CN110917355A - Dp1作为老年性高血压免疫治疗药物靶标及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明从临床出发，经在动物水平反复研究，发现在衰老相关高血压的发生发展过程中，前列腺素D₂受体DP1通过抑制Th1型炎症反应来抑制活性氧的产生和血管重塑，从而降低高血压的病症；当DP1被激活后可以改善老年性高血压的病症。本发明研究丰富了对老年性高血压发病机理的基础研究的内容，为更深入探索老年性高血压发病的本质原因提供了新的思路。同时，DP1可作为临床上治疗老年性高血压的一个新的药物靶标，DP1的激动剂及Th1型细胞因子的中和抗体可参考作为治疗老年性高血压的潜在药物。

Description

DP1作为老年性高血压免疫治疗药物靶标及其应用

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，具体涉及DP1作为老年性高血压免疫治疗药物靶标及其应用。

背景技术

高血压是老年常见疾病，且老年高血压患者在逐年递增。据2002年全国居民营养与健康状况调查资料显示，我国成人高血压患病率为18.8％，而中老年人的患病率则高达39％。在高血压病理进程中，固有免疫和适应性免疫发挥重要作用。免疫功能异常与高血压的发生发展存在密切的关系，免疫因素广泛参与血压调节并相互影响。越来越多的研究表明T细胞主要参与AngⅡ诱导的血压升高及血管损伤，但T细胞在衰老性高血压中的作用以及调控机制仍不清楚。自1970年Ebringer和Doyle发现30％的高血压患者中血清免疫球蛋白水平显著增高，此后，众多研究表明在实验性高血压动物和临床高血压患者中都存在免疫功能异常，提示免疫因素参与高血压的发生发展。高血压其实是一种低度炎症性疾病,从高血压的发生、发展到靶器官的损害,都与血管炎症有十分重要的关联。因此探讨免疫细胞参与血压升高的机制具有重要的意义。

(1)免疫因素与高血压

研究表明自发性高血压大鼠(SHR)体内白细胞总数、循环单核细胞、活化单核细胞、淋巴细胞数明显增加，肾脏淋巴细胞和巨噬细胞浸润程度与收缩压显著相关。Guzik等给RAG-1-/-小鼠(缺少T细胞和B细胞的转基因小鼠)缓慢灌注血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)后，其血压升高程度显著减轻且不发生血管损害，这提示RAG-1-/-小鼠对AngⅡ的低反应性与T、B细胞缺乏有关；移植T细胞(而不是B细胞)后，由AngⅡ引起的血压升高程度与野生型鼠完全相同，同时伴随内皮依赖性血管舒张功能的损害和血管氧化产物的增多；提示T细胞可能主要参与AngⅡ诱导的血压升高及血管损伤。

在高血压病理进程中，固有免疫和适应性免疫均发挥重要作用。固有免疫中的巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤性细胞以及适应性免疫细胞中的CD4+T淋巴细胞(分化成Th1、Th2、Th17和Tregs)和CD8+T淋巴细胞，它们各自通过表达不同的细胞因子以促炎或抑炎的方式参与高血压的病理过程。Th1主要是通过TNFα、IFNγ等细胞因子促进炎症反应，进一步促进高血压的发生及其引起的靶器官损害；基因敲除TNFα或IFNγ均可以抑制AngⅡ诱导引起的高血压反应；在体内用抗体中和TNFα发现也可以逆转AngⅡ诱导引起的高血压反应；此外在Th1分化过程中起关键作用的转录因子T-bet,有研究表明它的敲除也可以降低高血压的发生及相关靶器官的损害；Th2、Tregs主要是通过IL10、TGFβ等抑制炎症反应，对血压有一定保护作用；Th17主要通过IL17促进炎症反应参与高血压的发生和发展。

免疫系统调节异常引起高血压、血管和肾脏损害的机制主要包括三个方面：(i)释放的细胞因子直接影响血管和肾脏功能；(ii)间接刺激其他细胞释放细胞因子并募集更多的炎症细胞；(iii)调节T细胞与效应T细胞激活失衡。但T细胞如何被活化，其机制仍不清楚。

(2)前列腺素D₂(prostaglandin D₂)及其受体DP1与高血压

前列腺素是以膜磷脂来源的花生四烯酸为原料，经前列腺素H合成酶(通称羟氧化酶，Cyclooxygenase，COX)合成PGH₂；PGH₂再分别经前列环素合成酶、血酸素合成酶、前列腺素E2合成酶、前列腺素D₂合成酶和前列腺素F_2α合成酶的作用，生成前列环素(Prostacyclin，PGI₂)、血栓素(Thromboxane A₂，TxA₂)、PGE₂、PGD₂和PGF_2α。每种前列腺素可被其相应的受体所识别并发挥功能。PGE₂的受体(EP1-EP4)、PGD₂的受体(DP1和DP2)、PGF_2α、PGI₂和TxA₂的受体分别是FP、IP和TP。

前列腺素(PG)D₂是前列腺素家族中的一类重要活性物质。其合成所需的酶主要有两种：脂质运载蛋白型PGDS(L-PGDS)和需要谷胱甘肽的造血型PGDS(H-PGDS)。L-PGDS高表达在大脑以及心血管系统中，比如心肌细胞、心房心内膜细胞、动脉粥样硬化斑块的血管平滑肌细胞及内膜细胞和血管内皮细胞。临床研究发现：缺血性心力衰竭患者的冠状动脉血流中L-PGDS显著升高；在原发性高血压患者的血清及尿液中，L-PGDS的水平显著高于正常人。这表明PGD₂广泛参与心血管疾病包括高血压的发生发展过程。H-PGDS主要是在抗原呈递细胞比如巨噬细胞、肥大细胞中表达。它能够通过产生PGD₂及其水解产物15d-PGJ2作用于巨噬细胞和淋巴细胞减轻炎症反应，例如在H-PGDS KO小鼠身上诱导腹膜炎模型，KO小鼠炎症起始程度明显加重，炎症消退过程显著减慢。

PGD₂在体内的一类作用受体DP1，是一种G蛋白偶联受体，在免疫系统中表达在嗜酸性粒细胞，T淋巴细胞和树突状细胞。它通过偶联一个Gs蛋白在活化时提高胞内cAMP的水平，激活下游的蛋白激酶PKA。在肺炎模型中，特定的激活DP1会显著抑制炎症反应的发生。综合以上结果：DP1受体在体内的激活可能具有的抗炎的作用。

随着免疫因素纳入高血压的治疗范畴，高血压的发生发展过程可以简单概括为：由低度炎症到慢性炎症；由中枢氧化应激,交感输出到外周T细胞活化,最终导致血管、肾脏组织损害和功能失调,血压持久和严重的升高。近期研究结果表明：PGD₂可通过激活DP1受体抑制Th1细胞因子的产生，但其对Th1的调控机制有待进一步阐明；此外DP1受体的敲除可以促进AngⅡ在小鼠体内的动脉瘤和高血压反应。我们推测：PGD₂作为一种炎性介质，是否会通过T细胞的DP1受体介导对Th1的抑制作用，进而抑制高血压的发生发展。

(3)T细胞与老年性高血压

衰老常伴随着慢性低度炎症，健康的老年人外周循环中炎症因子IL-6，TNFα，IFNγ,IL-1α,CRP等升高明显。促炎细胞因子水平的升高与衰老相关疾病如糖尿病、高血压、血管疾病和癌症的发病率和死亡率密切相关。在衰老过程中，免疫应答会发生改变，T细胞是其中变化最明显的一类免疫细胞。大量研究表明,老年人的T细胞活化后可分泌大量的IFNγ和TNFα,已知基因敲除TNFα或IFNγ均可以抑制AngⅡ诱导引起的高血压反应，然而，T细胞来源的细胞因子在老年高血压中的作用尚不清楚，至今还未有炎症细胞通过表面蛋白DP1(PGD₂的受体)参与老年性高血压发生发展过程及相关机制的研究报道。

发明内容

本发明创造的目的在于提供DP1作为老年性高血压免疫治疗药物靶标的应用。

本发明的DP1基因或其表达产物(DP1基因的编码蛋白)在下述任一方面的应用：

i)开发、筛选老年性高血压功能产品方面；

ii)制备治疗或预防老年性高血压的功能产品方面。

其中，所述功能产品包括药品(或药物、药剂等)、抑制剂(或抑制物等)等能够对老年性高血压的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节等有益作用的产品或潜在物质；所述功能产品可以为单一制剂，也可以为包含有效量制剂成分的组合物，所述组合物中可以包括药剂学上能接受的载体。

其中，所述功能产品包括上调DP1基因的表达、转录或其表达产物的功能；本领域技术人员可知的能够上调DP1基因的表达、转录或其表达产物的手段包括但不限于以下一种或多种，均可以用于本发明：(i)DNA水平上：升高DP1基因拷贝数、转染DP1基因高表达载体；(ii)转录水平上：加速或促进DP1基因的表达、促进或激活调控DP1基因表达的启动子、抑制负调控DP1基因表达的转录因子；(iii)转录后水平上：激活抑制DP1基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进DP1基因表达的microRNA；(iv)翻译后水平上：导入促进DP1基因编码蛋白的分子、抑制负调控DP1基因表达的蛋白、促进DP1基因表达的因子及蛋白的表达。

其中，所述功能产品含有以DP1为靶标，并对DP1基因的表达、转录或其表达产物起到促进作用的有效成分。

该有效成分可以为核酸激动物、蛋白激动剂、抗体、配体、蛋白水解酶、蛋白结合分子中的一种或多种。

其中，所述蛋白激动剂为BW245C。

其中，所述抗体为Th1细胞因子TNFα的中和抗体，所述中和抗体为依那西普。

其中，所述功能产品用于起到以下一种或多种作用：

i)降低Th1细胞因子TNFα、IFNγ的表达；

ii)提高Th1细胞因子TNFα中和抗体的浓度；

iii)促进T细胞中PGD₂的表达；

iv)促进T细胞中DP1的表达；

v)降低血管和肾脏CD4⁺T细胞的浸润。

其中，人DP1基因CDS编码区的DNA序列为SEQ ID NO：1；小鼠DP1基因CDS编码区的DNA序列为SEQ ID NO：2。

其中，所述功能产品选自或含有以下任一种：

i)以SEQ ID NO：1或其转录本为靶序列，且能够促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

ii)能表达或形成i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；

iii)含有SEQ ID NO：1或其互补序列，且能够在转入体内后形成促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；

iv)促进SEQ ID NO：1基因表达后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物；

v)以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其转录本为靶序列，且能够促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

vi)能表达或形成v)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；

vii)含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其互补序列，且能够在转入体内后形成促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物。

其中，所述构建物可以为细胞(如转染细胞)或表达载体。所述同源序列的同源性优选地大于70％。

其中，所述DP1基因或其表达产物应理解为包括：

i)DP1基因或其表达产物的原始序列或片段；

ii)DP1基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物；

iii)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的DP1基因或其表达产物的原始序列或片段；

iv)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的DP1基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物。

另外，本发明还提供DP1基因作为药物靶标用于筛选、预防、缓解和/治疗老年高血压的药物的应用。

另外，本发明还提供DP1基因的蛋白激动剂BW245C用于制备预防、缓解和/治疗老年高血压的药物的应用。

另外，本发明中涉及的蛋白激动剂BW245C较优选自：

BW245C：DP1激动剂，货号：12050，Cayman Chemical(Ann Harbor,MI,USA)。

本发明主要采用血压遥测技术，激光共聚焦显微技术、Real-time PCR技术、质谱检测技术、免疫印迹技术等先进的分子生物学技术手段，从临床(老年组和年轻对照组)和基础(衰老小鼠模型组及年轻对照组)两方面着手对DP1在老年性高血压中的作用进行了研究。在临床研究中，本发明主要采取了人的血液样本对炎症细胞和相关细胞基因进行了检测分析。在基础研究中，以野生型和DP1受体条件性敲除小鼠为对象，研究DP1在老年性高血压中的作用及相关分子机制。首先，通过质谱和细胞因子检测发现伴随衰老，T细胞中PGD₂/DP1信号通路被下调，Th1细胞因子表达升高；再次，通过RT-PCR检测发现DP1基因表达水平与老年性血压升高呈负相关。在小鼠实验中，伴随衰老，CD4⁺T细胞DP1受体条件性敲除小鼠(TDP1 KO)的血压(包括收缩压和舒张压)明显升高，CD4⁺T细胞在血管和肾脏的浸润,Th1细胞因子分泌(TNFα和IFNγ)以及血管重建明显增强，反之，外源性DP1在T细胞中强制过表达(CD4-DP1-Tg)可延缓衰老相关血压升高及随后的高血压反应。TNFα中和或IFNγ删除可显著改善TDP1KO小鼠的老年性高血压反应。更重要的是，DP1受体激动剂BW245C的加入可明显降低衰老小鼠的收缩和舒张血压，Th1细胞因子分泌以及血管系统和肾脏系统超氧化物的产生。

本发明通过对衰老小鼠的治疗发现DP1激动剂可以有效缓解老年性高血压症状。通过以上研究，本发明可以确认DP1可以作为防治老年性高血压的有效药物靶标。

附图说明

图1反应PGD₂/DP1信号通路在老年人T细胞中被下调，并伴随Th1高度活化。

其中，图1A是老年人(大于60岁)和年轻人(20-30岁)外周血CD4⁺T细胞的DP1和DP2的转录表达水平。图1B是质谱检测老年人和年轻人外周血CD4⁺T细胞的PGD₂水平。图1C是老年人和年轻人外周血CD4⁺T细胞的Th1细胞因子的转录表达水平。图1D和图1E是人的收缩压和舒张压与DP1基因转录水平的相关性分析。*P<0.05,**P<0.01vs年轻组。

图2反应PGD₂/DP1信号通路在衰老小鼠T细胞中被下调，并伴随Th1高度活化。

其中，图2A是质谱检测衰老小鼠(26个月)和年轻小鼠(2个月)外周血CD4⁺T细胞的PGD₂水平。图2B是衰老小鼠和年轻小鼠外周血CD4⁺T细胞的DP1和DP2的转录表达水平。图2C和图2D是衰老小鼠和年轻小鼠外周血CD4⁺T细胞的Th1细胞因子的转录表达水平。*P<0.05,**P<0.01vs2月龄组。

图3反应DP1 T细胞条件性缺失增强小鼠衰老相关的血压升高和Th1活化。

其中，图3A为DP1 T细胞条件性缺失小鼠(TDP1KO)CD4⁺T细胞的DP1 mRNA表达水平。**P<0.01vs野生组。图3B、图3C血压遥测系统实时监测不同月龄野生组和TDP1KO组小鼠的收缩压和舒张压。图3D、图3E为ELISA检测不同月龄野生组和TDP1KO组小鼠外周血的Th1细胞因子水平。^#P<0.05vs 2月龄野生组；*P<0.05,**P<0.01vs对应月龄野生组。

图4体现DP1 T细胞条件性缺失增强小鼠衰老相关的组织重塑。

其中，图4A为通过伊红美蓝染色(H&E)、天狼星红染色(Sirus red)和二氢乙锭(DHE)染色检测年轻和衰老野生型(WT)小鼠和DP1缺失(TDP1KO)小鼠主动脉血管重塑和活性氧产生情况。图4B为通过伊红美蓝染色(H&E)、天狼星红染色(Sirus red)和二氢乙锭(DHE)染色检测年轻和衰老野生型(WT)小鼠和DP1缺失(TDP1KO)小鼠肾脏中组织重塑和活性氧产生情况。

图5反应DP1 T细胞条件性过表达抑制小鼠衰老相关的血压升高和Th1活化。

其中，图5A为2个品系的DP1 T细胞条件性过表达小鼠(CD4-DP1-Tg)CD4⁺T细胞的DP1 mRNA表达水平。**P<0.01vs野生组。图5B、图5C血压遥测系统实时监测不同月龄野生组和CD4-DP1-Tg组小鼠的收缩压和舒张压。图5D、图5E为ELISA检测不同月龄野生组和CD4-DP1-Tg组小鼠外周血的Th1细胞因子水平。^##P<0.01vs 2月龄野生组；*P<0.05,**P<0.01vs18月龄野生组。

图6体现DP1 T细胞条件性过表达减弱小鼠衰老相关的组织重塑。

其中，图6A为通过伊红美蓝染色(H&E)、天狼星红染色(Sirus red)和二氢乙锭(DHE)染色检测年轻和衰老野生型(WT)小鼠和DP1过表达(TDP1KO)小鼠主动脉血管重塑和活性氧产生情况。图6B为通过伊红美蓝染色(H&E)、天狼星红染色(Sirus red)和二氢乙锭(DHE)染色检测年轻和衰老野生型(WT)小鼠和DP1过表达(TDP1KO)小鼠肾脏中组织重塑和活性氧产生情况。

图7体现IFNr缺失可降低TDP1KO小鼠的衰老相关血压升高和活性氧产生。

其中，图7A、图7B为ELISA检测18月龄4组小鼠外周血的Th1细胞因子水平。图7C血压遥测系统实时监测18月龄4组小鼠的收缩压。*P<0.05,**P<0.01vs野生组；##P<0.01vsIFNr野生组。图7D为通过二氢乙锭(DHE)染色检测18月龄4组小鼠血管和肾脏组织中活性氧产生情况。

图8体现用依那西普中和TNFa可降低TDP1KO小鼠的衰老相关血压升高和活性氧产生。

其中，图8A、图8B为ELISA检测18月龄4组小鼠外周血的Th1细胞因子水平。图8C血压遥测系统实时监测18月龄4组小鼠的收缩压。*P<0.05,**P<0.01vs未加药野生组；#P<0.05，##P<0.01vs对应未加药组。图8D为通过二氢乙锭(DHE)染色检测18月龄4组小鼠血管和肾脏组织中活性氧产生情况。

图9体现用DP1激动剂BW245C可降低小鼠的衰老相关血压升高。

其中，图9A、图9B为血压遥测系统实时监测26月龄野生型小鼠在腹腔注射BW245C前后收缩压和舒张压情况。图9C和图9D是衰老小鼠治疗前后外周血CD4⁺T细胞的Th1细胞因子的转录表达水平。*P<0.05vs 2月龄未治疗组。^#P<0.05vs 26月龄未治疗组。图9E为通过二氢乙锭(DHE)染色检测26月龄小鼠治疗前后血管和肾脏组织中活性氧产生情况。

具体实施方式

下面通过结合具体实施例对本发明创造进行进一步说明。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语，除非另外说明具有下述一般含义，且下述含义被认为在本领域技术人员的知识范围之内：

“保守”指所涉及的氨基酸序列或核酸序列与原始序列具有较高的相似性或同一性，能够维持其原始序列基本的结构、生物学活性或功能，一般可以通过相似的氨基酸残基替换或等位基因(简并密码子)替换等获得。

“变体”指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或核酸序列，所述改变可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替换。变体可具有保守性改变，其中替换的氨基酸与原氨基酸具有相似的结构或化学性质，如亮氨酸和异亮氨酸之间的替换，也可具有非保守性改变。

“同源”包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指具有相同或相似的结构或功能，或具有相似的氨基酸序列；在描述核酸序列时，指具有相似性或互补的核酸序列，也包括根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的核酸序列；“同源”在本发明具有相对较为广泛的含义，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或核酸序列)，或包括序列的变体。

“衍生物”在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指由原多肽、蛋白质或氨基酸序列衍生而来的关联多肽、蛋白质或氨基酸序列，其具有与原始多肽、蛋白质或氨基酸序列相似的性质、活性或功能，例如，本发明中多肽、蛋白质或氨基酸序列包括这样的衍生物：(i)成熟多肽与另一种化合物融合，或者(ii)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列(linker、蛋白质纯化标识序列、酶切位点等)；等；在描述核酸序列时，指由原始序列衍生未来的关联序列，其具有与原始核酸序列相似的性质、活性或功能，可以包括：(i)序列或基因中连续或间隔地插入、缺失、替换一个或多个碱基(优选为等位基因的替换)，且所述一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、替换在同一序列或基因中可同时或不同时存在；(ii)序列或基因中一个或多个碱基被修饰；(iii)序列或基因中融合或插入编码附加的氨基酸序列的基因；等。

在通过本文得知了DP1基因或其表达产物与老年性高血压之间的相关性后，可以基于该特征来筛选能够作用于、尤其是能够促进DP1基因或其表达产物的功能产品，所用的筛选方法也可以通过本领域已知的多种手段得到实现。

下面通过具体实验及分析和讨论详细阐述DP1基因或其表达产物与老年性高血压之间的相关性。实施例1在老年人群和衰老小鼠中PGD₂/DP1信号被下调，Th1反应活化

本实施例涉及的主要实施过程如下：

1)收集年轻(20-30岁)和老年志愿者(60岁以上)的外周血，提取细胞进行质谱检测和Real-Time PCR检测；

2)收集不同月龄小鼠脾脏CD4⁺T淋巴细胞，分别作质谱检测和Real-Time PCR检测；

本实施例涉及的主要实验部分如下：

1、志愿者外周血和小鼠脾脏细胞流式分选检测

实验步骤如下：

1)取新鲜抗凝血2ml以2000rpm离心20min弃去血浆；

2)向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织匀浆稀释液2ml混匀；

3)将混合液叠加于细胞分离液之液面上(混合液：分离液＝2：1)；

4)以2000rpm离心15分钟(半径15cm水平转子)；

5)志愿者外周血分选用离心管中由上至下细胞分为四层。第一层，为血浆层；第二层，为环状乳白色淋巴细胞层；第三层，为透明分离液层；第四层，为红细胞层。收集第二层细胞放入含2ml细胞洗涤液的试管中，充分混匀后，以2000rpm离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞；小鼠脾脏细胞研磨后，过70um滤网，以2000rpm离心5分钟，弃去上清留沉淀细胞；

6)向细胞沉淀中加入500ul-1ml红细胞裂解液，混匀作用3min，加入10倍的1xPBS中和，2000rpm离心5min；

7)若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作；

8)裂解完成，离心弃去上清，向试管中加入1ml 1xPBS混匀；

9)向1.5ml离心管中加入490μlPBS，再加入10μl上步的细胞悬液，计数；

10)取10⁶个细胞加PBS定容至100μl，向细胞悬液内加入抗体(CD3，1:50，eBioscience；CD4,1:50,eBiocience)2μl，4℃孵育30min；

11)向细胞悬液中加入1ml PBS中和，2000rpm,离心5min；

12)弃上清，向管中加入200μl PBS，上机检测分选。

2、Real-Time PCR检测炎症因子表达

实验步骤如下：

1)将上述分离的人外周血CD4细胞或小鼠脾脏CD4细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解，裂解液放置于-70℃环境中长期保持；

2)向融化后的裂解液中，按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15s，室温放置10min(注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂)；

3)将样品于4℃条件下12000g离心15min；

4)吸取上层水相转移至新的1.5ml离心管(RNase free)中；

5)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，充分混匀，于室温放置5-10min；

6)将样品于4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇(DEPC处理后的去离子水配制)，温和振荡离心管，悬浮洗涤沉淀；

8)将样品于4℃8000g离心5min，尽量弃上清；

9)室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解；

10)可用20-50μl DEPC H₂O溶解RNA样品，55-60℃5-10min；

11)Nano Drop测量RNA浓度；

12)逆转录及RT-PCR反应条件：参照Takara公司反转录试剂盒说明书完成。

基因组DNA的除去反应体系如下表所示：

表1基因组DNA的除去反应体系

置于42℃反应2min(或室温5min^*b)。

*a：20μl反转录反应体系中，

Green qPCR法最多可使用1μg的Total RNA；

*b：室温反应时，可以延长至30分钟；

反转录反应体系如下表所示：

表2反转录反应体系

置于37℃反应15min，继以85℃反应5s。

定量PC反应体系如下表所示：

表3定量PCR反应体系

反应程序：95℃反应5min完成预变性反应；PCR循环扩增40轮，每轮反应于95℃保温25s以使模板变性、于60℃保温25s促进引物与模板配对结合、于72℃反应30s完成延伸反应并记录荧光读值。结果见图1A、1C-1E、2B-2D。

3、前列腺素的提取和检测

1)将上述分离的人外周血CD4细胞或小鼠脾脏CD4细胞加入500μl蛋白裂解液,12000g离心10min；

2)取上清液，在同一管中分别按每毫升上清加入4ng PGE₂及PGF_2α，PGD₂，PGI₂，TXA₂的内标(PGE₂，PGF_2α，PGD₂，PGI₂，TXA₂的内标贮存液浓度为100μg/ml，稀释后100倍，使用内标的终浓度为1ng/ul)；

3)然后加入40μl 1M柠檬酸及5μl 10％BHT来避免自由基催化氧化作用；

4)组织上清液液萃取，加入2ml的正己烷/乙酸乙酯(1:1)旋涡震荡混合1min；5)3000g,40℃离心10min后，吸出上层有机相并保存；

6)再将水相用正己烷/乙酸乙酯(1:1)二次萃取；

7)将两次有机相混合，用氮吹仪氮吹干；

8)再用100μl 10％乙腈溶解，用0.2μM spin HPLC柱离心12000g，1min；

9)收集滤液，即可上机检测，最终各内标浓度为20ng/ml。

10)建立标准曲线，统计PGD₂浓度。结果见图1B、2A。

小结：在本实施例的上述实验过程中，我们收集了年轻志愿者和年老志愿者的血样，经过流式分选CD4⁺T细胞，检测发现在老年人的T细胞中，PGD₂的合成与DP1基因的表达也都显著下调(图1A,1B)；通过Real-Time PCR检测了T helper type 1(Th1)型细胞因子TNFa和IFNr的表达水平(图1C)，发现这些炎症因子表达均有上调表达；并且DP1基因的表达水平与衰老相关的血压升高呈现高度负相关性(图1D,1E)。因此，我们推测PGD₂/DP1是通过调控T细胞的活性影响衰老相关的血压升高进程。

同理，在小鼠模型中，结果显示，伴随小鼠衰老，T细胞中PGD₂的合成减少(图2A)；定量PCR结果表明：T细胞中PGD₂受体亚型1DP1的表达在衰老中显著下降(图2B)，Th1细胞因子水平显著升高(图2C,2D)。

实施例2 DP1 T细胞条件性缺失增强小鼠衰老相关的血压升高,Th1活化和组织重塑。

本实施例涉及的主要实验部分如下：

1、RT-PCR检测DP1基因表达

方法同实施例1细胞因子的PCR检测，结果见图3A、图5A。

2、小鼠血压遥测

1)将洗消好的植入子放入无菌的生理盐水中浸泡至少15min。

2)待测小鼠通过腹腔注射阿弗汀进行麻醉。

3)对小鼠颈部及后劲背部用脱毛膏进行脱毛处理，随后用75％医用酒精对脱毛部位进行消毒处理。

4)用消毒的手术刀沿颈部中线划开2～3cm的小口，暴露出下颌腺。此外，小鼠后颈背部脱毛区域也划开适当大小的小口，以便将植入子埋入小鼠后背，并便于感受器导管向颈部的延伸。

5)用钝镊子从小鼠后颈背部开口处进入，沿皮下向小鼠背部扩展，撑出合适大小的空间，以满足植入子埋于小鼠背部皮下。

6)将生理盐水浸泡好的植入子埋于小鼠背部皮下，并将感受器导管沿小鼠侧颈部皮下引导至小鼠下颌部，并保持导管的湿润

7)固定好小鼠四肢，在体视显微镜下用湿润的棉签沿下颌腺中线向下颌两侧分开下颌，暴露器官及器官旁侧的颈总动脉。

8)用小尖摄在不损坏迷走神经及动脉的情况下，将一侧颈总动脉及粘附于动脉的迷走神经分离开来，并剪一小片未撕开的长方形封口膜放于动脉下方，以便将动脉与其他组织隔离开来，并用生理盐水保持血管的湿润。

9)沿动脉向远心端寻找第一个分叉，以此为基点，向近心端分离出约0.5cm的动脉，便于插管操作。

10)显微镜下观察感受器导管内是否有气泡，若有气泡将其挤出；填充胶是否充足，若不足需补胶，以保证感受器导管的正常使用。

11)用5-0真丝医用缝合线在已暴露的动脉近心端处阻断血流，并在动脉远心端的第一个分叉处用缝合线结扎死，而后用尖端弯折30°的1cm注射针头在结扎位置附近血管刺一小孔，再将感受器导管刺入血管中。

12)感受器导管刺入血管后，松开近心端阻断血流的缝合线，将感受器导管继续向近心端刺入约1cm，随后固定好导管，缝合皮肤开口，以及腹腔注射适量青霉素进行术后消炎处理。

13)3天后，将小鼠对号放置于相应的信号接收器上，打开遥测系统，进行血压测量，结果见图3B、3C、5B、5C。

3、组织切片H&E，天狼猩红及免疫荧光染色

3.1H&E染色

1)将主动脉组织或肾脏组织石蜡切片依次置于二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→二甲苯：无水乙醇＝1:1 2min；

2)然后置于100％乙醇Ⅰ5min→100％乙醇Ⅱ5min→80％乙醇5min→蒸馏水5min；

3)再经苏木精液染色5min→流水稍洗去苏木精液1-3s→1％盐酸乙醇1-3s；

4)稍水洗10-30s→蒸馏水过洗1-2s；

5)再0.5％伊红液染色1-3min→蒸馏水稍洗1-2s→80％乙醇稍洗1-2s→95％乙醇Ⅰ2-3s→95％乙醇Ⅱ3-5s；

6)然后将切片置于无水乙醇5-10min→石炭酸二甲苯5-10min；

7)二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min→二甲苯Ⅲ2min；

8)中性树胶封固；

9)显微镜选取视野拍摄分析组织重塑,结果见图4A、4B、6A、6B。

3.2天狼猩红染色

1)将主动脉组织或肾脏组织石蜡切片依次置于二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→二甲苯：无水乙醇＝1:1 2min；

2)然后置于100％乙醇Ⅰ5min→100％乙醇Ⅱ5min→80％乙醇5min→蒸馏水5min；

3)再经天狼星红染色液染色1h→流水稍洗去

4)苏木精液1-3s→1％盐酸乙醇1-3s；

4)稍水洗10-30s→蒸馏水过洗1-2s；

5)80％乙醇稍洗1-2s→95％乙醇Ⅰ2-3s→95％乙醇Ⅱ3-5s；

6)然后将切片置于无水乙醇5-10min→石炭酸二甲苯5-10min；

7)二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min→二甲苯Ⅲ2min；

8)中性树胶封固；

9)显微镜选取视野拍摄分析组织重塑，结果见图4A、4B、6A、6B。

3.3免疫荧光染色

1)取出新鲜组织样本，对于冰冻样品，梯度蔗糖脱水(5％2小时，30％过夜)；对于石蜡样品，用4％多聚甲醛固定；

2)作冰冻样品用OCT包埋，超低温速冻；石蜡样品，则经脱水后石蜡包埋；

3)冰冻样品利用冰冻切片机切成厚度为6-8μm的切片；石蜡样品则用石蜡切片机切成3-5μm的切片；

4)冰冻切片完成后，-80℃保存，使用时先室温晾干一小时，丙酮固定10-15min室温晾干；石蜡切片则经二甲苯、梯度乙醇脱水；

5)1-3％BSA封闭30-1.5h；

6)PBST洗涤3次，每次5min；

7)加入20Um DHE(D11347,Life Technology),37℃孵育30min；

8)PBST洗涤3次，每次5min,室温避光晾干；

9)加入防淬灭封片剂封片，使用激光共聚焦显微镜拍照(Olympus)并分析，结果见图4A、4B、6A、6B。

4、ELISA检测年轻和衰老小鼠外周血中细胞因子蛋白水平

将抗凝管中收集的小鼠外周血3000g离心取上清,备用，ELISA操作如下：

1)使用前将所有试剂平衡至室温；

2)洗液(Wash Buffer):如果浓缩液中已经形成结晶,平衡至室温,并轻轻地摇晃直到结晶完全溶解。加入去离子水或蒸馏水稀释20ml浓缩洗涤液至500ml；

3)底物溶液(Substrate Solution):显色试剂A和B应该在使用前15min以等体积混合。避光保存。每孔需要200ul生成的混合物；

4)相关细胞因子的标准品(Standard):使用5ml标准稀释液RD5T(CalibratorDiluent RD5T)(适用于细胞培养上清液样本)或标准稀释液RD6F(Calibrator DiluentRD6F)(适用于血清/血浆样本)重新配制标准品。重新配制的产品为300pg/ml贮存液。稀释前允许将标准品至少轻轻搅拌15min；

5)吸取适当的标准稀释液将标准品进行一系列稀释至各个EP管，没有稀释的标准品作为高标准，适当的标准稀释液作为0标准(0pg/ml)；

6)每孔加入100ul Assay Diluent RD1W；

7)每孔依次加入100ul标准品、样本和对照。用橡皮条密封。室温孵化2小时。记录测定标准和样本的分布；

8)吸弃孔内液体,每孔400ul洗涤液,充分洗涤后完全去除液体。在干净的纸上拍干。反复洗涤4次；

9)每孔加入200ul IL-6Conjugate。用新的橡皮膏条密封。室温温浴2小时；

10)重复步骤8；

11)每孔加入200ul Substrate Solution。室温避光孵育20分钟；

12)每孔加入50ul Stop Solution。孔内颜色应该由蓝变黄。如果孔内颜色是绿色,或者颜色变化不均匀,轻轻拍打板子以确保充分混匀；

13)30分钟内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度,如果波长校正是有效的,设为540nm或570nm。如果波长校正不可用,从450nm波长读数减去540nm或570nm波长读数。

14)建立标准曲线，计算各细胞因子浓度，统计结果，见图3D、3E、5D、5E。

小结：有研究报道，DP1的缺失可以增强小鼠对Ang II的高血压反应，但是DP1在衰老相关的血压升高进程中的作用还没有研究。我们利用已有的DP1T细胞条件性敲除小鼠(TDP1KO,图3A),采用成熟的血压遥测技术，对不同月龄的TDP1KO小鼠进行血压监测，结果显示：DP1的缺失增强了小鼠衰老相关的血压升高，包括收缩压和舒张压的升高(图3B,3C)。T细胞相关因子的检测发现，Th1细胞因子IFNr和TNFa的水平在TDP1KO小鼠中伴随衰老显著升高(图3D,3E)。组织形态学检测发现，TDP1KO小鼠中血管重塑、组织纤维化以及活性氧的产生都显著增强(图4)。相反，在DP1 T细胞过表达小鼠(CD4-DP1-Tg,图5A)中,小鼠衰老相关的血压升高被抑制(图5B,5C)，Th1细胞因子水平降低(图5D,5E)。组织形态学检测发现，衰老的CD4-DP1-Tg小鼠中血管重塑、组织纤维化以及活性氧的产生都明显降低(图6)。

实施例3 IFNr缺失或TNFa中和可降低TDP1KO小鼠的衰老相关血压升高和活性氧产生。

本实施例涉及的主要实验部分如下：

1、ELISA检测小鼠外周血中Th1因子的水平

方法同实施例2中ELISA检测，结果见图7A、7B、8A、8B。

2、小鼠血压遥测

方法同实施例2中血压检测，结果见图7C、8C。

2、免疫荧光检测组织中活性氧含量

方法同实施例2中免疫荧光检测,结果见图7D、8D。

3、TNFa的中和抗体对小鼠的治疗处理

18月龄的WT和TDP1KO小鼠，给予TNFa的中和抗体依那西普处理，对照组给予相应的IgG处理。中和抗体(8mg/kg)通过腹腔注射给予,每两天一次，直到治疗到第七天，开始监测血压。

小结：以上结果表明：T细胞中DP1的缺失通过促进Th1细胞的活化，增强小鼠衰老相关的血压升高。接下来繁殖的IFNr-/-和CD4⁺T细胞特异性DP1敲除(TDP1KO)双敲小鼠(IFNr/TDP1 DKO),全面分析IFNr敲除对T细胞中DP1的缺失加剧的衰老性高血压进展的影响。结果显示，IFNr的缺失可显著降低TDP1KO小鼠的衰老相关Th1细胞的活化(图7A、7B)、血压的升高(图7C)和活性氧(图7D)的产生。同理，用TNFa中和抗体依那西普(Eter)处理小鼠可显著逆转衰老小鼠中DP1缺失引起的血压升高及相关表型(图8)。

实施例4 DP1激动剂BW245C可显著降低小鼠的衰老相关血压升高。

本实施例涉及的主要实验部分如下：

1、DP1激动剂对小鼠的治疗处理

18月龄的WT小鼠，给予DP1激动剂BW245C处理，对照组给予PBS处理。激动剂(1mg/kg)通过腹腔注射给予，每天两次，直到治疗到第七天，开始监测血压。

2、小鼠血压遥测

方法同实施例2中血压检测，结果见图9A、9B。

3、RT-PCR检测Th1基因表达

方法同实施例1细胞因子的PCR检测，结果见图9C、图9D。

4、免疫荧光检测组织中活性氧含量

方法同实施例2中免疫荧光检测,结果见图9E。

小结：在对小鼠衰老相关血压升高病理的治疗过程中，我们发现DP1受体激动剂BW245C的加入可明显降低衰老小鼠的收缩和舒张血压(图9A、9B)；定量PCR结果发现，Th1细胞因子的分泌也被明显抑制(图9C、图9D)；DHE免疫荧光检测发现，DP1受体的活化可显著降低血管系统和肾脏系统活性氧的产生(图9E)。

综合上述各实施例，本发明从临床出发，经在动物水平反复研究，发现在衰老相关高血压的发生发展过程中，前列腺素D₂受体DP1通过抑制Th1型炎症反应来抑制活性氧的产生和血管重塑，从而降低高血压的病症；当DP1被激活后可以改善老年性高血压的病症。本发明研究丰富了对老年性高血压发病机理的基础研究的内容，为更深入探索老年性高血压发病的本质原因提供了新的思路。同时，DP1可作为临床上治疗老年性高血压的一个新的药物靶标，DP1的激动剂及Th1型细胞因子的中和抗体可参考作为治疗老年性高血压的潜在药物。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 天津医科大学

<120> DP1作为老年性高血压免疫治疗药物靶标及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人(Human)

<400> 1

atgaagtcgc cgttctaccg ctgccagaac accacctctg tggaaaaagg caactcggcg 60

gtgatgggcg gggtgctctt cagcaccggc ctcctgggca acctgctggc cctggggctg 120

ctggcgcgct cggggctggg gtggtgctcg cggcgtccac tgcgcccgct gccctcggtc 180

ttctacatgc tggtgtgtgg cctgacggtc accgacttgc tgggcaagtg cctcctaagc 240

ccggtggtgc tggctgccta cgctcagaac cggagtctgc gggtgcttgc gcccgcattg 300

gacaactcgt tgtgccaagc cttcgccttc ttcatgtcct tctttgggct ctcctcgaca 360

ctgcaactcc tggccatggc actggagtgc tggctctccc tagggcaccc tttcttctac 420

cgacggcaca tcaccctgcg cctgggcgca ctggtggccc cggtggtgag cgccttctcc 480

ctggctttct gcgcgctacc tttcatgggc ttcgggaagt tcgtgcagta ctgccccggc 540

acctggtgct ttatccagat ggtccacgag gagggctcgc tgtcggtgct ggggtactct 600

gtgctctact ccagcctcat ggcgctgctg gtcctcgcca ccgtgctgtg caacctcggc 660

gccatgcgca acctctatgc gatgcaccgg cggctgcagc ggcacccgcg ctcctgcacc 720

agggactgtg ccgagccgcg cgcggacggg agggaagcgt cccctcagcc cctggaggag 780

ctggatcacc tcctgctgct ggcgctgatg accgtgctct tcactatgtg ttctctgccc 840

gtaatttatc gcgcttacta tggagcattt aaggatgtca aggagaaaaa caggacctct 900

gaagaagcag aagacctccg agccttgcga tttctatctg tgatttcaat tgtggaccct 960

tggattttta tcattttcag atctccagta tttcggatat tttttcacaa gattttcatt 1020

agacctctta ggtacaggag ccggtgcagc aattccacta acatggaatc cagtctgtga 1080

<210> 2

<211> 1074

<212> DNA

<213> 鼠(mouse)

<400> 2

atgaacgagt cctatcgctg tcagacatcc acctgggtgg aaaggggctc ctcggcgacg 60

atgggcgctg tgctcttcgg tgcggggctt ctgggcaatc ttctggcgct ggtgctgctg 120

gcgcgctcgg gactggggtc ttgccggcca gggccactac acccgccgcc ctcggtcttt 180

tatgtgctcg tgtgtggctt gacggtcacc gacttgctgg gcaagtgtct gatcagcccg 240

atggtcctgg ctgcctacgc gcaaaaccag agcctaaagg aactgctgcc tgcctcaggc 300

aatcagttat gcgaaacgtt cgccttcctg atgtccttct ttgggctagc ctcgacctta 360

cagctgttgg ctatggcggt ggagtgctgg ctgtctctgg gacacccctt cttctaccaa 420

aggcacgtca ccttgcgccg gggagtgctg gtggcaccgg tcgtggccgc cttctgcttg 480

gctttctgtg cgctcccctt tgctggtttt gggaagttcg tgcagtactg tccaggcacc 540

tggtgtttca tccagatgat ccacaaggag cgttcatttt cggtaatagg cttctctgtg 600

ctctactcca gcctcatggc gctgctggtc ctcgcaaccg tggtgtgcaa cctgggtgcc 660

atgtacaacc tctatgacat gcacaggcgc cagaggcact atcctcaccg ctgctccagg 720

gaccgcgccc agtcaggctc agactacagg cacgggtccc tgcatccttt ggaggagctg 780

gaccactttg tgctgctggc tctcatgaca gtgctcttca ccatgtgttc cctgccttta 840

atttatcgtg cgtactatgg agcctttaaa cttgagaaca aagctgaagg agactcagaa 900

gacctccaag ccttgcgttt cctgtctgtg atttccatag tggacccctg gatcttcatc 960

atcttcagga cttcagtatt ccggatgtta tttcacaagg ttttcacaag acctctgatc 1020

tacagaaact ggagcagcca ttcccagcaa agtaacgtgg aatccacttt gtga 1074

Claims (8)

1.DP1基因或其表达产物(DP1基因的编码蛋白)在下述任一方面的应用：

i)开发、筛选老年性高血压功能产品方面；

ii)制备治疗或预防老年性高血压的功能产品方面。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品为能够对老年性高血压的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节等有益作用的产品或潜在物质；所述功能产品可以为单一制剂，也可以为包含有效量制剂成分的组合物，所述组合物中可以包括药剂学上能接受的载体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品含有以DP1为靶标，并对DP1基因的表达、转录或其表达产物起到促进作用的有效成分。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该有效成分可以为核酸激动物、蛋白激动剂、抗体、配体、蛋白水解酶、蛋白结合分子中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白激动剂为BW245C。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗体为Th1细胞因子TNFα的中和抗体，所述中和抗体为依那西普。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于起到以下一种或多种作用：

i)降低Th1细胞因子TNFα、IFNγ的表达；

ii)提高Th1细胞因子TNFα中和抗体的浓度；

iii)促进T细胞中PGD2的表达；

iv)促进T细胞中DP1的表达；

v)降低血管和肾脏CD4⁺T细胞的浸润。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品选自或含有以下任一种：

i)以SEQ ID NO：1或其转录本为靶序列，且能够促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

ii)能表达或形成i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；

iii)含有SEQ ID NO：1或其互补序列，且能够在转入体内后形成促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；

iv)促进SEQ ID NO：1基因表达后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物；

v)以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其转录本为靶序列，且能够促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

vi)能表达或形成v)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；

vii)含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其互补序列，且能够在转入体内后形成促进DP1基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物。

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