracción y la epitelización:

Si bien se puede obtener información importante al analizar los componentes individuales de los mecanismos de cicatrización de heridas, solo observando la imagen completa de la herida durante la cicatrización se puede obtener una representación precisa de la calidad de la cicatrización. Para lograr esto, se representa la superficie total de la herida en cada punto de tiempo dividido en el porcentaje de la superficie de la herida, el porcentaje de contracción y el porcentaje de epitelización (FIG. 40). Con estos tres componentes medidos que describen completamente la cicatrización de la herida con el tiempo, se pueden observar los mecanismos competitivos de contracción y epitelización para cada uno de los tratamientos. La clasificación de cada tratamiento se realizó con los criterios de mejor cicatrización como: superficie de herida pequeña, menor contracción y más epitelización. Los criterios para la peor cicatrización fueron; superficie grande de la herida, más contracción y menos epitelización. Los tres grupos tratados con polvo de amnios fueron los productos con mejor desempeño usando estos criterios, con el cierre más rápido y completo de las heridas, que fue impulsado por una epitelización aumentada y una contracción mínima. En estos grupos, la contracción representó aproximadamente el 30 % del cierre de la herida, mientras que el 70 % se debió a la epitelización al final del estudio. Los grupos no tratados y tratados con hidrogel fueron los de peor desempeño, mostrando el 60-70 % de contracción, el 20-30 % de epitelización y el 10 % de herida abierta restantes al final del estudio. Estos datos destacan la importancia del tipo y la calidad de la cicatrización de heridas, ya que la contracción puede dar como resultado una disminución de la superficie de la herida, pero también conduce a desfiguración, deformidad cicatricial y pérdida de función. Por esta razón, el cierre de la herida por reepitelización es más conveniente ya que esto da como resultado un restablecimiento rápido de la barrera de la piel, con óptimos resultados estéticos y funcionales.

Análisis histológico

Se usaron cortes teñidos con hematoxilina y eosina para evaluar y comparar la estructura general y la composición de cada una de las heridas. Las imágenes representativas de los cerdos 7-9 se muestran en la FIG. 41. Se usó piel de cerdo sano como control para este análisis. El análisis de las heridas de los cerdos 7-9 mostró que la epidermis de las heridas tratadas con polvo de amnios, amnios gel y amnios en gel tenía un aspecto similar al de la piel sana en cuanto a la cobertura de la epidermis, el grosor y la de presencia de crestas interpapilares. La epidermis de las heridas no tratadas y tratadas con hidrogel no siempre estuvo presente, pero cuando lo estaba parecía fina e inmadura, careciendo de un límite definido con la dermis y careciendo de crestas interpapilares. La dermis de la piel sana consistía en grandes fibras organizadas de color rosado claro, con sólo un mínimo de fibras desorganizadas, finas y violetas. Las heridas tratadas con amnios en polvo, amnios gel y amnios en gel tenían un aspecto similar al de la piel sana, con una composición similar que incluía grandes fibras dérmicas organizadas entrelazadas con fibras más pequeñas. Las heridas no tratadas y tratadas con hidrogel mostraron una densa red de pequeñas fibras oscuras y células hipertróficas. En general, todos los grupos tratados con polvo de amnios parecían más similares a la piel sana en lo que respecta tanto a la epidermis como a la dermis.

Tinción con pentachrome:

Se realizó una tinción con Pentachrome para dar una visión general de la composición de la matriz extracelular (MEC) de las heridas. Pentachrome es una tinción que puede identificar múltiples componentes de la MEC simultáneamente. La tinción con pentachrome muestra el colágeno en amarillo, las fibras maduras en rojo, las mucinas y los glucosaminoglucanos (los GAG) en azul/verde y los núcleos y las fibras elásticas en negro. La FIG. 42 muestra las imágenes representativas de los 5 grupos de tratamiento y de piel sana. La piel sana tenía una dermis que consistía en fibras de colágeno maduras gruesas (rojas) y tinción positiva en amarillo y verde para el colágeno y las mucinas/los GAG. También se observó algo de tinción negra de elastina en la dermis superior. Las heridas tratadas con amnios en polvo, amnios gel y amnios en gel tenían un aspecto similar al de la piel sana, con una cantidad intermedia de fibras gruesas de colágeno maduro (rojo) sobre un fondo amarillo/verde de colágeno, mucinas y GAG. También se observaron fibras de elastina en grado variable en todos los grupos tratados con polvo de amnios. Las heridas no tratadas eran principalmente fibras de colágeno inmaduras (amarillo) con algo de tinción de GAG/mucina (azul). Se observó muy poca tinción de colágeno maduro. Las heridas tratadas con hidrogel mostraron algo de tinción de colágeno maduro, sin embargo, esto no era obvio y las fibras todavía parecían pequeñas y desorganizadas. Tanto las heridas no tratadas como las tratadas con hidrogel mostraron hipertrofia celular.

Tinción con rojo sirio para colágeno inmaduro y maduro:

La tinción con rojo sirio diferencia entre colágeno inmaduro y maduro cuando se observa a la luz polarizada. El colágeno inmaduro desorganizado se tiñe de verde y el colágeno maduro organizado se tiñe de amarillo/naranja. La FIG. 43 muestra las imágenes representativas de los 5 grupos de tratamiento y de piel sana. La piel sana muestra una fuerte tinción en verde y naranja, indicando una red organizada de fibras de colágeno maduras más grandes con fibras de colágeno más pequeñas entremezcladas. Todos los grupos tratados con polvo de amnios parecen similares a la piel sana, mostrando una distribución similar de naranja y verde en toda la dermis. Los grupos no tratados y tratados con hidrogel mostraron una tinción mínima de colágeno, con solo una pequeña cantidad de colágeno maduro (rojo) visible.

Resistencia a la compresión

Se midió que la resistencia a la compresión era generalmente más alta en los grupos de no tratados y con hidrogel (respectivamente 40,72 y 42,35 MPa) en comparación con los grupos de polvo, polvo hidrogel y polvo en hidrogel (respectivamente 32,69, 31,93 y 32,01 MPa); FIG. 46A). Aunque estas diferencias no fueron significativamente distintas, muestran una tendencia consistente en que la inclusión de polvo de amnios reduce la resistencia a la compresión. De hecho, si se combinan los valores experimentales de hidrogel y sin tratar y se combinan todos los grupos que incluyen polvo, entonces la inclusión de polvo de amnios reduce significativamente la tensión de compresión (respectivamente 41,54 frente a 32,21 MPa; p < 0,05) (FIG. 46B).

Módulo de Young

El módulo de Young fue más bajo en el grupo sin tratar (9,78 MPa). Los otros grupos - hidrogel, polvo, hidrogel polvo y polvo en hidrogel, tenían módulos de Young más altos de, respectivamente, 11,10, 12,84, 10,07 y 11,62 MPa. Ninguna de las diferencias observadas fue estadísticamente significativa (FIG. 47A).

Límite de elasticidad

No se encontraron diferencias significativas entre ningún grupo en términos de tensión de fluencia (FIG. 47B).

Sumario

Facilidad de administración del tratamiento:

La aplicación del sistema de hidrogel modificado precisó una preparación mínima y solo una mano para la aplicación estéril. Este sistema de hidrogel se puede almacenar congelado en la jeringa de doble cámara lista para usar. Para su aplicación, el producto simplemente debe descongelarse y aplicarse.

Calidad de cicatrización de heridas:

El análisis de cierre de heridas, la contracción y la epitelización demostró que todos los grupos que contenían polvo de amnios fueron superiores en el cierre de heridas y la epitelización, y fueron los de mejor desempeño en la prevención de la contracción. Las heridas no tratadas y las tratadas con hidrogel mostraron una mayor contracción, una epitelización reducida y un tiempo de cierre de la herida más lento, desempeñándose las con hidrogel marginalmente mejor que las sin tratar. Los tratamientos que contienen polvo de amnios aceleraron la tasa y el alcance del cierre total de heridas a través de la aceleración significativa de la reepitelización de heridas. Se observó una diferencia mínima entre la tasa de epitelización del grupo de polvo en hidrogel en comparación con los otros dos grupos de amnios. Mientras que los tratamientos con polvo de amnios y amnios hidrogel implicaron la aplicación de toda la dosis de polvo sobre la herida, diluir polvo de amnios con hidrogel puede haber retrasado ligeramente la liberación de factores bioactivos en el lecho de la herida, potencialmente también diluyendo el efecto del polvo de amnios en puntos de tiempo clave durante la cicatrización de la herida.

Calidad de la piel:

Las observaciones histológicas mostraron que todos los grupos de polvo de amnios tenían una composición de la herida similar a la piel sana, consistente en una cobertura de la epidermis, un grosor y una presencia de crestas interpapilares. similares y una composición de la dermis que incluía grandes fibras dérmicas organizadas entrelazadas con fibras más pequeñas. La calidad de la MEC de la herida es de importancia clave para el éxito a largo plazo de la cicatrización de la herida.

La composición de la MEC tiene una gran influencia sobre las propiedades de cicatrización de heridas. La tinción histológica confirmó las observaciones iniciales, mostrando que todos los grupos tratados con polvo de amnios tenían una composición de la MEC dérmica que consistía en fibras de colágeno maduras gruesas entrelazadas con menos colágeno inmaduro y tinción de fibras de elastina con localizaciones e intensidades de tinción consistentes con la piel madura. Con respecto a la composición del colágeno dérmico, la tinción con rojo sirio mostró que todos los grupos tratados con polvo de amnios tenían una relación y una composición de fibras de colágeno inmaduras con respecto a maduras dentro de la dermis similares. Las heridas no tratadas y las tratadas con hidrogel mostraron una epidermis inmadura o ausente, y una composición de la dermis de fibras de colágeno densas, inmaduras y desorganizadas e hiperplasia celular.

Pruebas de compresión

Las diferencias en las pruebas de compresión no fueron estadísticamente significativas, en su mayor parte. Sin embargo, basándose en las tendencias generales, los datos combinados de resistencia a la compresión de sin polvo frente a con polvo, y el examen histológico de muestras de tejido extraído, sugieren que la inclusión de polvo de amnios en los tratamientos disminuye la resistencia a la compresión. La resistencia a la compresión representa el componente no elástico de la biomecánica de compresión del tejido y una resistencia a la compresión aumentada significa una capacidad reducida de la piel regenerada para deformarse y luego recuperarse elásticamente. Por lo tanto, estos datos sugieren que, en este punto del proceso de cicatrización, los grupos tratados con polvo son menos rígidos y más elásticos. Adicionalmente, todas las combinaciones de hidrogel con o sin polvo de amnios dan como resultado un módulo de Young más alto que el grupo no tratado. Esto puede sugerir que estos tratamientos aumentan la elasticidad de la piel en regeneración. Sin embargo, estos tejidos, cuyas mediciones se realizaron a los 28 días de la lesión, probablemente se encuentren en una fase demasiado temprana del proceso de regeneración para ser adecuados. Es posible que, si el estudio se produce durante más tiempo, las diferencias en las propiedades mecánicas pueden producir significación estadística.

En conclusión, el polvo de amnios, polvo de amnios hidrogel (en capas) y polvo de amnios en hidrogel (mixto) fueron igualmente fáciles de administrar en heridas de espesor total y dieron como resultado las tasas de cierre de heridas más rápidas, impulsado principalmente por una nueva epitelización, y da como resultado la formación de una epidermis y una dermis maduras con una composición similar a la de una piel sana. Estas observaciones son concordantes con el otro estudioin vivodescrito en el presente documento y proporciona múltiples opciones para el suministro de este producto para aplicaciones clínicas de cicatrización de heridas.

Debe entenderse que, siempre que se proporcionen valores e intervalos en el presente documento, todos los valores e intervalos abarcados por estos valores e intervalos, se prevé que estén todos incluidos dentro del alcance de la presente invención. Además, todos los valores incluidos dentro de estos intervalos, así como los límites superior o inferior de un intervalo de valores, también están contemplados por la presente solicitud.

Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de discernir no utilizando más que la experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos, realizaciones, reivindicaciones y ejemplos descritos en el presente documento. Dichos equivalentes se consideraron dentro del alcance de la presente invención y cubiertos por las reivindicaciones adjuntas a la misma. Por ejemplo, debe entenderse que, las modificaciones en las condiciones de reacción, incluyendo, pero sin limitación, los tiempos de reacción, el tamaño/volumen de la reacción y los reactivos experimentales, tales como disolventes, catalizadores, presiones, condiciones atmosféricas, por ejemplo, atmósfera de nitrógeno y agentes reductores/oxidantes, con alternativas reconocidas en la técnica y que no utilizan más que la experimentación de rutina, están dentro del alcance de la presente solicitud.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de polvo de membrana amniótica que comprende una cantidad de

(i) proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, preferentemente, la proteína total está en el intervalo de 50 mg/g a 250 mg/g;

(ii) elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, preferentemente, la elastina está en el intervalo de 5 mg/g a 60 mg/g;

(iii) colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g, preferentemente, el colágeno está en el intervalo de 10 mg/g a 600 mg/g;

(iv) glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g, preferentemente, los glucosaminoglucanos están en el intervalo de 0,5 mg/g a 2 mg/g;

(v) trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g, preferentemente la trombospondina 1 (TSP-1) está en el intervalo de 50 pg/g a 400 pg/g;

(vi) pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g, preferentemente la pentraxina 3 (PTX-3) está en el intervalo de 1 pg/g a 20 pg/g; o

(vii) gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g, preferentemente el TSG-6 es inferior a 1,0 ng/g,

comprendiendo además la composición un armazón, en donde el armazón es un hidrogel, en donde el hidrogel comprende PEGDMal.

2. La composición de la reivindicación 1(i), que comprende además una cantidad de

elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g;

colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g;

glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g;

trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g;

pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g; y/o

TSG-6 inferior a 1,5 ng/g.

3. La composición de la reivindicación 1(ii), que comprende además una cantidad de

colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g;

glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g;

trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g;

pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g; y/o

TSG-6 inferior a 1,5 ng/g.

4. La composición de la reivindicación 1(iii), que comprende además una cantidad de

glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g;

trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g;

pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g; y/o

TSG-6 inferior a 1,5 ng/g.

5. La composición de la reivindicación 1(iv), que comprende además una cantidad de

trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g;

pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g; y/o

TSG-6 inferior a 1,5 ng/g.

6. La composición de la reivindicación 1(v), que comprende además una cantidad de pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g y/o una cantidad de TSG-6 inferior a 1,5 ng/g.

7. La composición de la reivindicación 1(vi), que comprende además una cantidad de TSG-6 inferior a 1,5 ng/g.

8. La composición de polvo de membrana amniótica de la reivindicación 1, que comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g y glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g.

9. La composición de la reivindicación 8, que comprende además una cantidad de

trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 pg/g a 1000 pg/g;

pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 pg/g a 50 pg/g; y/o

gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g.

10. La composición de polvo de membrana amniótica de la reivindicación 1, que comprende proteína total en el intervalo de 30 mg/g a 500 mg/g, elastina en el intervalo de 4 mg/g a 100 mg/g, colágeno en el intervalo de 10 mg/g a 800 mg/g, glucosaminoglucanos en el intervalo de 0,1 mg/g a 5 mg/g, trombospondina 1 (TSP-1) en el intervalo de 30 |jg/g a 1000 jg/g, pentraxina 3 (PTX-3) en el intervalo de 0,1 jg /g a 50 jg /g y gen estimulado por factor de necrosis tumoral 6 (TSG-6) inferior a 1,5 ng/g.

11. La composición de la reivindicación 1, en donde el armazón comprende al menos un biopolímero seleccionado del grupo que consiste en hialuronano, quitosano, alginato, colágeno, dextrano, pectina, carragenano, polilisina, gelatina y agarosa, o al menos un polímero sintético seleccionado del grupo que consiste en (met)acrilato-oligolactida-PEO-oligolactida-(met)acrilato, poli(etilenglicol) (PEO), polipropilenglicol (PPO), copolímeros de PEO-PPO-PEO (Pluronics), poli(fosfaceno), poli(metacrilatos), poli(N-vinilpirrolidona), copolímeros de PL(G)A-PEO-PL(G)A, poli(etilenimina) y poli(etilglicol) diacrilato.

12. La composición de polvo de membrana amniótica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un método de inducción de la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto, en donde la composición de membrana amniótica es para administración a un sitio de tratamiento en el sujeto.

13. Un envase de kit para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto que comprende:

i. un primer compartimento que contiene una cantidad predeterminada de materiales precursores de hidrogel; y

ii. un segundo compartimento que contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende polvo de membrana amniótica y una composición que comprende PEGDMal como reticulante

o que comprende:

i. un primer compartimento que contiene una cantidad predeterminada de materiales precursores de hidrogel y una composición que comprende polvo de membrana amniótica; y

ii. un segundo compartimento que contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende PEGDMal como reticulante.

14. Un envase de kit para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto que comprende: una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel recubiertos por un material soluble en agua y PEGDMal como reticulante, en donde el polvo de membrana amniótica, los materiales precursores de hidrogel recubiertos por el material soluble en agua y el reticulante se desecan

o que comprende: una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel y PEGDMal como reticulante recubierto por un material soluble en agua, en donde el polvo de membrana amniótica, los materiales precursores de hidrogel y el reticulante recubierto por el material soluble en agua se desecan.

15. El envase de kit de la reivindicación 14, en donde el material soluble en agua es gelatina.

16. Un envase de kit para inducir la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en un sujeto que comprende: una cantidad predeterminada de polvo de membrana amniótica, materiales precursores de hidrogel y PEGDMal como reticulante, en donde los materiales precursores de hidrogel y el reticulante se desecan a partir de una solución con un pH <7.