FR2854243A1 - Procede de determination d'etats pre-alopeciques et/ou d'atteintes cutanees au moyen d'un marqueur predictif: hif-1(hypoxia inducible factor-1) - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet un procédé mettant en oeuvre la détection d'un marqueur biologique caractéristique de l'etat hypoxique cellulaire, HIF-1 (Hypoxia inducible factor-1) pour évaluer l'état de souffrance d'une zone cutanée et/ou d'un scalp alopécique.L'invention a également pour objet l'utilisation de ce marqueur pour mettre en évidence l'amélioration de l'état de souffrance d'une zone cutanée et/ou alopécique consécutivement à un traitement cosmétique ou pharmaceutique destiné à réverser les troubles cutanés et/ou l'état alopécique.
Description
Procédé de détermination d'états pré-alopéciques et/ou d'atteintes
cutanées
au moyen d'un marqueur prédictif: HIF-1 (hypoxia inducible factor-1) L'invention a pour objet un procédé mettant en oeuvre la détection d'un marqueur biologique caractéristique de l'état hypoxique cellulaire, HIF-1 (Hypoxia inducible factor-1) pour évaluer l'état de souffrance d'une zone cutanée et/ou d'un scalp alopécique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de ce marqueur pour mettre 10 en évidence l'amélioration de l'état de souffrance d'une zone cutanée et/ou alopécique consécutivement à un traitement cosmétique ou pharmaceutique destiné à réverser les troubles cutanés et/ou l'état alopécique.
L'invention permet également d'évaluer la dégradation de la zone cutanée et/ou alopécique consécutive à l'absence de traitement voire à l'utilisation d'un 15 traitement inapproprié.
L'invention a également pour objet l'utilisation de composés dans le cadre d'un traitement pharmaceutique destiné à réverser les troubles cutanés et/ou l'état alopécique, composés ayant la propriété de moduler le taux de marqueur biologique H1F-i caractéristique de l'état hypoxique. 20 La chute des cheveux ou alopécie est un processus physiologique dépendant de mécanismes biologiques distincts et complémentaires. Le terme d'alopécie recouvre toute une famille d'atteintes du follicule pileux ayant pour conséquence, quelle qu'en soit la raison, la perte définitive partielle ou générale des cheveux. Par 25 follicule pileux, on entend selon l'invention cheveu ou poil.
En ce qui concerne les hommes, parmi les facteurs accélérateurs de l'alopécie, sont couramment évoqués les maladies hypertensives, le diabète, l'inflammation et les androgènes.
Une méthode de dosage de médiateurs de l'inflammation (comme les 30 cytokines) au moyen de cheveux épilés a été décrite dans le brevet FR273081 1. Ce procédé permet de diagnostiquer et de suivre au moins une phase inflammatoire de désordres capillaires qui se caractérise par une modification du niveau d'expression de ces médiateurs.
Cependant, l'alopécie androgénétique présente en particulier la caractéristique d'être un processus lent, mettant parfois plusieurs années à se déclarer et donc à être détecté par des méthodes de mesure appropriées.
Il existe ainsi une période de temps pendant laquelle il serait possible 5 d'envisager un traitement préventif des troubles cutanés ou de l'alopécie alors même que les effets esthétiques ou sensoriels ne sont encore que très faiblement appréhendés. Il faudrait cependant disposer d'un outil de dosage prédictif corrélé à une constante particulière des phases précoces de ces troubles cutanés ou de l'alopécie afin de prédire et quantifier le niveau d'altération de la peau ou des 10 follicules. Cette méthode de dosage doit être simple, utilisable en routine et non invasive.
Le problème majeur consiste donc à disposer d'un marqueur pertinent des atteintes fonctionnelles précoces de la peau ou du cheveu, accessible par exemple à partir de cheveux ou de poils épilés voire de biopsies cutanées. 15 La demanderesse a trouvé que le taux d'un marqueur spécifique de l'état hypoxique cellulaire, HIF-1 (hypoxia inducible factor-l), était modifié selon l'état alopécique du sujet ou de la zone du sujet sur laquelle étaient prélevés les follicules.
L'invention a pour objet la détermination d'un état ou de l'évolution d'un état 20 de vieillissement cutané et/ou d'un état alopécique d'un sujet par le dosage de ce marqueur biologique.
L'invention a également pour objet un procédé de recherche de composés efficaces pour le traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané en comparant les taux de ce marqueur biologique dans des cellules traitées par ces composés ou 25 non.
Un autre objet est constitué par l'utilisation d'un composé dans le traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané grâce à sa capacité à augmenter le taux de ce marqueur biologique.
Un autre objet est constitué par l'utilisation d'un composé dans le traitement 30 de l'alopécie précoce grâce à sa capacité à diminuer le taux de ce marqueur biologique.
D'autres objets apparaîtront à la lumière de la description et des exemples qui suivent.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé de détermination d'un état ou de l'évolution d'un état de vieillissement cutané et/ou d'un état alopécique d'un sujet, caractérisé par le fait que l'on dose le marqueur tUF-1 (Hypoxia inducible factor-l) caractéristique de l'état hypoxique cellulaire sur des cellules cutanées ou 5 des follicules pileux, les cheveux ou les poils isolés d'un sujet soumis à un traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané.
Par marqueur biologique, on entend une molécule qui est présente dans la cellule en quantité plus ou moins importante selon l'état cellulaire. Par cellule en état hypoxique, on entend une cellule qui présente une diminution de la concentration en 10 oxygène par rapport à une cellule en normoxie (conditions normales en oxygène).
Le marqueur biologique caractéristique de l'état hypoxique considéré est 111F-i (Hypoxia Inducible Factor-1). Ce marqueur est un facteur de transcription hétérodimérique constitué d'une sous-unité (x régulée par l'oxygène et d'une sousunité f5/ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) exprimée 15 constitutivement. HIIF-1 est exprimé dans des conditions normoxiques mais son expression est augmentée en réponse à des conditions hypoxiques.
De façon surprenante, des cheveux prélevés en zone alopécique expriment environ trois fois plus d'ARN messager (ARNm) codant HIF-i que des cheveux prélevés en zone non alopécique chez le même donneur. Dans une étude de contrôle, 20 des cellules fibroblastiques placées en absence d'oxygène présentent une augmentation d'expression d'11F-i après 24 heures de traitement. En effet, dans les zones alopéciques, les cellules constituant le bulbe sont ainsi dans un état de souffrance comparable causé probablement par une vascularisation appauvrie et compensent ce manque d'oxygénation et de vascularisation en surexprimant le 25 facteur de transcription H1F-i.
Ce procédé est applicable à un sujet soumis à un traitement cosmétique de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané.
Ce procédé est destiné à évaluer et quantifier de façon non invasive le degré d'hypoxie des cellules constituant le cheveu, le poil ou la peau.
Or, dans des modèles expérimentaux d'hypoxie dans des fibroblastes rénaux, l'hypoxie a pour conséquence une fibrose tissulaire, (Normam et al, Kidney Int. 2000) que l'on retrouve dans les zones alopéciques. Cette fibrose a pour conséquence de limiter d'autant plus la vascularisation et l'apport en oxygène de l'organe en l'isolant du reste de la circulation sanguine ce qui renforce l'état hypoxique. Ce procédé est ainsi également destiné à évaluer le degré de fibrose et le degré d'inflammation des cellules constituant le cheveu, le poil ou la peau. Ce procédé est également destiné à évaluer et quantifier de façon non invasive le degré de vascularisation des cheveux, des poils ou de la peau.
Le marqueur biologique 11F-1 est en effet dosé après un prélèvement cutané ou sur des échantillons de poil ou de cheveu obtenus par épilation.
Par marqueur biologique HIF-1, on entend soit la protéine HIF-1, soit l'ARNm de MF-1 notamment pour les dosages effectués sur les cheveux prélevés conformément à l'invention.
Le marqueur biologique HIF-1 est ainsi dosé au niveau de ses ARNm par RTPCR (amplification en chaîne par polymérase-transcriptase inverse) à partir des échantillons de cheveux, de follicules pileux, de poils ou de peau.
Ce procédé permet également de mesurer les risques d'alopécie et/ou d'évolution de l'alopécie d'un sujet. En effet, le prélèvement de cheveux en zones 15 alopécique et non-alopécique chez un même donneur permet la comparaison des taux de HIF-1 en fonction des zones o ont été prélevés les cheveux.
Un autre objet de l'invention est un procédé de recherche de composés efficaces pour le traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané, caractérisé par le fait que l'on compare le dosage in vitro du marqueur HIF-1 caractéristique de 20 l'état hypoxique dans des cellules traitées avec ces composés avec le dosage de ce marqueur dans des cellules non traitées.
Lors du vieillissement cutané ou du cheveu, on constate une réduction de la vascularisation. Il apparaît donc utile notamment lors du processus de vieillissement, d'augmenter le taux d'HIIF-1 pour prévenir et anticiper une perte de vascularisation 25 conduisant à une baisse de l'apport en nutriments essentiels au bon fonctionnement du bulbe pilaire.
Un autre objet de l'invention est donc l'utilisation dans le traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané, d'un composé présentant comme caractéristique d'augmenter le taux du marqueur EGF-1 caractéristique de l'état 30 hypoxique de cellule cutanée ou d'échantillon de cheveux ou de poils de sujet soumis à des traitements de l'alopécie et/ou de vieillissement cutané par ledit composé, par rapport à des cellules ou échantillons isolés d'une zone non traitée ou du sujet avant traitement.
Parmi les composés capables d'augmenter le taux de I1F-1, nous pouvons citer l'azote, la quercétine, le dipyridyle, la lactacystine, le PR39 (un peptide riche en arginine et proline, isolé à partir d'intestin de porc, (Li, J., et al. (2000) Nat. Med., 6, pp49-55)) ou le 2-déoxy-L-ribose.
Cependant, si dans l'état de fibrose installée, il est utile d'augmenter le taux de HIF-1 afin de stimuler le remodelage matriciel et la revascularisation, dans les phases inflammatoires de l'alopécie, il est plus judicieux de limiter l'activité de HIF1. Ainsi, selon la phase alopécique concernée, l'intervention vis-à-vis de HIF-1 est différente. Le procédé selon l'invention permet justement de définir, en suivant 10 l'évolution du marqueur HIF-1 si on se trouve dans l'une ou l'autre de ces phases et si différentes zones du cuir chevelu se trouvent dans l'une ou l'autre de ces phases, permettant ainsi d'adapter l'intervention cosmétique ou dermatologique à un individu voire à une zone particulière du scalp pour un même individu.
Dans une phase alopécique plus précoce, dont on pourra justement en 15 constater le degré au moyen de la mesure de l'activité HIF-1 endogène, il sera donc au contraire utile de limiter les effets du marqueur H[F-1 pour éviter l'installation de la fibrose.
Un autre objet de l'invention est ainsi l'utilisation dans le traitement de l'alopécie notamment précoce, d'un composé présentant comme caractéristique de 20 diminuer le taux du marqueur TuF-1 caractéristique de l'état hypoxique de cellule cutanée ou d'échantillon de cheveux ou de poils de sujet soumis à des traitements de l'alopécie et/ou de vieillissement cutané par ledit composé, par rapport à des cellules ou échantillons isolés d'une zone non traitée ou du sujet avant traitement.
Parmi les composés capables de diminuer le taux de HIF-1, nous pouvons 25 citer la carnosine, le vérapamil, le 2-désoxy-D-ribose, des anticorps, des polypeptides, des séquences d'acides nucléiques, des polynucléotides antisens ADN ou ARN.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter: 30 Exemple 1: Expression de H1F-1 L'expression du gène de HIF-i et du gène de l'actine (contrôle) a été testée par la méthode semi-quantitative de RT-PCR (amplification en chaîne par polymérase-transcriptase inverse) dans des échantillons de bulbe de cheveux d'origine alopécique ou non alopécique et comparée à des échantillons de fibroblastes humains en conditions normales (contrôle négatif) et en privation d'oxygène: hypoxie (contrôle positif).
Les fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF pool PF2, utilisés au 8e passage) sont cultivés à 37 C sous une atmosphère à 5 % de CO2, dans du milieu de culture MEM/M199 contenant 1 % de sérum, tamponné avec 25 mM Hepes (Gibco) contenant également du bicarbonate de sodium (1.87 mg/ml), de la Lglutamine 2mM, de la pénicilline à 50 UI/ml (Polylabo) et 1 % v/v de sérum de veau 10 foetal (Gibco).
Les cellules de fibroblastes sont cultivées à confluence, puis placées en hypoxie (milieu tamponné en Hepes et bullage d'azote dans le flacon de culture) ou non, pendant 6 ou 24 h. Un lavage du tapis cellulaire en PBS est ensuite effectué puis les cellules sont congelées à -80 C.
Les échantillons de bulbes de cheveux sont directement congelés dans du Tri-Reagent (Sigma). L'ARNm de ces échantillons est extrait à 1' aide de Tri-Reagent, selon le protocole préconisé par le fournisseur, puis traité à la DNAse pour éliminer toute trace d'ADN contaminant, repurifié, réverse-transcrit en cDNA et les fragments spécifiques d'actine et d'HIFl sont amplifiés par PCR, séparés sur gel et analysés 20 par densitométrie.
Les séquences des amorces spécifiques d'HIF- 1 humain sont: HIF-1 humain (+) CCCCAGATTCAGGATCAGAC HIF-1 humain (-) GCGGAACTGCTITTCTAATGG Des amorces permettant d'amplifier une séquence de P-actine d'environ 500 25 paires de bases (contrôle interne) ont été utilisées en parallèle.
La réaction de PCR est effectuée avec l'enzyme PCR-Supermix (Gibco) et les amorces des gènes de,3 actine et d'HIF-l. Les conditions de PCR sont les suivantes: 94 C pendant 2 min, puis 35 cycles de 95 C pendant 1 min, 55 C pendant 1 min, 72 C pendant 2 min, puis enfin un cycle d'élongation de 7 min, à 72 30 C.
Les fragments amplifiés ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose (1,5 %), en présence de bromure d'éthidium. La saisie des images a été réalisée sur GelPrint 2000i (BioPhotonics Corp.,); les analyses densitométriques ont été obtenues à 1' aide du logiciel One-D-Scan (Scanalytics).
Exemple 2: Résultats
Analyse de fragments spécifiques d'HIF-1 et d'actine amplifiés par RT/PCR 5 dans les extraits de fibroblastes humains normaux (NHDF) témoins ou cultivés en anoxie (contrôle positif) et dans les échantillons de bulbes de cheveux épilés alopéciques ou non.
Modèle cellulaire Conditions Ratio ARNm HIF/actine Fibroblastes (NHDF) Témoin (à 24 h) 0.16 Anoxie (à 24 h) 0.51 Cheveux épilés Non alopéciques 0.32 Alopéciques 0.96 Le ratio HIF-1/actine en ARNm est plus élevé dans les cellules de fibroblastes en hypoxie que dans les conditions normales après 24 h de culture.
On note que le ratio d' ARNm de HIF-1/ARNm d'actine est nettement plus élevé dans les bulbes alopéciques que dans les échantillons normaux.
Claims (17)
1. Procédé de détermination d'un état ou de l'évolution d'un état de vieillissement cutané et/ou d'un état alopécique d'un sujet, caractérisé par le fait que l'on dose le marqueur HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1) caractéristique de l'état hypoxique cellulaire sur des cellules cutanées ou des follicules pileux, des cheveux ou des poils isolés d'un sujet.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le sujet est soumis à un traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, destiné à évaluer et quantifier de façon non invasive le degré d'hypoxie des cellules constituant le cheveu, le poil ou la peau.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, destiné à évaluer et quantifier de façon non invasive le degré de fibrose des cellules constituant le cheveu, le poil ou la peau.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, destiné à évaluer et quantifier de façon non invasive le degré d'inflammation des cellules constituant le cheveu, le poil ou la peau.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, destiné à évaluer et quantifier de façon non invasive le degré de vascularisation des cheveux, des poils ou de la peau.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérise par le fait que l'on dose le marqueur HIF-1 après un prélèvement cutané.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérise par le fait que l'on dose le marqueur HIF-1 sur des échantillons de poil ou de cheveu obtenus par épilation.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour mesurer les risques d'alopécie et/ou d'évolution de l'alopécie d'un sujet.
10. Procédé de recherche de composés efficaces pour le traitement de l'alopécie et/ou du vieillissement cutané, caractérisé par le fait que l'on compare le dosage in vitro du marqueur HIF-1 caractéristique de l'état hypoxique d'une part dans des cellules traitées avec ces composés et d'autre part avec des cellules non traitées.
3 2854243 I l. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que le marqueur HIF-1 caractéristique de l'état hypoxique est dosé par RT-PCR à partir des échantillons de cheveux, de follicules pileux, de poils ou de peau.
12. Utilisation d'un composé pour la préparation d'un médicament pour le traitement de l'alopécie précoce, composé caractérisé par le fait qu'il diminue le taux du marqueur EHF-1 caractéristique de l'état hypoxique de cellule cutanée ou d'échantillon de cheveux ou de poils de sujet soumis à des traitements de l'alopécie et/ou de vieillissement cutané par ledit composé, par rapport à des cellules ou échantillons isolés d'une zone non traitée ou du sujet avant traitement.
13. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est la carnosine.
14. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est le verapamil 15. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est le 2Déoxy- D-ribose.
16. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est un anticorps.
17. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est un polypeptide.
18. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est une séquence d'acide nucléique.
19. Utilisation d'un composé selon la revendication 12, qui est un polynucléotide antisens ADN ou ARN.
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