ES2955029T3 - Medicamento para la cicatrización de heridas - Google Patents

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ES2955029T3 ES18711636T ES18711636T ES2955029T3 ES 2955029 T3 ES2955029 T3 ES 2955029T3 ES 18711636 T ES18711636 T ES 18711636T ES 18711636 T ES18711636 T ES 18711636T ES 2955029 T3 ES2955029 T3 ES 2955029T3
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Sheila Macneil
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Abstract

La invención proporciona un azúcar D-desoxirribosa para su uso en la promoción de la cicatrización de heridas, en el que el azúcar se proporciona en un vehículo y en el que el vehículo es un material de matriz biocompatible o un hidrogel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medicamento para la cicatrización de heridas
Esta invención se refiere en general al campo de la restauración de la piel y el pelo. Más particularmente, la presente invención se refiere a la aplicación de una composición química que promueve la cicatrización de la herida, la angiogénesis, la vascularización y el nuevo crecimiento del pelo.
Antecedentes
Se han realizado muchos estudios sobre cómo promover la angiogénesis en los lechos de las heridas. De todos los factores angiogénicos, el más potente y comúnmente usado en el desarrollo de biomateriales es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Zhang y otros, Biomaterials. 2015; Miyagi y otros, Biomaterials. 2011; Khojasteh y otros, Materials Science and Engineering: C. 2016; Johnson y otros, Advances in Wound Care. 2014). Este factor de crecimiento puede producirse por tecnología recombinante y se ha examinado críticamente en muchos estudios (Neufeld y otros, The FASEB journal. 1999; Long y otros, Journal of theoretical biology. 2013; Xin y otros, Cell. 2016). Sin embargo, los resultados han sido generalmente decepcionantes cuando se añade solo, ya que se descompone rápidamente o se diluye y se desecha. Las estrategias más recientes han sido suministrar VEGF unido a biomateriales. Los biomateriales pueden tomar varias formas, que incluye hidrogeles, andamios o partículas (Chiu y otros, Biomaterials. 2010; Qakíakir-Ózkan y otros, Journal of 0ral and Maxillofacial Surgery. 2017; Zhang y otros, ACS Biomaterials Science & Engineering. 2016; Zhao y otros, Advanced healthcare materials. 2016).
Varios grupos, que incluye el grupo MacNeil, han buscado suministrar VEGF a partir de la heparina unida a los materiales porque la heparina es un glicosaminoglicano natural presente en el cuerpo en altas concentraciones en heridas donde actúa para unirse al VEGF y otros factores proangiogénicos (Wu y otros, Biomacromolecules. 2016; Gigliobianco y otros, Journal of biomaterials applications. 2015). Así, el grupo MacNeil ha desarrollado materiales donde ha buscado inmovilizar la heparina de forma electrostática ya sea a hidrogeles (Gilmore y otros, Biotechnology and bioengineering. 2013) o en un recubrimiento capa por capa de andamios electrohilados (Gigliobianco y otros, Journal of biomaterials applications. 2015; Easton y otros, Journal of Materials Chemistry B.
2014) . In vivo la heparina se une y libera VEGf y otros mitógenos proangiogénicos (Ferrara N y otros, Nature medicine. 2003). VEGF activa la proliferación y migración de células endoteliales tanto en tejido normal como tumoral y da como resultado una rápida generación de nuevos vasos sanguíneos (Harmey JH. Springer Science & Business Media; 2004; Hicklin y otros, Journal of clinical oncology. 2005). En consecuencia, se ha explorado el potencial de VEGF en la preparación de materiales donde se requiere angiogénesis, por ejemplo, en la preparación de dermis sintética para el tratamiento de lesiones por quemaduras de grosor total (Tan y otros, Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2014; Xie y otros, Acta biomaterialia. 2013; GOO R y otros, Biomaterials.
2011) y para estimular la cicatrización de la herida en heridas crónicas que no cicatrizan, como las úlceras diabéticas, en las que la microvasculatura está comprometida.
Aunque VEGF estimula la angiogénesis, es muy caro (930 $ por 50 μg de Sigma-Aldrich) y es inestable (Simón-Yarza y otros, Theranostics. 2012; Thompson y otros, 0xford Textbook of Vascular Surgery: 0xford University Press; 2016). Se conocen otros factores de crecimiento proangiogénicos implicados en la formación de nuevos vasos sanguíneos y existe una cascada compleja de factores que se producen y liberan en respuesta a la hipoxia.
La pérdida de la función de barrera de la piel puede poner en peligro la vida (Chua y otros, Burns & trauma. 2016; Blais y otros, Stem cells translational medicine. 2013). El tratamiento de primera línea habitualmente es el uso de injertos autólogos de piel dividida, pero en pacientes con quemaduras extensas no hay suficientes injertos disponibles para lograr una restauración rápida de la capa de barrera (Yi y otros, Plastic and reconstructive surgery.
2015) . A pesar de 30 años de investigación en esta área, sigue existiendo la necesidad de un sustituto dérmico permanente funcional y rentable para ayudar a los cirujanos a manejar pacientes con más del 30 % de heridas de grosor total (Chua y otros, Burns & trauma. 2016).
Cuando las heridas por quemadura se extienden a más del 30 o 40 % de la superficie corporal total, los cirujanos de quemaduras buscarán usar materiales naturales y sintéticos para proporcionar el recubrimiento inmediato de la herida y ayudar en el reemplazo eventual tanto de la dermis como de la epidermis (Sharma y otros, Burns. 2014). Sigue siendo técnicamente muy difícil producir un material de ingeniería tisular que sea equivalente a un injerto de piel de grosor parcial (que contenga toda la epidermis y parte de la dermis) que "tome" con éxito estos lechos de heridas (Bottcher-Haberzeth y otros, Burns. 2010). El mayor desafío no está en la producción de los materiales en el laboratorio (véase Boyce y otros) sino en los materiales de ingeniería tisular que sobreviven al injerto en el lecho de la herida, lo que requiere un crecimiento rápido de nuevos vasos sanguíneos desde el lecho de la herida subyacente (Boyce y otros, Annals of surgery. 2002; Supp y otros, Clinics in dermatology. 2005). En la práctica, la supervivencia del injerto depende por completo del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde el lecho de la herida subyacente en estos materiales de ingeniería tisular que carecen de vasculatura intrínseca (Laschke y otros, Tissue engineering. 2006; Hackery otros, Scientific reports. 2016).
En la práctica, las quemaduras de grosor total habitualmente se tratan en dos etapas (cuando no hay suficiente autoinjerto disponible). Los materiales se usan para proporcionar un sustituto dérmico vascularizado y después, cuando esta dermis está bien vascularizada, se coloca encima un injerto delgado de grosor parcial (frecuentemente se toman más injertos de piel de los sitios donantes iniciales una vez cicatrizados) o tras colocar células cultivadas sobre la dermis vascularizada. Los dos materiales más usados para proporcionar una dermis vascularizada son un biomaterial, Integra, que se ha desarrollado para este fin, y piel de cadáver de donante (Nguyen y otros, Burns.
2010; Weigert y otros, Journal of Hand Surgery (volumen europeo). 2011; Cleland y otros, Burns. 2014). Integra está compuesto por un sustrato de colágeno bovino con sulfato de condroitina de tiburón sobre el que se ha adherido una membrana de silicona (Chua y otros, Burns & trauma. 2016). El tejido quemado se extirpa clínicamente, se coloca Integra y después se deja en su lugar hasta que se vasculariza, lo que frecuentemente tarda tres semanas o más. En este punto, los cirujanos pueden retirar la membrana de barrera de silicona y colocar encima un injerto de piel delgado de grosor parcial. El material alternativo que se usa es la piel de cadáver. Esto puede usarse para proporcionar un recubrimiento inmediato de la herida (una vez que se extirpa el tejido quemado) y restaurar la función de barrera. Después, en el espacio de unas pocas semanas, se vasculariza y la epidermis del donante puede retirarse suavemente, lo que deja la dermis vascularizada del donante en su lugar y la barrera epidérmica se reemplaza con un injerto de piel de grosor parcial del paciente o con células epidérmicas cultivadas del paciente (como se discutió en MacNeil, Nature. 2007). Sin embargo, estos materiales no siempre están disponibles para los cirujanos de quemados en todo el mundo debido a la falta de bancos de piel bien administrados (para piel de donantes) o porque la compra de Integra se considera demasiado costosa.
La pérdida de pelo es una condición común en los seres humanos y se caracteriza por la pérdida o reducción en la cantidad de pelo de la cabeza o el cuerpo. Una serie de condiciones diferentes pueden implicar la pérdida de pelo. Si bien existen causas conocidas de algunos tipos de pérdida de pelo, que incluye infecciones, medicamentos, traumatismos y embarazo, la causa de otros tipos de pérdida de pelo sigue siendo desconocida. Las terapias convencionales para la pérdida de pelo pueden incluir terapia con medicamentos, por ejemplo, con medicamentos como minoxidil o finasterida. Otra terapia usada es la cirugía de trasplante de pelo, que consiste en recolectar folículos pilosos con fibras capilares de una parte del cuerpo con pelo y reubicar los folículos pilosos en una parte del cuerpo que no tiene pelo. El documento de patente WO 2014/165253 describe generalmente la cicatrización de la herida para ser promovida por carbohidratos, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
Sigue existiendo la necesidad de nuevos biomateriales efectivos y asequibles para proporcionar un sustrato dérmico bien vascularizado en el tratamiento de quemaduras graves. La cuestión clave es que ninguno de los mOteriales actuales contiene vasculatura intrínseca, por lo que el crecimiento de los vasos depende completamente de los vasos sanguíneos en el lecho de la herida subyacente (Supp y otros, Clinics in dermatology. 2005; Sahota y otros, Wound repair and regeneration. 2003). Sigue existiendo la necesidad de un sustrato dérmico que permita una vascularización mejorada que conduzca a una supervivencia posterior a la implantación mejorada.
Breve resumen de la descripción
En un aspecto, la invención proporciona un azúcar D-desoxirribosa para su uso en la promoción de la cicatrización de la herida en donde el azúcar se proporciona en un portador y en donde el portador es un material de matriz biocompatible o un hidrogel. Preferentemente, la D-desoxirribosa es 2-desoxirribosa.
En una modalidad, el portador es un portador biodegradable.
En una modalidad, el material de la matriz es un andamio electrohilado. Preferentemente, el andamio electrohilado comprende al menos uno de ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHBV.
En una modalidad, el hidrogel es un hidrogel reticulado. Preferentemente, el hidrogel comprende al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y colágeno. Adicionalmente, el hidrogel puede comprender alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y alcohol polivinílico.
En algunas modalidades, el portador comprende además un agente antimicrobiano.
En una modalidad, la herida es una herida crónica.
En una modalidad, la herida es una herida de grosor total.
En una modalidad, la herida es una lesión por quemadura.
En un aspecto, la invención proporciona un material de matriz biocompatible que comprende un azúcar D-desoxirribosa.
En una modalidad, el material de la matriz es un andamio electrohilado. Preferentemente, el andamio electrohilado comprende al menos uno de ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHBV.
En un aspecto, la invención proporciona un hidrogel que comprende un azúcar D-desoxirribosa.
En una modalidad, el hidrogel es un hidrogel reticulado. Preferentemente, el hidrogel comprende al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y colágeno. Adicionalmente, el hidrogel puede comprender alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y alcohol polivinílico.
En un aspecto, la invención proporciona el material biocompatible de cualquiera de los aspectos o modalidades antes mencionados para su uso en la promoción de la cicatrización de la herida o para su uso en el tratamiento de la alopecia.
En un aspecto, la invención proporciona el hidrogel de uno cualquiera de los aspectos o modalidades antes mencionados para su uso para promover la cicatrización de la herida o para su uso en el tratamiento de la alopecia. En un aspecto, la invención proporciona el material biocompatible de uno cualquiera de los aspectos o modalidades antes mencionados para su uso en un método para aumentar o inducir la vascularización en el lecho de una herida. En un aspecto, la invención proporciona el hidrogel de uno cualquiera de los aspectos o modalidades antes mencionados para su uso en un método para aumentar o inducir la angiogénesis en el lecho de una herida.
En un aspecto, la invención proporciona un azúcar D-desoxirribosa para su uso en el tratamiento de la alopecia, en donde el azúcar se proporciona en un portador y en donde el portador es un material de matriz biocompatible o un hidrogel. Preferentemente, la D-desoxirribosa es 2-desoxirribosa.
En una modalidad, el portador es un portador biodegradable.
En una modalidad, el material de la matriz es un andamio electrohilado. Preferentemente, el andamio electrohilado comprende al menos uno de ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHBV.
En una modalidad, el hidrogel es un hidrogel reticulado. Preferentemente, el hidrogel comprende al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y colágeno. Adicionalmente, el hidrogel puede comprender alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y alcohol polivinílico.
En algunas modalidades, el portador comprende además un agente antimicrobiano.
En un aspecto, la invención proporciona un método no terapéutico para promover el nuevo crecimiento del pelo, dicho método que comprende la administración de un azúcar D-desoxirribosa, en donde el azúcar se proporciona en un portador y en donde el portador es un material de matriz biocompatible o un hidrogel. Preferentemente, la D-desoxirribosa es 2-desoxirribosa.
En una modalidad, el portador es un portador biodegradable.
En una modalidad, el material de la matriz es un andamio electrohilado. Preferentemente, el andamio electrohilado comprende al menos uno de ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHBV.
En una modalidad, el hidrogel es un hidrogel reticulado. Preferentemente, el hidrogel comprende al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y colágeno. Adicionalmente, el hidrogel puede comprender alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato o cualquiera de sus combinaciones. En una modalidad, el hidrogel comprende quitosano y alcohol polivinílico.
En algunas modalidades, el portador comprende además un agente antimicrobiano.
En un aspecto, la invención proporciona un apósito para heridas que comprende el material de matriz biocompatible de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos o modalidades antes mencionados.
En un aspecto, la invención proporciona un apósito para heridas que comprende el hidrogel de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos o modalidades antes mencionados.
Breve descripción de las figuras
Las modalidades de la invención se describen con más detalle de aquí en adelante con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales:
La Figura 1 muestra imágenes ópticas y de microscopio electrónico de barrido (SEM) de fibras electrohiladas de PCL. Imágenes ópticas de láminas fibrosas (a) sin y (b) con D-desoxirribosa. Micrografías de SEM de fibras sin (c) y con (d) D-desoxirribosa con un aumento de 10000X.
La Figura 2 muestra la apariencia física de los hidrogeles (izquierda) y sus micrografías de SEM (derecha). (a) hidrogeles liofilizados sin TEOF (b) hidrogeles liofilizados con TEOF 16 %; (c) carga física de azúcar en hidrogel sin TEOF (d) carga física de azúcar en hidrogel con TEOF 16 %; (a1) micrografía de SEM de hidrogeles sin TEOF aumento 500 X (b1) micrografía de SEM de hidrogeles con TEOF 16 %, aumento 500 X (c1) micrografía de SEM de hidrogel cargado de azúcar sin TEOF, aumento 500 X (d1) micrografía de SEM de hidrogel cargado de azúcar con TEOF 16 %, aumento 500 X.
La Figura 3 muestra fotografías de hidrogeles de quitosano/colágeno para mostrar su fuerza, forma, flexibilidad y capacidad para plegarse.
La Figura 4 muestra micrografías de microscopio electrónico de barrido (SEM) de andamio CS/colágeno reticulado que muestra una sección transversal de hidrogeles. Micrografías que revelan la estructura porosa de los hidrogeles, Aumento 200 X; (a) control (sin azúcares), (b) hidrogel cargado con D-desoxirribosa, (c) hidrogel cargado con L-desoxirribosa, (d) hidrogel cargado con D-desoxiramnosa, (e) hidrogel cargado con L-desoxiramnosa, (f) hidrogel cargado con D-desoxifucosa, (g) hidrogel cargado con D-desoxifucosa.
La Figura 5 muestra espectros FTIR de diferentes materiales sintetizados [A] Fibras electrohiladas (a) Fibras PCL (b) Fibras PCL electrohiladas cargadas con D-ribosa (c) D-desoxirribosa; [B] Espectros FTIR de hidrogeles c S/PVA (d) control sin TEOF TEOF (e) hidrogel cargado con D-desoxirribosa con TEOF 16 %; [C] FTIR de hidrogeles CS/Colágeno/TEOF (f) hidrogel cargado con D-desoxifucosa, (g) hidrogel cargado con L-desoxiramnosa, (h) hidrogel cargado con D-desoxiramnosa, (i) hidrogel cargado con L-desoxirribosa, (j) hidrogel cargado con D-desoxirribosa, (k) control (sin azúcares).
La Figura 6 muestra [A] Evaluación del potencial angiogénico de las fibras electrohiladas y los hidrogeles cargados con D-ribosa (a) Fibras PCL e-hiladas sin D-desoxirribosa (b) Fibras PCL e-hiladas con D-desoxirribosa (c) hidrogel CS/PVA cargado con D-desoxirribosa con TEOF 16 %; [B] Histograma estadístico que muestra el número de vasos sanguíneos que penetran en los andamios. Se dibujó un círculo a 1 mm del andamio y se contó el número de vasos sanguíneos dentro del círculo. Para cada estudio, se implantaron 8 huevos con andamios y sobrevivieron en promedio 5 pollitos. Los resultados son la media ± S.D de 5 huevos separados.
La Figura 7 muestra el potencial proangiogénico de los hidrogeles CS/Colágeno/TEOF mediante el uso del ensayo CAM. [A] Los andamios se colocaron en CAM el día 8 de la fertilización. La figura muestra imágenes de microscopio óptico de andamios en CAM el día 14 de la fertilización (a) control (sin azúcares), (b) hidrogel cargado con D-desoxirribosa, (c) hidrogel cargado con L-desoxirribosa, (d) hidrogel cargado con D-desoxiramnosa, (e) hidrogel cargado con L-desoxiramnosa, (f) hidrogel cargado con D-desoxifucosa, (g) hidrogel cargado con L-desoxifucosa. La figura también muestra los respectivos hidrogeles explantados en la esquina inferior izquierda de cada imagen. Para cada experimento se implantaron 10 huevos con los respectivos andamios de los cuales sobrevivieron 7 pollitos. [B] La parte inferior de la imagen muestra el análisis estadístico del número de vasos sanguíneos de cada hidrogel. (a) control (sin azúcares), (b) hidrogel cargado con D-desoxirribosa, (c) hidrogel cargado con L-desoxirribosa, (d) hidrogel cargado con D-desoxiramnosa, (e) hidrogel cargado con L-desoxiramnosa, (f) hidrogel cargado con D-desoxifucosa, (g) hidrogel cargado con D-desoxifucosa. Los valores de p estadísticos se dan encima de las barras gráficas. Los valores mostrados son medias ± S.D de siete pollitos para cada andamio.
La Figura 8 muestra que la cicatrización de la herida se aceleró mediante andamios cargados con D-desoxirribosa. Se crearon heridas de grosor total tras marcar un área de 20 mm y después se realizaron escisiones bajo anestesia mediante el uso de tijeras quirúrgicas. Los respectivos materiales se aplicaron a las heridas, se suturaron en su lugar y se recubrieron inicialmente con vendas adhesivas Mepore (Suecia) y finalmente con vendas de algodón. Todas las ratas recibieron los mismos apósitos que se retiraron 3 días después de la creación de la herida. Cada herida se fotografió digitalmente en puntos de tiempo específicos y se cuantificó adicionalmente mediante el uso del programa Image J. Se muestran imágenes macroscópicas representativas de heridas, hidrogeles de control (andamio CS/colágeno reticulado) e hidrogeles cargados con D-ribosa en los días 3, 9, 11, 14 y 17 después de la creación de la herida.
La Figura 9 muestra las áreas de heridas durante 17 días en los histogramas. Se crearon heridas de grosor total tras marcar áreas circulares de 20 mm y después se extirpan con tijeras quirúrgicas. Se usó un control negativo que en realidad era una herida abierta y se dejó cicatrizar de forma natural. El control contenía andamio CS/colágeno sin carga de azúcar y D-R era andamio CS/colágeno cargado con D-desoxirribosa. Para cada tipo de experimento se usaron tres ratas y se observó la cicatrización de la herida hasta el cierre completo de la herida. El diámetro promedio de la herida se determinó mediante el uso del Image J y cada columna representa la media ± SD de cálculos independientes registrados de cuatro heridas para cada muestra. El análisis estadístico mostró que los hidrogeles sin carga aceleraron significativamente la cicatrización de la herida y la adición de D-desoxirribosa aceleró en gran medida la cicatrización de la herida, como puede verse en los días 9, 11, 14 y 17. p<0,0001.
La Figura 10 muestra imágenes H&E y tricrómica de Goldren del día 17. Barras de escala de 0,2 mm.
La Figura 11 muestra imágenes de inmunotinción del día 17. Barras de escala de 0,2 mm.
La Figura 12 muestra una evaluación de los datos de inmunotinción mediante el uso de un sistema de puntuación a ciegas. 0 = ausencia; 1 = presencia leve; 2 = gran presencia; 3 = abundancia; 4 = gran abundancia. Los resultados mostrados son medias ± SD, n=10. También se muestran estadísticas para comparaciones múltiples y la relación M2/M1.
La Figura 13 muestra una ilustración esquemática de las etapas de la aplicación directa de las sustancias y la implantación de los andamios de liberación de sustancias en CAM. La Figura muestra la metodología básica del Ensayo CAM ex-ovo a partir de EDD0.
La Figura 14 muestra las etapas que demuestran el método de cuantificación de macrovasculatura (A) y microvasculatura (B) de CAM.
La Figura 15 muestra una comparación de la respuesta angiogénica a E2 y 2dDR evaluada mediante el uso del ensayo CAM. (A) número de puntos de ramificación, (B) longitud promedio del vaso. **** P < 0,0001, *** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05, ns P>0,05, n=9 ± SD. Se calculó el número de puntos de ramificación y las longitudes promedio de los macrovasos observados en respuesta a diferentes concentraciones de E2 y 2dDR y se compararon con los controles de PBS durante 4 días (C). Los valores representan la media ± SD.
La Figura 16 muestra una demostración del efecto de E2 (200 ng/día) y 2dDR (200 μg/día) sobre la macrovasculatura y la microvasculatura en comparación con la aplicación de PBS (Control). VEGF se incluyó como control positivo y Sunitinib como control negativo. 2dDR se aplicó como 200 μg/día y E2 como 200 ng/día. Todas las comparaciones estadísticas se realizan con PBS. **** P < 0,0001, *** P < 0,001. Las barras de escala representan 1 mm y 50 μm respectivamente para imágenes de macrovasos (en la parte superior) y microvasos (en el medio), n=9 ± SD.
La Figura 17 muestra imágenes de SEM de los andamios. (A) PHBV simple, (B) PHBV E225 mg, (C) PHBV E2 50 mg, (D) PHBV 2dDR 250 mg, (E) PHBV 2dDR 500 mg. El gráfico en la esquina inferior izquierda muestra la distribución de diámetros de fibra para cada andamio, **** P < 0,0001, *** P < 0,001. Las barras de escala representan 100 μm.
La Figura 18 muestra la liberación de (A) 2dDR y (B) E2 de andamios de PHBV durante 30 días, n=6 ± SD. La Figura 19 muestra la comparación de (A) UTS, (B) rigidez y (C) tiempo de retención de gotas en los andamios, **** P < 0,0001, *** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05, n=6 ± SD.
La Figura 20 muestra imágenes representativas que demuestran el potencial angiogénico de los andamios de liberación de 2dDR (250 mg y 500 mg) y E2 (25 mg y 50 mg) en comparación con los andamios de PHBV. El gráfico en la parte inferior izquierda muestra los datos cuantitativos de estos experimentos. Conteos medios de vasos, **** P < 0,0001. Las barras de escala representan 3 mm, n=6 ± SD.
La Figura 21 muestra el análisis histológico de CAM después de 7 días de incubación con o sin andamios en diferentes aumentos. La orientación del andamio (s), las capas de ectodermo (*), mesodermo (**) y endodermo (***) de CAM se indicó en las imágenes. Las flechas muestran los vasos sanguíneos. Barras de escala = 0,2 mm 10*), 0,1 mm (20*), 0,05 mm (40*).
La Figura 22 muestra la cuantificación de los vasos sanguíneos discernibles adyacentes a los andamios con un aumento de 10 x del total de seis portaobjetos diferentes para cada grupo y seis áreas de interés diferentes de cada portaobjetos.
Descripción detallada
Los inventores encontraron sorprendentemente que los biomateriales cargados con d-desoxirribosa o L-desoxiazúcares (no reivindicados) favorecen la formación rápida de nuevos vasos sanguíneos y ayudan a la cicatrización de la herida. Un hidrogel cargado con desoxirribosa también estimuló la cicatrización en un modelo de herida in vivo. La cicatrización de la herida se asoció con la formación de nuevos vasos sanguíneos. La capacidad de la d-desoxirribosa para promover la cicatrización de la herida es particularmente sorprendente dado que se conoce que otros azúcares D-desoxi, como la 2-desoxi-D-glucosa, inhiben la angiogénesis Merchan J. y otros, PLoS ONE 5(10): e13699).
Los datos presentados muestran que los biomateriales cargados con 2-desoxi-D-ribosa favorecen la formación de nuevos vasos sanguíneos en 7 días. Esta propiedad angiogénica de la desoxirribosa no fue compartida en ningún grado útil por otros dos desoxiazúcares investigados, a saber, -desoxifucosa y desoxiramnosa, pero mientras que los isómeros L de los tres azúcares fueron fuertemente angiogénicos, solo el isómero D de la desoxirribosa fue fuertemente angiogénico. Existen varias ventajas al usar 2-desoxi-D-ribosa o un azúcar L-desoxi para estimular la producción de VEGF. Por ejemplo, son estables y económicos y pueden introducirse en biomateriales para dar una liberación sostenida durante varios días para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Además, a la mayoría de las bacterias les puede resultar difícil metabolizar la desoxirribosa (Christensen y otros, Journal of bacteriology. 2003).
Los inventores también encontraron que los patógenos Gram-positivos comunes no pudieron metabolizar ninguno de los isómeros D o L de los tres desoxiazúcares probados (-desoxirribosa, -desoxifucosa y desoxiramnosa), pero algunos de estos azúcares podrían ser metabolizados por una especie patógena Gram negativa.
Los inventores han demostrado que un hidrogel de hidrogel de quitosano/colágeno cargado con 2-desoxi-D-ribosa estimula la cicatrización en un modelo de herida cutánea in vivo en rata. La cicatrización de la herida se asoció con la formación de nuevos vasos sanguíneos.
Los inventores demostraron que la liberación gradual de 2-desoxi-D-ribosa a partir de biomateriales promoverá la producción de nuevos vasos sanguíneos y, por lo tanto, tendrá valor en la cicatrización de la herida. Los inventores introdujeron un azúcar D, 2-desoxi-D-ribosa, para ver si podía resultar proangiogénico y para evaluar si esto se podía hacer mediante el uso de una variedad de biomateriales de relevancia clínica. En consecuencia, este azúcar D-desoxi se cargó en tres biomateriales biodegradables, nanofibras de PCL electrohiladas, hidrogeles de quitosano/PVA e hidrogeles de quitosano/colágeno.
Los datos muestran que este azúcar D, 2-desoxi-D-ribosa, puede incorporarse fácilmente en tres biomateriales diferentes y los inventores han confirmado que, de hecho, era proangiogénico mediante el uso del ensayo CAM. También mediante el uso de este ensayo, los inventores exploraron hasta qué punto las propiedades angiogénicas del isómero D de la desoxirribosa se compartían con otros desoxiazúcares. Aquí los inventores encontraron que los tres isómeros L de los desoxiazúcares (ribosa, fucosa y ramnosa) eran proangiogénicos, pero solo el isómero D de la desoxirribosa era significativamente angiogénico.
Al observar la capacidad de estos azúcares para actuar como sustratos metabólicos para las bacterias, los inventores observaron tres cepas de Staphylococcus aureus, pero ninguno de ellos fue capaz de metabolizar estos azúcares. Esta es una noticia alentadora en la búsqueda de desarrollar biomateriales que contienen estos azúcares, ya que no son una fuente de nutrientes para las bacterias.
Se evaluó la contribución del isómero D de la desoxirribosa a la cicatrización de la herida in vivo, mediante el uso de un hidrogel de quitosano/colágeno. Para ello, los inventores usaron un modelo de herida cutánea en rata. Sorprendentemente, los inventores encontraron que la adición de D-desoxirribosa a un hidrogel de quitosano/colágeno aceleraba en gran medida la cicatrización de la herida cutánea asociada con un aumento de la vascularización detectada por tinción para células CD34 positivas. Quedó claro a partir de este modelo que el gel de quitosano colágeno en sí mismo estimuló la cicatrización de la herida, pero esto aumentó en gran medida con la adición del azúcar D. El día 17, las heridas tratadas con azúcar D se habían cerrado por completo y la histología mostró la presencia de folículos pilosos muy maduros. Sobre la base de esta evidencia, los inventores concluyen que la liberación de azúcar D de un gel de quitosano/colágeno estimula la angiogénesis y proponemos que el aumento de la cicatrización de la herida es una consecuencia natural de esto.
El examen de la respuesta de los macrófagos al desoxiazúcar mostró una ligera preponderancia de los macrófagos M2 sobre los macrófagos M1 el día 17, lo que indica una remodelación constructiva. Al realizar los experimentos con animales, el hidrogel inicial era bastante resistente para su manipulación y, de hecho, podía suturarse en su lugar. Las observaciones de ensayos en animales el día 3 revelaron que los hidrogeles estaban muy bien unidos y también era evidente el crecimiento interno de las células. (Figura 8). La unión de los hidrogeles con el tejido circundante fue mejor en el caso del hidrogel cargado de azúcar. El día 9, los hidrogeles de control y cargados con D-desoxirribosa todavía estaban intactos. Los hidrogeles se absorbieron gradualmente y para el día 11 más del 50 % del área de la herida estaba cicatrizada con el hidrogel de D-desoxirribosa (véase la Figura 9) pero el hidrogel restante todavía estaba presente en la herida (Figura 8). El día 14 no había signos de hidrogel de D-desoxiazúcar en la herida. El día 17, la herida injertada con D-desoxirribosa se había cicatrizado por completo. Este hidrogel parecía ser totalmente absorbido por el animal y no se podía sentir dentro de la piel cicatrizado al palparla. El hidrogel de control mantuvo su integridad hasta el final del estudio con animales.
Estos hidrogeles que liberan desoxiazúcar son un enfoque prometedor para estimular la angiogénesis en heridas crónicas que no cicatrizan y también para actuar como material de reemplazo dérmico en el tratamiento de quemaduras extensas de grosor total.
Existen varias ventajas en el uso de este D-azúcar para estimular la producción de VEGF; es estable y económico y puede introducirse en biomateriales para dar una liberación sostenida durante varios días para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos.
Los inventores encontraron que un hidrogel basado en quitosano que libera D-desoxirribosa podría actuar como un sustituto de la dermis, ya que estimulará el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos y proporcionará un lecho de herida vascularizado para el injerto posterior con un injerto de piel delgada o queratinocitos autólogos cultivados para proporcionar una capa de barrera permanente para la piel.
El efecto positivo de la D-desoxirribosa es sorprendente ya que, en 2010, Merchan y otros informaron actividad antiangiogénica de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG). Informaron que 2-DG inhibía la formación de capilares endoteliales y la migración de células endoteliales in vitro [.R. Merchan, K. Kovács, JW Railsback, M. Kurtoglu, Y. Jing, Y. Piña, N. Gao, T.G. Murray, M.A. Lehrman, T.J. Lampidis, Antiangiogenic activity of 2-deoxy-D-glucose, PLoS 0ne. 5 (2010). doi:10.1371/journal.pone.0013699].
Los datos presentados en la presente descripción demuestran que, para un producto clínicamente útil, la neovascularización rápida (dentro de los 5 días) posterior a la implantación es crítica. El rápido crecimiento interno y la infiltración de los vasos sanguíneos son cruciales para que cualquier construcción de TE de más de 200 |jm pueda sobrevivir in vivo [C.K. Griffith, C. Miller, R.C.A. Sainson, J.W. Calvert, N.L. Jeon, C.C.W. Hughes, S.C.George, Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue, Tissue Eng. 11 (2005) 257-266. doi:10.1089/ten.2005.11.257]. Los inventores han superado esta barrera tras funcionalizar un portador de ingeniería tisular con sustancias proangiogénicas.
Los inventores han producido portadores de ingeniería tisular que superan la neovascularización retardada comúnmente observada después del trasplante de construcciones de ingeniería tisular.
Los inventores han demostrado que los hidrogeles de CS/colágeno cargados con 2dDR se unieron firmemente al lecho de la herida de heridas por escisión de grosor total (20 mm) en ratas el día 3 y las heridas tratadas con 2dDR se cerraron por completo el día 17 con un crecimiento claro del pelo mientras que las heridas del control permanecieron abiertas sin evidencia de tejido epitelial o crecimiento de pelo. La histología de los lechos de las heridas de todos los animales sacrificados el día 17, mostró una cicatrización completa en el caso de las heridas tratadas con 2dDR con folículos pilosos bien desarrollados y la presencia de nuevos vasos sanguíneos en las heridas cicatrizadas se confirmó con la tinción de CD34 [M. Yar, L. Shahzadi, M. Azra, M.I. Raheem, S. Roman, A.A. Chaudhry, I. ur Rehman, C.W.I. Douglas, S. MacNeil, Deoxy-sugar releasing biodegradable membranes and hydrogels promote angiogenesis and stimulate wound healing, Mater Today Commun. 13 (2017) 295-305. doi:10.1016/j.mtcomm.2017.10.015].
Los carbohidratos pueden tener configuraciones enantioméricas D y L que están determinadas por la configuración del carbono quiral que está más alejado del carbono anomérico. Cuando la forma linealizada de un carbohidrato se dibuja como una proyección de Fischer, el grupo hidroxilo unido al carbono quiral puede colocarse a la izquierda o a la derecha del carbono. Si el hidroxilo está a la derecha del carbono quiral, el carbohidrato se anota como un carbohidrato D, mientras que, si el grupo hidroxilo se encuentra a la izquierda del carbono quiral, el carbohidrato se anota como un carbohidrato L. El siguiente ejemplo ilustra las configuraciones de las formas de glucosa enantioméricas D y L:
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0003
Los enantiómeros D de los carbohidratos son la forma más frecuente que se encuentra en la naturaleza y muchos pueden aislarse a partir de fuentes naturales. Por el contrario, los enantiómeros L de carbohidratos que no se producen de forma natural pueden ser costosos de fabricar mediante síntesis química o enzimática. Sin embargo, también se conoce que los enantiómeros L de algunos carbohidratos se encuentran en la naturaleza.
Un ejemplo particular de un D-azúcar natural es la D-ribosa (fórmula química C5H1OO5):
Figure imgf000008_0001
la forma linealizada de las formas fosforiladas de D-ribosa de D-ribosa participan en la síntesis de aminoácidos, se usan en la vía de las pentosas fosfato y son constituyentes del ácido ribonucleico (ARN).
Adecuadamente, la D-ribosa también puede deshidroxilarse, por ejemplo, en la posición 2', 3', 4' o 5'. Un ejemplo notable de una ribosa deshidroxilada es la 2-D-desoxirribosa en donde el grupo hidroxilo en la posición 2' se reemplazó con un átomo de hidrógeno. Este azúcar es un constituyente del ácido desoxirribonucleico (ADN). La desoxi-D-ribosa existe predominantemente como una forma cíclica en solución en lugar de una forma linealizada:
Figure imgf000009_0001
La forma linealizada de
Figure imgf000009_0002
las formas cíclicas 2-D-desoxirribosa de los D-enantiómeros 2-D-desoxirribosa de desoxirribosa encuentran un uso particular en la invención.
Los desoxiazúcares son azúcares que tienen un grupo hidroxilo reemplazado por un átomo de hidrógeno. Los ejemplos de desoxi azúcares incluyen L-2 desoxirribosa, L-fucosa (equivalente a 6-desoxi-L-galactosa) y L-ramnosa (equivalente a 6-desoxi-L-manosa),
Los enantiómeros L de desoxiazúcares encuentran un uso particular en la descripción, pero no se reivindican.
También se describe, pero no se reivindica, que los inventores también encontraron sorprendentemente que los biomateriales cargados con estradiol (E2) favorecen la formación rápida de nuevos vasos sanguíneos y ayudan a la cicatrización de la herida. El estradiol (E2) tiene un papel importante en la neovascularización durante el ciclo menstrual. [D.W. Losordo, J.M. Isner, Estrogen and Angiogenesis: A Review, Arterioscler 30 Thromb Vasc Biol. 21 (2001) 6-12. doi:10.1161/01.ATV.21.1.6, Y. Matsubara, K. Matsubara, Estrogen and progesterone play pivotal roles in endothelial progenitor cell proliferation, Reprod Biol Endocrinol. 10 (2012) 2. doi:10.1186/1477-7827-10-2]. Se usa clínicamente en el tratamiento de la osteoporosis y enfermedades del corazón [M.L. Stefanick, Estrogens and progestins: Background and history, trends in use, and guidelines and regimens approved by the US Food and Drug Administration, in: Am J Med, 2005. doi:10.1016/j.amjmed.2005.09.059]. Además, el bloqueo del receptor E2 con adyuvantes como el tamoxifeno para los tumores con receptores de estrógeno positivos, en los que el alto nivel de estrógeno ayuda a que las células cancerosas crezcan y se propaguen, es un método efectivo para reducir la vasculatura tumoral que se ha usado en las clínicas durante muchos años, especialmente para el tratamiento del cáncer de mama [B. Fisher, J. Costantino, C. Redmond, R. Poisson, D. Bowman, J. Couture, N. V Dimitrov, N. Wolmark, D.L. Wickerham, E.R. Fisher, A randomized clinical trial evaluating tamoxifen in the treatment of patients with node-negative breast cancer who have estrogen-receptor-positive tumors., N Engl J Med. 320 (1989) 479-84. doi:10.1056/NEJM198902233200802, Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group, Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials, Lancet. 351 (1998) 1451-1467. doi:10.1016/S0140-6736(97)11423-4]. Se ha demostrado que E2 promueve la migración y proliferación de células endoteliales in vitro [K. Nikhil, S. Sharan, R. Wishard, S.R. Palla, R. Krishna Peddinti, P. Roy, Pterostilbene carboxaldehyde thiosemicarbazone, a resveratrol derivative inhibits 15 170-Estradiol induced cell migration and proliferation in HUVECs, Steroids. 108 (2016) 17-30. doi:10.1016/j.steroids.2016.01.020, G.M. Rubanyi, A. Johns, K. Kauser, Effect of estrogen on endothelial function and angiogenesis, Vascul Pharmacol. 38 (2002) 89-98. doi:10.1016/S0306-3623(02)00131-3] y para estimular la formación de nuevos vasos sanguíneos tanto in vitro como in vivo [D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Grant, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Cid, H.K. Kleinman, H. William Schnaper, Estrogen Promotes Angiogenic Activity in Human Umbilical Vein Endothelial Cells In Vitro and in a Murine Model, Circulation. 91 (1995) 755-63]. Los inventores han confirmado que los andamios de ácido poli-L-láctico (PLLA) cargados con E2 eran altamente angiogénicos mediante el uso del ensayo CAM [N. Mangir, C.J. Hillary, C.R. Chapple, S. MacNeil, Oestradiolreleasing Biodegradable 25 Mesh Stimulates Collagen Production and Angiogenesis: An Approach to Improving Biomaterial Integration in Pelvic Floor Repair, Eur Urol Focus. (2017). doi:10.1016/j.euf.2017.05.004].
E2 fue informado previamente como angiogénico tanto in vitro como in vivo por muchos grupos, así como también por nuestro grupo de investigación. Albrecht y otros sugirieron que E2 promueve la angiogénesis a través de la regulación positiva de VEGF. Informaron un rápido aumento de la expresión de VEGF y la permeabilidad celular mediante la administración de E2 a babuinos ovariectomizados [E.D. Albrecht, J.S. Babischkin, Y. Lidor, L.D. Anderson, L.C. Udoff, G.J. Pepe, Effect 15 of estrogen on angiogenesis in co-cultures of human endometrial cells and microvascular endothelial cells., Hum Reprod. 18 (2003) 2039-2047. doi:10.1093/humrep/deg415]. Se observaron niveles de expresión de ARNm de VEGF elevados de manera similar en ratas ovariectomizadas después del tratamiento con E2 por Hyder y otros. [S.M. Hyder, G.M. Stancel, C. Chiappetta, L. Murthy, H.L. Boettger-Tong, S. Makela, Uterine expression of vascular endothelial growth factor is increased by estradiol and 20 tamoxifen, Cáncer Res. 56 (1996) 3954-3960]. De la misma manera, Morales y otros informaron que E2 promovió la migración de HUVEC y la formación de redes similares a capilares en Matrigel [D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Grant, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Cid, H.K. Kleinman, H. William Schnaper, Estrogen Promotes Angiogenic Activity in Human Umbilical Vein Endothelial Cells In Vitro and in a Murine Model, Circulation. 91 (1995) 755-63]. Pence y otros indicaron que el E2 exógeno promovió la producción endógena de VEGF por las células epiteliales del endometrio.J.C. Pence, K.B.H. Clancy, B.A.C. Harley, The induction of pro-angiogenic processes within a collagen scaffold via exogenous estradiol and endometrial epithelial cells, Biotechnol Bioeng. 112 (2015) 2185-2194. doi:10.1002/bit.25622]. Más recientemente, nuestro grupo ha demostrado la liberación de E2 tanto de fibras biodegradables (PLA[N. Mangir, C.J. Hillary, C.R. Chapple, S. MacNeil, Oestradiol-releasing Biodegradable 25 Mesh Stimulates Collagen Production and Angiogenesis: An Approach to Improving Biomaterial Integration in Pelvic Floor Repair, Eur Urol Focus. (2017). doi:10.1016/j.euf.2017.05.004]) como de fibras no degradables (PU [S. Shafaat, N. Mangir, S.R. Regureos, C.R. Chapple, S. MacNeil, Demonstration of improved tissue integration and angiogenesis with an elastic, estradiol releasing polyurethane material designed for use in pelvic floor repair, Neurourol Urodyn. (n.d.) n/a-n/a. doi:10.1002/nau.23510]) con ambos andamios electrohilados que muestran una buena actividad proangiogénica en el ensayo CAM.
Como se usa en la presente descripción, el término "promover la cicatrización de la herida" debe entenderse como restaurar una ruptura en la continuidad del tejido de la piel e incluye trastornos caracterizados por cualquier enfermedad, trastorno, síndrome, anomalía, patología o condición anormal de la piel (dermis y epidermis) y/o tejido conjuntivo subyacente. Por ejemplo, las heridas pueden comprender cortes o abrasiones menores; heridas de grosor parcial; heridas complicadas/de grosor total; heridas traumáticas tales como, por ejemplo, abrasiones, laceraciones; heridas quirúrgicas; incisiones posquirúrgicas; heridas crónicas/que no cicatrizan como úlceras por presión o heridas del pie diabético que no cicatrizan; úlceras, en particular una úlcera venosa, un decúbito, una úlcera cutánea derivada de una infección, una úlcera por presión o úlcera diabética; lesiones al tejido conectivo como hueso o cartílago; quemaduras químicas o térmicas, en particular quemaduras de tercer grado; una herida accidental; una herida necrótica como necrosis isquémica; una herida infectada; un sitio donante de injerto de piel de grosor total y grosor parcial; una úlcera de decúbito; dificultad inducida por diabetes e inducida por la edad para la cicatrización de la herida en la superficie de la piel y cicatrices tales como, por ejemplo, cicatrices queloides, cicatrices de contracturas, cicatrices hipertróficas y cicatrices de acné. La herida puede ser una herida abierta o una herida cerrada. Una herida 'cerrada' como se usa en la presente descripción significa una herida que estaba abierta en un punto (por ejemplo, una incisión quirúrgica o un corte accidental) y que se ha cerrado intencionalmente por medio de una sutura, grapa, adhesivo quirúrgico y similares.
Como se usa en la presente descripción, el término "herida de grosor total" se refiere a la rotura de la dermis, el tejido y la rotura de los vasos sanguíneos dérmicos. Por el contrario, "herida de grosor parcial" se refiere únicamente a la rotura del tejido dérmico.
Una aplicación particular de la D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) es para su uso en heridas extensas de grosor total debidas a lesiones por quemaduras.
De acuerdo con la invención, la cicatrización de la herida puede lograrse mediante la administración a un sujeto de cualquier régimen de dosificación, procedimiento y/o vía de administración adecuados de una composición que comprende un azúcar D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) en el lecho de la herida.
Como se usa en la presente descripción, el término "lecho de la herida" se refiere a la superficie expuesta del cuerpo cuando se ha producido una ruptura en la continuidad del tejido de la piel.
La restauración de una herida puede significar la cicatrización completa o la cicatrización sustancialmente completa de la herida en donde el tejido lesionado se restaura sustancialmente al mismo estado que tenía antes de la creación de la herida. Alternativamente, la restauración de una herida puede significar la cicatrización parcial de la herida. En una alternativa adicional, la restauración de una herida puede incluir la reducción de la formación de tejido cicatricial fibroso. La cicatrización de la herida puede usarse con fines terapéuticos o no terapéuticos [cosméticos]. Como se usa en la presente descripción, "inducir" se refiere a la acción de generar, promover, formar, regular o activar un fenómeno particular. Como se usa en la presente descripción, "aumentar" se refiere a la acción de acelerar o mejorar un fenómeno particular.
La D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) también puede usarse para aumentar o inducir la angiogénesis en el lecho de una herida.
Alternativamente, puede usarse D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) para aumentar o inducir la vascularización en el lecho de una herida.
Como se usa en la presente descripción, "vascularización" incluye formación de novo, crecimiento, desarrollo o proliferación de vasos sanguíneos derivados de células indiferenciadas o subdiferenciadas.
Adecuadamente, los vasos sanguíneos pueden formarse por la producción de novo de células endoteliales. Como se usa en la presente descripción, "angiogénesis" se refiere a la formación de nueva vasculatura (por ejemplo, vasos sanguíneos; por ejemplo, venas, arterias, vénulas, arteriolas, capilares) a partir de vasculatura preexistente. Por ejemplo, la angiogénesis puede ocurrir mediante el brote de nuevos vasos a partir de un vaso existente (angiogénesis por brote) y/o por la ramificación de un vaso (angiogénesis intususceptiva). Sin querer estar ligado a ninguna teoría en particular, la D-desoxirribosa puede inducir la estimulación química de la angiogénesis a través de la inducción y/o la estimulación y/o la producción de VEGF. VEGF es un estimulador químico conocido de la angiogénesis.
Alternativamente, puede usarse D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) en el tratamiento de la caída del pelo. Adecuadamente, puede usarse D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) para aumentar o inducir el nuevo crecimiento del pelo. La D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) también puede usarse para retrasar, evitar o minimizar la caída del pelo. Se contempla que para este fin la D-desoxirribosa puede tener usos tanto terapéuticos como no terapéuticos [cosméticos].
Adecuadamente, puede usarse D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) para tratar la alopecia. Como se usa en la presente descripción, "alopecia" es un término genérico que abarca todas las formas de pérdida médica del pelo. La alopecia puede deberse a la ausencia de folículos, destrucción (que puede ser cicatrización), enfermedad, infección, encogimiento, desregulación (alteraciones del ciclo del pelo) o inactividad/inactividad completa. Estos cambios pueden ser temporales o permanentes, parciales, regionales y/o aparentemente totales.
Los ejemplos de tipos específicos de alopecia que están abarcados por el uso del término alopecia se seleccionan del grupo que consiste en: alopecia androgénica; alopecia areata; alopecia totalis; alopecia universalis; efluvio telógeno; efluvio anágeno; alopecia traumática, alopecia por tracción mecánica' de rutinas de peinado; alopecia inducida por agentes químicos; alopecia inducida por calor; alopecia inducida por radiación; alopecia inducida por quimioterapia; alopecia cicatricial; alopecia inducida por enfermedad autoinmune (por ejemplo, a partir de lupus eritematoso discoide o lupus eritematoso cutáneo crónico); alopecia relacionada con enfermedades (por ejemplo, a partir de hipertiroidismo o hipotiroidismo, deficiencia de hierro); alopecia inducida por medicamentos (por ejemplo, alopecia inducida por antibióticos y fármacos antifúngicos; antidepresivos, anticonvulsivos; anticoagulantes como heparina y algunas LMWH; AINE como aspirina; antihipertensivos, terapia de reemplazo hormonal) y alopecia sifilítica.
Los ejemplos de otras condiciones que se considerarían bajo este término son: hipopituitarismo, por ejemplo, enfermedad de Simmonds y síndrome de Sheehan; otras endocrinopatías, por ejemplo, hipotiroidismo, diabetes mellitus, disperplasia suprarrenal; enfermedad crónica, por ejemplo, lupus eritematoso, neoplasma; monilethrix; pseudomilethrix; hipotricosis simple hereditaria del cuero cabelludo; alopecia temporal triangular congénita; alopecia de las suturas craneales - síndrome de Hallermann Streiff; alopecia cicatricial hereditaria, por ejemplo hipotricosis generalizada tipo Marie Unna; queratosis folicular cicatricial congénita difusa; nevus epidérmico - hamartoma epitelial benigno y/o tumor maligno o traumatismo físico benigno, por ejemplo, accidente de coche, lesión deportiva; posquirúrgico; agentes antitumorales, por ejemplo, agentes alquilantes y/o citostáticos; traumatismos químicos, por ejemplo, tioglicolatos, antimetabólicos; radiación ionizante; fármacos tóxicos, por ejemplo, talio, vitamina A; trauma físico autoinfligido, por ejemplo, tricotilomanía; bacteriano, por ejemplo, piodermitis, impétigo de Bockhart; micótico/fúngico, por ejemplo, candidiasis, dermatofilosis; traumatismo/roce accidental, por ejemplo, sombreros, peluqueros, etc. Un término relacionado es hipotricosis, que se define como una disminución en la producción de pelo.
Adecuadamente, puede aplicarse una composición que comprende un azúcar D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) a un folículo piloso aislado. Como se usa en la presente descripción, el término "folículo piloso" se refiere a una estructura similar a un tubo que se origina a partir de la epidermis donde puede desarrollar una fibra capilar. Un folículo piloso típicamente comprende las siguientes estructuras: papila, matriz, envoltura de la raíz, glándula sebácea y, opcionalmente, fibra capilar (que se compone de un tallo piloso y una raíz pilosa). La fibra capilar puede tener un diámetro disminuido o no estar presente en absoluto, en dependencia de la extensión de la alopecia o en dependencia de la extensión y la etapa de desarrollo del folículo formado.
Adecuadamente, puede proporcionarse D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) con un portador. El portador se selecciona preferentemente de un gel, más preferentemente un hidrogel, o un material de matriz biocompatible, preferentemente un andamio electrohilado, una partícula, un apósito para heridas o un hisopo que se impregna con una solución que contiene D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) .
Los portadores pueden consistir en materiales amorfos que no tienen superficies definidas y que carecen de una forma específica o matrices sólidas.
Adecuadamente, un portador que libera D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) podría actuar como un sustituto de la dermis, ya que estimulará el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos y proporcionará un lecho de herida vascularizado para el injerto subsecuente con un injerto de piel delgada o queratinocitos autólogos cultivados para proporcionar una capa de barrera permanente para la piel.
El portador puede comprender además una sustancia que actúa como agente antimicrobiano, por ejemplo, plata o cerio.
Estos portadores pueden ser adecuados para la liberación sostenida de D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) en la herida.
Las preparaciones de D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) con un portador son especialmente adecuadas para la administración tópica.
Adecuadamente, la D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) puede formularse con o acoplarse a un material de matriz biocompatible. El material de la matriz como se usa en la presente descripción significa un portador o un andamio para el reclutamiento, la unión, la proliferación y la diferenciación de células y un dispositivo potencial de suministro y almacenamiento para D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado).
La preparación de materiales de matriz biocompatibles se conoce bien en la técnica. Las matrices biocompatibles favorecen preferentemente la cicatrización de la herida y/o aumentan o inducen la angiogénesis o la vascularización en el lecho de una herida.
Adecuadamente, los materiales de matriz biocompatibles pueden comprender un material polimérico. El material polimérico puede comprender un homopolímero o un heteropolímero/copolímero de dos o más sustancias poliméricas diferentes, o una combinación de los dos. Como se usa en la presente descripción, el término "polímero" se refiere a una macromolécula formada por el enlace químico de cinco o más unidades de combinación idénticas llamadas monómeros, por ejemplo, azúcares. Los polímeros pueden ser de origen natural [por ejemplo, polisacáridos, tales como almidón, celulosa, pectina, gomas de algas marinas, gomas vegetales; polipéptidos, tales como caseína, albúmina, globulina, queratina, insulina, ADN; e hidrocarburos], sintéticos [tales como termoplásticos (elastómeros no vulcanizados, nailon, cloruro de polivinilo, poli(fluoruro de vinilideno trifluoroetileno) polietileno lineal, poliestireno, polipropileno, poliuretano, resinas de acrilato); termoendurecibles (por ejemplo, elastómeros vulcanizados, polietileno reticulado, fenoles, alquídicos, poliésteres) y semisintéticos (por ejemplo, celulósicos, tales como rayón, metilcelulosa, acetato de celulosa y almidones modificados)]. El término "homopolímero" se refiere a un polímero natural o sintético derivado de un solo monómero. El término "heteropolímero" se refiere a un polímero natural o sintético derivado de más de una subunidad monomérica (es decir, copolímero). A menos que se indique de otra forma, el término "polímero" se usa generalmente para referirse tanto a homopolímeros como a heteropolímeros (es decir, copolímeros) como se describe en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término "material biocompatible" o "material de matriz biocompatible" significa que el material no estimula una respuesta o estimula solo una respuesta leve y/o transitoria, a diferencia de una respuesta severa o creciente cuando se coloca o se implanta el material de matriz en el lecho de la herida deseada.
Los materiales de matriz biocompatibles pueden incluir, por ejemplo, matrices sintéticas o naturales, como colágeno, matriz acelular, moléculas de andamio biológico reticuladas, armazón estructural modificada, basada en tejidos, bioprótesis biofabricadas y otras estructuras implantadas, como, por ejemplo, injertos vasculares adecuados para la infiltración y proliferación celular útil en la promoción de la cicatrización de la herida. Los materiales de matriz biocompatibles adecuados adicionales pueden incluir tejido de colágeno modificado químicamente para reducir la antigenicidad y la inmunogenicidad. Otros ejemplos adecuados incluyen láminas de colágeno para apósitos para heridas, matriz acelular libre de antígenos o reducida en antígenos (Wilson G J y otros (1990) Trans Am Soc Artif Intern 36: 340-343) u otras matrices biocompatibles que se han modificado para reducir la respuesta antigénica al material de xenoinjerto. Otras matrices útiles en la promoción de la cicatrización de la herida pueden incluir, por ejemplo, proteínas de pericardio bovino procesadas que comprenden colágeno y elastina insolubles Courtman DWy otros (1994) J Biomed Mater Res 28:655-666) y otros tejidos acelulares que pueden ser útiles para proporcionar un microambiente natural para la migración de células huésped para acelerar la regeneración tisular (Malone J M y otros (1984) J VascSurg 1: 181-91).
Adecuadamente, el material de matriz biocompatible puede formarse mediante electrohilado para formar un andamio. El proceso de electrohilado implica la aplicación de una tensión alta a una solución de polímero eyectable para sintetizar materiales de matriz polimérica. La tensión alta aplicada es suficiente para superar la tensión superficial de una solución polimérica de manera que hace que las gotitas de polímero se alarguen, de esta manera se convierten en fibras finas que forman una matriz, estera o malla no tejida con una orientación aleatoria. El electrohilado típicamente produce matrices no tejidas (es decir, mallas) (también denominadas esteras y/o andamios) con diámetros de fibra en el intervalo de cientos de nanómetros con poros interrelacionados. El proceso de electrohilado típicamente conduce a la formación de una superficie lisa que está sustancialmente libre de fibras en forma de perlas. Las fibras de matriz pueden comprender una malla no tejida de nanofibras aleatorias y/o alineadas o una combinación de estas. Adecuadamente, una vez cargadas con el azúcar D-desoxirribosa, las nanofibras típicamente aumentarán de diámetro. Por ejemplo, las fibras cargadas pueden tener un diámetro de aproximadamente 0,2 micras a aproximadamente 5,0 micras.
Las nanofibras electrohiladas pueden comprender policaprolactona. Ventajosamente, la policaprolactona es biodegradable. Adecuadamente, puede(n) usarse otro(s) polímero(s) biodegradable(s) en lugar de policaprolactona. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables adecuados que podrían ser alternativas adecuadas incluyen ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA) y poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHbV.
Como se usa en la presente descripción, el término material "biodegradable" es uno que es capaz de descomponerse bajo condiciones fisiológicas normales in vivo durante un período finito en componentes que pueden ser metabolizados o excretados y no tienen efectos nocivos cuando se descomponen in vivo. Alternativamente, el portador puede ser un hidrogel. Los hidrogeles comprenden una red de grupos funcionales hidrófilos unidos a cadenas principales poliméricas naturales o sintéticas. Pueden comprender un gel coloidal con un medio de dispersión acuoso. La protrusión de los grupos funcionales hidrófilos de las cadenas poliméricas hace que los hidrogeles sean muy absorbentes (algunos pueden contener más del 99,9 % de agua). El alto contenido de líquido de los hidrogeles permite que los hidrogeles tengan un grado de flexibilidad comparable al tejido natural. La naturaleza absorbente de los hidrogeles también permite que los hidrogeles actúen como depósito para el suministro tópico de fármacos. El hidrogel puede ser un hidrogel reticulado. La reticulación del hidrogel puede evitar la disolución. La reticulación puede lograrse tras reaccionar con agentes de reticulación adecuados. Los hidrogeles adecuados pueden incluir, por ejemplo, redes tridimensionales de polímeros hidrófilos reticulados que son insolubles en agua e interactúan con soluciones acuosas por hinchamiento. Los hidrogeles ilustrativos son altamente conformables y permeables y pueden absorber cantidades variables de solución acuosa, en dependencia de su composición. Adecuadamente, el hidrogel puede no ser adhesivo contra el sitio de tratamiento o puede tratarse para retirarlo fácilmente.
Adecuadamente, un hidrogel puede comprender preferentemente al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, colágeno, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones. Preferentemente, el hidrogel puede comprender quitosano y colágeno. Alternativamente, los hidrogeles organoquímicos pueden comprender alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato y copolímeros con una gran cantidad de grupos hidrofílicos.
Adecuadamente, el portador comprende ácido ascórbico o un derivado de este tal como, por ejemplo, ácido L-ascórbico o acscorbato-2-fosfato (Mangir y otros. Acta Biomater. 1 de enero de 2016; 29: 188-197.doi: 10.1016/i.actbio.2015.10.019)
El término "apósito para heridas" se refiere a un apósito para aplicación tópica a una herida y excluye composiciones adecuadas para administración sistémica. Por ejemplo, el azúcar D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) puede dispersarse en o sobre una lámina sólida de material en contacto con la herida, como un material textil tejido o no tejido, o puede dispersarse en una capa de espuma, como espuma de poliuretano, o en un hidrogel tal como un hidrogel de poliquitosano, un alcohol polivinílico, un hidrogel de poliacrilato, gelatina, metilcelulosa, agarosa, alginato, hidrogel de ácido hialurónico o cualquiera de sus combinaciones, por ejemplo en un gel o pomada. Adecuadamente, el azúcar D-desoxirribosa o
E2 (no reivindicado) se dispersa en o sobre un material laminar biodegradable que proporciona una liberación sostenida de los ingredientes activos en la herida, por ejemplo, una lámina de mezcla de quitosano/alcohol polivinílico liofilizada.
Adecuadamente, la D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) puede proporcionarse en forma de una composición líquida, semisólida o sólida para aplicación directa, o la composición se aplica a la superficie de una capa de contacto sólida, o se incorpora a ella, como un apósito para heridas, hidrogel, andamio o matriz. La composición del apósito puede proporcionarse, por ejemplo, en forma de fluido o gel. Los apósitos de hidrogel amorfo adecuados pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de agua, polímeros y otros ingredientes sin forma, diseñados para donar humedad y mantener húmedos los entornos de cicatrización y/o para rehidratar el sitio de la herida. Los hidrogeles pueden usarse en combinación con un recubrimiento de apósito secundario.
Los apósitos de hidrogel pueden incluir, por ejemplo, gasas y esponjas no tejidas, cuerdas y tiras saturadas con un hidrogel amorfo. Los apósitos impregnados adecuados pueden incluir, por ejemplo, gasas y esponjas no tejidas, cuerdas y tiras saturadas con una solución, emulsión, aceite, gel o algún otro compuesto farmacéuticamente activo o agente portador, que incluye, por ejemplo, solución salina, aceite, sales de zinc, vaselina, xeroformo y rojo escarlata, así como también los compuestos descritos en la presente descripción.
Los apósitos laminares de gel de silicona adecuados pueden incluir, por ejemplo, recubrimientos suaves compuestos de polímeros reticulados reforzados o unidos a una malla o tela.
Los apósitos líquidos adecuados pueden incluir, por ejemplo, mezclas de material multiproteico y otros elementos que se encuentran en la matriz extracelular. Las soluciones pueden aplicarse al sitio de tratamiento después del desbridamiento y la limpieza y después se recubren con un apósito absorbente o una almohadilla no adherente. Los apósitos de película transparente adecuados pueden incluir membranas poliméricas de grosor variable recubiertas por un lado con un adhesivo. Las películas transparentes pueden ser impermeables a líquidos, agua y bacterias, pero permeables al vapor de agua y a los gases atmosféricos. La transparencia de la película puede permitir la visualización del sitio de tratamiento.
Los apósitos de relleno adecuados pueden incluir, por ejemplo, perlas, cremas, espumas, geles, ungüentos, almohadillas, pastas, cojinetes, polvos, hebras u otras formulaciones. Los rellenos pueden ser no adherentes y pueden incluir un agente antimicrobiano de liberación prolongada. Los rellenos ilustrativos pueden ser útiles para mantener un ambiente húmedo, manejar el exudado y para el tratamiento de, por ejemplo, heridas de grosor parcial y total, heridas infectadas, heridas que supuran y heridas profundas que requieren taponamiento.
La D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) puede proporcionarse en combinación con excipientes farmacéuticos convencionales para aplicación tópica. Los portadores farmacéuticos adecuados incluyen: geles plurónicos, geles de polaxámero, hidrogeles que contienen derivados de celulosa, que incluyen hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y mezclas de estos, e hidrogeles que contienen ácido poliacrílico (Carbopols).
Otros portadores adecuados también incluyen cremas/ungüentos usados para preparaciones farmacéuticas tópicas, por ejemplo, cremas basadas en ungüento emulsionante de cetomacrogol. Los portadores anteriores pueden incluir alginato (como espesante o estimulante), conservantes como el alcohol bencílico, tampones para controlar el pH como el fosfato de hidrógeno disódico/fosfato dihidrógeno de sodio, agentes para ajustar la osmolaridad como el cloruro de sodio y estabilizadores como el EDTA.
Las formulaciones preferidas son formulaciones para administración tópica. También se incluyen composiciones que comprenden la incorporación de D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) en liposomas, microemulsiones, micelas, micropartículas o vesículas para el suministro controlado durante un período de tiempo prolongado al lecho de una herida.
La composición farmacéutica puede comprender D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) formulada o acoplada a una matriz biocompatible, que comprende preferentemente colágeno, gelatina, quitosano y/o hialuronano, como se describió anteriormente. La composición farmacéutica también puede comprender un hidrogel con D-desoxirribosa o E2 (no reivindicado) como se describió anteriormente.
La composición farmacéutica puede comprender un agente antimicrobiano, como plata o cerio.
En particular, la presente invención proporciona la composición farmacéutica para uso como medicamento. Son usos particulares en la cicatrización de la herida y/o la estimulación de la angiogénesis como se ha descrito anteriormente. Los usos alternativos son para el tratamiento de la alopecia y otros trastornos asociados como se describió anteriormente. Una alternativa adicional es para el tratamiento cosmético de la caída del pelo.
También se proporciona el uso de este método in vivo, en particular en un sujeto con una herida o que necesite dicho tratamiento, por ejemplo, para estimular la angiogénesis.
"Administración tópica", tal como se usa en la presente descripción, significa administración a una superficie definida, por ejemplo, directamente a la superficie de la herida, o si la herida ha sido cerrada, al área alrededor o dentro del cierre. Como se usa en la presente descripción, de acuerdo con todos los aspectos de la invención, el término "sujeto" se refiere a vertebrados. Sujeto se refiere preferentemente a un animal mamífero, que incluye un ser humano, un animal veterinario o de granja, un animal doméstico o una mascota, y animales usados normalmente para investigación clínica, que incluye primates no humanos, perros, ratas y ratones. Más específicamente, el sujeto de la presente invención puede ser un ser humano.
A través de toda la descripción y reivindicaciones de esta descripción, las palabras "comprenden" y "contienen" y sus variaciones significa "que incluyen pero que no se limitan a", y no se pretende excluir (y no se excluyen) otras porciones, aditivos componentes, enteros o etapas. A través de toda la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, el singular abarca el plural, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se entiende que la descripción contempla la pluralidad, así como también los singulares, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera.
Ejemplo
Sección experimental 1Materiales
La policaprolactona (Mw: 45000), L-ramnosa y NaOH se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). El quitosano (CS) se adquirió de Mian Scientific Company, Lahore, Pakistán y se purificó adicionalmente en nuestros laboratorios (grado de desacetilación (DD) 84 %; Mw: 87047,26 g/mol) (Farooq y otros, Materials Science and Engineering: C.
2015). El colágeno se adquirió a los proveedores de Mian Scientific en Lahore. El alcohol polivinílico (PVA) (Mw: 72 000, grado de hidrólisis 98%), ácido clorhídrico (HCl) y ácido sulfúrico (H2SO4) se adquirieron de Merck (Alemania). El ortoformiato de trietilo (98 %) se adquirió de Alfa Aesar (Alemania). El ácido acético glacial (CH3COOH) se adquirió de AnalaR BDH Laboratory Supplies (Reino Unido). El etanol (99,8 %) se adquirió de Sigma-Aldrich (Alemania). La 2-desoxi-D-ribosa, D-fucosa y L-fucosa se adquirieron de Sigma-Aldrich China, Reino Unido y Eslovaquia, respectivamente. La 2-desoxi-L-ribosa y D-ramnosa fueron productos de Carbosynth (Reino Unido). El caldo de infusión cerebro corazón y el caldo triptona soja (1 % p/v) se adquirieron de Oxoid Ltd. El rojo de fenol se adquirió de Sigma-Aldrich, Reino Unido.
Electrohilado
Se disolvió PCL (10 % en peso) en 5 ml de DMFDCM (4:1, 10 % p/v) y se disolvió 2-desoxi-D-ribosa (1,8 % en peso) en DMF (0,5 ml). Ambas soluciones se combinaron y se dejaron en una estación oscilante durante la noche para producir una solución homogénea a temperatura ambiente. Al día siguiente, esta solución se electrohiló mediante el uso de jeringas de 4 x 5 ml. Estas se colocaron horizontalmente en una bomba de jeringa programable (Kent Scientific, EE. UU.) y se descargaron a una velocidad de 40 μl/min. Las jeringas se suministraron con 17 kV mediante el uso de un suministro de energía de alta tensión (Genvolt, Reino Unido). El andamio fibroso se recogió en un tambor giratorio de 16 cm x 6 cm de diámetro a una distancia de 17 cm de las puntas de las agujas. Este tambor giraba a 300 rpm, lo que dio como resultado un tapete de 18 * 16 cm. Los andamios se produjeron a una temperatura ambiente de aproximadamente 20 °C.
Preparación de hidrogeles reticulados covalentemente: Hidrogeles de quitosano/PVA que usan cantidades variables de agente reticulante para la encapsulación de D-desoxiazúcar
El CS (2,5 % p/v) se disolvió en una solución de ácido acético (1 %) y se agitó magnéticamente durante 12 horas. En un matraz separado, se disolvió PVA (10 % p/v) en agua destilada a 80 °C con agitación magnética. Después, las dos soluciones se mezclaron en relaciones de 80:20 de CS y PVA, respectivamente, y se agitaron adicionalmente durante 24 horas. A continuación, la solución se vertió en placas petri separadas y las placas se congelaron a -80 °C durante 24 horas. Las muestras se liofilizaron durante 24 horas en un liofilizador a -40 °C. Después, los hidrogeles liofilizados se rehidrataron y sumergieron en diferentes concentraciones de TEOF (es decir, 0, 4, 8 y 16 % p/v) con ácido sulfúrico (17 % p/v) durante 24 horas. Después, los hidrogeles se retiraron de las placas de petri y se trataron con NaOH (12 % p/v) durante una hora antes de lavarlos tres veces con agua destilada y liofilizarlos durante 24 horas.
Preparación de andamios CS/colágeno reticulados por gelificación por congelación
CS y colágeno (0,5 g cada uno) se disolvieron en ácido acético (0,5 M, 20 ml) y se agitaron a temperatura ambiente hasta que se disolvieron por completo y se obtuvo una solución transparente. A esto, se añadió ortoformiato de trietilo (4 % v/v, 0,8 ml) como agente de reticulación y la solución se agitó durante la noche para una mejor homogeneidad y reticulación de los materiales. A continuación, la mezcla se vertió en una placa Petri y se congeló a -20 °C durante la noche. A continuación, las membranas congeladas se sumergieron en una solución etanólica preenfriada de hidróxido de sodio (3 M) y se colocaron nuevamente a -20°C durante 24 horas. Posteriormente, las membranas congeladas se lavaron en una solución de etanol al 50 % (v/v) y después con agua destilada para eliminar el hidróxido de sodio. Finalmente, las membranas se lavaron dos veces en etanol absoluto durante 15 minutos y se secaron a temperatura ambiente para obtener andamios porosos.
Análisis FTIR
Los espectros infrarrojos (FT-IR) se registraron en modo fotoacústico en el intervalo de frecuencia de 4000-400 cm'1 con 256 escaneos consecutivos a 8 cm-1 de resolución en un espectrómetro FTIR Thermo-Nicolet 6700 P (EE. UU.). Microscopía electrónica de barrido (SEM)
La morfología de la superficie de las matrices compuestas se examinó bajo SEM, modelo JEOL JSM 6480. Las muestras se recubrieron con oro mediante espolvoreado catódico antes del examen en un intervalo de aumentos. Carga de desoxiazúcar en andamios
Para la carga de azúcar, los hidrogeles se sumergieron en una solución acuosa de 2-desoxi-D-ribosa (1 mg/ml) a 37 °C hasta que los hidrogeles absorbieron todo el líquido. Después del almacenamiento a -20 °C durante la noche, los hidrogeles se secaron en un liofilizador (Christ, Alpha 1-2 LD plus, Alemania) a -40 °C antes de la caracterización adicional.
Evaluación de las propiedades angiogénicas de biomateriales mediante el uso del ensayo CAM
Los huevos de pollos fertilizados (Gallus domesticus) se adquirieron de Big Bird (Raiwind road, Lahore, Pakistán) y se incubaron a 37 °C desde el día 2 de la fertilización hasta el día 8 en una incubadora de huevos humidificada (HHD, 435, China). El día 8, se cortó una ventana cuadrada (1 cm2) en la cáscara y se retiró, y una pieza de 2 cm2 del andamio electrohilado o hidrogeles (andamio electrohilado PCL al 16 %/CS/hidrogel de PVA/CS/hidrogeles de colágeno) se colocó en la CAM. Cada huevo se implantó con un andamio o hidrogel solamente.
La ventana de la cáscara se cerró con parafilm (Bemis Flexible Packaging, EE. UU.) y se selló con cinta adhesiva. Después de la implantación, los huevos se colocaron nuevamente a 37°C en una incubadora humidificada al 40 % hasta el día 14. El día 14, se recuperaron los biomateriales y se sacrificaron los óvulos. La angiogénesis se cuantificó tras tomar imágenes de microscopio óptico justo antes de la recuperación del andamio y después se calificó a ciegas por cuatro evaluadores mediante el uso de imágenes histológicas de los materiales recuperados. El número de óvulos implantados y supervivientes se indica en el título de las figuras del ensayo CAM respectivo. Modelo de herida por escisión de grosor total en ratas
Para experimentos in vivo, se prepararon círculos de hidrogeles de 20 mm de diámetro y 1,2 mm de grosor. Estas muestras se esterilizaron mediante el uso de una solución de etanol (70 %), se secaron al aire y se equilibraron brevemente en PBS antes de colocarlas sobre la herida. Para los ensayos con animales, se usaron en el estudio ratas macho Sprague-Dawley (SD) que pesaban 140-170 g. Los animales tenían libre acceso a comida y agua y se mantuvieron en las instalaciones del bioterio del Centro de Excelencia en Biología Molecular (CEMB), Lahore. Todos los animales se trataron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal en CEMB, Lahore, Pakistán. Los animales se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) y después se eliminó el pelaje del lado dorsal con una cortadora de pelo (Dingling professional hair clipper, rF-608, China). Los lomos de las ratas se rasuraron por completo para la fijación con cinta adhesiva y el apósito. Después del afeitado, los lomos se limpiaron con etanol y después se transfirieron a una mesa esterilizada limpia y se crearon tres heridas de forma circular tras extraer la piel en tres áreas marcadas con la ayuda de tijeras quirúrgicas (Noorani Surgical Medical Supplies, Pakistán). Inmediatamente después del proceso de escisión, una de estas heridas se recubrió con círculos de membrana esterilizada cargada con 2-desoxi-D-ribosa (mediante el uso de etanol al 70 %) y la otra se recubrió con membranas del mismo material, pero sin nada de 2-desoxi-D-ribosa. Ambas membranas implantadas se suturaron en posición mediante el uso de suturas de seda trenzada estéril (Mersilk, diámetro 220 micras). Los andamios se recubrieron con yeso adhesivo (Mepore, Suecia), después se cubrieron con gasa de algodón y finalmente se aseguraron con cinta adhesiva quirúrgica blanca (Nitto, Japón) para evitar daños por el aseo personal. Una de estas heridas se mantuvo abierta y se recubrió únicamente con apósito (Mepore, Suecia) para que sirviera como control negativo.
Los apósitos quirúrgicos se retiraron después de tres días de la implantación de la membrana. Los días 0, 3, 9, 11, 14 y 17 después de la creación de la herida, se midieron y fotografiaron las heridas. Las áreas de la herida se cuantificaron mediante el uso del programa Imagej. Al final de los experimentos, el día 17, se sacrificaron las ratas con una sobredosis de anestesia y se extrajeron secciones de tejido a partir de los sitios de implantación de los grupos normal, testigo quirúrgico, control y tratados con andamio cargado con 2-desoxi-D-ribosa. Las muestras se fijaron en solución de paraformaldehído al 3,7 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 24 horas a temperatura ambiente. Se deshidrataron mediante el uso de varias concentraciones de etanol y agua del 70 % al 100 % y se realizaron bloques de parafina.
Histología
Se cortaron secciones de 6 μm de grosor a partir de las muestras incluidas en parafina con un micrótomo (Leica TP 1020 Automatic Tissue Processor) y se colocaron en portaobjetos Superfrost® plus (Menzel-Glaser, Dinamarca). Se realizó la tinción convencional de hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción tricrómica de Gouldner (Yar y otros, International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. 2016) antes del montaje en medio de montaje DPX (Fisher Scientific) con un cubreobjetos.
Para la inmunohistoquímica, se procesaron secciones de 6 μm con un kit IHC de detección de HRP/DAB (ABC) específico de ratón/conejo (Abcam). Después de las etapas de rehidratación, recuperación antigénica y bloqueo de proteínas, las secciones se incubaron con 3 anticuerpos monoclonales diferentes (anti-CD34 de conejo (Abcam) 1:1000, anti-CD80 de ratón (Santa Cruz) 1:100 y anti-CD163 de ratón (AbD Serotec) 1:300) durante 2 horas diluido en BSA al 1% (Sigma-Aldrich). A esto le siguió una incubación de 10 min con un anticuerpo secundario antipolivalente de cabra biotinilado (kit Abcam Detection IHC). Después de la incubación con avidina y peroxidasa de rábano picante biotinilada, las proteínas diana se visualizaron mediante incubación en sustrato de peroxidasa y cromógeno DAB (kit Abcam Detection IHC). Después, las muestras se contrastaron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron según el protocolo H&E. Los controles consistieron en muestras incubadas sin anticuerpos primarios y secundarios, o incubadas solo con anticuerpos secundarios. La evaluación semicuantitativa de la extensión de la inmunotinción se realizó con un observador a ciegas mediante el uso de una escala de calificación cualitativa; ausente=0, presencia leve=1, presencia grande=2, abundancia=3, gran abundancia=4. Dos investigadores evaluaron a ciegas cinco imágenes representativas de cada muestra en cada momento (n=10). Se proporcionaron fotografías de ejemplo que representan 0, 1, 2, 3 y 4 como referencia y se usó el valor medio de estas puntuaciones. La relación M1/M2 también se calculó para cada uno mediante el uso de los valores de la puntuación de la inmunotinción a ciegas.
Fermentación de azúcares por bacterias.
Para evaluar la capacidad de las bacterias para metabolizar los L y D desoxiazúcares estudiados en esta investigación, se determinó su capacidad para fermentar los azúcares que producen ácido.
Bacteria
Se emplearon cinco cepas bacterianas en el estudio; cuatro cepas de Staphylococcus aureus y una cepa de Pseudomonas aeruginosa. Las cepas de S. aureus eran S235, un aislado clínico reciente que se usó en el desarrollo de un modelo de piel infectada bacteriana informado anteriormente por este laboratorio (Shepherd J y otros, Tissue Engineering Parte C: Métodos. 2009). NCTC 6571 (Oxford) - una cepa de referencia comúnmente usada como cepa de referencia para pruebas de sensibilidad a antibióticos, cepa Newman - originada a partir de una cepa clínica pero que tiene un defecto en la proteína de unión a fibronectina de superficie, y L-9879 - otro aislado clínico pero que es hidrófilo.
Crecimiento y fermentación de azúcares.
Las bacterias se cultivaron en caldo de infusión cerebro corazón durante 16 horas a 37 °C. Se añadieron alícuotas (100 ml) de caldo triptona soja (1 % p/v) suplementado con rojo fenol (0,02 % p/v; Sigma-Aldrich, Reino Unido) y azúcares apropiados (1 % de concentración final) a placas estériles de 96 pocillos. 5zi de los caldos de cultivo de la noche de cada cepa bacteriana se añadió a los pocillos y se incubó durante 16 horas a 37 °C. La capacidad de cada cepa para fermentar cada azúcar se juzgó por la producción de ácido y el cambio del indicador de pH rojo fenol. Estadística
Las diferencias entre grupos para la inmunotinción se probaron con una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y múltiples comparaciones entre grupos individuales mediante el uso de una prueba de Dunn.
Resultados
Incorporación de D-desoxiazúcar en membranas PLC electrohiladas
Se encapsuló 2-desoxi-D-ribosa en nanofibras electrohiladas y se usó DMF en DCM como disolvente para electrohilado. El electrohilado produjo una lámina de material fibroso suave cargado de azúcar (Figura 1). El diámetro promedio de las fibras PCL sin azúcar fue de 224 nm ± 82 nm, mientras que el diámetro promedio de las fibras cargadas con 2-desoxi-D-ribosa aumentó significativamente a 323 nm ± 25 nm (diámetro promedio de 40 fibras aleatorias) (p < 0,05). Sin embargo, ambos tipos de fibras estaban orientadas aleatoriamente con poros interrelacionados y sus superficies eran lisas y libres de perlas. Después de la carga de azúcar, el color de la membrana era azul claro.
Incorporación de D-azúcar en hidrogeles de quitosano/PVA
El método de reticulación entre CS y PVA mediante el uso de ortoformiato de trietilo (TEOF) se informó previamente por nuestro grupo en 2015 (Yar y otros, Materials Science and Engineering: C. 2015; Shahzadi y otros, Journal of biomaterials applications. 2016). En este estudio, cargamos 2-desoxi-D-ribosa por adsorción física en los hidrogeles CS/PVA reticulados con TE0F 16 %. En este estudio se usó hidrogel no reticulado cargado con 2-desoxi-D-ribosa como control. Las micrografías de SEM mostraron que tanto la reticulación como la carga de azúcar parecían afectar el tamaño de los poros y la morfología de estos hidrogeles (Figura 2). Antes de la reticulación, los hidrogeles tenían una estructura en capas en lugar de poros interconectados. El tamaño promedio de poro fue de 103 μm ± 52 μm. Después de la reticulación, el tamaño de los poros se redujo significativamente (p< 0,05). La adición de azúcar en ausencia de reticulación cambió la estructura en capas a poros distorsionados. Con la introducción tanto de la reticulación como de los azúcares, el tamaño promedio de los poros se redujo significativamente a 68 μm ± 31 μm (p< 0,05). Estos nuevos poros interconectados tenían una morfología más uniforme y los poros estaban bien distribuidos por toda la matriz de hidrogel.
Incorporación de D-desoxirribosa en hidrogeles de quitosano/colágeno reticulados con ortoformiato de trietilo El quitosano y el colágeno se reticularon mediante el uso de ortoformiato de trietilo y después se cargaron con 2-desoxi-D-ribosa tras sumergirlos en la solución acuosa de azúcar (1 mg/ml). El grosor promedio del hidrogel, antes de la inmersión en solución salina, fue de 1,11 mm y después de 24 horas de inmersión aumentó a 1,37 mm. Los valores son el promedio de tres experimentos independientes.
Es fundamental evaluar la estabilidad física de las membranas, ya que eventualmente los materiales se entregarán a un cirujano para que los aplique en la piel. La superficie de las membranas era lisa y sin grietas. La Figura 3 más abajo muestra la apariencia física de esta membrana junto con todos los parámetros importantes de resistencia, estiramiento y capacidad para doblarse que serán ventajosos durante los procedimientos quirúrgicos cuando se apliquen al sitio de la herida. Además, estas membranas podrían cortarse fácilmente con una cuchilla o tijeras en la forma deseada.
Las membranas eran fuertes y exhibían excelentes propiedades de flexibilidad, estiramiento y manipulación.
Para investigar cómo los diferentes azúcares afectan la estructura y la morfología de los hidrogeles, que desempeña un papel fundamental en la infiltración y proliferación celular, las estructuras microscópicas de estos hidrogeles cargados de azúcar fueron examinadas por SEM (Figura 4). En el caso de los hidrogeles de control, se observó una estructura en forma de lámina con un tamaño promedio de poro de 75,07 ± 34,48 μm (Figura 4a). El tamaño promedio de poro de D y L-desoxirribosa fue de 100,04 ± 24,01 μm y 93,33 ± 23,49 μm, respectivamente (Figura 4b, c). En el caso de L-desoxiramnosa (Figura 4e), la estructura del poro estaba intacta, uniforme e isotrópica con un tamaño promedio de poro de 110,89 ± 20,56 μm y su isómero D no fue diferente significativamente (tamaño promedio de poro 102,45 ± 23,05 μm). D y L-fucosa mostraron tamaños de poro de sección transversal promedio de 72,18 ± 16,92 μm y 87,43 ± 14,11 μm, respectivamente. Por lo tanto, las micrografías de SEM demostraron que todos los hidrogeles cargados de azúcar tenían estructuras altamente porosas similares.
Caracterización
FTIR
Se usó espectroscopia FTIR para observar las interacciones entre el azúcar y las microfibras de PCL. La Figura 5A muestra que el valor máximo principal de D-ribosa visto aproximadamente a 3400 cirr1 se detectó en las fibras PCL cuando este azúcar se añadió al polímero antes del hilado. Se observó una banda de absorbancia importante a 1720 cm'1 correspondiente al éster carbonilo de PCL. Los valores máximos de grupos alquilo, tanto en D-azúcar como en PCL, mostraron valores máximos de absorbancia entre 2700-2900 cirr1. El espectro de fibras PCL cargadas con D-azúcar también muestra que el azúcar se distribuyó homogéneamente en la mezcla de electrohilado.
Los hidrogeles CS/PVA, sin (Figura 5d) y con (Figura 5e) reticulante, contienen los valores máximos característicos de quitosano y PVA (Figura 5B). Los valores máximos cerca de 2900 cirr1 se asignaron a vibraciones de estiramiento C-H (Islam y otros, Carbohydrate Polymers. 2012). Un valor máximo a 1530 cirr1 se asignó a las vibraciones de flexión OH del PVA (Li y otros, Polymer. 2000). Las bandas que aparecieron cerca de 1400 cirr1 se debieron a vibraciones de flexión C-H. Los valores máximos a 1099 cm’1 se debieron a las vibraciones de estiramiento del C-O-C. Sin embargo, en el espectro de hidrogel reticulado, los estiramientos de 0-H y N-H también aparecieron a 3400-3200 cirr1 (Li y otros, Polymer. 2000; Teli y otros, International journal of biological macromolecules. 2012) como un pico ancho, pero hubo una disminución significativa en la intensidad de esta joroba. Esto puede deberse a la utilización de -NH2 de CS en la formación de nuevos enlaces -C=N. El nuevo valor máximo del enlace imina apareció a 1630 cirr1 (Yary otros, Materials Science and Engineering: C. 2015; Li y otros, Polymer.
2000; Rokhade y otros, Carbohydrate Polymers. 2007).
La Figura 5C muestra los espectros de CS/colágeno reticulados cargados con diferentes azúcares. Los espectros muestran todos los valores máximos característicos de CS y colágeno. Una banda de absorción amplia de 3200­ 3500 cm-1 se debió principalmente a las vibraciones de estiramiento O-H/N-H. La amplitud de la banda se debió a los enlaces de hidrógeno intermoleculares. Los valores máximos entre 2600-2800 cirr1 parecen deberse a las vibraciones de estiramiento C-H. Los valores máximos de amida I aparecieron a 1650 cm-1. Las vibraciones de estiramiento C-O-C y C-O del enlace éter también se desplazaron a 1147 cirr1 y 1053cirr1. La carga de azúcar no afectó los valores máximos de FTIR de los hidrogeles, probablemente debido a la concentración de azúcares muy baja en la matriz polimérica.
Evaluación de las respuestas proangiogénicas a los biomateriales cargados de azúcar desoxi mediante el uso del ensayo de membrana alantoica coriónica (CAM).
Hidrogeles y fibras electrohiladas cargadas con D-desoxirribosa
El ensayo CAM se usó para investigar el potencial angiogénico de los materiales sintetizados. En el caso de las fibras cargadas con 2-desoxi-D-ribosa, observamos el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos extensos debajo del material (véase la Figura 6A (b). Esto confirma el potencial quimiotáctico y angiogénico de los materiales cargados con 2-desoxi-D-ribosa.
Se cargó 2-desoxi-D-ribosa en los hidrogeles reticulados de quitosano/ortoformiato de trietilo de PVA tras sumergirlos en una solución acuosa de D-desoxiazúcar. Después de secar en un liofilizador, los hidrogeles se injertaron en los huevos fertilizados el día 8 y el día 14 se sacrificaron los huevos. Se observó que los andamios cargados con 2-desoxi-D-ribosa promovieron la angiogénesis a juzgar por la observación de más vasos sanguíneos nuevos en comparación con el material de control (Figura 6A).
Hidrogeles reticulados de quitosano/colágeno cargados con D y L-azúcar(3 azúcares, 6 isómeros) Generalmente, se cree que los biomateriales que ayudan en el crecimiento rápido y la infiltración de los vasos sanguíneos muestran mejor biocompatibilidad que aquellos que presentan angiogénesis retardada e inflamación continua (Wolf y otros, Biomaterials. 2014). En consecuencia, esta es una propiedad absolutamente esencial para que los materiales de ingeniería de tejidos aseguren la supervivencia de los tejidos.
Los isómeros D y L de tres -desoxiazúcares (ribosa, fucosa y ramnosa) se cargaron en los hidrogeles de quitosano/colágeno (1:1) reticulados covalentemente con ortoformiato de trietilo gelificado poroso (4 %). Los hidrogeles se sumergieron en una solución acuosa de azúcares (1 mg/ml) y después se liofilizaron (secado por congelación) para producir membranas porosas. En cuanto al andamio electrohilado, los hidrogeles se injertaron en los huevos fertilizados el día 8 y después del día 14 se sacrificaron los huevos y se investigó el efecto de los azúcares en la angiogénesis.
Como puede verse en la Figura 7, los tres isómeros L estimularon la angiogénesis, pero para los isómeros D, solo el isómero D de la desoxirribosa fue fuertemente angiogénico, no hubo una respuesta significativa al isómero D de la desoxifucosa y solo una respuesta marginal al isómero D de la desoxiramnosa.
Evaluación de las respuestas de cicatrización de la herida al hidrogel cargado con D-desoxirribosa mediante el uso de un modelo de herida cutánea en rata.
La cicatrización de la herida en ratas se aceleró mediante la aplicación de hidrogeles cargados con 2-desoxi-D-ribosa. Se crearon heridas de grosor total tras marcar un área de 20 mm y después se realizaron escisiones bajo anestesia mediante el uso de tijeras quirúrgicas. Los respectivos materiales se aplicaron a las heridas, se suturaron en su lugar y se recubrieron inicialmente con vendas adhesivas Mepore (Suecia) y finalmente con vendas de algodón. Todas las ratas recibieron los mismos apósitos que se retiraron 3 días después de la creación de la herida. Cada herida se fotografió digitalmente en puntos de tiempo específicos y se cuantificó adicionalmente mediante el uso del programa Image J. Las imágenes macroscópicas representativas de heridas se muestran en la Figura 8. Los hidrogeles de control (andamio CS/colágeno reticulado) y los hidrogeles cargados con 2-desoxi-D-ribosa se muestran en los días 3, 9, 11, 14 y 17 después de la herida.
El día 3, los andamios cargados con 2-desoxi-D-ribosa estaban muy unidos a los tejidos circundantes en comparación con los otros materiales probados (Figura 8) y cuando se estiró manualmente mostró buena resistencia mecánica de las heridas. Para el día 9, las heridas tratadas con D-desoxirribosa eran aproximadamente el 50 % de las áreas de la herida (Figura 9). En los días 11 y 14 hubo una disminución adicional en el área de la herida y para aquellos tratados con D-desoxirribosa para el día 17 la herida estaba completamente cerrada en contraste con las heridas de control y aquellas tratadas solo con hidrogeles.
Análisis histológico e inmunohistoquímico de tejidos de heridas extirpados
Las muestras de todos los grupos se recolectaron el día 17 y se fijaron durante la noche en paraformaldehído. Después de la deshidratación, las muestras se incluyeron en parafina para formar bloques que se seccionaron a 6 |jm. Después, los portaobjetos se tiñeron con H&E, tricrómica de Gouldner y con un kit de peroxidasa DAB para detectar tres antígenos (CD34 para células endoteliales progenitoras, CD80 para macrófagos M1 y CD163 para macrófagos M2). Finalmente, los portaobjetos se recubrieron con medio de montaje DPX y un cubreobjetos de vidrio antes de obtener imágenes con un microscopio óptico. Los grupos testigo quirúrgico (herida sin ningún tratamiento), control (las heridas tratadas con quitosano y andamio de colágeno) y D-desoxirribosa (las heridas tratadas con andamio cargado con 2-desoxi-D-ribosa) se compararon con piel normal de una rata no tratada.
A los 17 días, la cicatrización de la herida en el grupo tratado con 2-desoxi-D-ribosa fue esencialmente completa y la estructura del tejido explantado fue similar a la piel normal, como lo demuestra la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 10). La tricrómica de Goldren tiñe el colágeno de azul/verde, mientras que el músculo, el epitelio, los folículos pilosos y los vasos sanguíneos se tiñen de rojo. Aparte de la capa muscular teñida debajo de la piel como se muestra en el grupo normal, el resto se ve muy similar al grupo tratado con D-desoxirribosa con un epitelio y folículos pilosos ya formados. Por el contrario, los grupos testigo quirúrgico y de control aún mostraban tejido de herida de granulación desorganizado a los 17 días (Figura 10).
Los macrófagos que expresan marcadores de respuesta M1 se asocian con el rechazo del implante y la activación de una respuesta inflamatoria crónica, mientras que los marcadores de respuesta M2 se expresan por macrófagos con una respuesta inflamatoria asociada con remodelación constructiva. Badylak y otros, Tissue Engineering Parte A. 2008).
Como se esperaba, no hubo tinción para macrófagos M1 o M2 para el grupo normal sin lesiones (Figura 11). Se observaron algunos macrófagos M1 y M2 en los otros grupos, como se esperaba después de la creación de la herida o después de la implantación de materiales en los animales. La tabla que se muestra en la Figura 12 muestra una evaluación de la extensión de la presencia de macrófagos realizada a ciegas por el personal de investigación en el laboratorio. La relación de presencia de M2 a M1 fue de aproximadamente 1 para los animales lesionados y los tratados con el quitosano sin carga. Para aquellos grupos tratados con quitosano cargado con 2-desoxi-D-ribosa fue ligeramente mayor (no significativo estadísticamente) (Figura 11).
Capacidad de las bacterias para metabolizar Ly D-desoxiazúcares.
Los seis azúcares bajo investigación se compararon con la glucosa con respecto a su actuación como sustratos para el metabolismo bacteriano. Se investigaron cuatro cepas de S. aureus y una cepa de Pseudomonas aeruginosa como representantes de patógenos comunes en infecciones de heridas. Los resultados con las cuatro cepas de S. aureus fueron idénticos en el sentido de que todas podían usar glucosa como sustrato para la fermentación, pero ninguna de estas cepas fue capaz de usar los isómeros L o D de los tres desoxiazúcares bajo investigación. P. aeruginosa fue, sin embargo, capaz de fermentar todos los azúcares excepto los isómeros L de desoxi-fucosa y desoxi-ramnosa.
La razón para investigar la capacidad de estos azúcares para actuar como sustratos para las bacterias es que si se está preparando un biomaterial para su uso en heridas por quemaduras o heridas crónicas, entonces sería preferente usar materiales que las bacterias no puedan metabolizar fácilmente.
Tabla 1 La capacidad de las bacterias para fermentar azúcares
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Conclusión
Este estudio demostró la capacidad proangiogénica de la 2-desoxi-D-ribosa cuando se suministra en fibras PCL electrohiladas o en hidrogeles basados en quitosano. Esto no fue compartido por los isómeros D de desoxi-fucosa o desoxi-ramnosa, aunque los isómeros L de los tres 2-desoxi-azúcares probados fueron angiogénicos. La 2-desoxi-D-ribosa no pudo ser metabolizada por cuatro cepas de Staphylococcus aureus aunque podría ser metabolizado por Pseudomonas aeruginosa. La adición de D-desoxirribosa a un hidrogel de quitosano/colágeno aceleró la cicatrización de la herida y la restauración de los folículos pilosos en heridas de grosor total en ratas.
Sección experimental 2
Ensayo de CAM ex-ovo
Incubación de los huevos
Todos los experimentos CAM se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido. La demostración esquemática del ensayo de CAM ex-ovo se proporciona en la Figura 13. Se compraron huevos de gallina fertilizados (Gallus domesticus) de Henry Stewart & Co. (MedEggs, Norwich, Reino Unido). Los huevos se limpiaron cuidadosamente con una solución de alcohol metílico industrial (IMS) al 20 % mediante el uso de toallas de papel para manos a fin de eliminar la suciedad y las plumas de la cáscara. Después, los huevos se incubaron a 37,5 °C hasta el día 3 de desarrollo embrionario (EDD), colocados horizontalmente en una incubadora de huevos humidificada (RCOM King SURO, P&T Poultry, Powys, Gales).
Transferencia de los embriones a placas Petri
En EDD3, la superficie superior de los huevos se marcó con un rotulador. Los huevos se mantuvieron horizontalmente (con la superficie marcada en la parte superior) y se rompieron en el borde de un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml y se mantuvieron cerca de la superficie inferior de las placas Petri. Después, los embriones se transfirieron cuidadosamente a placas Petri estériles y se mantuvieron en una incubadora humidificada (Binder, Tuttlingen, Alemania) a 38 °C.
Aplicación de sustancias sobre CAM
Se usaron anillos de plástico (~6,5 mm de diámetro) como reservorio de sustancias y un marcador para el área de implantación, se colocaron en la CAM y las sustancias se aplicaron en un volumen de 20 j l en la CAM dos veces al día para dar un volumen total de 40 j l entre EDD7 y EDD11. Se adquirieron imágenes de los anillos mediante el uso de un microscopio digital en EDD11, y después se inyectó en la circulación aglutinina de Lens culinaris (LCA) 20 % (Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido) para marcar las células endoteliales intravasculares mediante el uso de agujas 30G bajo un microscopio de disección (Wild Heerbrugg, Heerbrugg, Suiza). A continuación, se retiraron las CAM y se fijaron en una solución de formaldehído al 3,7 %. Los embriones se sacrificaron al final de EDD11. Después, se tomaron imágenes de las muestras de CAM fijadas con un microscopio confocal (Zeiss LSM 510 Meta, Jena, Alemania) para investigar el efecto de las sustancias en la estructura microvascular de las CAM. Cuantificación de la angiogénesis
Los vasos sanguíneos se cuantificaron por segmentación de las imágenes [C. Roma-Rodrigues, A. Heuer-Jungemann, A.R. Fernandes, A.G. Kanaras, P.V. Baptista, Peptide-coated gold nanoparticles for modulation of angiogenesis in vivo, Int J Nanomedicine. 11 (2016) 2633-2639. doi:10.2147/IJN.S108661] para incluir todos los vasos discernibles y después contar los puntos de ramificación y calcular las longitudes promedio de los vasos [D. Ribatti, B. Nico, A. Vacca, M. Presta, El ensayo de membrana corioalantoidea de esponja de gelatina, Nat Protoc. 1 (2006) 85-91. doi:10.1038/nprot.2006.13, P. Brooks, A.P. Montgomery, D. Cheresh, Use of the 10-Day-0ld Chick Embryo Model for Studying Angiogenesis, Integrin Protoc. 129 (1999) 257-269. doi:10.1385/1-59259-249-X:257] a través de múltiples etapas de procesamiento de imágenes. En primer lugar, se recortó el área interna del anillo y se dividieron los canales rojo, verde y azul mediante el uso de Adobe Photoshop CS6 (AD0BE Systems Inc., San José, California, EE. UU.). Después, el canal verde se importó a la imagen (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EE. UU.) para su posterior análisis, que incluye el filtrado de máscara de enfoque, la mejora del contraste local, la eliminación de ruido y la segmentación. Finalmente, el número de puntos de ramificación se cuantificó mediante el uso del programa de cuantificación (AngioTool, National Cancer Institute, EE. UU.) (Figura 14A) y las longitudes promedio de los vasos sanguíneos se calcularon mediante el uso de histogramas de imágenes binarias con relaciones conocidas de píxeles/mm en imágenes (Wayne Rasband, National Institute of Health, EE.UU.).
El porcentaje de área vascular (VA %) de la microvasculatura de las CAM se cuantificó mediante el uso de imágenes confocales de muestras de CAM inyectadas con lectina marcada con rodamina como se muestra en la Figura 14B. Para ello, se importaron imágenes a Image J (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EE. UU.) y se convirtieron a imágenes binarias después de los procesos de filtrado y suavizado anteriores a la cuantificación. El VA % se calculó mediante el uso de la lista de histogramas de áreas en blanco y negro en la imagen.
Determinación de la concentración óptima de E2 (no reivindicado) y 2dDR en CAM antes de cargar andamios Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma Aldrich a menos que se indique de cualquier otra manera. La solución madre de VEGF165 recombinante se diluyó a concentraciones de 2 ng/jl (VEGF-80 ng). E2 se disolvió en metanol y después se prepararon soluciones de trabajo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para que fueran (a) 100 ng/día (E2-100 ng), (b) 200 ng/día (E2-200 ng) y (b) concentraciones de 600 ng/día (E2-600 ng). Las soluciones de 2dDR se prepararon tras disolverlas en PBS para que las concentraciones finales fueran (a) 20 jg/día (2dDR-20), (b) 200 jg/día (2dDR-200) y (c) 1000 jg/día (2dDR-1000). El malato de sunitinib (Sunitinib) se disolvió en DMS0 y se diluyó con PBS con una concentración final de 50 ng/jl. Las soluciones de trabajo de todas las sustancias se prepararon inmediatamente antes de EDD7. La eficacia angiogénica de las diferentes concentraciones de sustancias se evaluó mediante la aplicación directa de las sustancias a la CAM (2 dosis/día/embrión). La actividad angiogénica se determinó tras cuantificar el número de puntos de ramificación y calcular las longitudes promedio de los vasos sanguíneos.
Comparación del potencial angiogénico de andamios de liberación de E2 (no reivindicado) y de 2dDR en CAM Electrohilado de andamios de PHBV cargados con E2 y 2dDR
Preparación de las soluciones
La solución de PHBV 10 % (p/p) cargada se preparó antes del electrohilado. Se disolvieron 1 g de gránulos de PHBV (Goodfellow, Londres, Reino Unido) en 1 g de metanol (Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) y 8 g de DCM (Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) en una campana extractora. Se prepararon cuatro soluciones de PHBV 10 % antes de la adición de las sustancias. Finalmente, se añadieron a cada solución 25 mg de E2, 50 mg de E2, 250 mg de 2dDR y 500 mg de 2dDR por 1 g de PHBV. Las mezclas se agitaron magnéticamente durante la noche.
Electrohilado
Las soluciones (~10 ml) se cargaron en jeringas de 10 ml equipadas con puntas de jeringa de 0,6 mm de diámetro interno. Después, las jeringas se colocaron en una bomba de jeringa (GenieTMPlus, KentScientific, Connecticut, EE.
UU.). Se usó papel de aluminio como colector y se colocó a una distancia de 17 cm de las puntas de las agujas. La bomba se ajustó a 40 μl/min y se aplicó una tensión de 17 kV tanto al colector como a las puntas. El electrohilado se realizó a temperatura ambiente hasta que se usó toda la solución de polímero.
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
La morfología de la superficie de los andamios de liberación de E2 y 2dDR se observó bajo SEM (Philips/FEI XL-20 SEM; Cambridge, Reino Unido). Las muestras se recubrieron con oro mediante el uso de un equipo de espolvoreado catódico de oro (Edwards sputter coater S150B, Crawley, Inglaterra) antes de la obtención de imágenes. El diámetro de la fibra y el tamaño de los poros se midieron mediante el uso de imágenes.
Liberación de E2 y 2dDR a partir de los andamios
Los andamios se cortaron en piezas para que cupieran en una placa de 6 pocillos, se pesaron y se sumergieron en 4 ml de PBS. Las concentraciones de E2 y 2dDR liberadas de cada grupo (E225 mg, E250 mg, 2dDR 250 mg, 2dDR 500 mg) se midieron fluorométricamente mediante el uso de un espectrofotómetro UV-VIS (Thermo Fischer Evolution 220, Massachusetts, EE. UU.) a 238 nm para 2dDR y 220 nm para E2. Los valores de absorbancia se convirtieron en concentraciones mediante el uso de una curva estándar de concentraciones conocidas de E2 y 2dDR.
Implantación de andamios de liberación de E2 y 2dDR en CAM
Los andamios se cortaron en círculos de 5,5 mm de diámetro mediante el uso de una máquina de corte por láser (Epilog Laser Cutter, Clevedon, Reino Unido) y se esterilizaron con luz ultravioleta durante 1 hora antes de la implantación. Se colocaron dos andamios circulares en CAM en EDD8. Las imágenes de los andamios se adquirieron mediante el uso de un microscopio digital en EDD12 y EDD14. Se realizó microinyección de lectina marcada con rodamina en la circulación, se retiraron las CAM y se fijaron en una solución de formaldehído 3,7 %. Después, se sacrificaron los embriones al final de EDD14. La angiogénesis se cuantificó tras contar todos los vasos sanguíneos que convergían hacia el injerto.
Evaluación histológica de los andamios de liberación de E2 y 2dDR en CAM
La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) se realizó en andamios impregnados de células tras modificar un protocolo estándar [47]. Brevemente, las muestras fijadas se incluyeron en OCT a temperatura de corte óptima y se congelaron en nitrógeno líquido durante 3 minutos. Se cortaron secciones de 8-10 μm de grosor mediante el uso de un criostato (Leica Biosystems Nussloch, Alemania) a -20°C. Después, las secciones se tiñeron con hematoxilina durante 90 segundos y eosina durante 5 minutos, respectivamente. Finalmente, se adquirieron imágenes de H&E bajo un microscopio óptico (Motic DM-B1, Xiamen, China). El número total de vasos sanguíneos adyacentes a los andamios se cuantificó tras contar los vasos sanguíneos en las secciones de H&E [A. Minajeva, M. Kase, M. Saretok, A. Adamson-Raieste, S. Kase, K. Niinepuu, M Vardja, T. Asser, J. Jaal, Impact of Blood Vessel Quantity and Vascular Expression of CD133 and ICAM-1 on Survival of Glioblastoma Patients, Neurosci J. 2017 (2017) 8 páginas]. Brevemente, dos investigadores independientes contaron todos los vasos sanguíneos discernibles adyacentes a los andamios mediante el uso de dos microscopios independientes con un aumento de 10 x del total de seis portaobjetos diferentes para cada grupo y seis áreas de interés diferentes de cada portaobjetos.
Comparación de las propiedades mecánicas de los andamios de liberación de E2 (no reivindicados) y 2dDR Las muestras de prueba biomecánica se prepararon tras cortar piezas de 20 mm * 10 mm de los andamios. Las abrazaderas del dispositivo se colocaron a 10 mm de distancia entre sí y se midió el ancho y el grosor de cada andamio. Las muestras de prueba se sujetaron con dos mordazas en un tensiómetro (B0SE Electroforce Test Instruments, Minnesota, EE. UU.). Se realizaron pruebas de tracción en cada muestra a una velocidad de 0,1 mm/s hasta que las muestras fallaron (n=4). Los datos sin procesar de estas pruebas se usaron para dibujar gráficos de tensión-deformación y carga-desplazamiento. La resistencia máxima a la tracción (UTS) se calculó a partir de las curvas de tensión (a) y tensión (e) de cada muestra, mientras que la rigidez se calculó a partir de la curva de carga (F) y desplazamiento (AL). También se realizaron pruebas de humectabilidad de andamios electrohilados que liberan fármacos mediante el uso de un analizador de forma de gota (Krüss DSA100, Alemania) en condiciones ambientales de laboratorio para ver el efecto de E2 y 2dDR en la humectabilidad de los andamios. En breve, se dejó caer una gota de 5 μl sobre la superficie del andamio y se calcularon los tiempos de retención de la gota en los andamios antes de la absorción completa a partir de las películas grabadas de las pruebas. Se midió el tiempo de retención de un mínimo de tres gotas sobre tres sustratos diferentes para cada tipo de muestra.
Estadística
Los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso de la prueba t de Student para datos independientes. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos estadísticamente, y el grado de significación se indicó con el número de asteriscos, **** P < 0,0001, *** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05, ns P>0,05.
Resultados
Evaluación de la actividad angiogénica de E2 (no reivindicado) y 2dDR en CAM
La cuantificación de las macroimágenes de las CAM mostró que los grupos E2-100 ng, E2-200 ng y E2-600 ng aumentaron el número de puntos de ramificación 1,3 veces, 1,5 veces y 1,4 veces respectivamente y todas las concentraciones aumentaron la longitud promedio de los vasos 1,2 veces en comparación con los controles durante 4 días. De la misma manera, 2dDR-20|jg y 2dDR-200|jg aumentaron el número de puntos de ramificación en 1,3 veces y 1,4 veces, respectivamente. Ambas concentraciones aumentaron la longitud promedio de los vasos 1,2 veces, mientras que no hubo diferencias significativas para el grupo de 2dDR-1000 jg en comparación con los andamios de control. La cuantificación de los puntos de ramificación y las longitudes promedio de los vasos se proporcionan en las Figuras 15A y 15B respectivamente. Las macroimágenes de las CAM con las concentraciones más efectivas de E2 y 2dDR se muestran en la Figura 16.
La evaluación microvascular de las muestras de CAM mostró que el VA % aumentó del 55,3 % ± 3 % al 79,5 % ± 5 % y al 71,7 % ± 3 % para los grupos que recibieron E2 y 2dDR respectivamente en comparación con los controles durante 4 días (Figura 16). Se usaron VEGF y Sunitinib como controles positivo y negativo (Figura 16).
Efecto de incluir E2 (no reivindicado) y 2dDR en la microestructura de los andamios de PHBV
Las imágenes SEM de los andamios de PHBV que liberan E2 y 2dDR pueden observarse en la Figura 17. Los diámetros de las fibras aumentaron significativamente mediante la adición de sustancias en todos los grupos a los que se añadieron andamios de PHBV (E225 mg (0,83 ± 0,17 jm), E250 mg (0,98 ± 0,35 jm), 2dDR 250 mg (0,89 ± 0,19 jm), 2dDR 500 mg (1,22 ± 0,28 jm)) en comparación con el grupo de control de PHBV (0,66 ± 0,16 jm ) como se muestra en el gráfico en la esquina inferior derecha de la Figura 17.
Liberación de E2 (no reivindicado) y 2dDR de andamios PHBV durante 30 días
La velocidad de liberación de E2 y 2dDR a partir de los andamios se evaluó durante 30 días como se muestra en la Figura 18. A los 7 días, la liberación de 2dDR de los andamios fue del 81,3 % y el 86,5 % del 2dDR presente en la solución de polímero para andamios de 2dDR de 250 mg y 500 mg, respectivamente (Figura 18A). Por el contrario, la liberación total de E2 a partir de los andamios en 7 días representó el 1,3 % y el 1,6 % del E2 inicial presente en la solución de polímero para andamios de 25 mg y 50 mg de E2, respectivamente (Figura 18B).
Comparación de efectos de E2 (no reivindicado) y 2dDR sobre las propiedades mecánicas de los andamios Como puede observarse en la Figura 19A, la adición de todas las sustancias aumentó significativamente la UTS de los andamios de PHBV en comparación con los andamios de PHBV simples. El aumento más significativo de UTS se observó en el grupo de 250 mg de 2dDR. De manera similar, la rigidez de los andamios cargados con 2dDR y E2 fue significativamente mayor en comparación con los andamios PHBV sin carga. La carga de 250 mg de 2dDR aumentó la rigidez de los andamios de PHBV en mayor medida, como se muestra en la Figura 19B. La humectabilidad de los andamios de liberación de fármacos se investigó a través de un tiempo de retención de gotitas que se calcula mediante el uso de un analizador de la forma de la gota. El tiempo de retención de la gota de agua en los andamios liberados del fármaco se proporciona en la Figura 19C. Esto mostró que la adición de 2dDR hizo que los andamios fueran más humectables, mientras que la adición de E2 hizo que los andamios fueran menos humectables.
Evaluación de la actividad angiogénica de los andamios de liberación de E2 (no reivindicado) y 2dDR en CAM La evaluación de los andamios de liberación de E2 y 2dDR en CAM demostró que todos los grupos al menos duplicaron la cantidad de vasos sanguíneos discernibles que crecían hacia los andamios en comparación con los andamios de PHBV simples, como puede observarse en la Figura 20. Los conteos medios de vasos para andamios cargados con E225 mg y andamios cargados con E250 mg fueron 49,5 (± 0,92) (**** P < 0,0001) y 37,9 (± 1,05) (**** p < 0,0001) respectivamente, mientras que fue 48,6 (± 1,02) (**** P < 0,0001) y 37,1 (± 1,37) (**** P < 0,0001) para andamios cargados con 2dDR de 250 mg y 500 mg, respectivamente, en comparación con los grupos de control (conteo medio de vasos: 23,1 (± 1,24)). Ninguna de las sustancias cargadas afectó la tasa de supervivencia del embrión, que superó el 75 % para cada grupo.
Análisis histológico de los andamios de liberación de E2 (no reivindicado) y 2dDR en CAM
El número medio de vasos sanguíneos adyacentes a los andamios aumentó significativamente en respuesta a todas las concentraciones de andamios de liberación de E2 y 2dDR en comparación con los controles y los grupos de solo CAM (véanse las Figuras 21 y 22).
Todos los andamios, tanto cargados con agentes proangiogénicos como sin carga, mostraron una buena unión a la CAM, y todas las membranas mostraron una infiltración celular similar. La Figura 21 muestra las imágenes histológicas representativas.
Conclusión
De los datos puede concluirse que tanto la aplicación directa de 2dDR y E2 como la liberación gradual de estos factores a partir de las fibras de PHBV estimularon la angiogénesis en un ensayo CAM ex ovo. Estos dos pequeños factores estables se incorporaron fácilmente en las fibras electrohiladas, como las que se usarían para construcciones de ingeniería tisular y tienen un gran potencial para usarse para la funcionalización de los andamios TE para promover la angiogénesis in vivo.
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Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un azúcar D-desoxirribosa para su uso en la promoción de la cicatrización de la herida en donde el azúcar se proporciona en un portador y en donde el portador es un material de matriz biocompatible o un hidrogel.
2. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la D-desoxirribosa es 2-desoxirribosa.
3. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el portador es un portador biodegradable.
4. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el material de la matriz es un andamio electrohilado, opcionalmente en donde el andamio electrohilado comprende al menos uno de ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHBV.
5. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el hidrogel es un hidrogel reticulado.
6. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 5, en donde el hidrogel comprende al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones, opcionalmente:
(i) en donde el hidrogel comprende quitosano y colágeno; y/o
(ii) en donde el hidrogel comprende alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato o cualquiera de sus combinaciones.
7. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en donde el hidrogel comprende quitosano y alcohol polivinílico.
8. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el portador comprende además un agente antimicrobiano.
9. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la herida es una herida crónica.
10. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la herida es una herida de grosor total.
11. El azúcar D-desoxirribosa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la herida es una lesión por quemadura.
12. Un portador que comprende un azúcar, en donde el azúcar consiste en azúcar D-desoxirribosa, y en donde el portador es un material de matriz biocompatible o un hidrogel.
13. El portador de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el material de matriz biocompatible es un andamio electrohilado, opcionalmente en donde el andamio electrohilado comprende al menos uno de ácido poliláctico (PLA), poliglicólido (PGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) PHBV.
14. El portador I de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el hidrogel comprende al menos uno de quitosano, gelatina, alginato, agarosa, metilcelulosa, hialuronano o cualquiera de sus combinaciones.
15. El portador de acuerdo con la reivindicación 12 o 14, en donde el hidrogel comprende quitosano y colágeno.
16. El portador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12, 14 o 15, en donde el hidrogel comprende alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros de acrilato o cualquiera de sus combinaciones.
17. El portador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12, o 14 a 16, en donde el hidrogel comprende quitosano y alcohol polivinílico.
18. El portador de una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 para su uso en promover la cicatrización de la herida o para su uso en un método para aumentar o inducir la vascularización en el lecho de una herida, en donde el portador es un material de matriz biocompatible.
19. El portador de una cualquiera de las reivindicaciones 12, o 14 a 17 para su uso en promover la cicatrización de la herida o para su uso en un método para aumentar o inducir la angiogénesis en el lecho de una herida, en donde el portador es un hidrogel.
20. Un apósito para heridas que comprende el portador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17.
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