JP5442256B2 - ドーパミン受容体を標的とする薬剤、およびそのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に関する新たな知見を利用した、多発性硬化症等の免疫関連疾患に対する医薬、及び、前記医薬のスクリーニング方法、並びに、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構を制御するための各種薬剤に関する。

獲得免疫の中心的役割を担うヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインの違いなどから、細胞性免疫を促進するＴｈ１（タイプ１ヘルパーＴ細胞）と液性免疫を促進するＴｈ２（タイプ２ヘルパーＴ細胞）とに分類される。また、樹状細胞（ＤＣ）は免疫応答の初期に重要な役割を担う抗原提示細胞であるが、近年、Ｔｈ１の誘導を促進（ＤＣ１）、又はＴｈ２の誘導を促進（ＤＣ２）といった機能的差異をもったサブセットが存在することが明らかとなった。これを利用して、ナイーブＴ細胞からのＴｈ１やＴｈ２への誘導をＤＣを介して人為的に制御し、偏向したＴｈ１／Ｔｈ２バランスを是正する方法はいくつか試みられており、成功例も報告され始めている（Ｍｏｒｉｔａ Ｙ ｅｔ ａｌ．；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＬ−４ ｉｎｈｉｂｉｔ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００１ Ｍａｙ；１０７（１０）：１２７５−８４．）。

また、従来から、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの異常は様々な免疫関連疾患の発症に関与すると考えられており、例えば、Ｔｈ１細胞へのバランス偏向は、慢性炎症性疾患である関節リウマチや、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、肝炎、肝障害、自己免疫性溶血性貧血、白血球減少症、血小板減少症、脱髄疾患、橋本甲状腺炎、悪性貧血、乾癬）などに関与すると考えられており、また、Ｔｈ２細胞へのバランス偏向は、アレルギー性疾患や、多くの全身性自己免疫疾患に関与すると考えられている。一方、近年、複数の論文により、新たなＴｈ亜分画であるＴｈ１７が報告された。この細胞はもっぱらＩＬ−１７を産生することにより、自己免疫性炎症の増悪に関与している。特に前述の多発性硬化症や関節リウマチはこのＴｈ１７への偏向に起因する疑いが強いと考えられている（Ｂａｔｔｅｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２７ ｌｉｍｉｔｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６．７：９２９−９３６．）。Ｔｈ１７は、Ｔｈ１とは相互抑制的に、Ｔｈ２とは相互増強的に作用する。

前記したような各種免疫関連疾患を効果的に治療又は予防する方法として、異常となったＴｈ１／Ｔｈ２バランスを所望の通りに調整する方法は数多く提案されており、具体的には、例えば、ＴＣＣＲ（Ｔ細胞サイトカイン受容体）ポリペプチドアンタゴニストを投与することによるＴｈ１媒介疾患の治療方法（特表２００３−５１２８２４号公報）；多発性硬化症等の自己免疫疾患により引き起こされる過剰Ｔｈ１細胞媒介免疫応答をキサントフィルの使用により抑制する方法（特表２００３−５１０３５３号公報）；臓器特異的自己免疫疾患等を治療又は予防するための特定のベンズヒドリル誘導体を含む医薬組成物（特開２００３−３００８８１号公報）；などが提案されている。

しかしながら、獲得免疫システムには様々な要因が複雑に関与しており、どの免疫関連疾患に、Ｔｈ１偏向、Ｔｈ２偏向、Ｔｈ１７偏向のいずれが関与しているかは、未だ推測の域を超えない面もあると考えられる。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構、特に、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に関するより正確な知見、及び、前記知見を利用した、免疫関連疾患に対するより有効な医薬の開発が、望まれているのが現状である。

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に関して新たな知見を得ること、並びに、前記知見を利用し、免疫関連疾患に対する有効な医薬、前記医薬のスクリーニング方法、及び、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構を制御するための有効な薬剤を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、第１に、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に、ドーパミン（ＤＡ）の働きが大きく関与しているという知見である。また、第２に、従来Ｔｈ１偏向が原因とされてきた疾患をも含む、種々の臓器特異的自己免疫疾患や慢性炎症性疾患を、ドーパミン受容体の活性の修飾を介した、Ｔｈ１７やＴｈ２分化の抑制あるいはＴｈ１分化の誘導により、効果的に治療又は予防し得るという知見である。

前記第１の知見に関して、従来から、樹状細胞（ＤＣ）がＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化を誘導する過程には様々なサイトカインが関与することが知られており、より具体的には、ＤＣからのＩＬ−１２の産生が優位となるとＴｈ１分化が促進され、ＩＬ−４やＰＧＥ_２の産生が優位となるとＴｈ２分化が促進され、ＩＬ−６やＴＧＦβの産生が優位となるとＴｈ１７分化が促進されることなどが知られていた。

しかしながら、ＤＣを介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に、ドーパミン（ＤＡ）の働きが大きく関与していることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。

また、前記第２の知見に関して、従来から、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７バランスの異常を調整することにより免疫関連疾患を治療する試みは広く行われていた。中でも、臓器特異的自己免疫疾患の多くは、従来はＴｈ１細胞へのバランス偏向に起因する疾患であると考えられており、Ｔｈ２細胞への分化を誘導することによって、前記疾患を治療又は予防する試みが広く行われていた。

しかしながら、これら臓器特異的自己免疫疾患の少なくとも一部が、実際はＴｈ１７細胞又はＴｈ２細胞へのバランス偏向に起因する疾患であり、そのため、Ｔｈ１７細胞やＴｈ２細胞への分化を抑制したり、Ｔｈ１細胞への分化を誘導することにより、前記疾患を効果的に治療又は予防し得ることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、より詳しくは、以下の発明を包含するものである。
[１]Ｔｈインバランスに起因する疾患の治療又は予防のための医薬であって、ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物を有効成分として含有する医薬。
[２]Ｔｈインバランスに起因する疾患がＴｈ１７又はＴｈ２の過剰反応に起因する疾患であり、ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物が、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストである、[１]に記載の医薬。
[３]ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストがＳＣＨ２３３９０である[２]に記載の医薬。
[４]Ｔｈインバランスに起因する疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法であって、ドーパミン受容体への結合を指標として用いるスクリーニング方法。
[５]Ｔｈインバランスに起因する疾患がＴｈ１７又はＴｈ２の過剰反応に起因する疾患であり、ドーパミン受容体がドーパミンＤ１様受容体である、[４]に記載のスクリーニング方法。
[６]Ｔｈインバランスに起因する疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法であって、ドーパミン受容体の活性の修飾を指標として用いるスクリーニング方法。
[７]Ｔｈインバランスに起因する疾患がＴｈ１７又はＴｈ２の過剰反応に起因する疾患であり、ドーパミン受容体の活性の修飾がドーパミンＤ１様受容体の活性阻害である、[６]に記載のスクリーニング方法。
[８]樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を阻害する薬剤であって、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストを有効成分として含有する薬剤。
[９]ナイーブＴ細胞のＴｈ１７若しくはＴｈ２への分化の抑制、又はＴｈ１への分化の促進をする薬剤であって、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストを有効成分として含有する薬剤。
[１０]ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストがＳＣＨ２３３９０である、[８]または[９]に記載の薬剤。
[１１]樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を促進する薬剤であって、ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを有効成分として含有する薬剤。
[１２]ナイーブＴ細胞のＴｈ２への分化を促進する薬剤であって、ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを有効成分として含有する薬剤。

本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に関する新たな知見を利用し、免疫関連疾患に対する有効な医薬、前記医薬のスクリーニング方法、及び、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構を制御するための有効な薬剤を提供することができる。

図１Ａは、樹状細胞に対する各種薬剤の添加が、Ｔ細胞のＴｈ分化偏向に及ぼす影響を示したグラフである。 図１Ｂは、樹状細胞に対する各濃度のスルピリド添加が、Ｔ細胞のＴｈ分化偏向に及ぼす影響を示したグラフである。 図２は、樹状細胞におけるドーパミン受容体サブタイプの発現を確認したＲＴ−ＰＣＲ後電気泳動像の写真である。 図３Ａは、ドーパミンやスルピリドの添加が、樹状細胞内Ｃａ^２＋濃度変化に及ぼす影響を示したグラフである。 図３Ｂは、ドーパミンやスルピリドの添加が、樹状細胞内ｃＡＭＰ濃度変化に及ぼす影響を示したグラフである。 図４Ａは、樹状細胞に対する各種薬剤の添加が、樹状細胞によるサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０）の産生に及ぼす影響を示した図である。 図４Ｂは、樹状細胞に対する各種薬剤の添加が、樹状細胞の表面抗原分子発現に及ぼす影響を示したグラフである。 図５Ａは、樹状細胞において顆粒内にドーパミンが貯蔵されることを示した共焦点顕微鏡像の写真である。 図５Ｂは、樹状細胞に対する各種薬剤の添加が、顆粒内のドーパミン貯蔵量に及ぼす影響を示した蛍光顕微鏡像の写真である。 図６Ａは、各濃度のドーパミン刺激による、Ｔ細胞内のｃＡＭＰ濃度変化を示したグラフである。 図６Ｂは、ドーパミン刺激に加え、ＳＣＨ２３３９０（ドーパミンＤ１様受容体阻害剤）を添加した場合のＴ細胞内のｃＡＭＰ濃度変化を示したグラフである。 図６Ｃは、各濃度のドーパミン刺激がＴ細胞のＴｈ分化偏向に及ぼす影響を示したグラフである。 図７Ａは、樹状細胞とＴ細胞との共培養（ａｌｌｏ−ＭＬＲ）による樹状細胞の脱顆粒の様子を示した位相差顕微鏡像の写真である。 図７Ｂは、コルヒチン処理による樹状細胞の脱顆粒の阻害が、Ｔ細胞のＴｈ分化偏向に及ぼす影響を示したグラフである。 図７Ｃは、ドーパミン合成の過程を阻害する働きを有するＡＭＰＴ（α−ｍｅｔｈｙｌ−ｐ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）の添加が、Ｔ細胞のＴｈ分化偏向に及ぼす影響を示したグラフである。 図８は、実施例１〜７で示唆された、樹状細胞（ＤＣ）からのドーパミン放出を介したＴｈ分化誘導機構を示した模式図である。 図９Ａは、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、ＥＡＥの予防効果を示したグラフである。 図９Ｂは、各種ドーパミン受容体阻害薬の治療的投与による、ＥＡＥの治療効果を示したグラフである。 図９Ｃは、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化偏向（ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１７産生量）を示したグラフである。 図９Ｄは、各種ドーパミン受容体阻害薬の治療的投与による、Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化偏向（ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１７産生量）を示したグラフである。 図１０は、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、ＣＩＡの予防効果を示したグラフである。 図１１は、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、ＮＯＤの予防効果を示したグラフである。 図１２Ａは、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、糸球体腎炎の予防効果を示すためのポジティブコントロール（ＰＣ）群の光学顕微鏡像（ヘマトキシリンエオシン染色）の写真である。 図１２Ｂは、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、糸球体腎炎の予防効果を示すためのネガティブコントロール（ＮＣ）群の光学顕微鏡像（ヘマトキシリンエオシン染色）の写真である。 図１２Ｃは、各種ドーパミン受容体阻害薬の予防的投与による、糸球体腎炎の予防効果を示すためのＳＣＨ２３３９０投与群の光学顕微鏡像（ヘマトキシリンエオシン染色）の写真である。

（医薬）
本発明の医薬は、Ｔｈインバランスに起因する疾患の治療又は予防のために使用され得る医薬であり、ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。Ｔｈインバランスに起因する疾患は、好ましくは、Ｔｈ１７又はＴｈ２の過剰反応に起因する疾患であり、この場合、ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物は、好ましくは、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストである。

＜ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニスト＞
「ドーパミン受容体」にはＤ１〜Ｄ５までの５つのサブタイプが存在し、Ｇタンパク質と共役して細胞内にシグナルを送る働きを有することが一般に知られている。前記Ｄ１及びＤ５は「ドーパミンＤ１様受容体」として、アデニルシクラーゼ活性を上昇させ、ｃＡＭＰ濃度を上昇させるＧｓタンパクと共役することが知られている。一方で、前記Ｄ２〜Ｄ４は「ドーパミンＤ２様受容体」として、アデニルシクラーゼ活性を抑制するＧｉタンパクと共役することが知られている。したがって、前記「ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニスト」としては、前記ドーパミン受容体のサブタイプＤ１及びＤ５の少なくともいずれかの作用を阻害する働きを有する物質を使用することができる。

即ち、前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のドーパミンＤ１様受容体アンタゴニスト（ドーパミンＤ１様受容体阻害薬）を使用してもよいし、後述する本発明のスクリーニング方法によりドーパミンＤ１様受容体に対する結合能力及び／又は活性阻害能力を有すると評価された物質を使用してもよい。

前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストの具体例としては、例えば、ＳＣＨ２３３９０、ＳＫＦ８３５６６、Ｌ−ステフォリジン(Ｓｔｅｐｈｏｌｉｄｉｎｅ)、ＬＥ３００などが挙げられる。また、これらの中でも、ＳＣＨ２３３９０が特に好ましい。前記各ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストの構造式を以下に示す。

前記医薬中の前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記医薬は前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストそのものであってもよい。

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

＜剤型、製造＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、坐剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。

前記経口固形剤としては、例えば、前記ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。

前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。

前記経口液剤としては、例えば、前記ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。

前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。

前記注射剤としては、例えば、前記ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。

前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。

前記坐剤としては、例えば、前記ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物に、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）等の界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。

前記軟膏剤としては、例えば、前記ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。

前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。

前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。

＜対象疾患＞
前記医薬の対象疾患としては、Ｔｈインバランスに起因する疾患であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくはＴｈ１７又はＴｈ２過剰反応に起因する疾患である。本発明において、従来はＴｈ１過剰反応に起因するとされていた疾患の少なくとも一部が、実際はＴｈ１７又はＴｈ２へのバランス偏向に起因する疾患であることが見出された。従って、前記Ｔｈ１７又はＴｈ２過剰反応に起因する疾患としては、従来からＴｈ１７やＴｈ２の過剰反応に起因する疾患として知られているアレルギー性疾患や多くの全身性自己免疫疾患に加え、従来はＴｈ１過剰反応に起因するとされていた疾患も含まれる。Ｔｈ１７又はＴｈ２過剰反応に起因する疾患か否かは、例えば、ドーパミンＤ１様受容体の活性を抑制することにより、その疾患に対して予防あるいは治療の効果があるか否かにより評価することが可能である。ドーパミンＤ１様受容体の活性を抑制する薬剤（アンタゴニスト）は、上記の通り、公知である。本発明における対象疾患としては、特に、慢性炎症性疾患である関節リウマチや、多発性硬化症、１型糖尿病、糸球体腎炎等の臓器特異的自己免疫疾患が好適である。

＜投与＞
前記医薬の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。

また、前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与などが挙げられる。

また、前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、性別、症状等に応じて適宜選択することができるが、ヒト成人１日あたり、有効成分である前記ドーパミン受容体の活性を修飾する化合物（例えば、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニスト）の量として、２〜１００ｍｇ程度が好ましいと考えられる。また、前記医薬の投与頻度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１日あたりの投与量を、１日に１回で投与してもよいし、複数回に分けて投与してもよい。

また、前記医薬の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患の発症前に予防的に投与されてもよいし、前記疾患の発症後に治療的に投与されてもよい。

（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、本発明の前記Ｔｈインバランスに起因する疾患の治療又は予防のための医薬をスクリーニングするための方法であり、例えば、ドーパミン受容体への結合を指標とする方法（第１のスクリーニング方法）、及び、ドーパミン受容体の活性の修飾を指標とする方法（第２のスクリーニング方法）が挙げられる。

＜第１のスクリーニング方法（結合を指標）＞
前記第１のスクリーニング方法としては、前記ドーパミン受容体への結合を指標とする方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ）被験物質のドーパミン受容体への結合能力を評価する工程、及び、（ｂ）前記工程（ａ）で前記ドーパミン受容体への結合能力を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。本方法の対象とするＴｈインバランスに起因する疾患としては、好ましくは、Ｔｈ１７又はＴｈ２の過剰反応に起因する疾患であり、この場合、ドーパミン受容体としては、好ましくは、ドーパミンＤ１様受容体である。なお、前記被験物質としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。

−（ａ）評価工程−
前記評価工程における、前記被験物質の前記ドーパミン受容体への結合能力の評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ドーパミン受容体タンパク質を発現させた細胞株と前記被験物質との結合アッセイによる方法などが挙げられる。

なお、ドーパミン受容体の発現に関してのみ相違のある２種類の細胞株への前記被験物質の結合の程度に差があるという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ドーパミン受容体に対して結合能力を有していると評価することができる。

−（ｂ）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ）で前記ドーパミン受容体への結合能力を有すると評価された前記被験物質を選択する。

＜第２のスクリーニング方法（活性阻害を指標）＞
前記第２のスクリーニング方法としては、前記ドーパミン受容体の活性修飾を指標とする方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ’）被験物質のドーパミン受容体に対する活性修飾能力を評価する工程、及び（ｂ’）前記工程（ａ’）で前記ドーパミン受容体に対する活性修飾能力を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。本方法の対象とするＴｈインバランスに起因する疾患としては、好ましくは、Ｔｈ１７又はＴｈ２の過剰反応に起因する疾患であり、この場合、スクリーニングの指標となるドーパミン受容体の活性修飾としては、好ましくは、ドーパミンＤ１様受容体の活性阻害である。

−（ａ’）評価工程−
前記評価工程における、前記被験物質の前記ドーパミン受容体に対する活性修飾能力を評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被験物質存在下での、細胞内ｃＡＭＰ濃度、細胞内ドーパミン（ＤＡ）合成量、細胞内ドーパミン（ＤＡ）貯蔵量等の変化を調べる方法などが挙げられる。前記各種変化は、例えば、従来公知の手法を用いて調べることができる。

なお、ドーパミンＤ１様受容体を標的としてスクリーニングを行い、前記被験物質存在下では、前記被験物質非存在下と比較して、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下し、細胞内ＤＡ合成量が減少し、及び／又は、細胞内ＤＡ貯蔵量が減少するという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ドーパミンＤ１様受容体に対して活性阻害能力を有していると評価することができる。

−（ｂ’）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ’）で前記ドーパミン受容体に対する活性修飾能力を有すると評価された前記被験物質を選択する。

前記スクリーニング方法としては、前記第１のスクリーニング及び前記第２のスクリーニングのいずれかのみを行ってもよいし、両者を行ってもよいが、効率的に前記医薬を選択することができる点で、両者を行うことが好ましい。この場合、前記第１のスクリーニング及び前記第２のスクリーニングをこの順に行うことにより、より効率的に前記医薬を選択することができる。

（薬剤）
本発明の薬剤は、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構にドーパミンの働きが関与するという、本発明における新たな知見を利用した薬剤であり、例えば、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストを利用した薬剤、及び、ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを利用した薬剤が挙げられる。

＜ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストを利用した薬剤＞
本発明者らの新たな知見により、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７やＴｈ２分化の抑制あるいはＴｈ１分化の誘導をする働きがあることが示される。また、ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストは、樹状細胞（ＤＣ）におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を阻害する働きを有する可能性があることが示唆される。

したがって、前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストを利用した薬剤としては、例えば、後述する、樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を阻害する本発明の薬剤（第１の薬剤）、及び、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７やＴｈ２への分化を抑制又はＴｈ１への分化を促進する本発明の薬剤（第２の薬剤）が挙げられる。

−第１の薬剤、第２の薬剤−
前記第１の薬剤は、樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を阻害する薬剤（ＤＣにおけるＤＡ合成乃至貯蔵阻害剤）であり、前記第２の薬剤は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７やＴｈ２への分化を抑制又Ｔｈ１への分化を促進する薬剤（Ｔｈ１７やＴｈ２の分化抑制剤あるいはＴｈ１分化促進剤）である。前記第１の薬剤及び前記第２の薬剤はそれぞれ、前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストを有効成分として含有してなり、必要に応じてその他の成分を含有してなる。

前記第１の薬剤、前記第２の薬剤における前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明の前記医薬と同様に適宜選択することができる。

前記第１の薬剤、前記第２の薬剤中の前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記第１の薬剤、前記第２の薬剤は前記ドーパミンＤ１様受容体アンタゴニストそのものであってもよい。

また、前記第１の薬剤、前記第２の薬剤における前記その他の成分の種類、前記その他の成分の含有量、剤型、製造方法等も、特に制限はなく、例えば、本発明の前記医薬と同様に適宜選択することができる。

＜ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを利用した薬剤＞
また、本発明者らの新たな知見により、ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストは、樹状細胞（ＤＣ）においてドーパミンＤ２様受容体の働きを阻害し、ＤＣ内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、ＤＣにおけるドーパミンの合成乃至貯蔵を促進する働きを有することが示される。また、ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストは、ナイーブＴ細胞のＴｈ２分化を誘導する働きを有することが示される。

したがって、前記ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを利用した薬剤としては、例えば、後述する、樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を促進する本発明の薬剤（第３の薬剤）、及び、ナイーブＴ細胞のＴｈ２への分化を促進する本発明の薬剤（第４の薬剤）が挙げられる。

−第３の薬剤、第４の薬剤−
前記第３の薬剤は、樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を促進する薬剤（ＤＣにおけるＤＡ合成乃至貯蔵促進剤）であり、前記第４の薬剤は、ナイーブＴ細胞のＴｈ２への分化を促進する薬剤（Ｔｈ２分化促進剤）である。前記第３の薬剤及び前記第４の薬剤はそれぞれ、前記ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを有効成分として含有してなり、必要に応じてその他の成分を含有してなる。

前記第３の薬剤、前記第４の薬剤における前記ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストを使用してもよいし、本発明の前記スクリーニング方法と同様なスクリーニング方法を使用することにより、ドーパミンＤ２様受容体に対する結合能力及び／又は活性阻害能力を有すると評価された物質を使用してもよい。前記ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストの具体例としては、例えば、スルピリド、ネモナプリドなどが挙げられる。

前記第３の薬剤、前記第４の薬剤中の前記ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記第３の薬剤、前記第４の薬剤は前記ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニストそのものであってもよい。

また、前記第３の薬剤、前記第４の薬剤における前記その他の成分の種類、前記その他の成分の含有量、剤型、製造方法等も、特に制限はなく、例えば、本発明の前記医薬と同様に適宜選択することができる。

＜用途＞
前記第１〜第４の薬剤は、例えば、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に関連する実験用の試薬として好適である。また、前記第１〜第４の薬剤は、前記各種薬剤の投与により改善効果が期待される各種免疫関連疾患の治療又は予防用途に使用してもよい。例えば、前記第４の薬剤（ナイーブＴ細胞のＴｈ２への分化を促進する薬剤）は、Ｔｈ１過剰反応に起因する疾患の治療又は予防のために使用することもできる。

以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１：樹状細胞を介したＴ細胞のＴｈバランスへの各種薬剤の影響）
実施例１では、樹状細胞がＴ細胞の分化を誘導する過程において、ドーパミンＤ２様受容体阻害薬（ドーパミンＤ２様受容体アンタゴニスト）をはじめとした各種薬剤の添加がＴｈバランスに及ぼす影響を調べた。

ヒト末梢血より、ＣＤ１４陽性細胞とＣＤ４５ＲＡ陽性（ナイーブ）Ｔ細胞とをＭＡＣＳ（磁気細胞分離法）で分離した。得られたＣＤ１４陽性細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養して、樹状細胞への分化を誘導し、５日目に、図１Ａ〜図１Ｂに示す各種薬剤による刺激を加え、７日目に回収した。洗浄の後、回収された樹状細胞と、ナイーブＴ細胞との共培養を開始し、８〜９日目に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で再刺激を行い、Ｔ細胞の分化を誘導した。前記再刺激から１６時間後の培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡにより、Ｔｈ１サイトカインの代表としてＩＦＮ−γ、Ｔｈ２サイトカインの代表としてＩＬ−５の測定を行った。ＩＦＮ−γとＩＬ−５との産生量比により、Ｔｈバランスを確認した。結果を図１Ａ〜図１Ｂに示す。

図１Ａ〜図１Ｂは、各種薬剤を添加した際のＩＬ−５／ＩＦＮ−γの値を示したグラフである。ＩＬ−５／ＩＦＮ−γの値が高い程、Ｔｈ２分化偏向を起こしていることを示し、同値が低い程、Ｔｈ１分化偏向を起こしていることを示す。なお、ネモナプリド、スルピリドは公知のドーパミンＤ２様受容体阻害薬である。また、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）はアデニルシクラーゼの活性化剤であり、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる作用があることが知られている。また、ＬＰＳはグラム陰性菌由来のリポ多糖で、Ｔｈ１分化誘導作用があることが知られている。ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）としては酢酸を使用した。また、図１Ａ〜図１Ｂ中の「ｎｏｎｅ」は薬剤無添加区を示す（特に明記しない限り、他の図においても同様）。

図１Ａの結果から、ドーパミンＤ２様受容体阻害薬であるネモナプリド及びスルピリド、並びに、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）は、Ｔｈ２誘導活性を有していることが判明した。また更に、図１Ｂの結果から、ドーパミンＤ２様受容体阻害薬であるスルピリドは、濃度依存的なＴｈ２誘導活性を有していることが判明した。

実施例１の結果から、樹状細胞（ＤＣ）におけるドーパミンＤ２様受容体の阻害が、Ｔｈ２分化誘導能を持つＤＣ（ＤＣ２）への分化を誘導し、Ｔ細胞のＴｈ２への分化を誘導すること、更には、ＤＣ自体がドーパミンの産生・分泌能を有し、オートクラインにドーパミンＤ２様受容体に結合して、ＤＣ２への分化を抑制するメカニズムが存在することが示唆された。

（実施例２：樹状細胞におけるドーパミン受容体サブタイプの解析）
実施例２では、樹状細胞におけるドーパミン受容体のサブタイプの発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した。

ドーパミン受容体には、Ｄ１〜Ｄ５までの５つのサブタイプが存在し、Ｇタンパク質と共役して細胞内にシグナルを送ることが知られている。Ｄ１とＤ５はドーパミンＤ１様受容体として、アデニルシクラーゼ活性を上昇させ、ｃＡＭＰ濃度を上昇させるＧｓタンパクと共役することが知られており、一方で、Ｄ２〜Ｄ４はドーパミンＤ２様受容体として、アデニルシクラーゼ活性を抑制するＧｉタンパクと共役することが知られている。

ＣＤ１４陽性細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で５日間培養して、樹状細胞への分化を誘導し、前記樹状細胞（ＤＣ）からＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。また、比較対照のため、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）、ナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ）、メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ Ｔ）についても同様にＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲには、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５の各種ドーパミン受容体サブタイプのプライマーを使用した。また、陽性対照として、β−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）のプライマーを使用した。結果を図２に示す。

図２の結果から、ＤＣではＤ１、Ｄ４、Ｄ５受容体が発現していることが判明した。本実施例２の結果を前記実施例１の結果と照らし合わせることにより、ドーパミンＤ２様受容体阻害薬は、ＤＣにおいてはＤ４に作用し、Ｔ細胞のＴｈ２偏向をもたらす可能性が示唆された。なお、既報ではナイーブＣＤ４Ｔ細胞がＤ３を、メモリーＣＤ４Ｔ細胞がＤ２とＤ３を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞がＤ３を発現するとされている。

（実施例３：樹状細胞のドーパミンに対する反応）
実施例３では、樹状細胞の、ドーパミン刺激に対する反応（細胞内Ｃａ^２＋濃度変化及び細胞内ｃＡＭＰ濃度変化）を調べた。

ＣＤ１４陽性細胞を、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養して、樹状細胞への分化を誘導した。５日目の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）に、スルピリド（Ｓｕｌｐｉｒｉｄｅ）、又はビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ；酢酸）処理を施し、更に、ドーパミン(ＤＡ)を図３Ａ〜図３Ｂに示す各濃度で加えた。ドーパミン刺激後の各樹状細胞について、細胞内Ｃａ^２＋濃度（図３Ａ）及び細胞内ｃＡＭＰ濃度（図３Ｂ）を測定した。

図３Ａ及び図３Ｂの結果から、ドーパミンは樹状細胞（ＤＣ）内のＣａ^２＋濃度を上昇させる一方で、ｃＡＭＰ濃度を濃度依存的に低下させること、そしてこれらはスルピリド（Ｓｕｌｐｉｒｉｄｅ）によるドーパミンＤ２様（Ｄ４）受容体の阻害により抑制されることから、ｉＤＣにおいては、ドーパミンはＤ２様（Ｄ４）受容体に優位に結合して、細胞内にシグナルを送ることが示唆された。

（実施例４：樹状細胞におけるサイトカイン産生や表面抗原分子発現に対する各種薬剤の影響）
実施例４では、樹状細胞におけるサイトカイン産生や表面抗原分子発現に対する各種薬剤の影響を調べた。

ＣＤ１４陽性細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養して、樹状細胞への分化を誘導し、５日目の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）に、図４Ａ〜図４Ｂに示す各種薬剤による刺激を加えた。４８時間後に、培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０量をＥＬＩＳＡで（図４Ａ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲの各表面抗原分子の発現をＦＡＣＳで（図４Ｂ）、それぞれ測定した。

図４Ａ〜図４Ｂの結果から、ドーパミン(ＤＡ)や、スルピリド等のドーパミンＤ２様受容体阻害薬は、樹状細胞におけるＩＬ−１２ｐ７０サイトカイン産生、及び表面抗原分子の発現にほとんど影響を与えないことが判明した。

（実施例５：樹状細胞内のドーパミン貯蔵）
実施例５では、樹状細胞内におけるドーパミンの貯蔵状態、及びドーパミン貯蔵に対する各種薬剤の影響を調べた。

ＣＤ１４陽性細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養して、樹状細胞への分化を誘導し、５日目の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）に、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）１０μＭで刺激を加えて４８時間後に回収した。１０％ホルマリンで固定後、エタノール処理を行い、抗ドーパミン抗体とＦＩＴＣ標識の２次抗体で染色した。更に、Ｌａｍｐ−１抗体とＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識の２次抗体を使って二重染色を行い、共焦点顕微鏡で観察した（ｏｒｇｉｎａｌ×６０）（図５Ａ）。

また、フォルスコリン、スルピリドの各刺激によるＤＣのドーパミン貯蔵の様子を蛍光顕微鏡で観察し、ＦＡＣＳｃａｎで測定して、各平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めた（図５Ｂ）。

図５Ａ〜図５Ｂの結果から、ＤＣ内にはＬａｍｐ−１陽性顆粒内にドーパミンが蓄積すること、また、刺激の種類によりドーパミン貯蔵量に差が生じることが明らかになった。また、実施例５の結果を、実施例３の結果と照らし合わせることにより、スルピリド等のドーパミンＤ２様受容体阻害薬によるｉＤＣ内のｃＡＭＰ濃度上昇が、ドーパミン貯蔵量の増加をもたらすことが示唆された。

（実施例６：ナイーブＴ細胞のドーパミンに対する反応）
実施例６では、ナイーブＴ細胞の、ドーパミン刺激に対する反応（細胞内ｃＡＭＰ濃度変化）を検討した。

ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞をＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｈｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ）１ｍＭで１０分間処理し、図６Ａに示す各濃度のドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）で刺激し、１０分後の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定したところ、ドーパミン濃度依存的な細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇を認めた（図６Ａ）。

図６Ａの結果から、ナイーブＴ細胞においては、ドーパミンは主にＤ１様受容体に優位に結合して、細胞内にシグナルを送ることが示唆された。

前記示唆を確認するため、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞をＩＢＭＸ１ｍＭで１０分間処理し、ＳＣＨ２３３９０（ドーパミンＤ１様受容体阻害薬）１μＭ又はビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ；酢酸）を添加した。１０分間培養後、ドーパミン(ＤＡ)で刺激し、１０分後の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定した。ドーパミン（１０^−７Ｍ）刺激によるｃＡＭＰ濃度上昇は、ドーパミンＤ１様受容体阻害薬であるＳＣＨ２３３９０による前処理により完全に阻害された（図６Ｂ）。

図６Ｂの結果から、ドーパミンは、ナイーブＴ細胞に対しては、Ｄ１様受容体を介したシグナルによりｃＡＭＰ濃度上昇をもたらすことが確認された。

なお、ナイーブＴ細胞では、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体刺激時にフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）等のｃＡＭＰ上昇薬物を作用させることでＴｈ２分化を誘導することが知られるが、ドーパミンも同様の作用を有していることが示唆された。

前記示唆を確認するため、分離したヒトＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激する際に、各濃度のドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）を添加して培養を行い、刺激後８日目に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で再刺激した。１６時間後にＴ細胞を回収し、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ３の発現をＦＡＣＳｃａｎ（図６Ｃ、上１段）で、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γの分泌をＥＬＩＳＡ（図６Ｃ、下２段）でそれぞれ測定し、Ｔｈ１／Ｔｈ２分化を検討した。生理的濃度（１０^−９Ｍ）とされるドーパミン濃度においては、ＩＦＮ−γの高産生、ＣＣＲ４／ＣＸＣＲ３低下などからＴｈ１分化が誘導されること、更に、高濃度のドーパミンでは、ＩＬ−５の高産生、ＣＣＲ４／ＣＸＣＲ３高値などからＴｈ２分化が誘導されることが判明した（図６Ｃ）。

図６Ａ〜図６Ｃの結果から、樹状細胞とナイーブＴ細胞が相互作用する際に樹状細胞から放出されるドーパミンの量が、Ｔｈ分化の方向性を決定していることが示唆された。つまり、樹状細胞の放出するドーパミン量が少ないときはＴｈ１に、多いときはＴｈ２に偏向することが示唆された。

（実施例７：樹状細胞の脱顆粒がＴｈ分化に与える影響）
実施例７では、ａｌｌｏ−ＭＬＲ時の樹状細胞の脱顆粒の有無、また、樹状細胞から放出されるドーパミン量を変化させた際のＴ細胞のＴｈ分化の方向性を調べた。

ＣＤ１４陽性細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養して、樹状細胞への分化を誘導し、５日目の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）にフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）１０μＭで刺激を加えて４８時間後に回収した。洗浄後に３５ｍｍのガラス培養皿（Ｇｌａｓｓ Ｂａｓｅ Ｄｉｓｈ）上に懸濁（ｓｕｓｐｅｎｄ）し、アロ（ａｌｌｏ）のヒトＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を添加した。共培養（ａｌｌｏ−ＭＬＲ）開始直後より位相差顕微鏡で観察し、経時的に（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ）撮影を行ったところ、ＤＣの一部で、主にＴ細胞との接触後に脱顆粒する様子が確認された（図７Ａ）。

次に、チューブリン重合阻害作用を有するコルヒチン（０．５ｎｇ／ｍｌ）で処理したｉＤＣを用いて、前記同様にａｌｌｏ−ＭＬＲを行い、８日目に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で再刺激した。１６時間後に培養上清を回収し、ＩＬ−５及びＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。コルヒチンで処理したＤＣはＩＬ−５／ＩＦＮ−γが低下することが確認され、ＤＣの脱顆粒の阻害はＴｈ１反応を誘導することが示唆された（図７Ｂ）。

また、ドーパミン合成過程においては、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）によりチロシンからＤＯＰＡが合成されること、また、このＴＨはα−ｍｅｔｈｙｌ−ｐ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（ＡＭＰＴ）により阻害されることが知られる。そこで、このＡＭＰＴで処理したｉＤＣを用いて、前記同様にａｌｌｏ−ＭＬＲを行った。ＡＭＰＴで処理したＤＣは、ＩＬ−５／ＩＦＮ−γがＡＭＰＴの濃度依存的に低下することが確認され、ＤＣ内で合成されるドーパミン量が少ない場合は、Ｔｈ１反応を誘導することが示唆された（図７Ｃ）。

図７Ａ〜図７Ｃの結果から、ＤＣ−ナイーブＴ細胞の相互作用の際にＤＣから放出されるドーパミン量が、Ｔｈ分化の方向性を決定することが示唆された。

（樹状細胞を介したＴｈ分化誘導機構）
前記実施例１〜７の結果から、図８に模式的に示すような、樹状細胞を介したＴｈ分化誘導機構が示唆された。

Ｔ細胞による抗原ペプチド・ＭＨＣ分子の認識には、二次シグナルとしての接着・共刺激分子が関与し、ＴＣＲ／抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むレセプター／リガンドのペアからなるＳＭＡＣ（ｓｕｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒ）又は免疫シナプスと呼ばれる局所的相互作用領域が形成されることが知られている。

一方、神経におけるシナプスの場合は、シナプス前ニューロンからドーパミンなどのニューロトランスミッターが放出され、後ニューロンを活性化するのみならず、前ニューロンに発現する自己受容体を介してネガティブフィードバックによりドーパミン合成を調節する機能を有していることが知られている。

シナプス前ニューロンの終末部においては、ドーパミンは、チロシンがチロシン水酸化酵素（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＴＨ）によりジヒドロキシフェニルアラニン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；ＤＯＰＡ）に酸化され、更に芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ａｒｏｍａｔｉｃ Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＡＡＤ）によって脱炭酸されて生じ、小胞内に貯蔵される。このドーパミンの産生と細胞外への開口放出過程は、主にＧタンパク質を介した刺激によるｃＡＭＰとＣａ^２＋によって調節される。Ｇｓタンパクからの刺激は、アデニルシクラーゼ（ＡＣ）の活性化によりｃＡＭＰの上昇をもたらし、これがＤＯＰＡへの変換を増やしＤＡの貯蔵を増やすのに対して、Ｇｉタンパクからの刺激は細胞内Ｃａ^２＋の上昇によりＤＡ貯蔵小胞の開口分泌をもたらすと同時に、ＡＣの活性を抑制することで細胞内のＤＡ貯蔵量を抑制する。このシナプス前ニューロンからのドーパミン量の調節によって、シナプス後受容ニューロンの反応に変化が生じる。

前記実施例１〜７の結果から、神経シナプスにおけるこのような機構が、樹状細胞(ＤＣ)とナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）の相互作用の際にも存在し、Ｔｈバランスに影響を与えることが示唆された（図８）。

樹状細胞とＴ細胞の間には、あたかも神経シナプスと同じように免疫シナプスが形成される。樹状細胞はシナプス前ニューロンに、Ｔ細胞はシナプス後受容ニューロンに相当するものと考えられる。前記実施例１〜７の結果から、ｉＤＣにおいては、ＧｓタンパクであるＤ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体を介したアデニルシクラーゼ（ＡＣ）活性が、ＧｉタンパクであるＤ２様（Ｄ４）受容体を介して抑制されることで、ドーパミンの貯蔵量が（自己）調節されることが示唆された。また、スルピリド等のＤ２様受容体阻害薬によるＤ２様（Ｄ４）受容体の阻害は、ｉＤＣにおいてＡＣ活性優位の状態を招き、ＤＣ内のドーパミン貯蔵量の増加をもたらすことが示唆された。逆に、ＳＣＨ２３３９０等のＤ１様受容体阻害薬によるＤ１様（Ｄ１，Ｄ５）受容体の阻害は、ｉＤＣにおいてＡＣ活性を抑制し、ＤＣ内のドーパミン貯蔵量の減少をもたらすことが示唆された。

このようにドーパミン（ＤＡ）を細胞内に有するＤＣが抗原特異的相互作用によってナイーブＴ細胞と接触すると、ＤＣからのドーパミンの脱顆粒が誘導され、このドーパミンを主にＤ１様受容体で受け取ったナイーブＴ細胞に、そのドーパミン量に応じて、Ｔｈ１又はＴｈ２のいずれかに偏った分化誘導及び活性化が起こると予想される。

（実施例８：ＥＡＥモデルマウスにおけるドーパミン受容体阻害薬の効果）
ＳＪＬマウスを用いて、ＰＬＰ１３９−１５１＋ＣＦＡ＋ＰＴｘでＥＡＥ誘導を開始し（ｄａｙ０）、予防的投与として、ｄａｙ３〜ｄａｙ１８の間、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）をそれぞれ経口で隔日投与し、ＥＡＥ臨床スコア（ＥＡＥ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）で評価を行った。前記各薬剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解し、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるような量で投与した。また、コントロール群（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、ＰＢＳのみを投与した。各群２匹で試験を行った。

結果、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）投与群は、ｄａｙ１４で２匹とも死亡した。一方、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）投与群は２匹とも発症が全く認められなかった（図９Ａ）。

また、ＰＬＰ１３９−１５１＋ＣＦＡ＋ＰＴｘでＥＡＥ誘導を開始し（ｄａｙ０）、全例発症した２日後（ｄａｙ２８）より、治療的投与として、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）をそれぞれ経口で隔日投与し、ＥＡＥ臨床スコア（ＥＡＥ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）で評価を行った。

［ＥＡＥ臨床スコア］
１； 尾の緊張低下
２； 後肢の不全対麻痺
３； 後肢の対麻痺
４； 四肢麻痺
５； 瀕死又は死亡。

前記各薬剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解し、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるような量で投与した。また、コントロール群（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、ＰＢＳのみを投与した。各群１匹で試験を行った。

Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）を投与したマウスはｄａｙ３２より著明に悪化し、ｄａｙ３４で死亡した。一方、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）を投与したマウスはｄａｙ３８よりコントロール２匹に比べ症状は軽快し、ｄａｙ４４には寛解に至った（図９Ｂ）。

更に、抗原特異的なヘルパーＴ細胞の反応が各ドーパミン受容体阻害薬投与によってＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７のいずれにシフトしているかを調べるために、前記各マウスの脾細胞を分離し、インビトロにて再びＰＬＰ１３９−１５１を添加し、４８時間後の培養上清中のＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）、２４時間後の培養上清中のＩＬ−４、４８時間後の培養上清中のＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した（図９Ｃ〜図９Ｄ：図９Ｃは薬剤を予防的に投与したマウス、図９Ｄは薬剤を治療的に投与したマウス）。

図９Ｃの結果、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）投与群では、ＩＦＮ−γがコントロール群と比べて有意に高く、ＩＬ−４についてはコントロール群と有意な差は見られず、ＩＬ−１７がコントロール群と比べて有意に低かったことから、Ｔｈ１分化が誘導され、逆に、Ｔｈ１７分化が抑制されていることが確認された。一方、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）投与群では、ＩＬ−４がコントロール群と比べて有意に高く、ＩＦＮ−γはコントロール群と比べて有意に低く、ＩＬ−１７はコントロール群と有意な差は見られなかったことから、Ｔｈ２分化が誘導され、逆に、Ｔｈ１分化が抑制されていることが確認された。また、図９Ｄの結果から、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）投与群ではＴｈ１分化が誘導され、Ｔｈ１７やＴｈ２分化が抑制されていることが確認された。なお、図９Ｄ中、ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ（＋）はＥＡＥ誘導を行ったマウス、ｉｍｍｕｎｉｚａｉｔｉｏｎ（−）はＥＡＥ誘導を行わなかったマウスを示す。

図９Ａ〜図９Ｄの結果から、Ｔｈ２誘導能を有するドーパミンＤ２様（Ｄ４）受容体阻害薬であるＬ７５０６６７は、ＥＡＥを悪化させた。一方、Ｔｈ１誘導能（Ｔｈ１７やＴｈ２分化の抑制能）を有するＤ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬であるＳＣＨ２３３９０は、予防的投与及び治療的投与のいずれにおいても極めて高い抑制効果を示した。

（実施例９：コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルマウスおけるドーパミン受容体阻害薬の効果）
ウシ由来の２型コラーゲン（２００μｇ／匹）＋ＣＦＡを用いて、７週齢の雄マウス（ＤＢＡ／１Ｊ）において、ＣＩＡ誘導を開始し（ｄａｙ０）、ｄａｙ２１に追加免疫を行った。一方、予防的投与として、ｄａｙ１８〜ｄａｙ３４の間、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）をそれぞれ経口で週３回投与し、ｄａｙ３６にマウスの脾臓と血清を採取した。また、比較検討のため、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）についても同様に検討した。ＣＩＡ臨床スコア（ＣＩＡ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）を、以下の基準で、１本の肢ごとに評価し、マウス１匹（４肢合計）につき１６点満点で評価を行った。

[ＣＩＡ臨床スコア]
０； 正常
１； １ヵ所の腫れ
２； ２ヵ所以上の腫れで激しくないもの
３； ２ヵ所以上の激しい腫れのもの
４； 指先を含む２ヵ所以上の腫れで、激しいもの。

前記各薬剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解し、０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるような量で投与した。また、コントロール群（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、ＰＢＳのみを投与した。各群８匹で試験を行った。

結果、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）投与群では、ＣＩＡの発症は抑制されなかったが、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）投与群では、ＣＩＡの発症が抑制された（図１０）。

（実施例１０：１型糖尿病の自然発症モデルマウスおけるドーパミン受容体阻害薬の効果）
１型糖尿病の自然発症モデルであるＮＯＤマウスに対し、予防的投与として、生後４週齢より週に２回、ＳＣＨ２３３９０の経口投与を行った。また、比較検討のため、Ｌ７５０６６７（Ｄ２様（Ｄ４）受容体阻害薬）についても同様に検討した。前記薬剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解し、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるような量で投与した。その後、１４週齢より尿糖をモニターし、各群（ｎ＝１６）の糖尿病発症率を比較した。結果、ＳＣＨ２３３９０投与群では、糖尿病の発症が抑制された（図１１）。

（実施例１１：糸球体腎炎モデルマウスおけるドーパミン受容体阻害薬の効果）
前免疫として、５〜６週齢のＳＪＬ雄マウス（１２匹）に、ＣＦＡ懸濁液として、ヒツジＩｇＧ０．５ｍｇ／２０ｇ体重を皮下注射した。予防的投与として、前免疫の日を初日として、週３回、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）を経口投与した。薬剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解し、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるような量で投与した。ポジティブコントロール（ＰＣ）群およびネガティブコントロール（ＮＣ）群には、ＰＢＳのみを投与した。各群４匹で試験を行った。

次いで、ＳＣＨ２３３９０投与群およびＰＣ群に対し、抗基底膜抗体投与を行った。前免疫後５日目を第１病日として、抗マウス腎糸球体基底膜抗血清（ヒツジ）１５μｌ/２０ｇ体重を、連日３日間、尾静脈より静注した。ＮＣ群のマウスには、ＰＢＳを静注した。その後、第１４病日に断頭し、血液、脾臓、腎臓を採取した。

結果、ＰＣ群では、８０％の糸球体に全周性の細胞性半月体が形成され、糸球体毛細血管の広範な壊死や糸球体周囲間質への細胞浸潤等の高度な炎症性変化が認められた（図１２Ａ）。これらの炎症性変化は、ＮＣ群ではまったく認められなかった（図１２Ｂ）。ＳＣＨ２３３９０投与群では、２０％の糸球体に毛細血管壊死や半月体形成を認めたが、いずれも軽微であり、糸球体全体を占める瀰漫性変化や周囲間質への細胞浸潤等の高度な炎症所見は、認められなかった（図１２Ｃ）。

以上、実施例８から１１の結果は、従来、Ｔｈ１過剰反応に起因する疾患であると考えられてきた疾患も含め、多発性硬化症や糸球体腎炎等の臓器特異的自己免疫疾患や慢性炎症性疾患である関節リウマチが、Ｔｈ１７やＴｈ２の過剰反応に起因しており、Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬を投与するなどしてＴｈ１を積極的に誘導する（あるいはＴｈ１７やＴｈ２分化を抑制する）ことにより、効果的に治療又は予防し得る疾患であることを示すものである。なお、本実施例において、ＳＣＨ２３３９０（Ｄ１様（Ｄ１、Ｄ５）受容体阻害薬）が極めて高い効果を示したメカニズムの詳細は不明であるが、ＩＬ−１７の低下やＩＦＮ−γの上昇が病態に防御的に作用した可能性が高いものと考えられる。

本発明の医薬は、Ｔｈ１７やＴｈ２過剰反応に起因する疾患の治療又は予防剤として有用であり、また、本発明のスクリーニング方法は、前記医薬をスクリーニングする方法として有用である。また、本発明の各種薬剤は、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に関連する実験用の試薬として有用であり、また、前記各種薬剤の投与により改善効果が期待される各種疾患の治療又は予防剤としても有用である。

Claims (6)

1. ナイーブＴ細胞のＴｈ１７若しくはＴｈ２への分化の抑制、又はＴｈ１への分化の促進をする薬剤のスクリーニング方法であって、ドーパミン刺激に応答したナイーブＴ細胞内のｃＡＭＰ濃度の上昇の抑制を指標として用いるスクリーニング方法。
2. ナイーブＴ細胞のＴｈ１７若しくはＴｈ２への分化の抑制、又はＴｈ１への分化の促進をするための薬剤であって、ＳＣＨ２３３９０を有効成分として含有する薬剤。
3. ドーパミン刺激に応答したナイーブＴ細胞内のｃＡＭＰ濃度の上昇を抑制するための薬剤であって、ＳＣＨ２３３９０を有効成分として含有する薬剤。
4. 関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、および糸球体腎炎からなる群より選択される疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法であって、ドーパミン刺激に応答したナイーブＴ細胞内のｃＡＭＰ濃度の上昇の抑制を指標として用いるスクリーニング方法。
5. 樹状細胞におけるドーパミンの合成乃至貯蔵を促進するための薬剤であって、スルピリドを有効成分として含有する薬剤。
6. ナイーブＴ細胞のＴｈ２への分化を促進するための薬剤であって、スルピリドまたはネモナプリドを有効成分として含有する薬剤。