JP2003522196A - 潰瘍性大腸炎およびその関連疾患の治療方法および診断方法 - Google Patents

潰瘍性大腸炎およびその関連疾患の治療方法および診断方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、潰瘍性大腸炎の治療方法および予防方法の分野に関連する。具体的には、本発明はＣＥＰとヒトトロポミオシンとの間の相互作用を抑制する、化合物または組み換えタンパク質を投与することを含む。本発明は、潰瘍性大腸炎を処置するのに有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに患部組織におけるｈＴＭに対する自己抗原応答に関連する疾患を検出するための診断方法をも含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、潰瘍性大腸炎の治療方法および診断方法の分野に関連する。具体的
には、該方法はＣＥＰとヒトトロポミオシンとの間の相互作用を抑制する化合物
または組み換えタンパク質を投与することを含む。本発明はまた、潰瘍性大腸炎
の処置に有用な薬物のスクリーニング方法を含む。
【０００２】 （背景技術） 様々な科学文献および学術文献を本明細書で引用する。これらの文献は本明細
書の一部を構成し、本発明が属する技術分野の現状を記載する。
【０００３】 脊椎動物の骨格筋肉の収縮のＣａ２＋依存性は、アクチンフィラメントに密接
に関連する１組の特性化された補助タンパク質に完全に起因する。ミオシンを純
粋なアクチンフィラメントと試験管中で混合する場合には、ミオシンＡＴＰアー
ゼはＣａ２＋が存在してもいなくても活性化される。一方で、正常な筋原繊維に
おいて、アクチンフィラメントが補助タンパク質と会合する場合には、ミオシン
ＡＴＰアーゼの活性化はＣａ２＋に依存する。
【０００４】 これら補助タンパク質の１つは強固な棒状分子であり、このものはミオシンの
Ｘ線解析パターンと類似しているために、トロポミオシンと呼ばれる。ミオシン
の尾部と同様に、トロポミオシンは２つの同一のα−ヘリックス鎖の二量体であ
り、このものはコイルドコイルで互いの周りを巻いている。アクチンフィラメン
トの鎖長に沿って結合することによって、トロポミオシンはフィラメントを安定
化させ、硬直させる。
【０００５】 トロポミオシンは全ての真核生物の細胞に存在する。選択的スプライシングに
よって生成する異なるイソタイプのトロポミオシンは、組織に特異的な様式で発
現する（Less-Miller, JPらによる, Bioassays 1991; 13: 429-37）。ヒトの繊
維芽細胞組織において、少なくとも８つのイソ型のＴＭが同定されている。これ
らのイソタイプは分子量が３０〜４０キロダルトンの範囲である（Lin JJ-Cらに
よる, Int Rev Cytol 1997; 170: 1-38）。トロポミオシンは膜の挿入および転
移に必要とされるシグナル配列がないので、古典的にはそのものは細胞内に残る
ことが知られている（Less-Millerによる上記）。
【０００６】 ヒトトロポミオシン（ｈＴＭ）は細胞骨格のミクロフィラメントのタンパク質
である。有意な数の潰瘍性大腸炎の患者が、ｈＴＭ（特に、ｈＴＭ５イソタイプ
）に対する選択的な免疫応答を示す。従って、ｈＴＭは潰瘍性大腸炎の候補自己
抗原である。潰瘍性大腸炎を有する患者の粘膜からの固有層リンパ球および潰瘍
性大腸炎の血清を用いて、ｈＴＭイソタイプに対する自己抗体応答がいくつかの
独立した研究（これは、Das, K. M.らによるJ. Immunol. 1993; 150: 2487-93の
研究を含む）において実証されている。しかしながら、抗ｈＴＭ自己抗体応答は
、クローン病を有する患者においては観察されていない。最近、これらの発見は
ＴＣＲα−／−マウスを用いた大腸炎の動物モデルにまで拡張された（Mizoguch
i, A. らによるJ. Exp. Med., 1996; 183: 847-56）。これらのマウスにおける
大腸炎の激しさは、抗−ＴＭ自己抗体の力価の増大および抗−ＴＭ自己抗体を産
生する虫垂炎Ｂ細胞の数の増加と直接に相関する（Mizoguchi, A.らによるJ. Ex
p. Med. 1996; 184: 707-15）。
【０００７】 結腸上皮において、最も選択的に発現するｈＴＭイソタイプはｈＴＭ５である
（Geng, X.らによる, Gastroenterology, 1998; 114: 912-22）。特に、標的タ
ンパク質が全く細胞内であると予想される場合には、ｈＴＭ５が抗−ＴＭ自己抗
体に到達することができるかどうかは現在未知である。結腸上皮におけるｈＴＭ
５の外在化の可能性および分泌タンパク質と一緒でのｈＴＭ５の受動輸送の可能
性が考えられている。あり得るこのシャペロン機能の１候補は、７Ｅ１２Ｈ１２ モノクローナル抗体によって認識される結腸上皮に特有のタンパク質である。
【０００８】 モノクローナル抗体７Ｅ１２Ｈ１２は、非常に多量の結腸トロポミオシン（こ
のものは、以前は４０キロダルトンタンパク質またはｐ４０と呼ばれた）を用い
て産生された（Das K M.らによるJ. Immunol., 1987; 139: 77-84）。しかしな
がら、筋肉上皮細胞および非筋肉上皮細胞のいずれかからの７Ｅ１２Ｈ１２は、
ＥＬＩＳＡまたはイムノトランスブロット分析において、いずれの公知のｈＴＭ
５イソタイプとも反応しない（Das K M. らによるGastroenterology, 1997; 112
: A955）。しかしながら、７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体は、結腸上皮に排
他的に存在する細胞膜に関連するタンパク質を認識する（Das, K. M.らによる,1
987）上記、Das , K. M.らによる(1997）上記）。イムノトランスブロット分析
によって、ＣＥＰは結腸上皮細胞（小腸細胞ではない）に存在する、高分子量（
＞２００キロダルトン）のタンパク質であると同定された。大腸癌セルラインに
おいて、ＬＳ−１８０およびＤＬＤ−１細胞は７Ｅ１２Ｈ１２応答性タンパク質
を発現する（ＨＴ−２９細胞ではない）が、ＨＴ−細胞は発現しない（Hassan,
T.らによるClin. Exp. Immunol. 1995; 100: 457-462）。
【０００９】 （本発明の概要） 本発明によれば、ｈＴＭ５はシグナルペプチドがないにも関わらず、結腸の上
皮（小腸の上皮ではない）に外在化することを見出した。その上、ｈＴＭ５は結
腸上皮に特有のタンパク質（ＣＥＰ）と特に会合し、それらは共にＬＳ−１８０
大腸癌細胞によって分泌されることを見出した。
【００１０】 本発明の第１の態様は、ｈＴＭが結腸上皮で外在化しており、従ってこのもの
は免疫系を刺激することができて、その抗原的な役割を示すという新しい認識に
よるものである。ｈＴＭとＣＥＰとの物理的な相互作用はまた、細胞の外側での
ｈＴＭの放出にとって重要であると現在認められている。ｈＴＭに対する自己抗
体応答は潰瘍性大腸炎と関連しているので、該病気は結腸におけるｈＴＭの外在
化を減少させることによって処置することができる。従って、本発明の第１の態
様は、処置が必要な患者におけるｈＴＭに対する自己抗原応答に関連する潰瘍性
大腸炎および他の疾患を治療したりまたは予防したりするための予防法および治
療法である。好ましい態様において、ｈＴＭイソタイプはｈＴＭ５である。好ま
しい態様において、この処置方法は化合物を標的細胞に投与することを含む。該
化合物はｈＴＭの外在化および／または標的細胞内でのＣＥＰとｈＴＭとの相互
作用を抑制する。好ましい態様において、標的細胞は結腸細胞である。より好ま
しい態様において、該化合物はＣＥＰとｈＴＭとの相互作用を、該細胞中でその
どちらかと物理的に結合することによって抑制する。特に好ましい態様において
、該化合物はＣＥＰまたはＣＥＰ様タンパク質由来の機能性ｈＴＭ結合ドメイン
を有し、そしてインビボでｈＴＭ結合と競争する組換えタンパク質である。別の
好ましい態様において、該化合物は減少するかまたは標的細胞でのＣＥＰタンパ
ク質の発現を減少させる。別の好ましい態様において、該化合物は結腸細胞から
のｈＴＭの放出を減少させる。該化合物はまた、標的細胞からのＣＥＰ−ｈＴＭ
複合体の分泌を防止することもできる。より好ましい態様において、該化合物は
細胞骨格の組織化に影響を及ぼしたり、および／または能動分泌を抑制する。最
も好ましい態様において、該化合物はホルボール−１２−ミリステート−１３−
アセテート、モネンシンまたはメチルアミンである。
【００１１】 本発明の別の態様は、ｈＴＭヘのＣＥＰの特異的な結合を用いてｈＴＭの自己
抗原性質を減少させたりまたは除く、ｈＴＭに対する自己抗原応答に関係する潰
瘍性大腸炎およびその他の疾患を処置するための予防法または治療法である。該
方法の１態様は、非抗原性タンパク質と操作可能に連結させたＣＥＰ由来の機能
性ｈＴＭ結合部位を含む組換えタンパク質を投与することを含む。該方法の別の
態様は、ｈＴＭおよび／またはＣＥＰの経口摂食を繰り返すことによる寛容化を
含む。
【００１２】 本発明の別の態様は、潰瘍性大腸炎および、ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の解離を標
的とするｈＴＭに対する自己抗原応答に関係するその他の疾患を処置するのに有
用な薬物を同定するための方法である。好ましい態様において、ＣＥＰおよびｈ
ＴＭの細胞内会合は、ヒト結腸細胞からのｈＴＭの分泌によって測定され、ｈｔ
Ｍ分泌の減少は治療学的性質を有する薬物の指標である。より好ましい態様にお
いて、ＬＳ−１８０細胞を使用する。
【００１３】 本発明の別の態様は、ｈｔＭに対する自己抗原応答に関係する疾患を検出する
ための診断方法であり、該方法は患部組織においてＣＥＰ−ｈＴＭ複合体を検出
することを含む。ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の存在は、疾患の指標である。１態様に
おいて、該複合体またはその一部は患部組織の細胞外間隙で検出されたり、また
は感作したリンパ球によって結腸粘膜を形成する。別の態様において、該ＣＥＰ
−ｈＴＭ複合体は、患部組織の細胞内間隙において検出される。好ましい態様に
おいて、組織は結腸上皮である。
【００１４】 本発明の他の特徴および利点は、以下の図面、詳細な記載および実施例を参照
することによってより理解されるであろう。
【００１５】 （詳細な記載） 結腸上皮に特有のタンパク質（ＣＥＰ）と自己抗原ヒトトロポミオシン（ｈＴ
Ｍ）との特有の相互作用は、炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎の発生における基
礎的な要素であることが知られている。ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の形成は、結腸上
皮からのｈＴＭの分泌およびその結果生ずる自己免疫応答に必須である。結腸上
皮（小腸ではない）におけるｈＴＭの分泌は、結腸上皮でのＣＥＰの発現に起因
する。本発明の機能をいずれか１つの説明に限定するものではないが、分泌性タ
ンパク質であるＣＥＰと細胞内タンパク質であるｈＴＭと細胞内相互作用は、該
細胞からのＣＥＰと一緒のｈＴＭの受動輸送を可能とするようである。
【００１６】 従って、ｈＴＭ５の外在化はｈＴＭ５と分泌性タンパク質との共輸送によるよ
うである。結腸上皮細胞（小腸細胞ではない）でのｈＴＭ５の外在化は、結腸に
特有の因子が該プロセスに関与していることを示唆する。このことは、７Ｅ１２ Ｈ１２モノクローナル抗体が非常に多量の結腸性ＴＭ（このものは、以前にｐ４
０として同定されている）を注射することによって産生するという事実（Das, K
M. らによるJ. Immunol. 1987; 139: 77-84）、並びに結腸に特有のタンパク質
であるＣＥＰの細胞表面での発現とｈＴＭ５との相関関係によって支持される。
ｈＴＭ５は、結腸上皮細胞および小腸上皮細胞の両方の細胞内で発現する。しか
しながら、ｈＴＭ５の細胞表面の発現は、結腸上皮細胞およびＬＳ−１８０（こ
のものはＣＥＰを発現する）上でだけ観察されるが、このものはＣＥＰがない、
小腸上皮細胞およびＨＴ−２９細胞においては観察されない。このことは、ＬＳ
−１８０細胞の培地において、無傷のｈＴＭ５およびＣＥＰを回収することによ
って更に実証される。本発明の抗−ｈＴＭ５モノクローナル抗体および７Ｅ１２ Ｈ１２モノクローナル抗体を用いた共免疫沈降実験は、ｈＴＭ５とＣＥＰとの物
理的な会合を更に実証する。３１キロダルトンのタンパク質（これは、７Ｅ１２ Ｈ１２モノクローナル抗体との免疫沈降後は、ＬＣ１によっては沈降できない）
の消失はまた、ＣＥＰと会合する３１キロダルトンタンパク質がｈＴＭ５である
ことを示唆する。
【００１７】 本発明のＣＥＰは高分子量（＞２００キロダルトン）のタンパク質であると同
定される。このことは、結腸上皮細胞およびＬＳ−１８０大腸癌細胞のライゼー
ト、並びにＬＳ−１８０培地を用いて、７Ｅ１２Ｈ１２を用いたイムノトランス
ブロット分析によって証明された。更に、モノクローナル抗体である７Ｅ１２Ｈ １２ は、ｈＴＭを含むいずれかの細胞ライゼートまたは培地において、いずれの
他のタンパク質（これは、分子量が３１キロダルトン〜４０キロダルトンの範囲
であるｈＴＭイソタイプ１〜５を含む）とも反応しなかった。
【００１８】 ＣＥＰは、結腸細胞から分泌される膜と会合するタンパク質である。ｈＴＭ５
は細胞骨格と会合する。ＣＥＰおよびｈＴＭ５は、該細胞中では分離した状態で
あると考えられる。ＴＭイソタイプは、アクチンフィラメントの安定化、細胞形
態の変化、そして細胞内の顆粒移動および細胞質分裂の調節に関与する（Lin JJ
-Cらによる (1997), 上記）。アクチン細胞骨格は、ＬＳ−１８０細胞中の保存
型分泌性顆粒についての刺激依存性の調節されたエキソサイトーシスに関与する
ことが知られる（McCool, DJ.らによる(1995), 上記）。ｈＴＭ５はＣＥＰと一
緒に共免疫沈降するという観察に基づくと、少なくとも少量のＣＥＰが保存型分
泌性顆粒によって調節されたエキソサイトーシスに参加することができる。この
ことにより、ｈＴＭ５の分泌経路ヘの接近が容易となり得る。
【００１９】 本発明は、２つの分泌促進物質であるＡ２３１８７およびＰＭＡがＣＥＰおよ
びｈＴＭ５の分泌において異なる効果を有することを示す。ＣＥＰ分泌は、Ａ２
３８１７およびＰＭＡの両方の応答に影響を及ぼされなかった。しかしながら、
ｈＴＭ５の分泌はＡ２３１８７によって増大され、そしてＰＭＡによって抑制さ
れた。Ａ２３１８７およびＰＭＡはＬＳ−１８０細胞におけるムチンの分泌を刺
激することは知られる（McCool, DJらによる(1995), 上記）。しかしながら、Ｐ
ＭＡは細胞骨格の組織化に影響を及ぼすことができ、従ってｈＴＭ５の分泌を妨
害し得る（Derventzi, A.らによるBiochem. Biophys. Res. Commun., 1992; 182
: 1423-28）。ｈＴＭ５の分泌は、ゴルジ依存性およびゴルジ非依存性のタンパ
ク質分泌を抑制することが知られる薬物（これらはそれぞれ、モネンシンおよび
メチルアミン）によって抑制され得る。ＬＳ−１８０細胞でのｈＴＭ５の分泌経
路は知られていないが、これら２つの薬物の抑制効果は、ｈＴＭ５がＬＳ−１８
０細胞によって能動的に分泌されるという仮説を更に支持する。ＣＥＰの細胞表
面の分泌はモネンシン感受性であり、このことはＣＥＰ分子の輸送にゴルジが関
与することを示す。従って、本発明はＣａ＋２イオノホア（例えば、Ａ２３１８
７）がＣＥＰとｈＴＭ５との間の相互作用を促進する一方で、ＰＭＡ、モネンシ
ンおよびメチルアミンが該物理的な相互作用またはＣＥＰ−ｈＴＭ５複合体の共
輸送のいずれかを妨害することを示す。
【００２０】 自己抗体応答が結腸トロポミオシンに関連するので、ｈＴＭ５の細胞表面の発
現および分泌は潰瘍性大腸炎における自己免疫機構に関連する。結腸トロポミオ
シンは、上皮細胞のアポトーシスの間の粘膜免疫系にも使用することができる。
１０９のヒト自己抗原に存在する一般的な構造モチーフの物理化学的な分析によ
り、該トロポミオシンが最も多量の該モチーフを有しており、従って自己抗原と
して作用する性向が非常に高いことを示した（Dohlman, JGらによるBiochem. Bi
ophys. Res. Commun., 1993; 195: 686-96）。潰瘍性大腸炎の自己抗体について
の推定上の標的抗原（例えば、ｈＴＭ５またはｈＴＭ関連ペプチド）は、エフェ
クター免疫系を刺激することができ、そして様々な免疫機構（例えば、補体の活
性化を含む）によって該上皮の破壊を促進することができる。細胞内タンパク質
についての自己抗体は多数の自己免疫疾患において見られ、標的自己抗原が該抗
体に到達することができない限り、多くの場合には該抗体は病因でないと考えら
れる。いくつかの研究により、自己抗体も標的細胞の内側に内部移行することが
でき、そして細胞の損傷を引き起こすことがあり得ることが示されている（Alar
con-Segovia D.らによるImmunol. Today, 1996; 17: 163-64）。細胞内標的抗原
が自己抗体に曝露される可能性は、実験的な自己免疫心筋炎のマウスモデルにお
いて実証されている（Lio L.らによるJ. Exp. Med. 1995; 181: 1123-31におい
て報告）。このモデルにおいて、ミオシンに対する自己抗体は、恐らく補体の固
定化によって組織の損傷および炎症を引き起こす。
【００２１】 本発明は、ＣＥＰがｈＴＭ５の輸送のためのシャペロンとして機能することを
示す。小腸でのＣＥＰの欠如は、ｈＴＭ５が小腸細胞によって外在化されない理
由を説明することができる。このことはまた、潰瘍性大腸炎が結腸に限定される
理由についても関連する。胃腸管において、ＣＥＰは結腸上皮細胞においてのみ
発現する。しかしながら、結腸外部位ではＣＥＰは、皮膚および胆管上皮、眼の
繊毛上皮、並びに軟骨細胞においても発現する。これらは、炎症性腸疾患におい
て通常関与する器官および組織である。固定化ホルマリン組織を用いた免疫ペル
オキシダーゼ研究によって示される通り、ｈＴＭ５はまたこれらの腸外部位でも
発現する（Marks, M.らによるGastroenterology, 1998; 114: A1032）。従って
、本発明は潰瘍性大腸炎の免疫病理学におけるＣＥＰ＋ｈＴＭ５複合体の可能な
役割を示唆する。
【００２２】 ＣＥＰおよびｈＴＭタンパク質の会合は、潰瘍性大腸炎およびその関連疾患に
関する本発明の基礎を形成する。本発明はまた、潰瘍性大腸炎、並びにその関連
疾患（これは、細胞外間隙からｈＴＭ自己抗原を除去する目的で、ＣＥＰとｈＴ
Ｍとの結合の妨害を含む）を処置するための予防方法および治療方法をも含む。
本発明において、潰瘍性大腸炎およびその関連疾患についての診断方法において
ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の存在を使用する態様をも企図する。本発明は、潰瘍性大
腸炎およびその関連疾患の処置に有用であろう薬物を同定する方法をも含む。
【００２３】 本発明の化合物は、結腸上皮細胞からのｈＴＭの外在化を抑制する、潰瘍性大
腸炎に関連するいずれかの化合物であり得る。該化合物は、標的細胞においてＣ
ＥＰ−ｈＴＭ複合体の形成を抑制することが好ましい。該化合物は標的細胞にお
けるＣＥＰまたはｈＴＭのいずれかとの物理的な結合によって、ＣＥＰとｈＴＭ
５との間の相互作用を抑制することがより好ましい。該化合物は、ＣＥＰ由来の
機能性ｈＴＭ結合部位として作用する組換えタンパク質であることが、より一層
好ましい。本発明の化合物を投与することにより、標的器官でのＣＥＰタンパク
質の発現を減少させ、および／またはＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の分泌を防止するこ
とが好ましい。ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体についてのこの抑制は、細胞の細胞骨格組
織化または能動分泌のいずれかに影響を及ぼすことによって達成することができ
る。上記の目的での適当な化合物としては、例えばホルボール−１２−ミリステ
ート−１３−アセテート、モネンシンおよびメチルアミンである。
【００２４】 投与する化合物の量は、治療学的に有効な量である。使用する化合物の正確な
量は、処置する病気のタイプ（例えば、潰瘍性大腸炎）、並びにある化合物につ
いて推奨されるかまたは許容される用量などの因子についての被験者の好みの問
題である。通常、使用する化合物の量は目的の効果を得るのに必要な用量である
。
【００２５】 本発明はまた、潰瘍性大腸炎およびその他の関連疾患の治療方法または予防方
法にまで及ぶものであって、該方法は標的細胞に本発明の化合物を投与すること
を含む。該化合物が組換えタンパク質である場合には、該組換えタンパク質は理
想的には、ＣＥＰタンパク質上に存在する機能性ｈＴＭ結合部位を含む。この結
合部位は、非抗原性タンパク質と操作可能に連結する。
【００２６】 本発明の化合物および組換えタンパク質を、医薬的に許容し得る担体（このも
のは、様々な治療学的な活性を与えるのに有効な量の、ヒトに経口もしくは直腸
またはその両方で投与することができる医薬組成物を与える）と一緒に投与する
ことができる。当然に、担体のタイプは当該分野において一般的である医薬組成
物に望ましい投与方法、並びに目的の作用部位に依存する。該化合物またはタン
パク質は、ヒトに経口または直腸投与することが好ましい。
【００２７】 投与の容易さおよび用量の均一のための用量単位形態で、医薬組成物を製剤化
することが特に有利である。本明細書で使用する用語「用量単位形態」とは、単
位用量として使用するのに適当である物理的に別個な単位を意味し、各々の単位
は医薬的な担体と組み合わせて目的の治療学的な効果を与えるように算出された
、予め決められた量の活性成分を含有する。
【００２８】 炎症性の腸疾患を有する患者における腸外徴候は非常に一般的である。これら
の徴候の多数は、潜在する疾患を伴い、そしてその活性によって影響を受ける。
徴候としては、表１に例示するものを含む。これらの腸外徴候は炎症性の腸疾患
と密接に関連しているので、多くは外在化されたｈＴＭの自己抗原性質に起源を
有するようである。これら腸外疾患の診断および処置をも、本発明の方法に関連
して企図する。
【表１】 表１．炎症性腸疾患の腸外徴候 筋骨格 関節炎 -- 大腸炎タイプ、強直性脊椎炎、関節の単離の併発（isolated joi
nt involvement） 肥厚性骨関節症 -- 棍棒状、骨膜炎、転移性クローン病、 その他 -- 骨粗しょう症、無菌性壊死、多発性筋炎 皮膚および口 応答性病変 -- 結節性紅斑、壊疽性膿皮症、アフタ性潰瘍、水泡膿泡性発疹
、壊死性脈管炎 特有の病変 -- 亀裂およびフィステル、経口性クローン病、薬疹 栄養不足 --末端皮膚炎腸疾患（acrodermatitis enteropathica）（亜鉛）、
紫斑病（ビタミンＣおよびＫ）、舌炎（ビタミンＢ）、無毛（hair loss）およ
び脆化した爪（brittle nail）（タンパク質） 関連疾患 -- 白斑、乾癬、アミロイドーシス、表皮溶解性水泡の獲得（epid
ermolysis bullosa acquisita） 肝胆道 特有の合併症 -- 原発性硬化性胆管炎および胆管癌 関連炎症 -- 自己免疫性慢性活動性肝炎、胆管周囲炎、門脈繊維症および肝
硬変 代謝 -- 脂肪肝 眼 ブドウ膜炎（虹彩炎）、上強膜炎、強膜軟化症、角膜潰瘍、網膜血管疾患
【００２９】 従って、本発明は潰瘍性大腸炎およびその関連疾患を処置するのに有用な薬物
をスクリーニングする方法をも含む。該スクリーニング方法の１つは、ヒト大腸
癌細胞に候補薬物を投与し、引き続いて細胞中のＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の量を測
定することを含む。ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の量を、負のコントロール（例えば、
推定上の薬物を用いて処理しない細胞）または推定上の薬物を投与する前に測定
したＣＥＰ−ｈＴＭ複合体のレベルと比較する。ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体のレベル
の減少は、薬物の治療学的な価値の指標である。１態様において、この細胞ベー
スのアッセイを測定し、大腸癌細胞からのｈＴＭの量を定量化することによって
、ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の量を測定する。非常に好ましい態様において、大腸癌
細胞はＬＳ−１８０細胞である。分泌されたｈＴＭの検出は、分泌されたｈＴＭ
に特異的な抗体を有する血清／培地について、以下の実施例５に記載の通り、ウ
ェスタン免疫沈降分析を用いて達成することができる。
【００３０】 本発明の別の態様は、結合性ＣＥＰ−ｈｔＭ複合体についての細胞なしアッセ
イを含む。ｈＴＭおよびＣＥＰタンパク質を細胞なしの系中で混合し、試験化合
物と接触させる。該細胞なしの系は、細胞ライゼートおよび再構成したタンパク
質混合物からなる群から選ばれる。ｈＴＭおよびＣＥＰを同時に細胞中で発現さ
せて、該細胞を試験化合物と接触させる。試験化合物の適合性は、試験化合物が
ｈＴＭ−ＣＥＰ複合体の形成の減少を引き起こす能力を測定することによって測
定する。ｈＴＭ−ＣＥＰ複合体の検出は、通常の技術（これは、ゲル電気泳動ま
たはサイズ排除ゲルクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない）を用
いて達成することができる。これらの方法はルーチンであり、当該分野の当業者
にとってよく知られる。
【００３１】 本発明は、ＣＥＰ遺伝子およびプロモーターを含んで構成物を形成する発現ベ
ースのアッセイを含み、ここで該構成物はレポーター遺伝子と操作可能に連結さ
せる。
【００３２】 本発明は、上に記載したり、例示する態様に限定するものではないが、本特許
請求の範囲を逸脱することなく、改変および修飾を行なうことができる。
【００３３】 定義 本明細書で使用する用語「処置」とは、ｈＴＭとＣＥＰとの結合が影響を及ぼ
す、存在するかもしくは確立された障害の治療学的な処置、またはＣＥＰ−ｈＴ
Ｍ相互作用が影響を及ぼす障害の危険がある被験者における症状の予防を含む。
【００３４】 本発明の目的として、用語「被験者」とは、ヒトおよび非ヒト動物を含むと意
図する。用語「非ヒト動物」とは、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非
哺乳動物）を含み、例えばヒトでない霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、
両生類、爬虫類などを含む。ある態様において、被験者は哺乳動物（例えば、ヒ
トなどの霊長類）である。
【００３５】 本発明において、用語「投与する」とは、少なくとも１つの化合物を被験者に
導入して、意図する機能を発揮させる経路を含むことを意図する。投与は、いず
れかの適当な投与経路（例えば、経口、筋肉内または腹膜内を含む）によって行
なうことができる。
【００３６】 本明細書で使用する用語「治療学的に有効な量」とは、該疾患または障害の症
状およびその合併症を予防し、治癒したりまたは部分的に停止させるのに必要な
化合物の量を意味する。
【００３７】 用語「結合する」とは、互いに結合していない分子のランダムな衝突後に観察
される場合よりも、より長かったりおよび／またはより大きい強さもしくは結合
力である２つ以上の分子の物理的な会合を意味する。それらの結合は一時的であ
るかまたは長期間であり得る。
【００３８】 用語「スクリーニング」とは、多数の潜在的に有用な薬物を本発明の方法にお
いて処理する（processed）プロセスを意味する。１個の薬物についてその方法
および作用様式を詳細に決定するために研究する１つの実験とは区別されるプロ
セスである。
【００３９】 用語「容易に検出することができるリポーター」とは、物理的な、化学的な、
生化学的な、酵素的なまたは他の方法によって容易に検出することができるいず
れかの薬物または物質を意味する。該レポーターとしては、例えば酵素、蛍光分
子、発光分子または発色団分子、上記のいずれかで標識化された抗体、ハプテン
および抗原（これは、該抗体を用いて検出することができる）を含むが、これら
に限定されない。
【００４０】 用語「インビトロでの翻訳システム」とは、タンパク質をコードしたＲＮＡか
らタンパク質を翻訳することができる細胞なしの抽出物を意味する。該混合物は
典型的に、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、塩およびタンパク質合成を持続す
るするのに必要な様々な他の因子、加えてタンパク質合成を方向づけるＲＮＡを
含む。該混合物は典型的に、起源（例えば、ウサギの網状赤血球、ヒーラ細胞、
麦芽および大腸菌細胞などを含むが、これらに限定されない）から製造される。
該起源から得られる抽出物は、ｔＲＮＡ、アミノ酸などを必要に応じて添加する
ことによって捕捉することができる。
【００４１】 用語「操作可能に連結した」または「操作可能に挿入した」とは、コード配列
の発現に必要な調節配列がコード配列に対して適当な位置の核酸分子に存在して
、その結果コード配列を発現することができることを意味する。この同じ定義を
、発現ベクターにおける他の転写コントロール要素（例えば、エンハンサー）の
配列に適用する。
【００４２】 転写および翻訳コントロール配列とは、ＤＮＡ調節配列（例えば、プロモータ
ー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど）であって、
これらは宿主細胞中でのコード配列の発現を与える。
【００４３】 用語「プロモーター」、「プロモーター領域」または「プロモーター配列」と
は通常、遺伝子の転写調節領域を意味し、ここでこれらはコード領域の５’もし
くは３’位、コード領域内、またはイントロン内に存在することができる。典型
的に、プロモーターは細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合することができ、下流
（３’方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である
。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で結合
し、上流（５’方向）にまで伸張されて、上記のバックグラウンドを検出するこ
とができるレベルで転写を開始するのに必要な最少数の塩基または要素を含む。
プロモーター配列中には、転写開始部位（このものは通常、ヌクレアーゼＳ１を
用いたマッピングによって定義される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関
与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。
【００４４】 以下の実施例は本発明をより詳細に記載するために提示する。それらは本発明
を例示することを意図するものであり、限定するものではない。
【００４５】 実施例１：細胞の培養 大腸癌セルラインであるＬＳ−１８０およびＨＴ−２９を、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ロックビル、ＭＤ）から購入した。該細胞をダルベッ
コ改良イーグル培地（ＤＭＥ）（これは、１０％の胎児ウシ血清、ペニシリン（
１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）を用いて補足
した）中で培養した。
【００４６】 実施例２：モノクローナル抗体 ５つのイソタイプのｈＴＭ（ｈｔＭ１〜５）に対する抗−ＴＭモノクローナル
抗体を表２にまとめる。これらのモノクローナル抗体は非常にイソタイプ特異的
である。該イソタイプコントロールモノクローナル抗体である、ＭＯＰＣ Ｉｇ
ＧおよびＭＯＰＣ ＩｇＭをシグマケミカルズ（セントルイス、ＭＯ）から購入
した。結腸上皮に特異的なモノクローナル抗体である７Ｅ１２Ｈ１２の開発およ
び確認は、以前に報告されている（Das, KMらによる(1987), 上記）。ポリクロ
ーナル抗−ヒトリボソームタンパク質血清（このものは、分子量が３８キロダル
トン、１９キロダルトンおよび１７キロダルトンである３つのリボソームタンパ
ク質を認識する）をイムノビジョン（Immunovision）(Springdale, AR）から購
入した。抗−アクチンモノクローナル抗体（ＡＣ−４０）はシグマケミカルズ（
セントルイス、ＭＯ）から購入した。
【００４７】 実施例３：腸上皮細胞 ６つの外科的な直腸の標本を、大腸癌を有する患者から入手した（通常のセグ
メント）。通常の空腸の標本は、肥満のために胃のバイパス手術を受けた２つの
患者から入手した。２つの通常の回腸標本を、右半結腸切切除を受けた２つの患
者から入手した。上皮細胞は、Mayer L.らによるJ. Exp. Med. 1987; 166: 1471
-83のプロトコールに従って調製した。
【００４８】 実施例４：フローサイトメトリー分析： 単細胞の懸濁液を、リン酸で緩衝化したサリン（ＰＢＳ）（これは、４ｍＭ
ＥＤＴＡを含有する）を用いて単層から取り除くことによってセルラインから得
て、このものをＰＢＳを用いて２回洗浄し、生存度をトリパンブルー排除によっ
て測定した。新たに調製した腸上皮細胞を、＞９０％生存度を確認した後１時間
以内にフローサイトメトリー分析に使用した。細胞を、ＰＢＳ（これは、１％の
ウシ血清アルブミンおよび０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する）中でモノ
クローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートして、該試料をHolmes
, K.によるCurrent Protocols in Immunology; New York, John, Wiley & Sons,
Inc., 1994: 第5.3項に従ってカウンターフローサイトメーター（Counter Corp
oration, Fullerton, CA）を用いる分析のために処理した。
【００４９】 実施例５：生化学的な標識化および免疫沈降 ｈＴＭ５と結腸上皮に特異的なタンパク質（ＣＥＰ）（これは、７Ｅ１２Ｈ１ ２ モノクローナル抗体に対して反応性である）との会合の可能性を調べるために
、我々は大腸癌細胞由来の糖タンパク質の調節および未調節の分泌を研究におい
て用いる放射標識、追跡および薬物処置のためのプロトコールを用いた（McCool
DJ.らによるBiochem J. 1995; 312: 125-33；およびBrion C.らによるJ. Biol.
Chem., 1992; 267: 1477-83）。ＬＳ−１８０細胞をメチオニンのない培地（こ
れは、５％の透析した胎児ウシ血清を３５Ｓ−メチオニン（１００μＣｉ／ｍＬ
）を用いて１６時間補足した）中で標識化した。該細胞をＰＢＳを用いて２回洗
浄することによって、標識化を停止させ、、引き続いて規則的なＤＭＥを用いて
２時間追跡を行なった。分泌の刺激物質およびインヒビターの効果を調べるため
に、適当な薬物を上記（McCoolらによる上記；およびBrionらによる上記）の追
跡期間中に加えた。免疫沈降を、上記（Kesari, KVおよびGeliebterによるJ. Im
munol. Letts., 1993:; 38: 77-83）に記載の通り、該培地について行なった。
追跡後、該培地を集め、遠心分離していずれの不溶解な物質を除き、１〜１０倍
容量の１０Ｘ溶解緩衝液（５００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ ７．４ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、５％のＮＰ４０およびプロテアーゼインヒビターコックテイル、Comple
te, Boehringer-Mannheim, GMBH, 独）と混合した。非特異的な結合を減少させ
るために、ＬＳ−１８０細胞を増殖させる培地をタンパク質Ｇアガロース（GIBC
O-BRL, NY, 独）を用いて４℃で１６時間予め吸着させた。免疫沈降は、精製し
たモノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）または腹水（１０μｌ／ｍＬ）を用いて
氷上で２時間行ない、該免疫錯体をタンパク質Ｇアガロースを用いて集めた。Ｉ
ｇＭ免疫錯体を集めるために、タンパク質Ｇアガロースをアフィニティー精製し
たウサギの抗−マウスＩｇＭ−μ鎖に特異的な免疫グロブリン（２ｍｇ ＩｇＧ
／ゲルｍＬ）を用いて予め被覆した。該免疫錯体を氷冷した洗浄用緩衝液−１（
これは、５０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ
のＥＤＴＡおよび０．５％のＮＰ４０）を用いて３回遠心分離することによって
洗浄し、続いて緩衝液−２（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、５００
ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＮＰ４０）を用いて１回、
更に緩衝液−３（５０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ ７．４）を用いて１回洗浄した
。
【００５０】 実施例６：電気泳動 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）およびフルオログラフィーを、Coligan, J.によるcurrent Protocols in Im
munology, New York: John Wiley & Sons, Inc., 1994: Unit 8に記載の通り行
なった。当該分野の当業者にとってよく知られる方法を用いて、ウェスタンブロ
ット分析を行なって、ＬＳ−１８０細胞によるｈＴＭ５の分泌を測定した。ＬＳ
−１８０細胞を集密化させた後に、プレートをＰＢＳを用いて３回静かに洗浄し
、該培地を血清なしのＤＭＥで置き換えた。１８時間インキュベートした後、培
地を除き、３０分間遠心分離（１５，０００ｇ）し、該上清をＰＢＳに対する真
空透析によって濃縮した。該タンパク質の濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ
キット（bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）によって測定した。これらの実
験条件でのＬＳ−１８０細胞によって分泌されたタンパク質の量は、１．６μｇ
／ｍＬであった。ＬＳ−１８０培地（ＣＭ）または細胞ライゼートのどちらかか
らのタンパク質（１０マイクログラム）を、８％または１０％のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ中で分析し、続いて７Ｅ１２Ｈ１２および抗−ｈＴＭ５モノクローナル抗体、
並びにリボソームタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いたイムノトラン
スブロット分析を行った。次いで、条片をペルオキシダーゼに接合させた適当な
抗−免疫グロブリン（NEN Life Sciences, Boston, MA）を用いる化学発光を用
いて現像させた（develop）。
【００５１】 実施例７：実験結果 イソタイプのトロポミオシンおよびトロポミオシン関連分子が細胞表面で発現
するかどうかを測定するために、新たに単離した結腸および小腸の上皮細胞を、
本発明のフローサイトメトリー分析によって調べた。結腸上皮細胞を新たに得た
外科的な標本（通常のセグメント）から単離し、このものを抗−ｈＴＭモノクロ
ーナル抗体である、ＣＧ３（抗−ｈＴＭ５）、ＬＣ−２４（抗−ｈＴＭ４）、Ｃ
Ｇ１（抗−ｈＴＭ１）および７Ｅ１２Ｈ１２（抗−ＣＥＰ）を用いるフローサイ
トメトリーによって分析した。該イソタイプコントロールモノクローナル抗体で
あるＭＯＰＣ−ＩｇＭを各試料について使用して、バックグラウンドの染色を測
定した。様々なｈＴＭイソタイプ（ｈＴＭ１〜５）（表２を参照）に対する５つ
のモノクローナル抗体のうち、抗−ｈＴＭ５モノクローナル抗体であるＣＧ３だ
けが有意な染色を示し、直腸上皮細胞におけるイソタイプコントロールモノクロ
ーナル抗体の場合と比較して、ログで２の差異があった。正のコントロールとし
て使用される結腸上皮に特異的なモノクローナル抗体である、７Ｅ１２Ｈ１２も
また、結腸上皮細胞の同じ調製物について強い反応性を示した（モノクローナル
抗体である７Ｅ１２Ｈ１２の潰瘍性大腸炎の処置における使用については、米国
特許第５，８６９，０４８号に記載されている）。しかしながら、ｈｔＭイソタ
イプ１〜４に対する抗−ｈＴＭモノクローナル抗体との反応性は、イソタイプコ
ントロールモノクローナル抗体であるＭＯＰＣ−ＩｇＧまたはＭＯＰＣ−ＩｇＭ
と同様であった。このことは、結腸上皮細胞上のｈＴＭ１〜４の表面発現の欠如
を示唆する。これらのデータを他のデータ（上に記載）と組み合わせることによ
り、結腸上皮細胞上にｈＴＭ５（これは、他のｈｔＭイソタイプ（ｈＴＭ１〜４
）でない）が存在することを示唆する。
【００５２】 フローサイトメトリー分析においてＣＧ３モノクローナル抗体を用いて、本発
明者は６つの外科的に切除した結腸標本から新たに単離した結腸上皮細胞につい
て調べた。結腸上皮標本の各々は、フローサイトメトリー分析においてＣＧ３と
反応した。しかしながら、陽性細胞についての個体相互の変化（％）が存在した
。人為的結果を最小限にするために、９０％以上の生存度を有する結腸上皮細胞
試料だけを使用した。大腸癌細胞の場合と比較して結腸上皮細胞のより高いバッ
クグラウンドの染色が観察されるが、イソタイプコントロールモノクローナル抗
体であるＭＯＰＣ−ＩｇＭを用いることにより、ＣＧ３モノクローナル抗体を用
いたフローサイトメトリー分析による通常の結腸上皮細胞の陽性反応ははっきり
と明らかであった。
【００５３】 同様なＣＧ３反応性のエピトープが胃腸管の他の部分からの結腸上皮細胞上に
存在するかどうかを調べるために、２つの通常の回腸および２つの空腸標本から
新たに単離した上皮細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。回腸から
単離した上皮細胞は、ＣＧ３または７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体のいずれ
かとの反応性を示さない。３つの異なる結腸および１つの回腸標本の細胞ライゲ
ート（これは、各レーンに１０μｇのタンパク質を有する）を、ＣＧ３モノクロ
ーナル抗体と一緒に用いて、ウェスタンブロット分析を行なった。ｈｔＭ５の反
応性は３１キロダルトンではっきりと明白であった。ウェスタンブロット分析を
、結腸上皮細胞、空腸上皮細胞、ＬＳ−１８０大腸癌細胞および８％のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ後にＬＳ−１８０細胞を増殖させた皿からの細胞なしの培地からの全細
胞ライゲート（各レーンに１０μｇのタンパク質が存在する）に対する７Ｅ１２ Ｈ１２モノクローナル抗体を用いて行なった。ＣＥＰは、新たに調製した結腸上
皮細胞およびＬＳ−１８０細胞には存在したが、空腸上皮細胞には存在しなかっ
た。ＣＥＰはまた、ＬＳ−１８０細胞においても見られた。ＣＥＰは、７Ｅ１２ Ｈ１２モノクローナル抗体に対して反応性である、２００キロダルトンよりも大
きい唯一のタンパク質である。
【００５４】 コントロールＭＯＰＣ−ＩｇＭと比較して、４つの小腸標本の各々からの上皮
細胞とＣＧ３モノクローナル抗体との反応性には差異は観察されなかった。結腸
上皮に特異的なモノクローナル抗体７Ｅ１２Ｈ１２もまた、小腸上皮細胞中では
いずれの反応も示さなかった。小腸上皮細胞についてのフローサイトメトリー分
析におけるＣＧ３および７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体を有する、ｈＴＭ５
およびＣＥＰの表面染色の欠如は、これらの細胞中でのｈＴＭ５およびＣＥＰの
発現の欠如に起因すると考えられてきた。イムノトランスブロット分析は、小腸
上皮のライゼートを用いて行なった。小腸上皮細胞のライゼートを平行して使用
した。小腸および結腸の上皮細胞抽出物の両方が、細胞内でｈＴＭ５を発現する
。このことは、ＣＧ３モノクローナル抗体を用いてプローブしたトランスブロッ
ト分析によって証明される。しかしながら、結腸上皮細胞のライゼートだけが（
小腸上皮細胞の抽出物ではない）、ＣＥＰを発現した。ＬＳ−１８０大腸癌セル
ライン抽出物もまた、７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体と反応した。７Ｅ１２ Ｈ１２の反応性は、２００キロダルトンよりも大きい高分子量のタンパク質につ
いてははっきりと明白である。７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体のいずれかの
他のタンパク質（これは、３１キロダルトン〜４０キロダルトンの範囲であると
予想される、ｈＴＭイソタイプ（ｈＴＭ１〜５）を含む）との反応性については
、全く観察されなかった。従って本発明は、細胞内ｈＴＭ５が結腸および小腸の
上皮細胞の両方に存在するが、ｈＴＭ５の表面の発現は該表面および細胞内の両
方における結腸上皮細胞およびＣＥＰの発現に制限されることを、実証する。更
に、このｈＴＭ５の表面の発現は、結腸上皮細胞（小腸細胞ではない）に制限さ
れる。
【００５５】 インビトロシステムを確立するために、ｈＴＭ５の大腸癌セルラインＬＳ−１
８０およびＨＴ−２９での細胞表面の発現を調べた。大腸癌セルライン研究の場
合には、２つの抗−ｈＴＭ５モノクローナル抗体を用いた。これらのｈＴＭ５モ
ノクローナル抗体であるＣＧ３およびＬＣ１は、それぞれアミノ酸残基２９−４
４および１−１８を含有する、ｈＴＭ５のＮ末端部分での２つの独立したエピト
ープを認識する（表２）。大腸癌セルラインであるＬＳ−１８０は、２つの抗−
ｈＴＭ５モノクローナル抗体であるＣＧ３およびＬＣ−１を有する場合、並びに
抗−ＣＥＰモノクローナル抗体である７Ｅ１２Ｈ１２を有する場合には染色を示
す。別の大腸癌セルラインであるＨＴ−２９は、抗−ｈＴＭ５または抗−ＣＥＰ
モノクローナル抗体のいずれかとの反応性を示さない。フローサイトメトリー分
析において、ＬＳ−１８０細胞はＣＧ３およびＬＣ１の両方との陽性シグナルを
示した。ＬＣ１モノクローナル抗体との反応性は、ＣＧ３よりも強かった。しか
しながら、ＣＧ３モノクローナル抗体との反応性は、新たに単離した結腸上皮細
胞においてはより強かった。ＬＳ−１８０細胞はまた、陽性コントロールとして
使用される、結腸上皮に特異的なモノクローナル抗体である、７Ｅ１２Ｈ１２と
の強いシグナルを示す。フローサイトメトリー分析において、大腸癌セルライン
であるＨＴ−２９は、ＣＧ３およびＬＣ１モノクローナル抗体に対して、並びに
７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体に対して陰性であった。ＨＴ−２９細胞、並
びに抗−ｈＴＭ５モノクローナル抗体および７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体
を用いるイムノトランスブロット分析は、ｈＴＭ５の細胞内での存在を示した。
しかしながら、７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体との反応性は全く観察されな
かった。従って、ＨＴ−２９の反応パターンは、小腸上皮細胞の場合と同様であ
った。 表２：フローサイトメトリーおよびイムノトランスブロット分析において用いる
モノクローナル抗体
【表２】 ＊モノクローナル抗体Ｃｇβ６は、ｈＴＭ２およびｈＴＭ３の両方と反応する。
＊＊ＣＧ３およびＬＣ１モノクローナル抗体は、それぞれアミノ酸残基２９−４
４および１−１８を含有する、ｈＴＭ５のＮ末端での２つの独立したエピトープ
を認識する（Alarcon-Segovia, D.らによる(1996), 上記）
【００５６】 ＬＳ−１８０細胞上での表面発現はｈＴＭ５イソタイプに制限されるかどうか
を研究するために、ＬＳ−１８０細胞の反応性を、４つの他のｈｔＭイソタイプ
についてのイソタイプ特異的なモノクローナル抗体を用いるフリーサイトメトリ
ー分析によって調べた。特に、モノクローナル抗体ＬＣ２４はｈＴＭ４の場合に
ついて使用し、ＣＧ１はｈＴＭ１の場合について使用し、そしてＣｇβ６をｈＴ
Ｍ２&３の場合について使用した。これら３つのモノクローナル抗体の各々の反
応性は、イソタイプコントール抗体である、ＭＯＰＣ ＩｇＧまたはＭＯＰＣ
ＩｇＭの場合と同様であった。
【００５７】 抗−ｈＴＭ４（ＬＣ−２４）、抗−ｈＴＭ１（ＣＧ１）および抗−ｈＴＭ２&
３（ＣＧβ６）のモノクローナル抗体は、ＬＳ−１８０細胞の表面では反応しな
いことを見出した。従って、４つのｈｔＭイソタイプ（ｈＴＭ１〜ｈｔＭ４）は
ＬＳ−１８０細胞では検出されなかった。このことは更に、５つのｈＴＭイソタ
イプのうち、ｈＴＭ５だけがＬＳ−１８０細胞の表面で発現することを示唆する
。
【００５８】 結腸上皮細胞の表面で発現する、ＣＧ３／ＬＣ−１反応性タンパク質の分子同
一性を確認するために、ＣＧ３／ＬＣ−１反応性タンパク質を、表面タンパク質
のラクトペルオキシダーゼ放射ヨウ素標識後に免疫沈降した。細胞の表面でのｈ
ＴＭ５は少量であるというのが最もあり得る理由で、このことからは反応性を確
信することはできなかった。次いで、別の方法を用いて本発明者は、細胞から培
地へのｈＴＭ５の放出の可能性を調べた。実際に、ｈＴＭ５は該培地から無傷の
形で回収することができた。ウェスタンブロット分析（各レーンに１０μｇのタ
ンパク質）における、モノクローナル抗体であるＣＧ３およびｌＣ−１を用いた
細胞なし培地およびＬＳ−１８０細胞のライゼートにおいて、ｈＴＭ５の存在を
示した。陽性マーカーとして、組換えｈＴＭ５を平行して使用した。約６０キロ
ダルトンのタンパク質（これは、ｈＴＭ５の会合していない二量体であるようで
ある）もまた、ＣＧ３によって検出された。非常に高純度の組換えｈＴＭ５を使
用した場合でさえも、このタンパク質は存在する。他の研究者は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでのｈＴＭ二量体を報告している（Gimona, M.らによるProc. Natl. Acad,.
Sci. USA, 1995; 92: 9776-80）。抗−リボソームモノクローナル抗体を使用す
る、細胞ライゼートおよびＣＭのウェスタンブロット分析は、ライゼート（培地
ではない）中に２つのリボソームタンパク質（１９および３８キロダルトン）の
存在を示す。このことは、細胞の整合性および細胞損傷の欠如を示唆する。更に
、３５Ｓ−標識化されたＬＳ−１８０細胞を抗−アクチンモノクローナル抗体と
一緒に用いるイムノトランスブロット分析および免疫沈降実験の両方によって、
アクチンを調べた。該培地をアクチンを含なかったが、このことは更に細胞整合
性が存在することおよび細胞損傷の欠如を示唆する。
【００５９】 細胞内ｈＴＭ５が細胞損傷または細胞死のいずれかのために放出される場合に
は、リボソームタンパク質およびアクチンを該培地中に予想することができる。
その理由としては、ｈＴＭに似て、リボソームタンパク質およびアクチンは一様
に且つ大量に細胞内タンパク質で発現するためである。該培地中でのｈＴＭ５の
存在およびリボソームタンパク質の非存在は、ｈＴＭ５がＬＳ１８０細胞によっ
て放出されることを示唆する。該ＬＳ−１８０培地はまた、７Ｅ１２Ｈ１２反応
性タンパク質であるＣＥＰを含む。
【００６０】 上記の実験によって実証される通り、ｈＴＭ５（３１キロダルトン）およびＣ
ＥＰ（２００キロダルトンよりも大きい）の両方がＬＳ−１８０培地の上清に存
在する。このことは、イムノトランスブロット分析によって示される。共免疫沈
降実験を、抗−ｈＴＭ５モノクローナル抗体である、ＬＣ１および７Ｅ１２Ｈ１ ２ モノクローナル抗体を用いたＬＳ−１８０培地を用いて行なった。これらの実
験のために、ＬＳ−１８０細胞を３５Ｓ−メチオニンを用いて標識化した。培地
を上記の通り集めた。免疫錯体を方法において記載する通りに洗浄し、そして３
〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥフルオログラフィーによって分析した。ＣＥＰ
およびｈＴＭ５の両方を７Ｅ１２Ｈ１２およびＬＣ−１のモノクローナル抗体に
よって共免疫沈降させた。７Ｅ１２Ｈ１２モノクローナル抗体は、ＬＣ−１免疫
沈降と比較して大量のＣＥＰを示す。このことは、大量のＣＥＰがｈＴＭ５と結
合していない上清に存在することを示唆する。再び、ＬＣ−１を用いて免疫沈降
を行なった場合には、３１キロダルトン（ｈＴＭ５）のタンパク質を検出するこ
とができなかった。この免疫沈降の欠如は、ＬＣ１または７Ｅ１２Ｈ１２のモノ
クローナル抗体を用いる１回の免疫沈降後に、ｈＴＭ５の完全な除去を示す。こ
の観察は更に、ｈＴＭ５とＣＥＰとの物理的な会合を示唆する。免疫沈降実験に
おいて、いくつかの他の微量タンパク質を観察することができるが、７Ｅ１２Ｈ １２ モノクローナル抗体がＣＥＰ以外のいずれかのタンパク質と直接に反応する
可能性はあり得ない。その理由は、新たに単離した結腸上皮細胞およびＬＳ−１
８０大腸癌細胞の両方のライゼート、並びにＬＳ−１８０培地を用いるウェスタ
ンブロット分析により、ＣＥＰに対してだけ特異的な反応性が実証されるからで
ある。同様に、細胞ライゼートおよび細胞培地における、ＬＣ１のｈＴＭ５に対
してだけの特異的な反応性はイムノトランスブロット分析においてはっきりと明
白であった。
【００６１】 ＬＳ−１８０細胞由来のｈＴＭ５の放出は能動的なプロセスであるかどうかを
確認するために、公知の刺激物質（分泌促進物質）およびインヒビターの分泌に
おける効果を本発明において調べた。２つの分泌刺激物質であるＣａ＋２イオノ
ホアであるＡ２３１８７およびホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテ
ート（ＰＭＡ）を用いて、ＬＳ−１８０細胞における分泌経路が探索されている
（McCool Djらによる(1995)，上記）。ＬＳ−１８０細胞の培養上清を３５Ｓ−
メチオニン（１００μＣｉ／ｍＬ）を用いて１６時間標識化し、様々な薬物と一
緒にインキュベート後の２時間、追跡を行ない、免疫沈降を行ない、３〜１２％
のＳＤＳ−ＰＡＧＥフルオログラフィーによって分析した。未処置の細胞の場合
には、１０μｌ／ｍＬのＤＭＳＯを、該追跡の間に加えた。免疫沈降を、７Ｅ１ ２ Ｈ１２またはＬＣ−１モノクローナル抗体を用いて行なった。コントロールは
、未処置の細胞由来の培地上清の免疫沈降プロフィールを含めた。３１キロダル
トンのタンパク質をコントロールにおいて観察した。分泌促進剤の効果を、該追
跡の間に２μＭのＡ２３１８７または１０μＭのＰＭＡを加えることによって調
べた。組み合わせ効果を調べるために、Ａ２３１８７（２μＭ）およびＰＭＡ（
１０μＭ）を一緒に加えた。
【００６２】 ＣＥＰおよびｈＴＭ５の分泌における２つの薬物の異なる効果を観察した。Ｃ
ＥＰの分泌は、薬物処置によっては有意に影響を受けなかった。このことは大量
のＣＥＰ分子が分泌促進剤がなくても分泌することを示唆する。いくつかの他の
タンパク質（これは、３１キロダルトンのタンパク質を含む）は、ＣＥＰと一緒
と共免疫沈降した。未処置の細胞由来の培地をＬＣ−１モノクローナル抗体と一
緒に免疫沈降させた場合には、ｈＴＭ５（〜３１キロダルトン）およびいくつか
の他のタンパク質を観察した。該ＣＥＰと会合する３１キロダルトンのタンパク
質はｈＴＭ５と一緒に移動し、従ってこのことは３１キロダルトンのタンパク質
がｈＴＭ５で゛あるという考えを支持する。比較的に少量のＣＥＰに相当するタ
ンパク質は、ｈＴＭ５と一緒に共免疫沈降した。このことは、ＣＥＰとｈＴＭ５
とは複合体を形成するが、全ての分泌されたＣＥＰ分子がｈＴＭ５と会合するも
のではないという記載と一致する。
【００６３】 ゲルに終夜曝露させた後に、ＣＥＰおよびｈＴＭ５と共免疫沈降させた３１キ
ロダルトンのバンドの濃度測定分析を、１ミリメートル平方の窓を有するBioRad
670濃度計を用いて行なった。７Ｅ１２Ｈ１２またはＬＣ−１のモノクローナル
抗体のいずれかによって免疫沈降させた３１キロダルトンタンパク質についての
これら濃度測定のパターンは、個々の薬物処置の場合と比較して同様であった。
このことは、３１キロダルトンのタンパク質はｈＴＭ５であることを更に示唆す
る。ＤＭＳＯ処置だけの場合と比較して、Ｃａ＋２イオノホアはｈＴＭ５の分泌
を７Ｅ１２Ｈ１２免疫沈降の場合に４．５倍およびＬＣ−１免疫沈降の場合に７
．８倍だけ刺激した。一方で、ＰＭＡはほとんど全て該分泌を抑制した。このこ
とは、ＰＭＡおよびＡ２３１８７はＬＳ−１８０細胞における調節された分泌に
ついて相乗的な効果を発揮することが知られているので（McCool DJらによる(19
95), 上記）、驚くべき結果であった。ＰＭＡおよびＡ２３１８７を一緒に加え
た場合には、分泌したｈＴＭ５の量は７Ｅ１２Ｈ１２およびＬＣ−１のモノクロ
ーナル抗体と一緒に免疫沈降させた場合にそれぞれ、５．７６倍および７．８倍
だけ増加した。この増加は、Ａ２３１８７の優位な効果を示唆する。その上、細
胞の溶解または細胞死が薬物処置した際の培地上清でのｈＴＭ５の放出に寄与し
ている場合には、死んだりまたは損傷した細胞によって放出されるｈＴＭ５の量
の増加だけが観察されると予想される。更に、細胞の溶解または細胞死がｈＴＭ
５の放出に関係するならば、ｈＴＭ５の分泌の抑制は期待されないであろう。し
かしながら、ＰＭＡを用いて観察される場合と同様に、ｈＴＭ５の抑制が本発明
において観察された。
【００６４】 能動分泌の２つのインヒビター（いわゆる、モネンシンおよびメチルアミン）
がｈＴＭ５の分泌に及ぼす効果を調べた。インヒビターを追跡の間に加えた。細
胞培地をＬＣ−１モノクローナル抗体と一緒に免疫沈降させた。これらインヒビ
ターの選択の理論的根拠は、モネンシンはゴルジ機能を抑制することが知られて
おり（McCool, DJらによる(1995)、上記）、一方でメチルアミンはタンパク質の
ゴルジ外輸送を抑制することが知られているからである（Sato, S.らによるExp.
Cell Res., 1993; 207: 8-18）。公知のインヒビターとして、ＰＭＡもまた該
実験において含む。ｈＴＭ５の分泌は、モネンシンおよびメチルアミンの両方に
よって抑制された。
【００６５】 新たに単離された結腸上皮細胞および大腸癌セルラインであるＬＳ−１８０に
ついてのフローサイトメトリー分析は、細胞表面でのｈＴＭ５またはｈＴＭ５関
連分子の存在を示す。外科的な標本から単離した上皮細胞にはいくらかの不均一
性が存在し、このことはいくらかは、他の細胞の種類による混入、ｈＴＭ５の細
胞表面発現での個体相互の変化、または細胞表面でｈＴＭ５を発現しない結腸上
皮細胞が原因であり得る。ＣＧ３およびＬＣ１のモノクローナル抗体を有するＬ
Ｓ−１８０細胞の染色プロフィールは、少量のｈＴＭ５だけが細胞表面に存在し
ており、ＬＳ−１８０細胞個体群の一部がある一定の時間では表面上にｈＴＭ５
を発現し得ないことを示す。ｈＴＭ５の細胞表面での発現が細胞周期によるかど
うか、またはそのことがその細胞外ヘの放出前の一時的な表面発現の有力なプロ
セスであるのかどうかは未知である。しかしながら、ｈｔＭは細胞骨格ミクロフ
ィラメントタンパク質であってシグナルペプチドを欠いているので、いずれの量
のｈＴＭ５の外在化も予想されない。該外在化は平行して研究した小腸細胞およ
びＨＴ−２９大腸癌細胞においては観察されなかった。このことは、膜内ヘの挿
入のためのリーダーペプチドおよび他のシグナルを欠いた細胞内タンパク質の外
在化および、続く転移（例えば、塩基性細胞芽成長因子（ｂＦＧＦ）、インター
ロイキン−１および酵母菌交配（mating）因子α）によって支持される。
【００６６】 本発明は、上で記載したり、例示する実施態様に限定するものではないが、特
許請求の範囲内での改変および修飾は可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/16 1/16 17/00 17/00 17/06 17/06 17/14 17/14 19/02 19/02 19/08 19/08 19/10 19/10 27/02 27/02 35/00 35/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/574 Ｚ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 335 Ｇｅｏｒｇｅ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐ． Ｏ．Ｂｏｘ 2688，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗ ｉｃｋ、ＮＪ 08903、Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 カイロン・エム・ダス アメリカ合衆国08836ニュージャージー州 マーティンズビル、ダーレン・ドライブ25 番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DA78 4C084 AA02 AA17 BA44 CA53 NA14 ZA682 4C086 AA02 CA01 MA01 MA04 NA14 ZA68 4C206 DB04 DB06 DB56 FA01 KA04 MA01 MA04 NA14 ZA68

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 化合物を標的細胞に投与することを含む、標的細胞における
    潰瘍性大腸炎およびその他の関連疾患の治療方法または予防方法であって、該化
    合物はＣＥＰとｈＴＭとの間の相互作用を抑制する該方法。
  2. 【請求項２】 化合物は標的器官においてＣＥＰまたはｈＴＭのいずれかと
    の物理的な結合によって、ＣＥＰとｈＴＭとの間の相互作用を抑制する、請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 化合物は、ＣＥＰ由来の機能性ｈＴＭ結合部位を含む組換え
    タンパク質である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 化合物は標的細胞でのＣＥＰタンパク質の発現の減少を引き
    起こす、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 化合物はＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の分泌を防止する、請求項１
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 化合物は細胞骨格の組織化または能動分泌のいずれかに影響
    を及ぼす、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 化合物はホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテー
    ト、モネンシンまたはメチルアミンのいずれかである、請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＣＥＰ由来の機能性ｈＴＭ結合部位を含む組換えタンパク質
    を投与することを含む、潰瘍性大腸炎およびその他の関連疾患の治療方法または
    予防方法であって、該機能性結合部位は非抗原性タンパク質と操作可能に連結し
    ている該方法。
  9. 【請求項９】 薬物をヒト大腸癌細胞に投与し、そしてＣＥＰ−ｈＴＭ複合
    対の量を測定することを含む、潰瘍性大腸炎およびその他の関連疾患を処置する
    のに有用な薬物のスクリーニング方法であって、ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の減少は
    薬物の治療学的な価値の指標である該方法。
  10. 【請求項１０】 ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の量を、大腸癌細胞から分泌される
    ｈＴＭの量を定量化することによって測定する、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 大腸癌細胞はＬＳ−１８０細胞である、請求項１０に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 患部組織でのＣＥＰ−ｈＴＭ複合体を検出することを含む
    、患部組織におけるｈＴＭに対する自己抗原反応に関連する疾患を検出するため
    の診断方法であって、ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体の存在は疾患の指標である該方法。
  13. 【請求項１３】 ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体を患部組織の細胞外間隙で検出する
    、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ＣＥＰ−ｈＴＭ複合体を患部組織の細胞内間隙で検出する
    、請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 組織は結腸上皮である、請求項１２に記載の方法。
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